DE69734600T2

DE69734600T2 - Verfahren zur konservierung eukariotischen zellen und dadurch hergestellte zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69734600T2
Application number: DE69734600T
Authority: DE
Inventors: Alan G. Horningsea TUNNACLIFFE; David T. Stanley WELSH; Bruce Joseph Roser; Kamaljit S. Hitchin DHALIWAL; Camilo Colaco
Original assignee: Quadrant Drug Delivery Ltd
Current assignee: Quadrant Drug Delivery Ltd
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: EP0946710B1; US6468782B1; DE69734600D1; JP2001505431A; WO1998024882A1; ATE309326T1; CA2272821A1; AU721391B2; EP0946710A1; US20030113900A1; AU5403498A; ZA9710974B; CN1239997A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Konservierung von Zellen. Spezieller betrifft sie Verfahren zur Trocknung und Stabilisierung von prokaryotischen Zellen und die damit erhaltenen Zusammensetzungen.
STAND DER TECHNIK
Lebende prokaryotische Zellen, insbesondere Bakterien, werden in großem Umfang und zunehmend in wichtigen medizinischen, landwirtschaftlichen und industriellen Anwendungen verwendet. Landwirtschaftliche oder Umweltanwendungen umfassen Biopestizide und die biologische Sanierung. Medizinische Anwendungen schließen die Verwendung von Lebendbakterien in Impfstoffen sowie der Produktion von pharmazeutischen Produkten und zahlreichen industriellen Zusammensetzungen ein. Die Verwendung von Lebendbakterien-Impfstoffen verspricht im Hinblick auf den dramatischen Aufschwung der Biotechnologie sowie die intensive Forschung bezüglich der Behandlung von infektiösen Krankheiten in den letzten 20 Jahren nur zuzunehmen.
Bakterienzellen müssen über bedeutende Zeitspannen gelagert werden können, während ihre Lebensfähigkeit konserviert wird, um sowohl bezüglich der gewünschten Ergebnisse als auch der Kosten effektiv verwendet werden zu können. Die Lager-Lebensfähigkeit hat sich als eine Hauptschwierigkeit erwiesen. Verfahren zur Konservierung von lebenden prokaryotischen Zellen leiden unter mehreren ernsten Nachteilen, wie dass sie energieintensiv sind und eine kalte Lagerung erfordern. Weiter stellen vorhandene Konservierungsverfahren keine zufriedenstellende Lebensfähigkeit nach der Lagerung bereit, insbesondere, wenn Zellen bei Umgebungs- oder höherer Temperatur gelagert werden.
Gefriertrocknung wird häufig für die Konservierung und Lagerung von prokaryotischen Zellen verwendet. Jedoch weist sie die unerwünschten Merkmale einer deutlichen Verringerung der Lebensfähigkeit auf sowie, dass sie zeit- und energieintensiv und zu teuer ist. Die Gefriertrocknung beinhaltet das Geben der Zellen in Lösung, das Einfrieren der Lösung und die Einwirkung eines Vakuums auf den gefrorenen Festkörper unter Bedingungen, wo er fest verbleibt und das Wasser und andere flüchtige Komponenten durch Sublimation entfernt werden. Die resultierende getrocknete Formulierung umfasst die prokaryotischen Zellen.
Trotz der offensichtlichen Allgegenwart von Gefriertrocknung sind gefriergetrocknete Bakterien bei Umgebungstemperaturen instabil, was so ihre Lagerung durch Kühlung erfordert. Jedoch selbst wenn sie gekühlt werden, können die Zellen schnell ihre Lebensfähigkeit verlieren. Der durch dieses Verfahren verursachte Schaden kann bis zu einem gewissen Ausmaß durch die Verwendung von Hilfsstoffen, wie Lyoprotektoren, umgangen werden. Jedoch können Lyoprotektoren anschließend mit den getrockneten Zellen reagieren, was den gefriergetrockneten prokaryotischen Zellen bei der Lagerung eine inhärente Instabilität auferlegt.
Andere Verfahren, die zur Herstellung von trockenen, angeblich stabilen Präparaten von prokaryotischen Zellen verwendet wurden, wie Umgebungstemperatur-Trocknung, Sprühtrocknung, flüssige Formulierungen und Einfrieren von Bakterienkulturen mit Kryoprotektoren, weisen ebenfalls Nachteile auf. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks über die Austrocknungs-Toleranz von Prokaryonten siehe Potts (1994), Micro. Rev. 58:755-805. Umgebungstemperatur-Trocknungstechniken eliminieren den Gefrierschritt und den damit verbundenen Gefrierschaden für die Substanz, und diese Techniken sind für der Entfernung von Wasser rascher und energiesparender; Crowe et al. (1990), Cryobiol. 27:219-231. Jedoch liefert eine Umgebungstemperatur-Trocknung häufig keine zufriedenstellende Lebensfähigkeit. Sprühtrocknung hat eine begrenzte Lagerungszeit und eine verringerte Lebensfähigkeit zum Ergebnis, selbst wenn stabilisierende Hilfsstoffe verwendet werden. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks siehe Lievense und van't Reit (1994) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 51:45-63, 72-89. Flüssige Formulierungen können nur eine Kurzzeit-Stabilisierung bereitstellen und erfordern Kühlung. Das Einfrieren von Bakterienkulturen hat eine beträchtliche Beschädigung der Bakterien-Zellwand und den Verlust von Lebensfähigkeit zur Folge, was durch die Verwendung von Kryoprotektoren nur verringert, aber nicht beseitigt wird. Darüber hinaus müssen diese gefrorenen Kulturen auch gekühlt aufbewahrt werden.
Trehalose (α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid) ist ein natürlich vorkommendes, nicht-reduzierendes Disaccharid, wobei anfänglich gefunden wurde, dass es mit der Verhütung eines Austrocknungsschadens in gewissen Pflanzen und Tieren verbunden ist, die ohne Schaden austrocknen und wieder zum Leben kommen können, wenn sie rehydratisiert werden. Es ist häufig gezeigt worden, dass Trehalose bei der Verhütung der Denaturierung von Proteinen, Viren und Lebensmitteln bei der Trocknung nützlich ist. Siehe die U.S. Patente Nr. 4,891,319; 5,149,653; 5,026,566; Blakeley et al. (1990), Lancet 336:854-855; Roser (Juli 1991), Trends in Food Sci. and Tech. 10:166-169; Colaco et al. (1992), Biotechnol. Internat. 1:345-350; Roser (1991) BioPharm. 4:47-53; Colaco et al. (1992), Bio/Tech. 10:1007-1011; und Roser et al. (Mai 1993) New Scientist, S. 25-28. Trehalose-Dihydrat ist Handel als kristalline Formulierungen in „good manufacturing process" (GMP)-Güte erhältlich. Ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose aus Stärke ist in der EP-Patentveröffentlichung Nr. 639 645 A1 beschrieben. Dieses Verfahren beinhaltet eine enzymatische Zweistufen-Bioumwandlung von Stärke, was einen Trehalose-Sirup liefert, aus dem der Zucker durch Kristallisation gewonnen wird.
Bakterien sind in der Lage, einem osmotischen Schock durch Akkumulation und/oder Synthese von Kalium mit wenigen Arten von organischen Molekülen, einschließlich einiger Zucker, entgegenzuwirken. Die Osmoregulation in Bakterien wie Escherichia coli in Glucose-Mineral-Medium ohne irgendwelche osmoprotektiven Verbindungen beinhaltet die endogene Produktion von Trehalose; Larsen et al. (1987) Arch. Microbiol. 147:1-7; Dinnbier et al. (1988) Arch. Microbiol. 150:348-357; Giaever et al. (1988) J. Bacteriol. 170:2841-2849; und Welsh et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137:745-750.
Die WO-A-95/03395 offenbart ein Verfahren zur Verbesserung der Lebensfähigkeit einer getrockneten Bakterien-Zellmasse durch Aufrechterhaltung einer Kultur der Bakterien in einer stationären Phase über eine ausgewählte Zeitspanne und Trocknen der Bakterien. Das Kulturmedium kann ein höheres als normales osmotisches Potential aufweisen, was eine höhere Trehalose-Konzentration zum Ergebnis hat. Die US-A-5,312,909 offenbart eine transformierte Hefe, die ein modifiziertes Trehalose- oder Trehalose-6-phosphat-Gen und als Ergebnis einen Gehalt an modifizierter Trehalose aufweist.
Ein Verfahren zur Konservierung von prokaryotischen Zellen ist die Gefriertrocknung in Anwesenheit von Trehalose, siehe z.B. Israeli et al. (1993) Cryobiol. 30:519-523. Jedoch liefert dieses Verfahren keine zufriedenstellende Lebensfähigkeit. Israeli et al. gefriertrockneten E. coli in Anwesenheit von 100 mM Trehalose, aber teilten Überlebensdaten für nur vier Tagen nach Einwirken von Luft bei 21 °C auf die getrockneten Proben mit. Eine spätere Studie testete die Überlebensraten von E. coli und Bacillus fluoringiensis, die in Anwesenheit von Trehalose gefriergetrocknet wurden; Leslie et al. (1995), Appl. Env. Microbiol. 61:3592-3597. Überlebensdaten wurden lediglich für 4 Tage nach Einwirkung von Luft auf die getrockneten Proben mitgeteilt.
Eine weitere Studie, die gefriergetrocknete mit an Luft getrockneten (unter Stickstoff verschlossenen) E. coli in Anwesenheit von Trehalose vergleicht, berichtete über Überlebensraten von etwa 10⁷ bis über 10¹⁰ Kolonien-bildenden Einheiten (CFU) pro ml für 25 Wochen lang gelagerte Zellen, aber die Zellen wurden bei 4 °C aufbewahrt. Louis et al. (1994), Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:684-688.
Im Hinblick auf die zunehmenden Anwendungen für lebensfähige Bakterien und die bestehenden Probleme der Aufrechterhaltung der Bakterien-Lebensfähigkeit während der Lagerung gibt es einen dringenden Bedarf an einem Verfahren zur preiswerten Trocknung und Stabilisierung von prokaryotischen Zellen. Es ist besonders wünschenswert, Verfahren zu entwickeln, welche eine Lagerung von getrockneten prokaryotischen Zellen bei Umgebungstemperatur ermöglichen würden, d.h. keine Kühlung erfordern. Die hierin beschriebenen Verfahren sprechen diesen Bedarf an, indem sie trockene, bemerkenswert lagerfähige prokaryotische Zellen bereitstellen, welche die Lebensfähigkeit ohne das Erfordernis für Kühlung beibehalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Produktion von getrockneten stabilisierten prokaryotischen Zellen. Die Erfindung schließt auch Zusammensetzungen, die durch diese Verfahren produziert werden, sowie Verfahren zur Rekonstitution der prokaryotischen Zellen ein.
