CN115838635B - 一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法 - Google Patents
一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs‑4菌种的长期保藏方法，涉及生物保藏技术领域，具体包括以下步骤：配制复合冷冻保护剂；制备菌体孢子悬浮液；将复合冷冻保护剂与孢子悬浮液混合后分装进安瓿管中；安瓿管预冻，再冷冻干燥；冷冻干燥后的在真空条件下熔封；熔封后放置于低温环境中保藏。本发明的菌种保藏年限可达15年，菌种活化后菌落形态与未保藏菌种一致，菌种恢复后的活性最高可达92％以上、发酵性能最高可达97％以上。恢复后的菌种在活性及发酵性能方面与未保藏的生产菌种基本相同。
Description
技术领域
本发明涉及微生物保藏技术领域，具体讲是一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法。
背景技术
冬虫夏草为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是一种传统的名贵中药材，在中国已有千年的历史。发酵虫草菌粉Cs-4为中国医学科学院药物研究所从天然冬虫夏草中分离所得的蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)经深层发酵，产物经过滤干燥制成，经研究与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，为可替代天然虫草的虫草制品。其制剂药品金水宝胶囊为国家中药一类新药，临床应用广泛。蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种被列为国家保密菌种。
菌种保藏是根据菌种的生物学特性，人为创造条件尽量降低微生物菌体的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。目前常用的菌种保藏方法有：低温定期移植法、石蜡油低温保藏法、甘油管保藏法、液氮超低温保藏法等。不同的保藏方法都有各自的优势与缺陷。发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种是一种大规模产业化生产用菌种，其菌种保藏与其他目的菌种保藏要求有所不同。发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种保藏是要使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，在长期的保藏过程中力求把菌种衰退现象推迟或减缓到最低限度。因此，为了避免由于菌种保藏导致的菌种发酵性能退化，使得产品收率及质量产生波动，降低对产品一致性造成不良影响，寻找一种适合发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种长期保藏方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法。
本发明的技术解决方案如下：
一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法，包括以下步骤：
S1：配制复合冷冻保护剂，灭菌后备用；
S2：制备菌体孢子悬浮液，并将菌体孢子悬浮液与步骤S1中的复合冷冻保护剂混合，分装入灭菌后的安瓿管中，封口；
S3：将步骤S2的安瓿管预冻，预冻后，将安瓿管进行冷冻干燥；
S4：将步骤S3的安瓿管装入多歧管，抽真空后，用火焰熔封，得到待保藏样品；
S5：将步骤S4的待保藏样品放置于低温环境中长期保藏。
进一步地，所述步骤S1中，复合冷冻保护剂为脱脂牛奶、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油中的一种或几种。
进一步地，所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液的浓度为108～1010个/ml。
进一步地，所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液与复合冷冻保护剂按体积比1:1～2混合。
进一步地，所述步骤S3中，预冻温度为-20℃～-30℃，时间10～15h；冷冻干燥温度为-40℃～-50℃，时间10～20h。
进一步地，所述步骤S5中，低温环境温度为2℃～8℃。
进一步地，所述步骤S5中，长期保藏的年限至少为15年。
本发明的有益效果是：
本发明的公开方法中的步骤S2和S3可以减少保藏过程对菌体细胞的破坏，提高保藏菌种的稳定性，菌种保藏的年限可达15年，菌种活化后菌落形态与未保藏菌种一致，恢复后的菌种在活性及发酵性能方面与未保藏生产用菌种基本相同。因此，本发明降低了发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种在产业化生产应用中频繁传代可能导致的菌种变异和退化的风险。
具体实施方式
本发明提供了一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种长期保藏方法，下面以具体的实施例进一步介绍本发明。
需说明的是，以下实施例中使用的发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种是从青海新鲜冬虫夏草中分离得到，该菌种于1997年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0327。
实施例1
S1：复合冷冻保护剂的制备：按重量体积g/ml计，选取脱脂牛奶、山梨醇两种保护剂，按终浓度配制成25％脱脂牛奶和10％山梨醇溶液，115℃灭菌10分钟，得到冷冻保护剂。
S2：孢子悬浮液的制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡3分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至108个/ml。
S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:1混合，用无菌毛细滴管吸取0.4ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于-20℃环境中，预冻8小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度为-40℃，冷冻干燥15小时。
S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
实施例2
