BG100105A

BG100105A - Жизнеспособни бактерии

Info

Publication number: BG100105A
Application number: BG100105A
Authority: BG
Inventors: David Rodham; John Cantwell; Graham Arnold; Ivor Brown; Nigel Bishop; Malcolm Houghton; Michael Ricks; John Waterman; Francis Tierney; Peter Dolton
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 1996-12-31
Also published as: AU684072B2; JPH08509374A; HUT72846A; EP0696316A1; GB9308734D0; WO1994025564A1; AU6510494A; BR9406488A; KR960701986A; CZ280595A3; HU9503064D0; SK134695A3; CN1121731A; NZ263867A; GB9406552D0; CA2161220A1; PL311297A1

Abstract

Изобретението се отнася до микробни клетки, стабилизирани за съхранение под формата на сух състав исуспендирани в разрушен матрикс. Съставът се получава чрез смесване на микробните клетки, например грамотрицателни бактерийни клетки на рsеudомоnаs fluоrеsсеns, с воден състав на база полихидроксисъединение, за предпочитане захарид, от който се получава матрикс. Сместа се суши в условия, при коитосе получава вискозно разтичане на полихидроксисъединението и матрицата се разрушава, без да уврежда прекомерно клетките. За предпочитане е температурата на стъкления преход на матрикса да е над температурата, при която се съхранява съставът.

Description

Изобретението се отнася до метод за получаване на състави съдържащи изсушени микробни клетки в стазисно състояние, до такива състави и до живи култури получени от тях.

Известен е проблема за съхраняване на жизнеспособни култури. U.S. 3 897 307 описва (I) използването на комбинация οι аскорбашо съединение и глутамат или аспартат като стабилизатор за бактериини клети произвеждащи млечна киселина и (ii) използва!ιοιο на някой захари, по-специално на инозитол при концентрация на разтвора 25 мг/мн, като криопрогектант при сушене чрез замразяване на такива бамерннни клетки.

Mugnier et al., Applied and Environmental Microbiology, 1985, pp 108 114 описва използването на полизахариден гел в комбинация с някой хрщниеини вещества, например С_1Чи С_{6 р} съединения, каю мшрица за сушени чрез замразяване бактериини клетки. Ние открихме, че тел обрл.тут.ащиге понизахариди не се разрушават при сушене чрез зам| tauiieiiio.

» ·

Redway el al , Cryobiology, 1974, Vol.11, 73 - 79 изследва някой монозахариди (концентрации до 150 мг/2 мл проба) и сродни съединения кшо среда за дългосрочно преживяване на изсушени чрез замразяване бактерии.

Ceia открихме, че Koiaro микробни клечки се суспендира! в излетна матрица, както по-долу е описано, и се изсушат при определени условия, тяхната краткосрочна жизнеспособност се подобрява и когато тези изсушени системи се съхранят и отново оводпяг при определени условия, по-долу описани, дълюсрочната жизнеспособност на микробните клетки се подобрява.

Освен това, изненадващо открихме, че разрушашничо на ма фината в която микробните клетки са суспендирани, не води до т рн ι и.'.¹11 'нйна жизнеш юсобнос ι.

Съгласно първият аспект на настоящето изобретение осигурен е стабилизиран изсушен състав съдържащ микробни клетки ъ стазисно съсι о.яι is io cyci ιοί и inpai in в разрушен ia Mai рица.

11од ,,стабилизиран“ ние имаме предвид, че деградирането на микробниιе клещи е намалено (юва деградиране би довело да загуба на втзстановими жизнеспособни клетки).

Под „стазисно състояние“ ние подразбираме, че кленчпе но ме1аболизират, не се делят и не нарастват (но са вьзстановими ако се подложат на подходящо обработване).

Под „възсгаповими“ ние имаме предвид клетки, който при поставяне в подходящи условия (i.e. рехидратиране и изючник на храни ι опни вещества) са способни на растеж и делене.