Demgemäß stellt die Erfindung in einem Aspekt Verfahren zur Konservierung von prokaryotischen Zellen ein, umfassend das Kultivieren der prokaryotischen Zellen unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Trehalose-Konzentration auf mindestens 30 mM erhöhen, das Mischen der prokaryotischen Zellen mit einer Trocknungslösung, die ein Kohlenhydrat, wie Trehalose, umfasst, und das Trocknen der prokaryotischen Zellen derart, dass ein Glas mit weniger als etwa 5 % Restfeuchte erzeugt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Alignment der Trehalose-Synthase-Aminosäuresequenzen, die durch Gene aus einer Anzahl von Organismen codiert werden: 1. Kluyveromyces lactis; 2. Saccharomyces cerevisiae; 3. Aspergillus niger, 4. Schizosaccharomyces pombe; 5. Mycobacterium leprae und 6. E. coli (SEQ. ID NOS: 1-6).
2 ist eine Halbton-Reproduktion eines Southern-Blot-Tests auf die Anwesenheit von Trehalose-Synthase-Genen in E. coli und Salmonella. Die horizontalen Linien auf der linken Seite stellen Molekulargewichts-Marker (λ Hind III) mit 23, 9,3, 6,6, 4,4, 2,3, 2,0 bzw. 0,56 kb dar.
3 ist ein Diagramm, das die Stabilität von E. coli NCIMB 9484 nach Lagerung bei 37 °C zeigt. Die Kreise zeigen eine intrazelluläre Trehalose-Induktion an, und die Dreiecke stellen keine Trehalose-Induktion dar.
4 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen T_g und Restfeuchte in einer Formulierung mit 45 % Trehalose und 15 % Kollidon 90 zeigt.
5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen Restfeuchte und Dauer der Trocknungszeit in einer Formulierung mit 45 % Trehalose und 0,1 % CMC zeigt. Das FTS-Trocknungsprotokoll war 30 mTorr ST 40 °C (× h).
Die 6A und 6B sind Diagramme, welche die Auswirkung einer Bedingung mit hoher Osmolarität (0,5 M NaCl) auf die intrazelluläre Trehalose-Konzentration zeigen. 6A zeigt die Akkumulation der intrazelluläre Trehalose-Konzentration und die Wachstumskurve für E. coli, die bei 37 °C in Evans-Medium und 0,5 M NaCl gezüchtet wurden. 6B zeigt die Akkumulation der intrazellulären Trehalose-Konzentration und die Wachstumskurve bei 37 °C von E. coli, die bei 37 °C in Evans-Medium gezüchtet wurde, dem NaCl fehlte. Sowohl in A als auch in B stellen die Kreise die induzierte Trehalose-Konzentration dar und stellen die Quadrate das bei 600 nm gemessene Zellwachstum (Extinktion) dar.
7 ist eine Reproduktion einer Reihe von Schreibspuren einer HPLC-Analyse der intrazellulären Trehalose-Konzentration in Salmonella vor und nach Trehalose-Induktion durch osmotischen Schock.
8 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit der Zellen und der Trocknungszeit in einer Formulierung mit 45 % Trehalose und 0,1 % CMC zeigt. Das FTS-Trocknungsprotokoll war 30 mTorr ST 40 °C (× h).
9 ist ein Diagramm, das die intrazelluläre Trehalose (•)- und Protein (∎)-Konzentration während des Wachstums von S. typhimurium bei 37 °C zeigt.
10 ist ein Diagramm, das die prozentuale Zurückgewinnung von mit Trehalose induzierten (•) und nicht-induzierten
S. typhimurium 1344 nach Lagerung bei 37 °C zeigt.
WEISEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Wir haben gefunden, dass prokaryotische Zellen durch Induktion der intrazellulären Trehalose-Produktion auf mindestens 30 mM und Trocknen der Zellen in Anwesenheit eines Kohlenhydrats getrocknet und stabilisiert werden können. Die hierin beschriebenen Verfahren zur Stabilisierung von prokaryotischen Zellen können für die Produktion von getrockneten stabilen Bakterien verwendet werden, die für eine pharmakologische Behandlung, Prophylaxe, landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen nützlich sind.
Prokaryotische Zellen, die durch die hierin offenbarten Verfahren erhalten werden, sind bemerkenswert stabil: durch diese Verfahren stabilisierte Bakterien behalten eine hohe Lebensfähigkeit selbst nach Lagerung bei Umgebungs- oder oberhalb von Umgebungstemperaturen bei. Unter diesen Bedingungen getrocknete Bakterien behalten etwa 50 – 80 % Lebensfähigkeit nach dem Trocknen bei. Weiter zeigen durch diese Verfahren stabilisierte Bakterien weniger als 10 % Verlust an Lebensfähigkeit bei der Lagerung, selbst nach Lagerung bei Temperaturen bis mindestens 37 °C für so lange wie 6 Wochen. Dieses Maß an Stabilisierung während der Trocknung und Lagerung ist signifikant größer, als es früher unter Verwendung anderer Verfahren mitgeteilt wurde. Die stabilisierten Zellen können bei Raumtemperatur gelagert werden und erfordern so keine Kühlung. Abhängig von den Bedingungen kann die Trocknung im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden bewerkstelligt werden, was für Energie- und Kosteneinsparungen sowie für eine erhöhte Lebensfähigkeit sorgt.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung erleichtern die Entwicklung von vielen benötigten nützlichen Produkten, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: (i) Lebendbakterien-Impfstoffen in trockener stabiler Form; (ii) Lebendbakterien-Nahrungsergänzungsmitteln in trockener stabilen Form; (iii) anderen pharmazeutischen Lebendbakterien-Produkten in trockener stabiler Form, z.B. zur Behandlung von Infektionen des Vaginaltrakts oder der Harnorgane; (iv) Lebendbakterien-Starterkulturen in trockener stabiler Form für kommerzielle Produkte, wie für die Milchindustrie; (v) Lebendbakterien in trockener stabiler Form für die landwirtschaftliche, ökologische oder biologische Sanierungsverwendung, wie Pestizide; und (vi) Lebendbakterien-Kulturen in trockener stabiler Form für die Biotechnologie-Industrie.
Wie hierin verwendet, sind „prokaryotische Zellen" Zellen, welche die Merkmale von Prokaryoten aufweisen, was ein in der Technik wohlbekannter Ausdruck ist. Prokaryoten sind typisch einzellige Organismen und weisen keine Organellen (wie Mitochondrien, Chloroplasten und Golgi-Apparate), kein Zytoskelett und keinen diskreten Zellkern auf. Beispiele für prokaryotische Zellen umfassen Bakterien, wie Eubakterien, Cyanobakterien und Prochlorophyten; Archeabakterien; und andere Organismen, wie Rickettsiae, Mycoplasmen, Spiroplasmen und Chlamydien. Für die Zwecke dieser Erfindung sind Prokaryoten in der Lage, Trehalose zu synthetisieren. Die Fähigkeit kann nativ sein oder durch rekombinante Techniken verliehen sein. Die Fähigkeit, Trehalose zu synthetisieren, kann durch Messen der intrazelluläre Trehalose-Konzentration bestimmt werden, was nachstehend beschrieben wird. Bevorzugt sind die prokaryotischen Zellen Bakterien.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck „Kohlenhydrat", ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Oligosaccharide und ihre entsprechenden Zuckeralkohole, Polyhydroxyl-Verbindungen, wie Kohlenhydrat-Derivate und chemisch modifizierte Kohlenhydrate, Hydroxyethylstärke und Zucker-Copolymere. Sowohl natürliche als auch synthetische Kohlenhydrate sind zur Verwendung hierin geeignet. Synthetische Kohlenhydrate umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, jene, bei denen die glycosidische Bindung durch eine Thiol- oder Kohlenstoff-Bindung ersetzt ist.
Sowohl die D- als auch die L-Form der Kohlenhydrate kann verwendet werden. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Kohlenhydrat bevorzugt nicht-reduzierend. Besonders ist das nicht-reduzierende Kohlenhydrat Trehalose. Andere Beispiele für bevorzugte nicht-reduzierende Kohlenhydrate werden nachstehend angegeben.
Bedingungen, welche die „intrazelluläre Trehalose-Konzentration erhöhen", sind Bedingungen, welche die Syntheserate der Trehalose innerhalb der Zelle(n) initiieren, fördern, ermöglichen und/oder erhöhen und/oder die Menge an Trehalose innerhalb der Zelle(n) erhöhen, wenn sie mit dem Züchten oder Inkubieren der Zelle(n) ohne diese Bedingungen verglichen werden. Bedingungen (einschließlich bevorzugter Bedingungen), welche die Produktion der intrazellulären Produktion von Trehalose stimulieren, werden nachstehend in Einzelheit erörtert. Beispiele für diese Bedingungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, das Züchten der Zelle(n) unter ungünstigen Bedingungen, wie osmotischem Schock, d.h. Bedingungen mit hoher Salzkonzentration. Bedingungen, welche die Produktion von intrazellulärer Trehalose stimulieren, können z.B. auch durch die Inhibierung der Abbaugeschwindigkeit von Trehalose, die Expression rekombinanter Gene und die Induktion der Aufnahme exogener Trehalose bewirkt werden.
„Umgebung" ist ein technischer Ausdruck, der Atmosphären-Druck und die Feuchtigkeit und/oder die Temperatur des Raums bezeichnet, in dem die verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Umgebungstemperatur wird auch als Raumtemperatur bezeichnet und liegt im Allgemeinen bei etwa 15 bis etwa 25 °C.
„Restfeuchte" ist die Wassermenge, die nach Trocknen von prokaryotischen Zellen durch die hierin beschriebenen Verfahren verbleibt (ausgedrückt in Gewichtsprozent). Restfeuchte kann durch ein Karl/Fischer-Coulometer gemessen werden, wie in Einzelheit nachstehend erörtert.
