CN112662560A - 适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂 - Google Patents

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杨莉
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Abstract

本发明涉及微生物领域,具体而言,涉及一种适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:脱脂乳粉8%~13%、蔗糖8%~13%、抗环血酸和/或其盐0.3%~1%。上述成分互相配合,能够有效提高冷冻干燥后的脑膜炎球菌及肺炎球菌的活菌率。

Description

适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体而言,涉及一种适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂。
背景技术
微生物个体微小,代谢活跃,生长繁殖块,如果保存不妥容易发生变异,或被其他微生物污染,甚至导致细胞死亡。因此,在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。目前微生物保藏技术主要分为四类:冷冻法、干燥法、传代法和冷冻干燥法,其原理主要是运用隔绝空气、低温和干燥的手段,使微生物的代谢处于最不活跃状态,其生命活动始终处于半永久性的休眠状态,以达到保藏的目的。当今公认的最安全、最可靠的并且能够长期保存微生物的方法是真空冷冻干燥法,该方法适用于大多数微生物的保藏。真空冷冻干燥法保藏适用范围广,只有一些不产孢子只产菌丝体的真菌不适合采用外该方法外,其它微生物如病毒、细菌等均能采用该方法。真空冷冻干燥法基本原理是在低温下微生物用冻干保护剂混合并冻结至共晶点以下,冰晶在适当的真空环境中升华干燥,然后再进行解吸干燥,部分结合水会被除去,最终得到干燥的微生物产品,对其进行真空熔封,最后在低温及避光环境下保藏。
冻干保护剂分为了小分子冻干保护剂(如缓冲盐类、醇类和低聚糖类)以及大分子冻干保护剂(如多糖类、多肽类和蛋白质类)。小分子冻干保护剂,分子结构中含有氢键,并且具有很强的亲水性,在冷冻及干燥过程中,可与微生物的蛋白质极性基团或细胞膜磷脂中的磷酸基团形成氢键,从而保护细胞膜和蛋白质功能与结构的完整性。然而大分子冻干保护剂“包裹”保护微生物菌体本生,并且促进了低分子冻干保护剂的发挥。保护剂类型的选择取决于微生物的生物学特性,蔗糖、血清、脱脂牛乳等既是很好的低温保护剂又是有效的冻干保护剂。
目前,很少有适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂的研究,大多数的冻干保护剂还是适用于传统的微生物。因此,如何提高脑膜炎球菌及肺炎球菌冻干后的保存时间、存活率及稳定性等指标,以获得更高的综合性能的菌种来满足大规模的发酵生产需求是亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术中的上述问题,本发明提供了一种适用于脑膜炎球菌及肺炎球菌的冻干保护剂,其活性成分为脱脂乳粉、蔗糖和抗环血酸和/或其盐。
本发明提供了冻干保护剂的组合,其在冷冻干燥(例如真空冷冻干燥)时获得脑膜炎球菌和/或肺炎球菌的高存活率。为了最大限度地提高存活率,在冷冻干燥前将冷冻干燥保护剂组合物添加到细菌中。具体地,本发明还涉及冻干保护剂的用途,其用于增加经冷冻干燥后的细菌的存活力,以及改善冷冻干燥细菌在低温下的长期稳定性。
本发明的第一方面涉及一种冻干保护剂,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉8%~13%、蔗糖8%~13%、抗环血酸和/或其盐0.3%~1%。
可选的,如上所述的冻干保护剂,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~12%、蔗糖9%~12%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.8%。
可选的,如上所述的冻干保护剂,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~11%、蔗糖9%~11%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.7%。
