CN105602863A - 一株高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株 - Google Patents

一株高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌<i>（</i><i>Bacillus？Bubtilis</i><i>）</i>NJtech？489，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015561。该菌株经分离、筛选、鉴定所得。本发明的枯草芽孢杆菌可以同时高产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸。

Description

一株高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株
技术领域
本发明属于生物技术领域或者农业微生物技术领域，涉及一株同时高产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸的功能菌株。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是土壤中一类比较重要的微生物群体，在防治植物的根部、叶部和枝干病害中发挥了重要作用。枯草芽孢杆菌用于防治植物病害的作用已受到国外企业的充分重视，作为生物杀菌剂已有多个厂商进行了登记。枯草芽孢杆菌中通过非核糖体途径合成的脂肽类化合物是一类主要的抑菌物质，主要有表面活性素(surfactin)、丰产素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)和制磷脂菌素(plipstatin)。其中，surfactin是表面活性最强的脂肽类抗生素，具有广谱高效的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌等多种细菌或真菌具有抗菌作用，而且对病毒、支原体和原虫等也具有显著的抑制效果。
聚-γ-谷氨酸，由微生物合成的一种细胞外高分子多氨基酸聚合物，由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基缩合而成，同样具有生物可降解性，并具有缓释性、吸水性等功能。许多菌株都能在胞外产生γ-PGA，目前已经发现能够产生γ-PGA的菌株均属于芽孢杆菌属。聚谷氨酸在土壤和肥料等方面的应用已经成为了农业领域一个新的生长点，如：可用于土壤保水剂、包埋尿素提高肥料利用率。聚谷氨酸自身也具有良好的肥料效应，在玉米、小白菜等作物上开展的实验表明，较低浓度的细菌源聚谷氨酸对低营养条件下植物的生长有显著的促进作用。
因此，同时产生脂肽抗生素surfactin和高分子量γ-聚谷氨酸两种功能物质的芽孢杆菌菌株在农业应用领域具有显著的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可以高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：
一株枯草芽孢杆菌，该菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(BacillusBubtilis)NJtech489，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2015561。
该菌株能够同时高产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
一种同时生产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸的方法，发酵培养本发明所述的菌株，分离发酵液和菌体，从发酵液中分别纯化获取Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
本发明所述的菌株具有以下特征：
(1)菌株的菌落形态特征：形状不规则，边缘不整齐，表面皱褶，湿润，挑起菌落会形成长细丝。
(2)菌体的形态特征：菌株是革兰氏阳性杆菌，形成芽孢，芽孢较大，圆柱形，居中。半固体穿刺运动，有鞭毛，有荚膜。
(3)菌体的代谢特征：在羊血平板上生长时，有产生溶血圈；发酵生产过程中会生成大量气泡，并且发酵液粘度会增大，即可以同时产生生物表面活性素Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
(4)菌体分子特征，16sDNA鉴定同源性最近的种属为枯草芽孢杆菌。
(5)菌株的代谢生长特征：可以高效利用木糖进行自身生长，但低产本身能够高产的surfactin与聚谷氨酸。
附图说明
图1可视化分析图。
本发明涉及的生物材料是一株枯草芽孢杆菌，该菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(BacillusBubtilis)NJtech489，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏日期是2015年9月18号，其保藏编号为CCTCCNO：M2015561。
具体实施方式
实施例1：本实施例说明分离、鉴定菌株的过程
(1)土壤样品处理：取1g胜利油田的土壤放入100mL无菌水(放有磁力搅拌器，少量玻璃珠)中，在37℃，搅拌30min，再将土样液在沸水中煮沸8-10min。
(2)将步骤1中获得的液体，静止10-20min，取上清液1mL放入50mL种子培养液中，37℃，200rpm下培养12h。
其中，种子培养液培养基组成为：蛋白粉10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
(3)在超净工作台用移液枪取上述步骤2中培养液1mL于①号9mL生理盐水的无菌试管中，充分震荡，使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液；再取10-1的样品稀释液1mL于②号9mL生理盐水的无菌试管中，以此类推，依次标记10-2、10-4、10-5、10-6、10-7。