(1)复合冷冻保护剂制备：按重量体积g/ml计，选取脱脂牛奶、甘露醇两种保护剂，按终浓度配制成30％脱脂牛奶和6％甘露醇溶液，115℃灭菌10分钟，得到冷冻保护剂。
(2)孢子悬浮液制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡4分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至109个/ml。
S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:1混合，用无菌毛细滴管吸取0.4ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于-20℃环境中，预冻8小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度范围为-50℃，冷冻干燥12小时。
S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
实施例3
(1)复合冷冻保护剂制备：按重量体积g/ml计，选取甘油、甘露醇两种保护剂，按终浓度配制成30％甘油和6％甘露醇溶液，115℃灭菌20分钟，得到冷冻保护剂。
(2)孢子悬浮液制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡5分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至109个/ml。
S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:2混合，用无菌毛细滴管吸取0.3ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于-30℃环境中，预冻6小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度范围为-50℃，冷冻干燥12小时。
S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
实施例4
(1)冷冻保护剂制备：按重量体积g/ml计，选取甘油、葡萄糖两种保护剂，按终浓度配制成25％甘油和10％葡萄糖溶液，115℃灭菌20分钟，得到冷冻保护剂。
(2)孢子悬浮液制备：倒入适量的无菌水于菌种斜面，接种环刮下菌苔上的孢子，倒入含有玻璃珠的灭菌三角摇瓶中，震荡5分钟，倒入有灭菌滤纸的漏斗中过滤，收集滤液，加入适量的无菌水，将孢子悬浮液浓度调整至108个/ml。
S3：混合与分装：将菌体孢子悬液与复合冷冻保护剂按体积比1:2混合，用无菌毛细滴管吸取0.3ml混合液，滴入安瓿管底部，用无菌棉花封口。
S4：冷冻干燥：将安瓿管放置于-30℃环境中，预冻6小时。再将安瓿管放置于冷冻干燥机中，调节冷冻温度范围为-40℃，冷冻干燥15小时。
S5：真空熔封：冷冻干燥后的安瓿管取出，立即插入多歧管的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，达到最大真空后，在继续抽真空下用喷灯对准安瓿管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放入6℃医用冷藏箱保藏。
性能测试：
(1)取保藏15年的实施例1～4制备的安瓿管，在无菌超净台上用磨口砂轮打开，用无菌毛细滴管吸取少量无菌水，滴入安瓿管底部，溶解冻干粉末，将内溶物接种至斜面培养基上，在温度20～26℃，湿度80～95％的条件下培养7天。观察斜面菌体生长情况。
(2)挑取1.0cm*1.0cm的斜面菌苔，接种入液体培养基摇瓶中，在温度20～26℃，湿度80～95％的条件下培养3天。检测培养液菌体的菌浓和腺苷含量。
(3)菌浓检测数据与未经保藏的生产菌种采用相同培养方式下的菌浓之比，为菌种活性恢复情况。
(4)菌体腺苷含量检测数据与未经保藏的生产菌种采用相同培养方式下的菌体腺苷含量之比，为菌种发酵性能恢复情况。
为了考察发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4长期保藏菌种的活性及发酵性能恢复情况，将保藏菌种与未长期保藏的斜面菌种进行对比实验。
对比例1
选用保藏时间3个月的蝙蝠蛾拟青霉Cs-4斜面菌种采用性能测试的步骤(2)进行培养后，检测菌浓及腺苷含量。来源于申请人技术部菌种室定期传代的斜面保藏菌种。
(1)菌体的菌浓检测：
取培养液V0(ml)装入离心管中，放入离心机，在3000转/分钟的条件下离心10分钟，将上清液倒入量筒中，记录体积V1(ml)。
菌浓(％)＝(V0-V1)/V0*100％
(2)菌体的腺苷含量检测：
培养液放入离心机中，在3000转/分钟的条件下离心10分钟，收集菌丝体，放置于烘箱中85℃烘干，干燥菌丝体经粉碎后称取1g，按照卫生部版标准WS3-C1-0001-95(Z)中液相色谱法检测菌体的腺苷含量(wt％)。
实施例1～4及对比例1的菌种培养液的菌浓、腺苷含量及活性恢复情况，如表1所示：
表1保藏菌种活性及发酵性能恢复情况
从上述表1中的数据可以看出，实施例1-4的保藏菌体从安瓿管内取出接活后，菌落生长旺盛，与对比例1菌种生长情况一致，无明显的区别。同时经过菌种活性考察，保藏菌种的活性恢复可达75％以上，发酵性能可达91％以上。在进行冷冻剂的选择及菌种保藏工艺调整后，实施例2菌种恢复后活性可达92％以上，液态发酵培养后的菌体发酵性能可达97％以上，与对比例1的活性和发酵性能无明显差距，基本上与未保藏的生产菌种在活性及发酵性能上没有改变。因此，本发明公开的菌种保藏方法可以很好应用于发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌种的长期保藏，保藏时间可达15年，保藏菌种恢复后在活性及发酵性能方面与未保藏的生产菌种基本相同。
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种发酵虫草菌粉用蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌种的长期保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：配制复合冷冻保护剂，灭菌后备用；
S2：制备菌体孢子悬浮液，并将菌体孢子悬浮液与步骤S1中的复合冷冻保护剂混合，分装入灭菌后的安瓿管中，封口；
S3：将步骤S2的安瓿管预冻，预冻后，将安瓿管进行冷冻干燥；
S4：将步骤S3的安瓿管装入多歧管，抽真空后，用火焰熔封，得到待保藏样品；
S5：将步骤S4的待保藏样品放置于低温环境中长期保藏；
所述步骤S1中，复合冷冻保护剂为脱脂牛奶、山梨醇两种保护剂；或；脱脂牛奶、甘露醇两种保护剂；或；甘油、甘露醇两种保护剂；或；甘油、葡萄糖两种保护剂；