„Glas" ist ein in der Technik wohlverstandener Ausdruck, insbesondere wie er auf Kohlenhydrat-Gläser angewendet wird. Für die Zwecke dieser Erfindung bezeichnet „Glas" einen nicht-kristallinen, glasartigen, festen physikalischen Zustand, der bei genügend Wasserverlust erreicht wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „geschäumte Glasmatrix" (FGM) ein Kohlenhydrat-haltiges Glas, das Blasen enthält, die in dem Glas dispergiert sind, was einen Schaum zum Ergebnis hat. Für die Zwecke dieser Erfindung enthält eine geschäumte Glasmatrix weniger als 5 % Restfeuchte, bevorzugt weniger als 4 % Restfeuchte, bevorzugter weniger als 2 % Restfeuchte.
„Hohe Osmolarität" bezeichnet eine übermäßige Konzentration an gelösten Stoffen in Wachstumsmedien. Eine „übermäßige" Konzentration an gelösten Stoffen bedeutet, dass die Konzentration an gelösten Stoffen (im Allgemeinen Salzen) über der Konzentration liegt, bei der eine Zelle in ihrer nativen Umgebung vorliegt und/oder sich vermehrt.
„Lebensfähigkeit" ist ein in der Technik wohlverstandener Ausdruck und wird hierin übereinstimmend verwendet, um Manifestationen eines funktionierenden lebenden Organismus zu bedeuten, wie Metabolismus und Zellteilung. Verfahren zur Messung der Lebensfähigkeit sind in der Technik bekannt und werden hierin beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Produktion von stabilisierten prokaryotischen Zellen und die dadurch produzierten Zellen. Diese Verfahren umfassen die Schritte der Erhöhung intrazellulärer Trehalose, bevorzugt durch Kultivieren oder Inkubieren der prokaryotischen Zellen unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Trehalose-Konzentration auf mindestens 30 mM erhöhen, des Mischens der prokaryotischen Zellen mit einer Trocknungslösung, die ein Kohlenhydrat, bevorzugt ein nicht-reduzierendes Kohlenhydrat wie Trehalose, enthält, und des Trocknens der resultierenden Mischung derart, dass ein Glas erzeugt wird, das weniger als etwa 5 % Restfeuchte aufweist.
Züchten von prokaryotischen Zellen, um die intrazelluläre Trehalose-Konzentration zu erhöhen. Um Verfahren dieser Erfindung durchzuführen, können prokaryotische Zellen unter Bedingungen gezüchtet werden, welche die intrazelluläre Trehalose-Konzentration erhöhen. Intrazelluläre Trehalose kann unter Verwendung von technischen Standardverfahren gemessen werden, wie nachstehend beschrieben. Jede prokaryotische Zelle, insbesondere Bakterien, die endogen oder rekombinant Trehalose-Synthase-Gene enthält, sollte in der Lage sein, intrazelluläre Trehalose zu produzieren.
Es ist von vielen Arten von prokaryotischen Zellen bekannt, dass sie Trehalose synthetisieren. Beispiele für Bakterien, die das Trehalose-Synthase-Gen enthalten, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enterobacteriaceae, wie Salmonella und Escherichia (z.B. S. typhimurium und E. coli); halophile und halotolerante Bakterien, wie Ectothriorhodospira (z.B. E. halochloris): Micrococcocaceae, wie Micrococcus (z.B. M. luteus), Rhizobium -Arten, wie R. japonicum und R. leguminosarum b.v. phaseoli; Cyanobacteria- und Mycobacteria-Arten, wie M. tuberculosis, M. bovis und M. smegmatis. Ein Alignment von Trehalose-Synthasen, die durch Gene aus einer Vielfalt von Organismen codiert werden, ist in 1 gezeigt. Von mehreren anderen Bakterien ist gezeigt worden, dass sie Trehalose-Synthase-Gene aufweisen, die zum E. coli-Gen hoch homolog sind. Diese Bakterien schließen Pseudomonas putidae und Aeromonas salmonicida ein.
Die Ermittlung, ob eine bestimmte Bakterienart Trehalose-Synthetase-Gen(e) enthält, kann z.B. mittels Durchsuchen verfügbarer Nukleinsäure- (und/oder Protein-) Datenbanken auf die Anwesenheit von Sequenzen bewerkstelligt werden, die Konsensus-Regionen der Aminosäuresequenz der Trehalose-Synthase-Gene codieren (oder diesen entsprechen). Bakterien besitzen zwei Gene, die an der Trehalose-Synthese beteiligt sind (d.h. T-phosphat-Synthase und T-6-P-Phosphatase), wohingegen Hefen mindestens drei Gene besitzten. Im Allgemeinen identifiziert eine Suche mit Sonden, die für Hefegene spezifisch sind, auch die Bakterien-Gene, obwohl mit etwas niedrigeren Homologie-Punktzahlen. Aminosäuresequenz-Alignments von Trehalose-Synthase zeigen eine Homologie zwischen Bakterien, Hefen und Pilzen, und spezifischere Such- und Durchmusterungssonden können aus diesen Alignments bestimmt werden (1). Alternativ können Southern-Blots von genomischer DNA aus einer Testzelle erzeugt werden, die mit DNA sondiert wurde, welche alles oder einen funktionalen Teil des Trehalose-Synthase-Gens codiert. 2 zeigt einen Southern-Blot der Trehalose-Synthase-Gene von E. coli und von zwei Stämmen von Salmonella.
Steigerungen der intrazellulären Trehalose können erhalten werden, indem man die Zellen unter ungünstigen Bedingungen, z.B. osmotischem Schock, Wärme oder Sauerstoff-Begrenzung (Schock), Kohlenstoff/Stickstoff-Mangel oder irgendeiner Kombination der obigen kultiviert. Alternativ hat die Verwendung von Inhibitoren von Enzym(en), die am Trehalose-Abbau beteiligt sind (d.h. Trehalase), wie Validomycin, ebenfalls eine Akkumulation von intrazellulärer Trehalose zur Folge. Geeignete Bedingungen können empirisch ermittelt werden, was sehr wohl innerhalb des Vermögens eines Fachmanns liegt. Obwohl man nicht durch eine spezielle Theorie gebunden sein will, kann die Induktion der Trehalose-Produktion unter ungünstigen Bedingungen die Synthese oder Akkumulation von anderen Molekülen auslösen, die für die Konservierung vorteilhaft sind, wie Betain und Chaperonine.
Bei Bakterien, insbesondere Escherichia, kann die Trehalose-Produktion durch Züchten der Zelle(n) unter Bedingungen hoher Osmolarität, d.h. Konzentrationen an gelöstem Stoff (im Allgemeinen Salzen), die ausreichen, um die Trehalose-Produktion zu stimulieren, stimuliert werden. So erfasst die Erfindung das Kultivieren von prokaryotischen Zellen in einer Osmolarität von mindestens etwa 350 mOsmol bis etwa 1,5 Osmol, bevorzugt mindestens etwa 400 mOsmol bis 1 Osmol, bevorzugter 250 mOsmol bis 500 mOsmol. Die Erfindung umfasst auch das Kultivieren von prokaryotischen Zellen in einer Osmolarität von mindestens etwa 300 mOsmol, bevorzugt mindestens etwa 400 mOsmol, bevorzugter mindestens etwa 500 mOsmol. Im Allgemeinen ist eine minimale Salzkonzentration von etwa 200 mOsmol erforderlich, aber eine wirksame Konzentration kann empirisch abgeleitet werden. Ein einziges Salz kann ausreichend sein, um die Trehalose-Produktion zu stimulieren, z.B. 200 mM NaCl.
KCl und CaCl₂ stimulieren ebenfalls die intrazelluläre Trehalose-Produktion, was anzeigt, dass die intrazelluläre Trehalose-Produktion vom verwendeten Kation oder der Chloridkonzentration im Wachstumsmedium nicht abhängt. Wenn jedoch (NH₄)₂SO₄ verwendet wird, wird nur etwa die Hälfte der Trehalose im Vergleich zu jener produziert, die in Anwesenheit von KCl, NaCl und CaCl₂ produziert wird. Eine Kombination von Salzen kann ebenfalls verwendet werden. Zusätzlich kann, wenn er verwendet wird, um die Osmolarität des Mediums zu erhöhen, ein nicht-eindringender gelöster Stoff, wie Sorbit und/oder Glucose, zur Stimulation der Trehalose-Akkumulation beitragen.
Beispiele für Salze, die verwendet werden können, um die Osmolarität zu erhöhen, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Natriumphosphat (Na₂HPO₄), Kaliumphosphat (KH₂PO₄), Ammoniumchlorid (NH₄Cl), Natriumchlorid (NaCl), Magnesiumsulfat (MgSO₄), Calciumchlorid (CaCl₂), Thiaminhydrochlorid oder jede Kombination derselben. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält minimales Medium etwa 0,5 M Salz. Noch bevorzugter ist das 0,5 M Salz aus den Folgenden zusammengesetzt: Na₂NPO₄, 6 g/l; KH₂PO₄, 3 g/l; NH₄Cl, 0,267 g/l; NaCl, 29,22 g/l; 1 M MgSO₄, 1 ml/l: 0,1 M CaCl₂ (1 ml/l); Thiamin-HCl, 1 ml/l; mit Glucose bei einer Endkonzentration von 2,5 % Gew./Vol. Es sollte ausreichend Glucose als Kohlenstoff-Quelle und für die Trehalose-Produktion verfügbar sein. Die Bestimmung von ausreichenden Glucose-Konzentrationen kann empirisch ermittelt werden und liegt gut innerhalb des Vermögens des Fachmanns.
Die Salzkonzentration (d.h. Osmolarität), die zur Stimulierung und/oder Induktion der Trehalose-Produktion erforderlich ist, hängt von der Gattung, der Art und/oder dem Stamm der verwendeten prokaryotischen Zelle ab. Bevorzugt wird/werden die Zelle(n) in einem salzhaltigen minimalen Medium gezüchtet. Im Handel erhältliches minimales Medium wird mit gewünschten Salzen und/oder anderen gelösten Stoffen supplementiert, obwohl minimales Medium nicht wesentlich ist und definierte Medien ebenfalls verwendet werden können. Die erforderliche Zeit zum Initiieren und Erreichen des gewünschten Maßes an intrazellulärer Trehalose-Konzentration variiert abhängig vom Grad der Osmolarität sowie von der Gattung, der Art und/oder dem Stamm der verwendeten prokaryotischen Zelle und kann empirisch ermittelt werden. Die Trehalose-Synthese beginnt im Allgemeinen innerhalb einer Stunde, nachdem man die Zellen unter eine Bedingung gegeben hat, die ausgelegt ist, um die Trehalose-Produktion zu stimulieren. Im Allgemeinen erreicht in E. coli die Menge an intrazellulärer Trehalose ein Maximum etwa 15 bis 20 Stunden, nachdem die Zellen unter Bedingungen gegeben worden sind, welche die Trehalose-Produktion stimulieren.