(4)血平板培养：分别取10-5-10-7稀释度稀释液0.15mL无菌涂布棒涂布均匀于血平板上，平放静置20min，后倒置于37℃恒温培养箱培养12h。其中血平板培养基组成为：酵母膏5-10g/L，蛋白胨10-12g/L，氯化钠10-12g/L，脱纤维除菌棉羊血8％，琼脂2％。
(5)取步骤1.4中溶血圈较大的菌株进行排油圈试验。取直径为9cm的培养皿，加入20mL的蒸馏水，在水中央加入200μL的用苏丹红Ⅲ染色的煤油形成一薄层油膜，在煤油中间慢慢加入一滴发酵上清液，测定排油圈的直径。煤油是经过苏丹红Ⅲ染色的，煤油：苏丹红Ⅲ的比例为200:1。选取排油圈较大的几个菌株进行分别平板划线后平放静置20min，后倒置于37℃恒温培养箱培养12h。分别标记BS-1、BS-2、BS-3….。
(6)通过对1.5步骤所分离出来的菌株进行平板观察，有菌落形态为中间凸起，且挑起有长丝，不易脱离平板。
获得了一株菌株，初步命名为BacillusBubtilis-NJtech489。
(7)将步骤6所得菌株接种于LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床下培养12h。再分别按1％接种量接种到发酵培养基中，37℃，200rpm摇床下培养48h，对发酵液进行处理(进行Surfactin含量的测定)，有不溶于有机溶剂物质，因此，用无水乙醇对发酵液进行醇提，有部分沉淀(由于太少，无法定量)，故采用凝胶渗透色谱进行定量及分子量的分析。测得发酵液中含有Surfactin与聚谷氨酸含量分别为262mg/L、1.5g/L，并得聚谷氨酸分子量为40万-200万Da。
发酵培养基的配方为：蔗糖30g/L，氯化铵5g/L，磷酸二氢钾2g/L，7水合硫酸亚铁0.02g/L，7水合硫酸镁0.2g/L，pH为7.00。
凝胶渗透色谱条件：色谱柱为Superose6(PharmaciaCo.)，流动相为50mmol/LpH7.5的磷酸缓冲液，流速0.4mL/min，经计算，所产聚谷氨酸分子量范围：40万-200万Da。
高效液相色谱条件：色谱柱为SynchronisC18(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇：水(含有0.05％的三氟乙酸)＝9:1；流速为0.8ml/L，波长214nm，温度35℃。
实施例2：本实施例说明菌株了16sDNA鉴定、命名与保藏的过程
1、细菌DNA的提取：
1.1摇瓶接种：挑去单菌落于液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床下培养12h。LB液体培养基配方为：蛋白粉10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
1.2细菌基因组的提取：
①：取1mL细菌菌液于1.5mL离心管中，室温12000rpm，离心2min弃上清。若为革兰氏阴性菌，加入180μLBufferGL、20μL(20mg/ml)的蛋白酶和10μL的RNaseA(10mg/ml)充分振荡混合均匀，于56℃水浴温育10min。若为革兰氏阳性菌，500μL的BufferBS重悬细胞、加入50μL的Lysozyme(20mg/ml),充分吸打均匀，与37℃水浴温育60min(每隔20min混匀一次)，后12000rpm离心5min，弃上清，再加入180μL的BufferGL、20μL的ProteinanseK(20mg/ml)和10μL的RNaseA(10mg/ml)充分振荡混合均匀，于56℃水浴温育10min。
②：再加入200μL的BufferGB和200μL的100％的乙醇，充分吸打混匀。将SpinColumn放置新离心管中，12000rpm离心2min，弃滤液。
③：加入500μLBufferWA，12000rpm离心2min，弃滤液。再加入700μLBufferWB，12000rpm离心2min，弃滤液。再12000rpm离心2min。
④：最后将SpinColumn放置新的1.5ml离心管中，加入50-200μL的灭菌蒸馏水，静置5min，最后12000rpm离心2min，得DNA提取液。
⑤将提取到的基因组DNA通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行验证。
2、16srDNA的PCR扩增：以提取的细菌DNA作为模板，用细菌通用引物扩增16SrDNA序列。引物序列为：
BSF(27f)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
BSR(1492r)：TACGGCTACCTTGTTTACGACTT。
反应条件：
PCR反应产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，然后将电泳胶回收，得纯化后的DNA片段。
3.连接：
将纯化后的DNA片段连接到载体上，以备测序。载体采用大连宝生物工程有限公司的PMD-18TVector。
连接体系：
反应体系对照体系
SolutionI：5uL(放在冰上溶解) SolutionI：5uL
回收产物：4uL ddH2O：3uL
T-Vector：1uL ControlI：1uL
T-Vector：1uL
4、转化：
取2组感受态细胞50ul在冰上溶解，第一组加连接液5ul，另一组作为对照组不加外源DNA，轻轻旋转，混匀内容物，在冰上放置30min。之后取出，42℃，90s热激，不能摇动。冰浴2min。每管加入900ulLB培养基(37℃预热)，不含抗生素。温浴45min，(160rpm，37℃)离心，12000rpm，1min，不要弃尽上清，剩余约200ul涂平板，37℃，培养24h。
挑选重组子(白色菌落)，接种AmpLB，37℃,200rpm过夜摇瓶培养。AmpLB液体培养基配方为：蛋白粉10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。灭菌后加入已过滤除菌的氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL。