所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液的浓度为108～1010个/ml；所述步骤S2中，菌体孢子悬浮液与复合冷冻保护剂按体积比1:1～2混合；所述步骤S3中，预冻温度为-20℃～-30℃，时间10～15h；冷冻干燥温度为-40℃～-50℃，时间10～20h；所述步骤S5中，低温环境温度为2℃～8℃；
保藏时间可达15年，保藏菌种恢复后在活性及发酵性能方面与未保藏的生产菌种基本相同。
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|---|---|
| CN (1) | CN115838635B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667062A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-26 | 江南大学 | 一种樟芝无性孢子低温保藏保护剂及其使用方法 |
| CN103667061A (zh) * | 2013-11-21 | 2014-03-26 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种菌种保藏方法 |
| CN105733947A (zh) * | 2016-05-11 | 2016-07-06 | 鲁东大学 | 一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法 |
| CN106983134A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-28 | 北华大学 | 北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法 |
| CN107955794A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-04-24 | 沈阳农业大学 | 蛹虫草菌种的优质保藏方法 |
| CN109182231A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-11 | 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 | 一种乳酸菌菌种长期保藏方法 |
| CN109294917A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-02-01 | 黑龙江省菌益粮康科技发展有限公司 | 一种菌种保藏剂及利用该保藏剂超低温冷冻保藏基因工程菌的方法 |
| CN111394263A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-07-10 | 中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所 | 一种虫草菌种保藏专用低温冷冻保护剂及使用方法 |
| CN114381373A (zh) * | 2020-10-20 | 2022-04-22 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种硬葡聚糖组合保护剂在放线菌冷冻干燥保藏中的应用 |
-
2022
- 2022-10-08 CN CN202211223398.6A patent/CN115838635B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667061A (zh) * | 2013-11-21 | 2014-03-26 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种菌种保藏方法 |
| CN103667062A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-26 | 江南大学 | 一种樟芝无性孢子低温保藏保护剂及其使用方法 |
| CN105733947A (zh) * | 2016-05-11 | 2016-07-06 | 鲁东大学 | 一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法 |
| CN106983134A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-07-28 | 北华大学 | 北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法 |
| CN107955794A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-04-24 | 沈阳农业大学 | 蛹虫草菌种的优质保藏方法 |
| CN109294917A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-02-01 | 黑龙江省菌益粮康科技发展有限公司 | 一种菌种保藏剂及利用该保藏剂超低温冷冻保藏基因工程菌的方法 |
| CN109182231A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-11 | 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 | 一种乳酸菌菌种长期保藏方法 |
| CN111394263A (zh) * | 2020-05-28 | 2020-07-10 | 中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所 | 一种虫草菌种保藏专用低温冷冻保护剂及使用方法 |
| CN114381373A (zh) * | 2020-10-20 | 2022-04-22 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种硬葡聚糖组合保护剂在放线菌冷冻干燥保藏中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 冬虫夏草菌种保藏方法的比较;方苏;林勤;倪志婧;;安徽农业科学(第14期);摘要，第1.2.1-1.2.2以及1.2.5节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115838635A (zh) | 2023-03-24 |
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