Um die intrazelluläre Trehalose-Produktion durch osmotischen Schock zu induzieren, sollte die Gesamtkonzentration an Salz(en) im Medium mindestens etwa 0,2 M, bevorzugt mindestens etwa 0,4 M, bevorzugter mindestens etwa 0,5 M betragen. Im Fall von E. coli sollte die Gesamtkonzentration an Salz(en) 0,6 M nicht überschreiten. Bei etwa 0,6 M oder darüber nimmt die intrazelluläre Trehalose-Produktion in E. coli ab. Die für das gewünschte Ergebnis erforderliche Salzkonzentration kann abhängig von der verwendeten Gattung/Art/dem verwendeten Stamm variieren und kann empirisch ermittelt werden.
Intrazelluläre Trehalose kann auch unter Verwendung rekombinanter Verfahren gesteigert werden, die alle in der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel können prokaryotische Zellen mit einem DNA-Plasmid transfiziert werden, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein geeignetes Trehalose-Synthase-Gen codiert. Geeignete Gene sind aus einer großen Vielfalt von Ressourcen verfügbar, wie durch die Zahl der in 1 dargestellten Gene und anderer kürzlich identifizierter Gene angezeigt. Das Gen wiederum ist operativ an einen geeigneten Promotor geknüpft, der konstitutiv oder induzierbar sein kann. Rekombinante Verfahren werden in einer Vielfalt von Literaturstellen beschrieben, wie „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al. 1989).
Intrazelluläre Trehalose kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Assays gemessen werden, wie durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), gekoppelt mit elektrochemischer Detektion, und Glucose-Assay (Trinder-Assay unter Verwendung von Trehalase) für die quantitative enzymatische Bestimmung von Trehalose. Dünnschicht-Chromatographie kann als qualitatives Verfahren für die Auftrennung von verschiedenen Kohlenhydraten verwendet werden. Die Brechungsindex-Bestimmung liefert ein weiteres Mittel zur quantitativen Bestimmung von Zuckern.
Beim Messen von Trehalose mittels HPLC werden die Zellen aufgebrochen, wobei intrazelluläre Trehalose auf bevorzugte Weise in 70%-igem Ethanol gelöst wird, gefolgt von der Entfernung von Triglyceriden mittels Chloroform-Extraktion. Die intrazelluläre Trehalose-Konzentration wird durch Multiplizieren der Trehalose-Konzentration (wie durch eine Standard-Kurve bestimmt) mit dem Bruchteil des Endvolumens des Überstands, dividiert durch das Pellet-Volumen, bestimmt. Eine detailliertere Beschreibung dieses Assays wird in Beispiel 1 geliefert.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an intrazellulärer Trehalose mindestens etwa 50 mM, bevorzugter mindestens etwa 100 mM, am bevorzugtesten mindestens etwa 150 mM, mehr bevorzugt mindestens etwa 200 mM, mehr bevorzugt mindestens etwa 250 mM und sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 300 mM. Wir haben gefunden, dass die Stabilität von Bakterien unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren deutlich abnimmt, wenn die intrazelluläre Trehalose-Konzentration unter etwa 30 mM liegt. So umfasst die Erfindung das Kultivieren der prokaryotischen Zellen unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Produktion von Trehalose stimulieren, wobei die intrazelluläre Trehalose-Konzentration mindestens etwa 30 mM, bevorzugt mindestens etwa 50 mM, bevorzugt mindestens etwa 100 mM, bevorzugter mindestens etwa 150 mM, bevorzugter mindestens etwa 200 mM, bevorzugter mindestens etwa 250 mM und sogar noch bevorzugter mindestens etwa 300 mM beträgt.
Die erforderliche Zeit zur Stimulation der intrazellulären Trehalose-Produktion hängt unter anderem von der Natur der prokaryotischen Zellen (einschließlich Gattung, Art und/oder Stamm) und den Bedingungen ab, unter denen die Trehalose-Induktion stattfindet (d.h. ob durch osmotischen Schock, Sauerstoffentzug usw.). Bei der Trehalose-Induktion durch osmotischen Schock hängt die erforderliche Zeit für eine maximale Konzentration an intrazellulärer Trehalose wiederum von dem Grad der Osmolarität sowie den speziellen verwendeten Salzen ab. Zum Beispiel stimuliert in E. coli Ammoniumsulfat ((NH₄)₂SO₄) etwa die Hälfte der Menge an intrazellulärer Trehalose-Konzentration wie NaCl, CaC1₂ oder KCl. Bei E. coli in minimalen Medien mit 0,5 M Salz tritt die maximale intrazelluläre Trehalose-Konzentration innerhalb von etwa 10 – 17 Stunden auf, mit einer signifikanten Induktion bei 17 Stunden nach osmotischem Schock (Beispiel 1; 6).
Wie es für den Fachmann leicht ersichtlich ist, kann das Erreichen einer gewünschten zellulären Trehalose-Konzentration auch durch andere Mittel, wie die Einführung von Trehalose in die Zelle(n), bewirkt werden. Dies kann z.B. durch Kultivieren von Zellen in Anwesenheit von Trehalose bewerkstelligt werden, während die Zelle(n) Bedingungen unterworfen werden, welche die Zellwand und -membran permeabilisieren. Beispiele für derartige Bedingungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Bedingungen, die einen Membran-Phasenübergang (wie Zyklen von Abkühlen und Erwärmen oder osmotischem Schock) bewirken, und Elektroporation. Die intrazelluläre Trehalose-Konzentration kann bei diesen Bedingungen bestimmt werden, wie oben beschrieben. Bedingungen, die einen Membran-Phasenübergang bewirken, werden insbesondere auf Gramnegative Bakterien angewendet.
Demgemäß ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Konservierung von prokaryotischen Zellen, umfassend die Schritte des Kultivierens der prokaryotischen Zellen unter Bedingungen, welche die intrazelluläre Trehalose-Konzentration auf mindestens 30 mM mit den hierin beschriebenen Methoden erhöhen, des Mischens der prokaryotischen Zellen mit einer Trocknungslösung und das Trocknens der prokaryotischen Zellen auf solche Weise, dass ein Glas mit weniger als etwa 5 % Restfeuchte produziert wird.
Mischen der prokaryotischen Zellen mit Trocknungslösung. Nachdem intrazelluläre Trehalose auf das gewünschte Maß gesteigert worden ist, werden die prokaryotischen Zellen z.B. durch Zentrifugation geerntet und in einer Trocknungslösung resuspendiert, die ein Kohlenhydrat, bevorzugt ein nicht-reduzierendes Kohlenhydrat, wie Trehalose, enthält.
Besonders bevorzugte nicht-reduzierende Kohlenhydrate sind Trehalose, Maltit (4-O-β-D-Glucopyranosyl-D-glucit), Lactit (4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucit), Palatinit [eine Mischung aus GPS (α-D-Glucopyranosyl-1→6-sorbit) und GPM (α-D-Glucopyranosyl-1→6-mannit)] und dessen einzelne Zuckeralkohol-Komponenten GPS und GPM und hydrierte Maltooligosaccharide und Maltooligosaccharide.
Zusätzlich zu Trehalose umfassen geeigneten Kohlenhydrate, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, nicht-reduzierende Glycoside von Polyhydroxy-Verbindungen, die aus Zuckeralkoholen und anderen geradkettigen Polyalkoholen ausgewählt sind. Andere nützliche Kohlenhydrate umfassen Neotrehalose, Lactoneotrehalose, Galactosyltrehalose, Saccharose, Lactosaccharose, Raffinose, Stachyose und Melezitose. Kohlenhydrate mit schwach reduzierender Aktivität, wie Maltohexose, Maltoheptulose, Sepharose und Dextran, können auch mit Maillard-Reaktions-Inhibitoren verwendet werden, wie in der Patentanmeldung PCT/GB95/01967 beschrieben. Maillard-Reaktions-Inhibitoren können auch verwendet werden, um das Verhalten von instabilen reduzierenden Kohlenhydraten, wie Saccharose, zu verbessern.
Die Konzentration an nicht-reduzierendem bzw. -reduzierenden Kohlenhydrat(en) in der Trocknungslösung hängt von mehreren Variablen ab, spezieller von der Gattung, der Art und/oder dem Stamm der prokaryotischen Zelle, die stabilisiert wird, und dem Trocknungsverfahren. Bei E. coli bertägt die Konzentration an nicht-reduzierendem Kohlenhydrat (Trehalose) bevorzugt mindestens etwa 25 %, mehr bevorzugt mindestens etwa 35 %, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 45 % (Gew./Vol.). Bevorzugt sollte die Kohlenhydrat-Konzentration weniger als etwa 50 % betragen, da höhere Konzentrationen ein wirksames Trocknen beeinträchtigen können.
Bei dem bzw. den Lösungsmittel(n), welche die Grundlage für die Trocknungslösung bilden, kann es sich um irgendeine einer Anzahl von Substanzen handeln, vorausgesetzt, dass sie nicht signifikant die Lebensfähigkeit der Zelle beeinflusst. Bevorzugt ist das Lösungsmittel wässrig.
Die Trocknungslösung kann gegebenenfalls Zusätze enthalten, welche zur Gesamtstabiliät der prokaryotischen Zellen beitragen. Im Allgemeinen erhöhen bevorzugte Zusätze die Viskosität der Trocknungslösung, was wiederum das Trocknungsverfahren durch eine effizientere Schaumproduktion mit höheren T_gs verbessert. Beispiele für Zusätze umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polyvinylpyrrolidone (Kollidon-Reihe: 12, 17, 25, 30. 90; BASF), Carboxymethylcellulose (Blanose HF; Aqualon), Hydroxypropylcellulose und Hydroxyethylstärke (HES; MG 200 000). Bevorzugt liegt Kollidon 90 in der Trocknungslösung bei einer Konzentration von etwa 1,5 % vor. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Carboxymethylcellulose etwa 0,1 %. Besonders bevorzugt ist eine Trocknungslösung, die etwa 45 % Trehalose und entweder etwa 1,5 Kollidon 90 oder etwa 0,1 % Carboxymethylcellulose enthält. Andere Zusätze, die verwendet werden können, umfassen flüchtige Salze, welche zu einer wirksamen Trocknung (über Schaumbildung) beitragen. Beispiele für flüchtige Salze umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat und Ammoniumsulfat. Wenn diese Salze verwendet werden, ist es jedoch möglich, dass der wirksameren Trocknung durch eine geringere Lebensfähigkeit aufgrund des pH und salzspezifischer Effekte entgegengewirkt wird.