Под „жизнеспособни клетки¹¹ ние имаме предвид клечки, който при поставяне в подходящи условия (т е рехидратиране и източник на храна) са способни на растеж и делене.

Под „разрушаване ние имаме предвид • · · · * · · ··· · ·» „ • * · * · · ·е··· *· ·· ·· ·· · · t ···· * · · «, ·· · · ··· ·· ·· ··· (I) матрицата се е свила и е станала по-малко порьозна като гюзпопяпа малко проникване на нискомолекулни дифундиращи видове в ма I [ ли io I а, например тя абсорбира малко водни пари при излагане на влажен въздух, и/или iii) матрицата е била подложена на температура над 1ази на cn.KJK’iinn й преход (lg) така че в poTynim ее е нолучино вискозно разтичано, което води до значително намаляване на съотношението на повърхностната площ/обем и до капсулиране на клетките в нископорьозно защитно покритие.

Съгласно втория аспект на настоящето изобретение, осигурен е метод за попучамане на стабилизиран изсушен състав съдържащ микробни клетки в стазисно състояние суспендирани в матрицата, който метод включва етапите на:

А смесване на микробните клетки с воден състав съдържащ материала от който ще се гюлучи матрицата;

Б. сушене на сместа при условия такива, че да се получи вискозно течене на материала и матрицата да се разруши, но да не се увредя! прекомерно клетките.

За предпочитане е състава получен в етап Б да се свхрани при гем! icpaiypa по ниска от Тд на матрицата, т.е. състава има Тд над предвидената темперен ура за съхраняването му.

В съответствие с това, състава получен в етап Б се предпочита да се изсуши по нататък, така нареченото „вторично сушене“, за да се повиши Тд на матрицата с оглед съставът да е стабилен при но широки параметри на условията на съхранение, т.е. да може да се съхранява при но високи температури.

Микробнше клетки от коиго е съставен стабилизирания изсушен съснав ciTjiacHO изобретението са с предпочитание бак1ерпппи клечки. Нрн В'..-.* юва, ние не* изключваме възможното ia за изпол ъано и на друш микробни клетки например гъби, дрожди и т τι. Koi am микробните • · • · ·*·· ‘ _е•·4 ·· ··· ·· ·· ··· клетки са бактериини клетки, те за предпочитане е да са Грамотрицателни бактериини клетки, въпреки че не изключваме и възможността клетките да бъдат и Грам-положителни. Като примери на ткива I рам отрицателни клетки трябва между npyioio да се споменат Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli и родствени на 11lizosphere6a κι ί'ρτιιι

Концентрацията на микробните клетки в матрицата получена в етап А в метода съгласно настоящето изобретение е между Ι0⁴ /мл и 10^,3/мп и за предпочитане между 1О¹⁰ /мл и 10^и/мл.

t

Веществото, което се смесва с микробните клетки в етап А на метода <'Ъ1ляено изобретението е попихидрокси съединение, например полипи, като манитол, инозитол, сорбитол, галактитол или за I ip·:щ| το¹ τι 11 ai ie в bi j юхидрат, най- добре захарид.

Когато веществото е захарид, то може да бъде дизахарид, тризахарид, опигозахарид, но се предпочита монозахарид. Като пример на монозахарид трябва да се имат предвид между друюю хексози, например' рамноза, ксилоза, фрукгоза, глюкоза, маноза и галактоза. Като примери на дизахариди могат да се споменат ме: л.у другото мангова, лактоза, трехалоза и захароза. Като пример на тризахарид мотат да се споменат рафиноза. Като представи! ели на олигозахариди1е могат да се споменат машодекстримите.