5、提取质粒
将上步骤的发酵液提取质粒，再经0.8％琼脂糖凝胶电泳进行验证。
6.测序：
经电泳检测后，挑取在有明显条带的质粒送去测序。测序交由南京金斯瑞生物技术有限公司完成。
7、BLAST比对结果
将测序得到的序列提交到GENBANK，采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类。
所测的菌株的序列如SEQIDNO:1所示。经比对可得此为枯草芽孢杆菌，因此命名为枯草芽孢杆菌NJtech489。并保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为：CCTCCM2015561。
实施例3.本实施例说明利用该菌株同时生产Surfactin及聚γ-谷氨酸的情况培养方法
1种子培养：将冷冻保藏的枯草芽孢杆菌活化三代后接种到LB液体培养基，于37℃，200rpm条件下摇瓶培养12h。
2摇瓶发酵：将种子液按2％接种量接入发酵培养基(优化碳源、氮源、无机盐)，于37℃，200rpm条件下静置发酵培养48h。
2γ-聚谷氨酸的测定
利用凝胶渗透色谱仪(GPC)进行聚谷氨酸含量的测定。发酵液样品经12000rpm离心15min，取上清液稀释10倍进行液相分析。液相条件为色谱柱为Superose6(PharmaciaCo.)，流动相为50mmol/LpH7.5的磷酸缓冲液，流速0.4mL/min，聚谷氨酸出峰时间为15.1min。
3高效液相色谱定量Surfactin含量
发酵液经12000rpm离心15min，取上清液稀释5倍，过0.22μm有机膜，液相色谱检测条件如下:流动相为90％的甲醇和10％的0.05％三氯乙酸水溶液，流速为0.8ml/L，波长214nm，柱温30℃。
4别研究发酵培养条件(温度，接种量，PH,时间)与发酵培养基(碳源，氮源，谷氨酸钠，金属离子)对枯草芽孢杆菌产脂肽抗生素和聚谷氨酸的影响。
4.1分别将接种后的发酵培养基于30℃、34℃、37℃、40℃，其他条件一致的条件下摇瓶培养。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.2分别将调节发酵培养基pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件一致的条件下摇瓶培养。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.3分别接种量为1％、2％、3％、4％、5％，其他条件一致的条件下摇瓶培养。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.4将培养基于同一培养条件下摇瓶培养，分别培养12h、24h、36h、48h、60h。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.5碳源选择
葡萄糖，蔗糖，乳糖，可溶性淀粉，甘油各30g/L。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
碳源加入量的优化碳，分别以10、20、30、40、50、60g/L为选择对象，以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.6氮源优化
氮源选择：酵母粉，蛋白胨，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵各10g/L。以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
氮源加入量的优化，分别以3、6、9、12、15、18g/L为选择对象，以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.7谷氨酸钠的添加
分别以0、10、20、30、40、50、60g/L为选择对象，以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
4.8金属离子的影响
Mg2+、Mn2+、Fe2+、K+、Ca2+、Na+(MgSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4·7H2O、KH2PO4、无水CaCl、NaCl)，以谷氨酸利用率，Surfactin产量为优化指标。
金属离子的添加量分别为：KH2PO4选0、1、3、5、7、9g/L六个因素，NaCl选0、2、4、6、8、10g/L六个因素，无水CaCl2选0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L六个因素，MgSO4·7H2O选0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L六个因素、MnSO4选0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L六个因素、FeSO4·7H2O选0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L六个因素。
通过以上实验，得实验数据分析得，温度、时间、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+对双产物的影响有明显规律，如下表格1。
表1
表格1其中“↗”表示随条件上升，“↘”表示随条件下降，“∩”表示随条件n型变化，“∪“表示随条件U型变化，37℃为变化率最小，故37℃为最佳。
5可视化实验
智能可视化优化软件(IVOS)由武汉理工大学鄢烈祥教授惠赠。其基本原理为：基于生产过程的数据或试验数据，建立降维映射模型，并应用智能算法，将多维空间的数据降维映射到平面，并在平面上产生目标函数的等值线，据此，在映射平面上直接看出优化区域或最优点。
选择碳源、氮源、谷氨酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、接种量6个影响因子作为研究因素，10水平。采用均匀设计表，设计优化实验，如表格2。