可选的,如上所述的冻干保护剂,所述抗环血酸盐为L-抗坏血酸钠。
可选的,如上所述的冻干保护剂,所述溶液的溶剂为水。
根据本发明的第二方面,还涉及如上所述的冻干保护剂的制备方法,包括:
将灭菌后的各组分混合。
可选的,如上所述的方法,所述脱脂乳粉的灭菌方法为先配制为溶液后高压蒸气灭菌,灭菌条件为110℃~120℃处理10min~20min。
可选的,如上所述的方法,所述抗环血酸和/或其盐、所述蔗糖的灭菌方法为先配制为溶液后过滤除菌。
根据本发明的第三方面,涉及一种微生物冻干粉的制备方法,包括:
将所述微生物与如上所述的冻干保护剂混合后再冻干;
所述微生物为脑膜炎球菌和/或肺炎球菌。
可选的,如上所述的方法,所述冻干的方法包括:
先-70℃~-90℃冷冻2小时以上,再真空冷冻干燥。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
脱脂奶粉在干燥时,乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜保护层,经过“包裹”作用保护菌体。蔗糖能在冷冻干燥过程中能够取代水分子以及细胞膜中的磷酸基团或者能够与菌体中的蛋白质极性基团形成氢键,达到保护细胞膜以及蛋白质在冷冻干燥过程中免受损伤。蔗糖还能够通过抑制质膜的相变,显著改变对微生物细胞的冻干脱水现象,即在微生物失水时,进行水置换作用。抗坏血酸作为抗氧化剂,在冷冻及干燥过程中对菌体蛋白起到一定的保护作用。上述成分互相配合,能够有效提高冷冻干燥后的脑膜炎球菌及肺炎球菌的活菌率。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词,其是包容性或开放式的,不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数,以及所引述的端点。
当描述一个可测量的值,例如参数,量,时间期限等时,本文中所使用的术语“约”意欲涵盖与指定值相差+/-20%或更少、优选+/-10%或更少、更优选+/-5%或更少、更优选+/-1%或更少,更优选+/-0.1%或更少的变化,此类变化适宜在所披露的发明中使用。
本发明的第一方面涉及一种冻干保护剂,其包含脱脂乳粉、蔗糖和抗环血酸和/或其盐。
以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉8%~13%、蔗糖8%~13%、抗环血酸和/或其盐0.3%~1%。
在本发明中,术语“冻干”和“冷冻干燥”在本文中可互换使用和是指通过首先冷冻和然后减少周围的压力以允许物质中的冷冻的水升华而脱水的物质。物料可先在冷冻装置内冷冻,再进行干燥。但也可直接在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。
在本发明中,术语“工作浓度”用于限定所述冻干保护剂在处理微生物时主要活性组分的比例,所述冻干保护剂中活性组分的浓度可以为工作浓度,也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液)。
在一些实施方式中,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~12%、蔗糖9%~12%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.8%。
在一些实施方式中,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~11%、蔗糖9%~11%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.7%。
脱脂奶粉在干燥时,乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜保护层,经过“包裹”作用保护菌体,脱脂奶粉的含量还可以为8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%。蔗糖能在冷冻干燥过程中能够取代水分子以及细胞膜中的磷酸基团或者能够与菌体中的蛋白质极性基团形成氢键,达到保护细胞膜以及蛋白质在冷冻干燥过程中免受损伤。蔗糖还能够通过抑制质膜的相变,显著改变对微生物细胞的冻干脱水现象,即在微生物失水时,进行水置换作用。蔗糖的含量还可以为8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、17%、18%、19%。抗环血酸和/或其盐作为抗氧化剂,在冷冻及干燥过程中对菌体蛋白起到一定的保护作用。抗环血酸和/或其盐的含量还可以为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%。上述成分互相配合,能够有效提高冷冻干燥后的脑膜炎球菌及肺炎球菌的活菌率。