Концентрацията на попихидрокси съединението използвано в сместа в етап А на процеса съгласно изобретението е между 10 мг/10¹⁰и IOOO мт/ю'° клетки и за предпочитане между 200 мт/ю'° клетки и 400 мг/10¹⁰ клетки. Опитен специалист чрез експериментиране ще може да намери концентрацията при която може да се получи разрушена матрица от дадено попихидрокси съединение. Например, ние открихме че инозитол има оптимална концентрация приоколо 45 мг/мл, при концентрация над 60 мг/мл гой причинява масивни увреждания на клетките, и не се разрушава при концентрация под 25 мг/мл • · • ·

Някой от нолихидрокси съединенията проявяват защитни свойства при широк диапазон от концентрации. При някой други, над критичната концентрация, която изглежда е свързана с разтворимостia на нолихидрокси съединението във водната среда, се проявява пагубен еф'1· i.

И юбрсίeihtoio по нататък е илюстрирано и ноягяичю чрея придружаващите го чертежи, въз основа на примери на състави съгласно изобретението.

Н чертежите:

Фигура 1 илюстрира под формата на графика промените в жизнеспособността на Pseudomonas fluorescens с различни концентрации инозигол (добвка), когато е сушен от вода или от 0.0-1 М ма1нез1юв сулфа! чрез замразяване. Вертикалното ос представлява жизтижноеобността в части на билион (т.е. 1Е + 09 = 10⁹ ppb, IE + 08 - ю ppb, ht.ii.), а хоризонталната ос представлява концентрацията на добавкато в милшрами за проба. Черните квадрати в нопото на графит а ί а са за инозитол в магнезиев сулфат, а кръгчетата в полето са за инези1оп във вода фтиури 2 до 1 илюстрират под формата на графика промените в жизнеспособността на изсушен чрез замразяване Pseudomonas lluorescens с различни концентрации от различни монозахариди. Вертикалната ос представлява жизнеспособността в части на билион или в билиони (т.е. 1Е Т 0 - 1 билион, 5Е - 1 = 0.5 билиона, 2Е -1—0.2 билиона и ги.) а хоризонталната ос представлява захарните концентрации в милиграми за проба. Илюстрираните монозахариди са:

Фигура 2 толакгоза фигура 5 ксилоза

Фигура 3 фруктова фигура 6 рамноза фигура Ί глюкоза фитура 7 маноза фитура 8 илюстрира под формато на трафика промените в скорост то на смъртност на клетките (кЦ по отношение на Гд на • · • · ·

() мафнцпга и премените на 1д при относиюлна влажни>а. Лявата вершт.ална ос преде 1авлява К|, дясната вертикална ос нр( лтлавлява Гд (” (.;) и хоризошапната ос представлява огноси1елна1а нла khoci (%). Черпин·· KBajiparicia върху |рафикпта свързани е шпица ли:г.и, показва! титт ciiiiaia (К|) на смьр1носг на клещите, а ромблекна вързани с ίipr-t-b,Ήπια линия показват температурата на стъклен преход (lg).

чертежите, жизнеспособността е изразена като число на жизнеспособни бактерии за 10^ч жизнеспособни бактерии в ори,иннлнаш суспензия, т.е. то представлява броя бактерии, които преживяват от всеки един билион бактерии, коию са били жизнеспособни в началото. То е представено като части на билион ж.иав;jкюобност (ppb) или 10⁹ ppb е еквивалентно на 100 % нрекинчване и 10 е равно на 10 % преживяване и кн.

От фигура I се вижда, че при ниските инозигодни концентрации жизнеспособността на клетките се поддържа, докато при по-високи конце111рации, например по-високи от 100 mi/проба (еквивалетно на 50 μι/μπ), жизнеспособността на клетките бързо намалява.

От фигури <’ до 7 може да се види, че известни монозахариди защшавя! клетките от увреждане при ниски концентрации, например по-малки от 10 мг/проба (равна на 5 мг/мл) и че защитата практически се поддържа при високи концентрации, например около 400 мг/мл (равна на 130 мг/мп)

От фигура 8 може да се види, че когато Тд падне под ίом1 ppaiypaiа на съхранение (представена с най lopnaia хоризошална линия при 21 - 22° 0), скоростта на смъртност на клетките (к₍) зпачи1слно се увеличава, с което се илюстрира важността от поддържане на стъкловидно състояние при съхранението.