表2均匀设计表格
通过以上表格配方进行发酵实验，以谷氨酸利用率和Surfactin产量为双目标，进行可视化分析。如图1。
以8，5两点为优化参照点，分别取步长为0.8、0.6、0.4、0.2，得四个预测配方，预测产量如下表3：
表3
其中，预测2验证成功，如下表4：
表4验证成功配方相关参数
得结论，经发酵优化，双产物产量分别为聚谷氨酸达21.74g/L，脂肽抗生素达543.21mg/L。
其中，步骤3优化过程中探索各个影响因素时，除特殊说明外，培养条件都是37℃，发酵48h，接种量为2％，转速为200rpm。
实施例4本实施例说明枯草芽孢杆菌NJtech489利用木糖进行Surfactin及聚γ-谷氨酸的生产情况
木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的单糖，但很多微生物代谢木糖能力不强，且在以葡萄糖和木糖等混合碳源发酵时，CCR效应会抑制木糖的摄入利用。微生物菌株能利用木糖生长代谢，可以大大降低发酵成本投入，并为解决日益严峻的粮食危机等问题。
为探索本发明菌株利用枯草芽孢杆菌NJtech489木糖生长代谢情况，进行的实验步骤如下：
(1)挑取枯草芽孢杆菌NJtech489单菌落于LB培养基中，37℃，200rpm下培养12h作为种子液。LB培养基组成为：蛋白粉10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
(2)接种2％的步骤1中种子液于发酵培养基中，37℃，200rpm下培养48h。分别在12h，24h，36h，48h测其OD及surfactin和聚谷氨酸含量，结果如表5。发酵培养基组成为：木糖20g/L，羽毛水解液1.5％(v/v)，磷酸二氢钾10g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L。其中，羽毛水解液为含有氨基酸(18-20％)，氯化铵(20-25％)和小肽(<2％)等成分。
OD值用紫外分光光度计，波长600nm。
surfactin含量测定方法：发酵液经12000rpm离心15min，取上清液用甲醇稀释5倍，过0.22μm有机膜，液相色谱检测条件如下:C18柱(4.6*250mm，5um)，流动相为90％的甲醇和10％的0.05％三氟乙酸水溶液，流速为0.8ml/L，波长214nm，柱温35℃。
聚谷氨酸含量测定方法：发酵液样品经12000rpm离心15min，取上清液稀释10倍进行液相分析。液相条件为色谱柱为Superose6(PharmaciaCo.)，流动相为50mmol/LpH7.5的磷酸缓冲液，流速0.4mL/min。
表5
“-”表示未检测到。
结果表明，本发明菌株枯草芽孢杆菌NJtech489可高效利用木糖进行自身生长，但所得代谢产物surfactin和聚谷氨酸几乎没有，原因具体不明，值得进一步探索。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一株高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株
<130>xb15121101
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1419
<212>DNA
<213>BacillusacidopullulyticusNJtech489
<400>1
tgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaa60
cacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccgga120
tggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatg180
gacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagc240
cgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggag300
gcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtg360
atgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatag420
ggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcg480
gtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggt540
ttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggga600
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Claims (3)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）NJtech489，保藏于中国典型微生物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2015561。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该菌株能够同时高产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
3.一种同时生产脂肽抗生素Surfactin和聚-γ-谷氨酸的方法，其特征在于，发酵培养如权利要求1所述的菌株，分离发酵液和菌体，从发酵液中分别纯化获取Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
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