就保护体系而言,保护剂的浓度会影响冻干后细胞存活率。若保护剂太少,会有大量细胞膜裸露在介质中,在冻干时就可能改变细胞通透性,不能起到保护菌体的作用;反之保护剂太多,细胞的渗透压和通透性也会受影响。
在一些实施方式中,所述抗环血酸和/或其盐为L-抗坏血酸及其盐。
在一些实施方式中,抗坏血酸盐可以为抗坏血酸钠或者抗坏血酸钾。
在一些实施方式中,所述溶液的溶剂为水,例如去离子水,无菌水。
任选地,冻干保护剂中还可以含有缓冲物质,本文使用的术语“缓冲物质”指水溶液或组合物,当酸或碱加入该溶液或组合物中时,所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此,显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反,它们一般能够维持在特定范围内的pH,例如pH 7~pH 9。一般地,缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如,Mohan,Buffers,A guide for the preparation and useof buffers in biological systems,CALBIOCHEM,1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
根据本发明的第二方面,还涉及如上所述的冻干保护剂的制备方法,包括:
将灭菌后的各组分混合。
在一些实施方式中,所述脱脂乳粉的灭菌方法为高压蒸气灭菌,灭菌条件为110℃~120℃处理10min~20min;灭菌条件还可以为,例如,115℃处理13min。
在一些实施方式中,所述抗环血酸和/或其盐、所述蔗糖的灭菌方法为过滤除菌。
在一些实施方式中,过滤滤器的滤孔为0.20μm~0.24μm,例如0.21μm、0.22μm、0.23μm。
根据本发明的第三方面,涉及一种微生物冻干粉的制备方法,所述方法包括:
将所述微生物与如上所述的冻干保护剂混合后再冻干;
所述微生物为脑膜炎球菌和/或肺炎球菌。
在将所述微生物与如上所述的冻干保护剂混合之前
脑膜炎球菌学名是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis),其抵抗力弱,对寒冷、日光、热力、干燥、紫外线及一般消毒剂均敏感。对磺胺、青霉素、链毒素、金霉素均敏感,但容易产生耐药性。根据脑膜炎球菌表面荚膜多糖抗原的不同,分为多个血清群。在一些实施方式中,所述脑膜炎球菌的血清型选自A群、B群、C群、D群、Y群、W135群、29-E群、H群、I群、K群、L群、X群及Z群中的一种或多种。
肺炎球菌,又称为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)致病力仅次于金黄色葡萄球菌。不同的是,到目前为止,肺炎链球菌极少对青霉素类抗生素产生耐药性。肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性,是肺炎链球菌分型的依据。此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病。
在一些实施方式中,所述冻干的方法包括:
先-70℃~-90℃冷冻2小时以上,再真空冷冻干燥。
冷冻的时间可以为4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时或者更多。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明,用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导,随后的定义用于更好地理解本发明的教导。
实施例
本发明实施例中所采用的冻干保护剂的配制方法为:
1.配制:
先将冻干保护剂分别按照以上配方溶解于纯化水中,分别用玻璃棒搅拌各成分,然后分别定容。冻干保护剂的各成分分别按照以下配方配制:
成分 含量(g/L)
脱脂乳粉 200.0g