Концентрацията при която матрицата е ефективна, т.е. тя се разрушава без прекомерно да се разрушават клеткию, зависи от редици фактори, включително между другото οι обемнаця фракция на *· 7 *’ ..... .....

клетките в суспензията в етап А; от присъщата (свойствена) температура на стъклен преход на полихидрокси съединението; от промени!е в температурата на стъклен преход на матрицата като функция на съдържанието на вода в поя и от температура!а до която Maipnunia е изложена през време на и след изсушаваното чрез замръзване

Трябва да се подразбира че полихидрокси съединението може да действа като (I) крио-защитник при ниска температура, по-специално срещу увреждане от ледени частички през време на сушенето чрез замразяване и/или (II) като лио-защитник, който защитава срещу увреждане дължащо се на зшуба на вода през време на сушене и/или съхранение и/или (III) като хранителен източник при възстановяване на клет кит е.

Микробните клетки, които се използват в метода съгласно изобретението, могат да се развиват в обичайна храни!елна среда, например хранителен бульон или триптон соев бульон. 1е μοιήι да се събера! вьв всяка удобна фаза на растеж, за предпочитане в ранната стационарна фаза.

1ака например, култура се развива в или на подходяша среда, например течни или твърди плочки, за да се получи желаната клетъчна κυιιΐΗ'ΗΗрадия. Kjioikhio се изолират, обикновено чрез ценιρυψγιпране. Ίο го суспендират наново във водна среда съдържаща вепта-iRo, което що образува матрицата и евентуално още и други добавки, както се сном-’нава но надолу.

Предпочита се, микробните клетки използвани в метода на изоОреизниею да се изолира! οι средата в която се р;ι ιητιη.ίι, да се cyciif’H,мирят наново в разтвор съдържащ полихидрокси οί единение, подходящи добавки и т.н. и да се сушат. При това, ние ни изключваме възможнос!ia полихидрокси съединението и подходящото досавки и ι.ιι.

• · · ·· к*· ··· ·· .. ...

да се прибавят към клетките в средата в която се развиват и получената смес да се суши.

Koiaro микробните клетки се суспендират наново, те се рссуспепдират в подхоД/Яща водна среда, например воден раелвор на машелнев сулфат, или за предпочитане вода, съдържаща ноннхидрокси съединението.

Сушенето в етап Б на метода съгласно изобретението се провежда например чрез изпарение, вакуумно сушене, сушене чрез разпръскване, сушене на въздуха или за предпочитане сушене чрез замразяване.

Както вече беше уточнено, съществено е да се постите вискозно разтичано поне в етапа па сушене, етапа Б, или в койю и да е ιιο<;Ηΐ·,'ν··;ιιιι eian.

ί ь.икновенг) съдържанието на лода в сухия състав получен в етан Б е по малко от 15 % т/т.

Когато при етапа Б се използва сушене чрез замразяване, съставът обикновено съдържа една или повече подходящи добавки. Като примери на подходящи добавки могат да се споменат между другото крио протектанти, например захари или полимерни вещества, например полгшинилалкохол, поливинилпиролидон; лио протекаaiпи, като например захари или полимерни вещества, например поливинипапкохол, полиегиленгликол; или за ι р ж'*д| точи гане антиоксидапти или така наречените погенциатори, например дскорбат или 1пугама1, Не се изключва възможност та за ползване и на Hpyin добавки, например вещества придаващи обем, например крги 1а.лизнращи захари, например манитол, и регулатори на осмозата, например бетаин, уреа/триметиламино-М-оксид, пропин, саркозин.

Изобретението се илюстрира по-добре с помощта на следните примери • · * • « * 4 · · t -«.»· * * * · · · · · ··»* •*·· . . „, ·· I)·· ··· ·· ·····

Примери 1-6

1ези примери илюстрират състави сь|ласно naoCppienHeiO в коик» метрицата се състои ог рамноза.