Das Volumen der Trocknungslösung, das zu den prokaryotischen Zellen gegeben wird, und so die Dichte der prokaryotischen Zellen in der Trocknungslösung, kann variieren. Jedoch erhöht eine zu geringe Zelldichte proportional die Trocknungszeit pro Zelle; eine zu hohe Dichte kann die Geschwindigkeit und/oder die Effizienz der Schaumbildung und so der Trocknung nachteilig beeinflussen. Darüber hinaus könnte eine zu hohe Zelldichte eine höhere Konzentration der von den Zellen produzierten Schaumverhütungsmittel zur Folge haben. Bevorzugt beträgt die Zelldichte etwa 4 bis 8 × 10⁹ Zellen (CFU) pro ml, obwohl Dichten von so hoch wie 1 × 10¹⁰ Zellen pro ml mit Erfolg verwendet worden sind. Im Allgemeinen ist das Volumen der Trocknungslösung deutlich geringer als das Volumen des Kulturmediums, das für die Erhöhung der intrazellulären Trehalose- Konzentration verwendet wird. Das optimale Volumen variiert etwas mit den Arten von Zellen und gelösten Stoffen und kann leicht empirisch ermittelt werden.
Trocknung der prokaryotischen Zellen. Nach Suspendieren in der Trocknungslösung werden die prokaryotischen Zellen so getrocknet, dass ein Glas gebildet wird. Das Trocknen kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren bewirkt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Luft (d.h. Umgebungstemperatur)-Trocknung, Sprühtrocknung und Gefriertrocknung. Wie hierin verwendet, weist das Glas, das die getrockneten prokaryotischen Zellen enthält, vorzugsweise einen Restfeuchte-Gehalt von weniger als etwa 5 % auf.
Das Trocknen wird bevorzugt bei einem Druck von weniger als Umgebung (d.h. Vakuum) durchgeführt. Bevorzugt beträgt der Druck etwa 0,1 bis 0,075 Torr/mm Hg. Bevorzugter beträgt der Druck etwa 0,075 bis 0,05 Torr/mm Hg. Am bevorzugtesten beträgt der Druck etwa 0,05 bis 0,03 Torr/mm Hg und beträgt die äußere Temperatur etwa 40 °C.
Bevorzugt findet das Trocknen über Gefriertemperaturen und unter einem solchen Vakuum statt, dass eine geschäumte Glasmatrix (FGM) gebildet wird; PCT/GB96/0136. Vakuumtrocknung unter Gefrierbedingungen führt zu geringerer Lebensfähigkeit. Für die Schaffung eines Vakuums kann jeder Vakuumtrockner mit einer Steuerung, vorzugsweise einer programmierbaren Steuerung, des Vakuumdrucks und der äußeren Temperatur verwendet werden. Als Beispiel ist eine Pumpe in der Lage, ein Vakuum von 0,01 Torr/mm Hg bereitzustellen und die Produktkammer innerhalb von 15 – 20 Minuten auf 0,2 – 0,1 Torr/mm Hg hinab zu evakuieren. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Maschinen waren das FTS Systems Inc. (Stone Ridge, New York) Modell TDS 0007-A mit einer VP-62P-Vakuumpumpe und einem FD-0005-A-Kondensatormodul oder das Labconco, Inc. (Kansas City) Modell Nr. 77560 mit einer Lyph-Lock 12-Kondensatoreinheit und einer Edwards E2M8-Zweistufen-Vakuumpumpe.
Die Verringerung des äußeren Drucks hat mindestens zwei gewünschte Auswirkungen. Zuerst verringert sie den Dampfdruck des Lösungsmittels in der Gasphase, was das Verdampfen und das Trocknen beschleunigt. Die erhöhte Verdampfungsgeschwindigkeit bewirkt eine Verdampfungskühlung, falls nicht äußere Wärme angewendet wird, um die latente Verdampfungswärme zu ersetzen. Unter Vakuum wird die Trocknungsgeschwindigkeit durch diese Energiezufuhr beschränkt. So ist die Wirkung der Erhöhung der äußeren Temperatur überraschend, die Trocknungsgeschwindigkeit zu beschleunigen, und nicht, die Probentemperatur zu erhöhen. Die zweite Auswirkung des verringerten äußeren Drucks besteht darin, den Siedepunkt der Probe drastisch zu erniedrigen. Das Sieden kann deshalb durch eine sehr mäßige Erhöhung der Probentemperatur bewerkstelligt werden, die keine schädliche Auswirkung auf das Produkt hat.
Bevorzugt findet die Trocknung in zwei Stufen statt, zuerst Konstanthalten der äußeren Temperatur über eine Zeitspanne und zweitens Erhöhen der äußeren Temperatur, bis die Trocknung vollständig ist. Die Temperatur kann allmählich erhöht werden, z.B. 10 Grad über eine Stunde, oder bevorzugter kann die Temperatur in gleichen Inkrementen erhöht werden, wobei jedes Inkrement über eine Zeitspanne konstant gehalten wird. In einer Ausführungsform wird die Temperatur etwa 16 Stunden lang bei etwa 40 °C gehalten, gefolgt von einer allmählichen Erhöhung der Temperatur auf etwa 80 °C über ungefähr die nächsten 4 Stunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die prokaryotischen Zellen wie folgt getrocknet: Der Druck wird auf 30 mTorr eingestellt, bei einer anfänglichen Lagertemperatur von 40 °C über 16 Stunden, gefolgt von einer inkrementellen Erhöhung der Lagertemperatur auf 80 °C mit einer Geschwindigkeit von 2,5 °C pro Minute in Inkrementen von 2 °C, wobei jedes Inkrement etwa 12 Minuten gehalten wird. Nach dieser Vorschrift findet das Schäumen typisch innerhalb von 60 Minuten ab Beginn der Trocknung statt, und das Trocknungsverfahren ist innerhalb von 24 Stunden beendet, ohne dass die Lebensfähigkeit wesentlichen beeinträchtigt wird. Beispiel 6 liefert eine Versuchsvorschrift.
FGMs werden auch gebildet, indem man die Hauptlösungsmittelmenge aus der Trocknungslösung verdampft, um einen Sirup zu erhalten, den Sirup einem Druck und einer Temperatur aussetzt, die ausreichen, um ein Sieden oder Schäumen des Sirups zu bewirken und Feuchtigkeit so zu entfernen, dass die Restfeuchte etwa 4 %, bevorzugt etwa 3 %, bevorzugter etwa 2,5 % nicht überschreitet.
Im ersten Trocknungsschritt wird das Lösungsmittel so verdampft, dass man einen Sirup erhält. Typisch wird ein „Sirup" als eine Lösung mit einer Viskosität im Bereich von 10⁶ – 10⁷ Pascal·Sekunden definiert. Der Sirup ist nicht als eine festgelegte Konzentration definiert, sondern ist ein Ergebnis davon, dass der Hauptteil des Lösungsmittels aus der Mischung verdampft. Ein Sirup ist typisch eine viskose Mischung, die das Glasmatrix-bildende Material und/oder Zusätze oder prokaryotische Zellen in einer deutlich höheren Konzentration als jener der anfänglichen Mischung enthält. Typisch wird der Verdampfungsschritt unter ausreichenden Bedingungen durchgeführt, um etwa 20 % bis 90 % des Lösungsmittels zum Erhalt eines Sirups zu entfernen. Die Viskosität des Sirups ist bevorzugt derart, dass, wenn der Sirup siedet, das Verdampfen aus der erhöhten Oberfläche, die durch umfangreiche Blasenbildung bereitgestellt wird, dessen Verglasung zur Folge hat.
Unter dem Vakuum hält das rasche Trocknen an, bis die Viskosität der Probe anfängt zuzunehmen. An diesem Punkt verringert die verringerte Mobilität der Wassermoleküle durch den viskosen Sirup die Geschwindigkeit der Verdampfungskühlung, und die Probentemperatur steigt an, bis sie den Siedepunkt beim verringerten Druck erreicht. Beim Sieden findet aufgrund der Blasenbildung des Sirups eine starke Erhöhung der Oberfläche der Flüssigkeits/Gas-Grenzfläche statt. Diese erhöhte Verdampfungsoberfläche verursacht eine scharfe Zunahme der Trocknungsgeschwindigkeit, und der flüssige Schaum trocknet zu einem festen Glasschaum (FGN). Typisch findet dies bald nach dem Sieden statt.
Die Temperaturen des Siedeschritts können über oder unter Umgebungstemperatur liegen. Bevorzugt beträgt die äußere Temperatur bei dem Siedeschritt etwa 5 bis 80 °C. Bevorzugter beträgt die äußere Temperatur etwa 5 bis 60 °C; noch bevorzugter etwa 5 bis 35 °C.
Der Trocknungsprozess hat die Bildung von Blasen zur Folge, was in großem Maß die Verdampfungsoberfläche des Sirups erhöht. Dies ermöglicht eine verstärkte Verdampfung des restlichen Lösungsmittels, und die FGM verglast als fester Schaum der Blasen, die aus dem Siedeschritt resultieren. Der Endpunkt des Siedeschritts kann durch eine Erhöhung der Probentemperatur festgestellt werden, welche bevorzugt über eine ausreichende Zeitspanne beibehalten wird, um ein vollständiges Trocknen sicherzustellen. Die optimale Zeit variiert von Probe zu Probe, ist aber vom Fachmann leicht bestimmbar.
Verschiedene Behälterformen und -größen können gleichzeitig verarbeitet werden. Idealerweise ist die verwendete Behältergröße ausreichend, um die anfängliche Mischung zu enthalten und das Volumen der daraus gebildeten getrockneten Zellen unterzubringen. Im Allgemeinen werden pharmazeutische 3 ml-Fläschchen verwendet. Alle derartigen Fläschchen können verwendet werden, einschließlich pressgeformter und aus Rohren geschnittener Wheaton-Fläschchen. Bevorzugt sind die Fläschchen feuchtigkeitsbeständig, um alle schädlichen Einflüsse aufgrund einer Feuchtigkeitsaufnahme von einer Probe zu eliminieren.