纯化水 1L
成分 含量(g/L)
蔗糖 500.0g
纯化水 1L
成分 含量(g/L)
L(+)-抗坏血酸钠 50g
纯化水 100ml
2.分装:
将定容后的冻干保护剂分别分装到三角瓶中,分别扎上8层纱布和牛皮纸,用棉线扎紧。
3.灭菌:
将分装好的终浓度为20%脱脂乳粉的三角瓶放置于高压蒸汽灭菌锅中,115℃,灭菌13min。将分装好的终浓度为50%蔗糖的三角瓶和分装好的终浓度为50%抗坏血酸钠的三角瓶在超净工作台中,用0.22μm的滤器以过滤除菌的方式分装到已灭菌的250mL空三角瓶中。
4.保存:
将灭菌完成后的20%脱脂乳粉三角瓶放置于室温,待培养基温度冷却到室温后,与50%蔗糖和50%抗坏血酸钠三角瓶放置于2~8℃保存备用。
在配制时,将上述母液按需要稀释混合。
实施例1
在本实施例中,所采用的冻干保护剂中各成分的浓度为脱脂乳粉9%、蔗糖9%、抗环血酸钠0.5%。
取复苏1型肺炎球菌种子的血平板,用2mL液体TSB培养基洗下菌苔,混匀后用毛吸管接种至4块血平板,于35~37℃、10%CO2培养12~16小时。从4块血平板刮取菌苔至5mL液体TSB培养基,混匀后接种至2瓶75mL液体TSB培养基中,35~37℃、10%CO2静置培养3~6小时,直到OD600nm至1.0~2.0。将培养物立即转移至4个50mL无菌离心管,封口后4500g×10min离心,弃上清后用30mL~60mL冻干保护剂悬浮菌体并均匀混合后分装至菌种管,按0.25mL~0.3mL菌液分装并在管口塞无菌棉花。用8~12层纱布包裹菌种管口,置-80℃冷冻2~4小时。将分装、预冻好的菌种管,置冻干机抽真空冷冻干燥17~24小时。在生物安全柜内,将冻干菌种管连接在硅胶管上,硅胶管连接到真空泵抽真空,用高温火焰熔封法封口。
实施例2
在本实施例中,所采用的冻干保护剂中各成分的浓度为脱脂乳粉8%、蔗糖13%、抗环血酸钠0.6%。
取复苏X群脑膜炎球菌种子的血平板,刮取菌苔于2mL MVM-S/MVM-XS液体培养基,混匀后用毛细吸管接种至4块血平板,于35℃~37℃、5%CO2培养8~12小时。从4块血平板刮取菌苔至5mL MVM-S/MVM-XS液体培养基,混匀后接种至2瓶75mL MVM-S/MVM-XS液体培养基中,35℃~37℃、180rpm培养3~6小时,直到OD600nm至2.0~2.5。将培养菌液立即转移至50mL无菌离心管,封口后4500g×10min离心,弃上清后用20mL~50mL冻干保护剂悬浮菌体并均匀混合后分装至菌种管,按0.2mL~0.3mL菌液分装并在管口塞无菌脱脂棉塞。用8~12层纱布包裹菌种管口,置-80℃冷冻4~6小时。将分装、预冻好的菌种管,置冻干机抽真空冷冻干燥17~24小时。在生物安全柜内将冻干菌种管连接在硅胶管上,硅胶管连接到真空泵抽真空,用高温火焰熔封封口。
实施例3
在本实施例中,所采用的冻干保护剂中各成分的浓度为脱脂乳粉10%、蔗糖10%、抗环血酸钠0.5%。
取复苏A群脑膜炎球菌种子的血平板,刮取菌苔于2mL半综合液体培养基,混匀后用毛吸管接种至6支血琼脂斜面,置5%CO2、35℃~37℃条件下培养12~16小时。从6支血琼脂斜面刮取菌苔至5mL半综合培养基,混匀后接种至2瓶75mL半综合培养基中,35℃~37℃,180rpm摇床培养3~6小时,直到OD600nm至1.5~2.0。将培养物立即转移至4个50mL无菌离心管,封口后5000rpm×10min离心,弃上清后用30mL~60mL冻干保护剂悬浮菌体并均匀混合后分装至菌种管,按0.2mL~0.3mL菌液分装并在管口塞无菌棉花。用8~12层纱布包裹菌种管口,置-80℃冷冻12~14小时。将分装、预冻好的菌种管,置冻干机抽真空冷冻干燥17~24小时。在生物安全柜内,将冻干菌种管连接在硅胶管上,硅胶管连接到真空泵抽真空,用高温火焰熔封法封口。
实施例4
在本实施例中,所采用的冻干保护剂中各成分的浓度为脱脂乳粉10%、蔗糖10%、抗环血酸钠0.4%。
取复苏b型流感嗜血杆菌种子的巧克力斜面,刮取菌苔于2mL综合液体培养基,混匀后用毛吸管接种至6支巧克力斜面,置5%CO2、35℃~37℃条件下培养12~16小时。从6支巧克力斜面刮取菌苔至5mL综合培养基,混匀后接种至2瓶75mL综合培养基中,35℃~37℃,180rpm摇床培养3~6小时,直到OD600nm至1.5~2.0。将培养物立即转移至4个50mL无菌离心管,封口后5000rpm×10min离心,弃上清后用30mL~60mL冻干保护剂悬浮菌体并均匀混合后分装至菌种管,按0.2mL~0.3mL菌液分装并在管口塞无菌棉花。用8~12层纱布包裹菌种管口,置-80℃冷冻12~14小时。将分装、预冻好的菌种管,置冻干机抽真空冷冻干燥17~24小时。在生物安全柜内,将冻干菌种管连接在硅胶管上,硅胶管连接到真空泵抽真空,用高温火焰熔封法封口。