Peeiidomonas fluorescent се култивира в стандарта среда (двойно усилен хранителен бульон) и събирането на клетките се nani.piuna r ранна стационарна фаза чрез цетрофу! иране Концет11раιι,ι от клетки се суспендира наново в стерилна вода и /(остатъчно коничесчво сн авгоклавно шерилизиран, концентриран разтвор на рамноза се прибавя за да се получат приблизително 200 равни чаши с крайна концентрация 200 мг захар за 2 х 10¹⁰ клетки в общ обем от 4 мл Rona r 5 мл опи шишета за сушене чрез замразяване.

Шишетата се зареждат в температурно контролирани полици на anapai за сушене чрез замразяване и температурата на полиците се понижава до -30° С, при коего съдържанието на шишетата се замръзва като температурата им спада до -28° С до -30° С за период ог два часа. Ирина! а се вакуум и в продължение на 48 часа се извършва първичното сушене. 1емпературата на полиците се повишава до 0° С и се оставя да се извърши вгоричною сушени в продължение на 24 часа. Шишетата се оставя! да се затоплят до тайна температура и се запечата! под вакуум преди изваждането им от апарата за сушене чрез замразяване.

Шишета!а се съхраняват при 4° С под вакуум (пример I) или на въздух с контролирана влажност при 21° С (примери 2 - 6)

Пробите се овлажняват отново в стелирпа вода и сс определя броя па жизнеспособните клетки чрез серийно разреждане гшв сода и последващо посяване върху растежна среда на Кинг. Броя н колонииобрачунащите единици (cfu) върху плочите с най високо ра ч -кдане се ижетплю за изчисляване на броя на бактериинню клеп е жт единица обем преживяли сушенето чрез замразяване и условията па сьхрапопие.

I leiюсредсmenu след сушенето чрез замразяване жизнеспособността на клетките е 3 х 10^в ррб • · • · · · • ·

Габлица 1

ND - не е определяна

СИ - сравнителен опш без да има рамноза.

От таОпица I се вижда, че присъствието на рамнозна матрица подобрши значително жизнеспособността на бактериите.

ί’езулiaiше от съхраняването на бактерии при 21° С в камера с контролирана влажност са дадени на таблица 2.

Таблица 2

11ример No	Относителна	Жизнеспособност (ppb) след съхраняване
	влажност	13 дни	27 дни	34 дни
о	(Rl I %) I	8 х 10'	........ 3 х I0⁷	4 х I0⁷
к i	4	3 х 10^z	7 X 10''	2 х 10⁷
4	9	9 х 10'	5 х Ю⁷	4 х Ю⁷
	23	4 х 10⁷	4 х 10''	8х 10*’
6	44	3 х 10^г	1 х I0⁷	3 х Ю’’
	1	10³

G12 =- сравнителен опиг без наличиею на рамноза.

Οι таблица 2 се вижда, че присъствието на захар значително увеличава жизнеспособност^, дори при ниска RH, т.е пример 2 сравнен с СΙ2.

Примери 7 Ι0

1ези примери илюстрират състави съгласие нас ι оящет о н юирстоние в които матрицата се състои οι рамноза и машсзисв ονιιφπι ! ia'ii-nibT па рабош от примерите 1 - 6 се повтаря и изкш-.; тшпю па н>ва, ч(? концен1ра1а от клетки се суспендира повторна н 0.04 М ρηπίΗορ па магнезиев сулфш вместо в стерилна вода и сн<-д юна се прибавя разтвора па рамноза.

Жизнеспособността на клетките непосредствено след изсушаването чрез замразяване е 5 х 10⁸.