Der Restfeuchte-Gehalt kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Assays gemessen werden, wie dem Karl-Fischer-Coulometer-Verfahren und dem Gravimetrieverfahren. Für die Bestimmung der Restfeuchte unter Verwendung eines Coulometers wird die Restfeuchte unter Verwendung von Formamid extrahiert, gefolgt von einer Messung unter Verwendung eines Coulometers. Die prozentuale Feuchtigkeit in der Probe (Gew./Gew.) wird unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt:
Eine detailliertere Beschreibung dieses Assays wird in Beispiel 2 bereitgestellt. Bevorzugt ist die Restfeuchte gleich oder weniger als etwa 5 %, bevorzugter weniger als etwa 4 %, bevorzugter gleich oder weniger als etwa 3 %, noch mehr bevorzugt gleich oder weniger als etwa 2,5 %. Wenn die Zellen durch allmähliches Erhöhen der Temperatur rascher getrocknet werden als oben beschrieben, kann die Restfeuchte unter 2 % fallen. Das zulässige Maximum für verschiedene Zelltypen kann leicht empirisch bestimmt werden. Im Allgemeinen kann eine Restfeuchte über etwa 5 % für die Lebensfähigkeit schädlich sein. Dies variiert unter anderem in Abhängigkeit von der verwendeten Gattung/Art/dem verwendeten Stamm, der Konzentration und der Art an in der Trocknungslösung verwendetem nicht-reduzierendem Kohlenhydrat, dem Trocknungsverfahren und der Art der Lagerung.
Das resultierende Glas oder die resultierende FGM, welche(s) die getrockneten, stabilisierten prokaryotischen Zellen enthält, sollte eine ausreichend hohe T_g aufweisen, um die Zellen zu konservieren. "T_g" bezeichnet die Temperatur, bei der das Glas einen Übergang in die flüssige Phase eingeht. Variablen, welche T_g festlegen, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Menge an Restfeuchte des oder der getrockneten Präparats/Präparate und der Art von verwendetem Stabilisierungsmittel. Im Allgemeinen erhöhen Protein und Polysaccharide die T_g, während Salze die T_g im Allgemeinen erniedrigen. 4 veranschaulicht die Beziehung zwischen T_g und prozentualer Restfeuchte.
Für die Zwecke dieser Erfindung sollte die T_g mindestens etwa 70°C, bevorzugt mindestens etwa 75°C, bevorzugter mindestens etwa 80°C, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 85°C, am meisten bevorzugt mindestens etwa 90°C betragen. Die T_g kann unter Verwendung von technischen Standardverfahren, wie Differentialscanningkalorimetrie, bestimmt werden. Im Allgemeinen ist die zulässige Lagertemperatur umso höher, je höher die T_g ist.
Die Zeitdauer, die erforderlich ist, um die gewünschte Restfeuchte und/oder T_g zu erzielen, hängt von mehreren Variablen ab, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Probengröße, des Drucks und der Temperatur. Je länger die Proben getrocknet werden, desto niedriger ist im Allgemeinen die Restfeuchte (und damit desto höher die T_g). 5 zeigt die Beziehung zwischen Restfeuchte und Dauer der Trocknungszeit. Das Trocknen kann in so wenig wie 20 Stunden, allgemeiner innerhalb von etwa 24 Stunden erzielt werden. Eine allmähliche Temperaturerhöhung während der Trocknung, wie oben beschrieben, erniedrigt die Trocknungszeit, ohne signifikant die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern (Beispiel 6).
Prokaryotische Zellen, welche durch die hierin offenbarten Verfahren getrocknet werden, können über variierende Zeitdauern bei Umgebungs- oder höheren Temperaturen gelagert werden. Die Zeitdauer, über welche die getrockneten, stabilisierten prokaryotischen Zellen gelagert werden können, hängt unter anderem von der Gattung, der Art und/oder dem Stamm der prokaryotischen Zelle, dem Ausmaß der intrazellulären Trehalose-Produktion und/oder -Konzentration, der Konzentration und der Art des Stabilisierungsmittels in der Trocknungslösung, der gefolgten Trocknungsvorschrift, der Menge an Restfeuchte nach Trocknung und dem akzeptablen Grad der Lebensfähigkeit ab.
Rekonstitution von stabilisierten Zellen. Die prokaryotischen Zellen können nach Trocknung durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden. Demgemäß umfasst die Erfindung Verfahren zur Rekonstitution von prokaryotischen Zellen, welche durch die hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die Natur und Menge des für die Rekonstitution verwendeten Lösungsmittels hängt von den prokaryotischen Zellen sowie ihrer beabsichtigten Verwendung ab. Derartige Ermittlungen können empirisch vom Fachmann vorgenommen werden. Im Allgemeinen können Zellen mit einem wässrigen Lösungsmittel rekonstituiert werden. Wenn die Zellen als Pharmazeutikum zu verwenden sind, geschieht die Rekonstitution bevorzugt mit einem sterilen physiologisch annehmbaren Puffer.
Wenn die prokaryotischen Zellen als Impfstoff zu verwenden sind und demgemäß als immunogenes Mittel, kann ein Adjuvans in einer ausreichenden Menge zugesetzt werden, um die Immunantwort auf das Immunogen zu verstärken. Das Adjuvans kann den prokaryotischen Zellen vor dem Trocknen zugesetzt werden, zum Beispiel kann die Cholera B-Toxin-Untereinheit gleichzeitig mit V. cholera getrocknet werden. Alternativ kann das Adjuvans getrennt zusammen mit den prokaryotischen Zellen rekonstituiert werden.
Geeignete Adjuvantien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Aluminiumhydroxid, Alaun, QS-21 (U.S. Patent Nr. 5,057,540), DHEA (U.S. Patente Nr. 5,407,684 und 5,077,284) und dessen Derivate (einschließlich Salzen) und Vorstufen (z.B. DHEA-S), beta-2-Mikroglobulin (WO 91/16924), Muramyldipeptide, Muramyltripeptide (U.S. Patent Nr. 5,171,568), Monophosphoryllipid A (U.S. Patent Nr. 4,436,728; WO 92/16231) und dessen Derivate (z.B. Detox^TM) und BCG (U.S. Patent Nr. 4,726,947). Andere geeignete Adjuvantien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Aluminiumsalze, Squalen-Mischungen (SAF-1), Muramylpeptid, Saponin-Derivate, Mycobakterium-Wand-Präparate, Mycolsäure-Derivate, nichtionische Block-Copolymer-Tenside, Quil A, Cholera-Toxin B-Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs), wie jene, die von Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875, beschrieben wurden.
Für die Veterinärverwendung und für die Produktion von Antikörpern in Tieren können mitogene Komponenten von Freund'schem Adjuvans verwendet werden. Die Wahl eines Adjuvans hängt teilweise von der Stabilität des Impfstoffs in Anwesenheit des Adjuvans, dem Verabreichungsweg und der vorschriftsmäßigen Annehmbarkeit des Adjuvans ab, insbesondere wenn es für die Human-Verwendung gedacht ist. Zum Beispiel ist Alaun von der United States Food and Drug Administration (FDA) zur Verwendung als Adjuvans bei Menschen zugelassen.
Die Lebensfähigkeit der Zellen (d.h. das Überleben) kann unter Verwendung irgendeines einer Anzahl von in der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden, wie zum Beispiel eines Platten-Assays für Kolonien-bildende Einheiten (CFU). Die Lebensfähigkeit kann zu jedem Zeitpunkt bestimmt werden, einschließlich bevor und unmittelbar nachdem die Zellen getrocknet werden sowie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Lagerung. Es kann wünschenswert sein, die Lebensfähigkeit nach der Rekonstitution, aber vor der Anwendung und/oder Verabreichung der Zellen zu testen.
Bei einem Platten-Assay werden die Zellen zu (einer) gewünschten Zeit(en) mit einem gewünschten Lösungsmittel rekonstituiert, im Allgemeinen sterilem destilliertem Wasser mit einem Volumen, das mindestens gleich dem Volumen der getrockneten Zellen ist. Nach Vortexen werden die Lösungen der rekonstituierten Kulturen in Mineralmedien (zum Beispiel M9 minus einer Kohlenstoff-Quelle) verdünnt (im Allgemeinen zehnfach) und in dreifacher Ausführung wieder innerhalb von 30 Minuten, bevorzugter innerhalb von 15 Minuten auf einer geeigneten Nährsubstanz plattiert. Nach 18- bis 24-stündiger Inkubation bei 37°C wird die Zahl der Kolonien-bildenden Einheiten (CFU) bestimmt. Das Überleben wird als Prozentsatz der Kolonienzahlen zur Zeit null berechnet. Eine detailliertere Beschreibung des Platten-Lebensfähigkeitsassays wird in Beispiel 2 bereitgestellt.
Zusammensetzungen von Zellen, die durch die Verfahren hierin hergestellt wurden. Die Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, welche prokaryotische Zellen umfassen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die Zusammensetzungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, getrocknete prokaryotische Zellen und rekonstituierte prokaryotische Zellen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt worden sind. Die Zusammensetzungen können weiter jedes pharmazeutisch annehmbare Vehikel oder jeden pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfassen, die in der Technik wohlbekannt sind.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht zu beschränken. S. typhimurium 1344 und S. typhi Ty21a wurden vom National Institute of Biological Standards and Control, South Mimms, UK, erhalten.
Beispiel 1
Auswirkung von osmotischem Schock auf die Produktion von intrazellulärer Trehalose in E. coli
E. coli NCIMB Stamm 9484 wurde in Evans-Medium (pH 7,0; Tabelle 1) kultiviert, das eines einer Anzahl von Mitteln für die Erhöhung des osmotischen Drucks enthielt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C in anfänglichem Evans-Medium wurde eine 4 ml-Kultur von E. coli, die in Evans-Medium unter Stickstoff-Beschränkung gezüchtet worden war, verwendet, um eine 200 ml-Kultur von Evans-Medium mit osmotischem Schock zu beimpfen.
Tabelle 1. Evans-Medium und Evans-Medium mit osmotischem Schock
Die intrazelluläre Trehalose-Konzentration wurde, wie nachstehend beschrieben, zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Initiierung des osmotischen Schocks gemessen.