对比例1:冻干保护剂配方10%脱脂奶粉+0.5%抗坏血酸钠;
对比例2:冻干保护剂配方10%蔗糖+0.5%抗坏血酸钠;
对比例3:冻干保护剂配方10%蔗糖+10%脱脂奶粉;
对比例其余条件均与实施例3一致。
将实施例1至实施例4所得到的冻干菌种进行活菌计数,具体计数方法如下:
冻干前可直接用0.85%生理盐水在无菌96孔U型板上稀释。冻干后要先用0.85%生理盐水进行等量复溶,再在无菌96孔U型板上稀释。活菌计数方法:先在96孔无菌U型板上先进行100倍预稀释,用微量移液器吸取180μl生理盐水,再用微量移液器吸取20μl菌液,吹打使其充分混匀,A-H排进行5倍稀释。用微量移液器吸取160μl生理盐水,再用微量移液器从预稀释的孔中吸取40μl菌液然后充分混匀。稀释完成后,用10μl多道移液器,从各孔中取10μl液体,轻轻点样至血平板或者巧克力平板上,倾斜,使其沿平皿流动一段距离,放平,待菌液在平皿上完全吸收,盖上平皿盖,倒置培养,注意做好标记。每个平板上各列点样1次,做三次重复试验。放入温度为37℃,二氧化碳含量为5~10%的恒温箱倒置培养约10~14h,查看结果。
结果计算平均值:细菌总数CFU/mL=某一稀释度下平板上生长的平均菌落数×稀释倍数/点样体积(mL)
冻干前后活菌数比例%=冻干后/冻干前×100
表1:冻干保护剂活菌计数结果
Figure BDA0002879140630000101
Figure BDA0002879140630000111
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种冻干保护剂,其特征在于,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉8%~13%、蔗糖8%~13%、抗环血酸和/或其盐0.3%~1%。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂,其特征在于,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~12%、蔗糖9%~12%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.8%。
3.根据权利要求2所述的冻干保护剂,其特征在于,以质量百分数计,其在工作浓度下由如下活性成分组成的溶液:
脱脂乳粉9%~11%、蔗糖9%~11%、抗环血酸和/或其盐0.5%~0.7%。
4.根据权利要求1~3任一项所述的冻干保护剂,其特征在于,所述抗环血酸盐为L-抗坏血酸钠。
5.根据权利要求1~3任一项所述的冻干保护剂,其特征在于,所述溶液的溶剂为水。
6.权利要求1~5任一项所述的冻干保护剂的制备方法,其特征在于,包括:
将灭菌后的各组分混合。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述脱脂乳粉的灭菌方法为先配制为溶液后高压蒸气灭菌,灭菌条件为110℃~120℃处理10min~20min。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述抗环血酸和/或其盐、所述蔗糖的灭菌方法为先配制为溶液后过滤除菌。
9.一种微生物冻干粉的制备方法,其特征在于,包括:
将所述微生物与权利要求1~5任一项所述的冻干保护剂混合后再冻干;
所述微生物为脑膜炎球菌和/或肺炎球菌。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述冻干的方法包括:
先-70℃~-90℃冷冻2小时以上,再真空冷冻干燥。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104958759A (zh) * 2015-06-24 2015-10-07 天津康希诺生物技术有限公司 多价脑膜炎球菌制剂盒、疫苗制剂及其制备方法
CN111849781A (zh) * 2020-08-21 2020-10-30 上海荣盛生物药业有限公司 肺炎链球菌冻干保护剂

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