Изсушените чрез замразяване клетки се съхраняват при различни температури за различен период от време показани на таблица 3

Таблица 3

Пример	Температура	Жизнеспособност	(ppb) след дни
No	на съхрапе	50	100	175	365
	ние (° С)
7	-20	8 х 10°	5 х Ю”	5 х 10”	5 X 10”
8	4	2 х 10*	2 х 10*	Ϊ х Ϊ0”
9	15	2х И)⁸	ί х ю	5 X 10'
10	20	2 х 10⁸	2 х 10⁷

От таблица з може да се види че формулировката осигурява съществена защита в широк интервал от температури.

Примери 11 15

Iсзп примери илюстрират състави съгласно изобретението при котло в матрицата присъстват натриев аскорбаг и натриев niyiaMar.

Повтаря се начина на работа or примерите 1 - 6 с изключение на това, че към повторно суспептиданите във вода и рамноза клетки се прибавя! водни разтвори на натриев аскорбаг и натриев 1лун!маг.

Жизнеспособността на клетките непосредствено . след изсушаването чрез замразяване е 2 х 10⁸ррЬ.

Пробите са съхранявани във влажен въздух при 21° С.

(аблица 4

Пример No	(Сноситепна	Жизнеспособност (ppb) след	ig
	влажнеел	съхранявано за	^(,с
	(RH %)	34 дни	I28 днн
I)	6	1 х 10^в	1 х 10^,!	25
“........12 '..........	14....................	1 х 10^в	1 х 10^к	24
13	30	ϊ X 10°	4 х 10'	14
и	40	. 9 X 10'' Зх 10'...............	5 х 10^в	12
15	53	3 х 10'	8

Or примери I I и 12 в 1аблица 4 може да се види, че съхраняване на cyxiiie клетки при reMiiepaiypn под Тд на маιридала тнабилизира клет кн i е за ι |родьлжи ι елен период.

Pe.'iyniainre показват, че комбинацията ог разрушена матрица в стъкловидно състояние и присъствието на аитиоксидат осигурява мацища, кояю може да слабнлизира жизнеспособния клечки за Г1роцнн<и1 елен период от време при сравнително супенι външни условил.

Пример 16 г полет от Pseudomonas fluorescens клетки, яделен от купгураннага среда чрез цегрофугиране и съдържаш, 5 х 10^мжизнеспособни клетки, се смесва с 14 г малтодекстрин (Глуцтекс ΙΤ19) с нцдовска чиси)та и с 1.6 г натриев аскорбат и продукпл, първоначално при тайна температура, се суши под вакуум, при което нл1Ь')р‘’ил|;1 вода co кондензира в леден уловител, поддържан ipn но’’ (X

Сушенето приключва слсд приблизително 18 часа , I ί р 03 което време шжуумьг е I мбар.

• · · · * · * • · · · ·»· ·· · · · · · в

Проби отново оводнени с чиста вода и поставени в хранителен атар обикновено показват 50 до 90 % възстановяване на жизнеспособни! е клетки.

Продуктите получени по този метод се явяват каю разрушени аморфни матрици със стъклен преход надвишаващ 20° С (конно проби:е < · ιι;ιμιπ;ΐι на С1;1нларнта iiaOopaiopi-ia огтюсиюлна клатило riaieiiiHM претенции

I Бпабинизиран сух състав съдържащ микробни клечки в ciasHoiio съсюяние суспендирани в разрушена матрица, ? Състав съгласно претенция 1, в койю микробните клетки са бактерии! in клетки.

3. Състав съгласно пре1енция 2, в който бактериините клетки са Грам-отрицателни бактериини клетки.

4. Състав съгласно претенция 3, в който Грам-отрицателните бактериини клети са Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli и родшвени на rhizosphere бактерии.

5. Меюд за получаване на стабилизиран изсушен състав съдържащ микробни клетки в стазисно състояние суспендирано в Maiprma, койю меюд включва етапите на:

А. смесване на микробните клетки с воден CbciaR съдържащ материала от койю ще се получи матрицата;

Б. сушене на сместа при такива условия че да се получи вискозно разтичане на материала и матрицата да се разруши, без при това да се увреждат прекомерно клетките.