Bestimmung der intrazellulären Trehalose-Konzentration
Die intrazelluläre Trehalose-Konzentration wurde unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wie folgt bestimmt. Trehalose-Standards wurden hergestellt, indem zuerst 10 mM Trehalose in 70 %-igem Ethanol hergestellt wurden, gefolgt von 10-facher Reihenverdünnung von 10 mM bis 10 nM unter Verwendung von 70 %-igem Ethanol als Verdünnungsmittel. 30 μl des Standards wurden in ein Mikroröhrchen gegeben, das 5 Minuten in ein Wasserbad bei 80°C gegeben wurde, während das anfängliche Volumen des Überstands nach Inkubation notiert wurde. Die Mikroröhrchen wurden 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an Chloroform zu dem Überstand wurden die Proben gevortext und 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert. Die Chloroform-Extraktionen wurden zwei weitere Male wiederholt. Das Endvolumen des Überstands wurde unter Verwendung von deionisiertem Wasser auf 500 μl eingestellt. Eine Kalibrierungskurve wurde erzeugt, indem man Proben bei variierenden Konzentrationen testete.
Die Zellproben wurden für die Analyse präpariert, indem man die Zellwand durch Beschallung zerstörte (jedes andere Verfahren, wie Mörser und Pistill, osmotische Lyse, Perlen, kann verwendet werden), begleitet von dem bevorzugt stattfindenden Lösen von Trehalose in 70 %-igem Ethanol, gefolgt von der Entfernung von Triglyceriden durch Chloroform-Extraktion. 1 ml der Zellsuspension wurde in ein Mikroröhrchen gefüllt, das 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde mit 100 μl 70 %-igem Ethanol (anfängliches Volumen) resuspendiert. Das Pelletvolumen wurde durch Messen der relativen Zunahme des anfänglichen Volumens nach Resuspension der Zellen bestimmt. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten in einem Wasserbad bei 80°C inkubiert. Die Röhrchen wurden 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Ein gleiches Volumen an Chloroform wurde dazugegeben, und der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt. Die Chloroform-Extraktion wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Das Endvolumen des Überstands wurde unter Verwendung von deionisiertem Wasser auf 500 μl eingestellt.
Die quantitative Bestimmung von Trehalose wurde mittels HPLC (Beckman Instruments) unter Verwendung einer analytischen Dionex CarboPac PA 100-Säule mit einem gepulsten amperometrischen elektrochemischen Dionex ED40-Detektor erzielt. Die gesamte Trehalose-Konzentration aus dem ursprünglichen Zellpellet wurde als Bruch des extrahierten Endvolumens und Pelletvolumens, multipliziert mit der Trehalose-Konzentration, unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt:
Das Endvolumen des Überstands war das wässrige Volumen, das nach der letzten Chloroform-Extraktion verblieb. Das Pellet-Volumen war die Differenz im resuspendierten Pellet nach der Zugabe von 100 μl 70 %-igem Ethanol. Die Konzentration der gebildeten Trehalose wurde unter Verwendung der Trehalose-Konzentrationskurve bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Signifikante Zunahmen der intrazellulären Trehalose-Konzentrationen wurden 15 – 17 Stunden nach Initiierung des osmotischen Schocks beobachtet, wobei die Werte bei weniger als 20 Stunden ein Maximum aufwiesen.
Beispiel 2
Stabilisierung und Rekonstitution von E. coli unter Verwendung von Trehalose
E. coli (Stamm 9484) wurde in 100 ml-Batch-Kulturen von mit M9 (minimalem Medium) verwandtem minimalem Medium gegeben, das aber einen hohen (0,5 M) Salzgehalt aufwies (Na₂HPO₄, 6 g/l; KH₂PO₄, 3 g/l; NH₄Cl, 0,267 g/l; NaCl, 29,22 g/l; 1 M MgSO₄, 1 ml/l; 0,1 M CaCl₂, 1 ml/l; Thiamin-HCl, 1 ml/l, Glucose bei einer Endkonzentration von 2,5 % Gew./Vol.). Dies ist "modifiziertes M9-Medium". Die Zellen wurden 22 Stunden unter Schütteln bei 37°C gezüchtet. Eine Kontrollkultur, in der das Medium mit 20 mM Betain supplementiert war, worin die Trehalose- Synthese deutlich verringert sein würde, wurde ebenfalls hergestellt. Proben von Kulturen wurden für die Trehalose-Bestimmung (3 × 1 ml), wie in Beispiel 1 beschrieben, und die Protein-Abschätzung mittels des Bradford-Assays (3 × 10 ml; Bio-Rad) entfernt.
Zwei 25 ml-Aliquoten der Test- und Kontrollkultur wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min geerntet. Die Zellpellets wurden in 5 ml 45 % Trehalose, 1,5 % Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 90; BASF) oder 0,1 % Carboxymethylcellulose (Blanose HF; Aqualon) resuspendiert. Die Suspensionen wurden dann zu einem Gesamtvolumen von 10 ml mit einer typischen Dichte von 4 – 8 × 10⁹ Bakterien/ml gepoolt, und 300 μl-Aliquoten wurden in pharmazeutische 3 ml-Fläschchen abgefüllt.
Die Bakterien wurden in einem modifizierten FTS-Gefriertrockner unter Vakuum ohne Einfrieren gemäß dem folgenden Protokoll getrocknet: Vakuum, 30 mTorr; anfängliche Lagertemperatur 40°C über 16 Stunden, gefolgt von einem Anstieg auf 80°C mit einer Geschwindigkeit von 2,5°C pro Minute in Inkrementen von 2°C mit einer Haltezeit von 12 Minuten pro Inkrement. Das Schäumen fand innerhalb von etwa 60 Minuten nach dem anfänglichen Trocknen statt.
Der Restfeuchte-Gehalt wurde wie folgt bestimmt. 1 ml Formamid wurde sorgfältig in jedes Fläschchen abgefüllt, das die getrockneten Bakterien in Trehalose enthielt. 1 ml Formamid, das in ein leeres Fläschchen gegeben wurde, diente als Kontrolle. Die Restfeuchte wurde durch 15- bis 20-minütiges Mischen bei Raumtemperatur extrahiert. Für die Analyse wurden 100 μl des Leerproben-Formamids (Kontrolle) unter Verwendung von Einweg-Nadeln und -Spritzen in ein Reaktionsgefäß gegeben, und der von dem Coulometer (Karl/Fischer) registrierte Wert wurde verzeichnet. Man ließ Sorgfalt walten, keine Luft in die Formamid-Proben einzuführen, da Luft Wasserdampf enthält. Die Test- (und Kontroll-) Proben wurden zweifach gemessen. Der durch das Coulometer bestimmte Wert war gleich μg Wasser. Testprobe minus Leerprobe geteilt durch 100 ist gleich μg Wasser pro μl Formamid in der Probe. Die prozentuale Feuchtigkeit in der getrockneten Probe (Gew./Gew.) ist:
Die Lebensfähigkeit wurde unmittelbar nach Beendigung und zu verschiedenen Zeiten während der Lagerung bei 37°C unter Verwendung eines Platten-Assays bestimmt. Für den Platten-Assay wurden 10-fache Reihenverdünnungen von Zellen unter Verwendung von minimalem Medium minus einer Kohlenstoffquelle als sterilem Verdünnungsmittel erstellt.
30 μl der Zell-Suspension aus dem sechsten Verdünnungsröhrchen wurden unter Verwendung eines sterilen Glasverteilers zu jeder von 3 LB (Luria-Bertuni)-Platten gegeben, um die Kultur über die gesamte Oberfläche der Platte zu verteilen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, und die Kolonien wurden gezählt. X = Zahl der Kolonien X × 33-1/3 × 1 × 106 Verdünnungszone CFU/ml
Die Ergebnisse für eine Lagerung bei 37°C bis zu 45 Tagen sind in 3 gezeigt. Es wurde eine mehr als 50 %-ige Lebensfähigkeit (typisch 50-80 %-ig) in den Trehalose-induzierten Zellen in Proben beobachtet, die unmittelbar nach Trocknung rekonstituiert wurden. Was signifikanter ist, es wurden keine weiteren Verluste bei der Zurückgewinnung von lebensfähigen Zellen bei der Lagerung der getrockneten Zellen beobachtet, selbst bei 45 Tagen Lagerung bei 37°C (3).
Beispiel 3
Southern-Blot-Analyse, um die Anwesenheit des Trehalose-Synthase-Gens nachzuweisen
DNA wurde aus E. coli, S. typhimurium 1344 (1344) und Salmonella typhi Ty21a (Ty21a) unter Verwendung von Standardverfahren präpariert. Genomische E. coli- und Salmonella-DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen Hind III (H), EcoRI (R) oder Bam HI (B) verdaut, auf einem 0,8 %-igen TBE (Tris-Borat-Elektrophoresepuffer)-Agarosegel aufgetrennt und auf Nylon-Filter geblottet. Die Filter wurden unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde durchmustert, welche der otsA/B-Region von E. coli entspricht, welche die Trehalose-Synthase-Gene in E. coli codiert. Nach Hybridisierung wurden die Filter bei niedriger Stringenz gewaschen. Die Gele wurden über Nacht bei E. coli und drei Tage bei Salmonella spp Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Anwesenheit von Trehalose-Synthase-Genen wurde in beiden Stämmen von Salmonella nachgewiesen, wie in 2 gezeigt. Schwachere Banden wurden detektiert, als die Filter unter Bedingungen höherer Stringenz gewaschen wurden.
Beispiel 4
Induktion der Trehalose-Synthese in Salmonella
Salmonella typhimurium (1344) wurde über Nacht bei 37°C in M9- (minimalem) Medium sowohl mit als auch ohne 0,5 M NaCl gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bezüglich der intrazellulären Trehalose-Konzentration mittels HPLC-Analyse analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Das Züchten in Medium mit hohem Salzgehalt zeigte eine 4- bis 5-fache Induktion der Trehalose-Synthese.
Beispiel 5
Beziehung zwischen Tg und Restfeuchte
E. coli (Stamm 9484) wurde in M9-Medien gezüchtet, die einen hohen Salzgehalt enthielten, wie in Beispiel 2 beschrieben. Zum Trocknen wurden die Zellen in einer wässrigen Trocknungslösung suspendiert, die 45 % Trehalose und 1,5 % Kollidon 90 enthielt, und 3 – 24 h unter Vakuum getrocknet, wie in Beispiel 2 beschrieben. Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, und der Restwasser-Gehalt und die Tg wurden bei Aliquoten derselben Probe gemessen, um jede mögliche Schwankung von Fläschchen zu Fläschchen zu eliminieren. Die Ergebnisse der Beziehung zwischen Tg und der Restfeuchte sind in 4 gezeigt.