6. Метод съгласно претенция 5, при койю сътавъг получен в eian Б се суши по-нататък за да се повиши температурата на стъкловиден преход на матрицата, така че съставът се стабилизира в по широки ipaiiHiiii οι условия на съхранение.

ϊ. Меюд съгласно претенция 5, при койю конценц ήηηηιη па Μ!ικ| н >б| Ив е клетки в сместа получена в етап А е между 1о ',^!:ж и !0^{| !}/мл.

8. Метод съгласно претенция 7, при които κοιιιтеч11раци:на на клепашо е между 1О^1о/мл и 10^н/мл.

· • · · · • · | /· · · · · » * « · * ·

Метод съгласно претенция 5, при който вещество го което се смесвл с микробни!е K.neiKH в етагт А на метода е полнхидрокси съединение.

io. Мегод съгласно претенция 9, при който поштхпдрокси сг.единениего е монозахарид.

II Метод cbinaciTO претенция 9 при κοιϊιο концснпюцижа на полнхидрокси съединението използвано в сместа в етап Λ е между 10 мг/1о'° и 1000 мг/Ю¹⁰ клетки.

12. Мегод съгласно претенция 11, в кой го концешрацнята на п<типлндрокси съединението е между 200 мг/10^И) клегки и Ί00 μι/ΙΟ¹⁰Ю1Р1КИ

И. Състав получен съгласно претенция 5, който има температура па CH4JICH преход над гази предвидена за съхранение.

• · · · · · · · ·

ПРЕРАБОТЕНИ СТРАНИЦИ В ОТГОВОР НА ДОКЛАДА ОТ МПЕ

Claims

Паюнтни претенции

1. Стабилизиран сух състав съдържащ микробни клетки в сгазисно състояние суспендирани в разрушена матрица, в който бакιорнициiе клетки са I рам oipnuaieniiM.

? Състав съгласно претенция 1, в който Грам-отрицателните бакгериини клежи са Pseudomonas fluorescent, Escherichia coli и родствени на rhizosphere- бактерии.
3. Метод за получаване на стабилизиран изсушен състав съдържащ микробни клетки в които бакгериините клечки са Грам OI|)И1ро’лни бактериипи клетки, в сгазисно състояние суспендирано в MOipiiH'T. кой io меюд включва eiaiiHie на:

Λ смесване на микробните клетки с воден състав съдържащ материала от койю ще се получи матрицата;

Б сушене на сместа при такива условия че да се получи вшжозно разшчапе на материала и матрицата да се разруши, без при това да се увреждат прекомерно клетките.
4 Меюд съгласно претенция 3, при който съставът получен в етап Б ек < ушн по TiaiaibK за. да се повиши tomiiepaιурата па en.Kiiommcii преход на мафицена, ока че сьаавът се стабилизира в нотпироки 1|Х1!1||Ц|| οι условил на съхранение >> Метод сшласно претенция 3, при който концен|р;.щияга на Mi-iKpoOiitne клетки в смеша получена в етап А е между 10^-1/мл и 10^н/мл.

о. Метод cbinacHO претенция 5, при които концешрацияга на «лошите е между 10^|о/мп и 10^и/мл / Меюд сь|ласно претенция 3, при които веществото което се смесва с микробните клетки в етап А на метода е полихидрокси сьединение в Метод cbniacuo претенция 7, при κοικο п< шии у ιj юги < ·<?,·,jи? mi 1«·ιο е монозахарид.
9. Метод съгласно претенция 7 при които κοιιιιοίι»| οιтяιа на полихндрокси съединението използвано в смета в eian Λ о между Ю mi/Io'¹’ и 1000 Mi/ίο¹⁰ клети.

1° Метод съгласно претенция 9, в които конн/чнрацият на полихидрокси съединението е между 200 мг/1О¹⁰ клетки и 100 мг/Ю¹⁰клети.

II. Състав получен съгласно претенция 3, който има температура на оня лен проход над тази предвидена за съхранение.