Beispiel 6
Vergleich der Auswirkung von langsamerer und schnellerer Trocknung auf die Lebensfähigkeit
E. coli (Stamm 9484) wurde in den in Beispiel 2 beschriebenen modifizieren M9-Medien gezüchtet. Zum Trocknen wurden die Zellen in einer wässrigen Trocknungslösung suspendiert, die 45 % Trehalose und 0,1 % Carboxymethylcellulose (Blanose H.F., Aqualon) enthielt.
Man folgte zwei verschiedenen Trocknungsprotokollen: (a) Druck: 30 mTorr; äußere Temperatur 40°C über 16 Stunden, gefolgt vom Erhöhen (Steigern) der Temperatur auf 80°C mit einer Geschwindigkeit von 0,04°C/Minuten in Inkrementen von 2°C, Halten jedes Inkrements über etwa 60 Minuten (langsame Trocknung); (b) Druck, 30 mTorr; äußere Temperatur 40°C über 16 Stunden, gefolgt vom Erhöhen der Temperatur auf 80°C mit einer Geschwindigkeit von 2,5°C/Minute in Inkrementen von 2°C, Halten jedes Inkrements über etwa 12 Minuten (schnelle Trocknung).
Die Lebensfähigkeit wurde unmittelbar nach dem Trocknen gemessen. Die durch schnelle Trocknung hergestellten Proben waren nicht weniger lebensfähig als jene Proben, die durch langsame Trocknung hergestellt wurden. Bereiche zwischen etwa 48 % und 52 % wurden bei den "schnell" getrockneten Proben beobachtet, während bei den "langsam" getrockneten Proben zwischen etwa 40 % und 52 % beobachtet wurden. Im Durchschnitt zeigten die "schnell" getrockneten Proben eine höhere Lebensfähigkeit als die "langsam" getrockneten Proben.
Die Auswirkung der Länge der Trocknungszeit auf die Lebensfähigkeit ist in 8 gezeigt. Die Trocknungslösung enthielt 45 % Trehalose und 0,1 % CMC. Das FTS-Trocknungsprotokoll war 30 mTorr ST 40°C über variierende Zeitspannen.
Beispiel 7
Vergleich der Auswirkungen von verschiedenen Hilfsstoffen auf die Stabilisierung der äußeren Membran von E. coli 9894 nach intrazellulärer Induktion von Trehalose
E. coli Stamm 9894 wurde in 100 ml-Batch-Kulturen von minimalem Medium eingeimpft, das mit M9 verwandt war, aber mit einem hohen (0,5 M) Salzgehalt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Zellen wurden 22 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator gezüchtet (frühe stationäre Phase). Proben der Kulturen wurden für die Trehalose-Bestimmung (3 × 1 ml) und die Protein-Abschätzung mittels des Bradford-Assays (3 × 10 ml; Bio-Rad) entfernt. Die Trehalose-Konzentration wurde als μMol (mg Protein)^–1 ausgedrückt.
Die intrazelluläre Trehalose-Konzentration wurde unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie mit elektrochemischer Detektion bestimmt. Kalibrierungsstandards wurden hergestellt, indem man zuerst eine Vorratslösung von 1 mM Trehalose-, Glucose-, Saccharose- und Maltose-Standard in Wasser herstellte, gefolgt von Reihenverdünnungen von 1 mM bis 2,5 μM unter Verwendung von Wasser als Verdünnungsmittel.
1 ml Zellsuspension wurde in ein Mikroröhrchen gefüllt, das 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert wurde, und der Überstand wurde entfernt. Das Zellpellet wurde in 200 μl 80 %-igem Ethanol resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Analyse präpariert, indem man die Zellwand 10 Minuten in einem Bad bei 80°C aufbrach, begleitet von einem bevorzugt stattfindenden Lösen aller intrazellulärer Zucker in 80 %-igem Ethanol. Die Suspension wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Ein gleiches Volumen Chloroform wurde zum Überstand gegeben und gevortext, und die Probe wurde zentrifugiert, wobei Triglyceride durch die Chloroform-Extraktion entfernt wurden. Die wässrige Schicht wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt, und die Chloroform-Extraktion wurde wiederholt. Die wässrige Schicht wurde in HPLC-Fläschchen abgefüllt und im Vakuum getrocknet, gefolgt von einer Rehydratisierung unter Verwendung von 500 μl sterilem Wasser.
Die quantitative Bestimmung der Trehalose wurde mittels HPLC (Dionex DX-500) unter Verwendung einer analytischen Dionex CarboPac PA-Säule mit einem gepulsten amperometrischen elektrochemischen Dionex ED-40-Detektor erzielt. Die Trehalose-Konzentration wurde aus der Kalibrierungskurve bestimmt.
Zwei 30 ml-Aliquoten aus jedem Kolben wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min geerntet. Die Zellpellets wurden in 8 ml 25 – 45 % Zucker, 0,1 % CMC (Natriumcarboxymethylcellulose; Blanose 7HF; Aqualon) resuspendiert. Die Suspensionen wurden dann zu einem Gesamtvolumen von 16 ml mit einer typischen Zelldichte von 4 – 8 × 10⁹ CFU/ml gepoolt, und 300 μl-Aliquoten wurden in pharmazeutische 3 ml-Fläschchen abgefüllt.
Die Bakterien wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls unter Vakuum ohne Einfrieren getrocknet: Vakuum, 30 mTorr; anfängliche Lagertemperatur 40°C über 16 Stunden, gefolgt vom Erhöhen auf 80°C mit einer Geschwindigkeit von 2,5°C/min in Inkrementen von 2°C mit einer Haltezeit von 12 Minuten pro Inkrement. Das Schäumen fand zwischen 60 – 120 Minuten der anfänglichen Trocknung statt.
Die Lebensfähigkeit wurde unmittelbar vor und nach Beendigung des Trocknungsverfahrens und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Lagerung bei 37°C unter Verwendung eines Platten-Assays bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der Restfeuchte-Gehalt und die Glasübergangstemperatur wurden ebenfalls bestimmt.
Die Ergebnisse für die Lagerung bei 37°C sind in Tabelle 2 gezeigt. Nach 6-wöchiger Lagerung von E. coli bei 37°C unter Verwendung der nichtreduzierenden Zucker Trehalose, Palatinit oder Lactit als Hilfsstoffe für die Stabilisierung der äußeren Membran wurde kein signifikanter Verlust bei der Zurückgewinnung von lebensfähigen Zellen beobachtet. Was bedeutender ist, es wurde mehr als 99 % Verlust bei dem reduzierenden Zucker Glucose beobachtet.
Tabelle 2. Zurückgewinnung lebensfähiger E. coli 9484-Zellen unmittelbar nach Beendigung von QT4-Trocknung und nach 3 und 6 Wochen Lagerung bei 37°C
Beispiel 8
Vergleich von QT4 (dem Verfahren von Beispiel 2) und der Gefriertrocknung von E. coli
E. coli NCIMB Stamm 9484 wurde in 250 ml Batch-Kultur von modifiziertem M9-Medium eingeimpft. Die Zusammensetzung dieses Mediums wurde in Beispiel 2 beschrieben. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Proben der Kulturen wurden für die Trehalose-Bestimmung (6 × 1 ml) und Protein-Abschätzung mittels des Bradford-Assays (5 × 10 ml) entfernt, wie in Beispiel 7 beschrieben.
Acht 25 ml-Aliquoten wurden aus dem Kolben entfernt, und die Bakterien wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min geerntet. Die Zellpellets wurden in 8 ml 45 % Trehalose, 0,1 % CMC (Natriumcarboxymethylcellulose; Blanose 7HF; Aqualon) resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden dann auf ein Gesamtvolumen von 64 ml mit einer typischen Zelldichte von 0,5 – 1,2 × 10⁹ CFU/ml gepoolt. 300 μl- und 500 μl-Aliquoten wurden in pharmazeutische 3 ml-Fläschchen für ein Schäumungs- bzw. Gefriertrocknungs-Verfahren abgefüllt.
Die Bakterien wurden ohne Einfrieren unter Verwendung des QT4-Schäumungsprotokolls getrocknet, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Bakterien wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls gefriergetrocknet: Temperaturerniedrigung mit 2,5°C/min auf eine anfängliche Lagertemperatur von –40°C; die primäre Trocknung wurde bei einem Vakuumdruck von 30 mTorr bei –40°C durchgeführt, 40 Stunden gehalten; die sekundäre Trocknung wurde bei einem Temperaturanstieg mit 0,05°C/min von –40 auf 30°C und 12-stündigem Halten durchgeführt.
Die Lebensfähigkeit wurde unmittelbar vor und nach Beendigung der Trocknungsverfahren und nach 3 Wochen Lagerung bei 37°C unter Verwendung eines Platten-Assays bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der Restfeuchte-Gehalt und die Glasübergangstemperatur wurden ebenfalls bestimmt.
Die Ergebnisse für die Lagerung bei 37°C sind in Tabelle 3 gezeigt. Nach 3-wöchiger Lagerung bei 37°C wurde sowohl bei den durch das QT4-Verfahren getrockneten Bakterien als auch bei den gefriergetrockneten Bakterien kein signifikanter Verlust der Bakterien-Lebensfähigkeit beobachtet. Der Restfeuchte-Gehalt und die Glasübergangstemperatur bei den QT4-getrockneten Bakterien betrugen 1,85 ± 0,2 % bzw. 69,05 ± 5,0°C. Die Tg bei den gefriergetrockneten Bakterien betrug 104,5 ± 2,1 °C, und der Restfeuchtegehalt betrug 0,70 ± 0,2 %.
Tabelle 3. Vergleich zwischen QT4-Trocknung und Gefriertrocknung bei der Zurückgewinnung von lebensfähigen E. coli 9484-Zellen nach Lagerung bei 37°C
Beispiel 9
Intrazelluläre Akkumulation von Trehalose bei der Züchtung von S. typhimurium bei 37°C in einem Medium mit hohem Salzgehalt
S. typhimurium 1344 wurde in Batch-Kultur in minimalem Salmonella-Züchtungsmedium sowohl mit als auch ohne 0,5 M NaCl (NaCl, 29,22 gl^–1; (NH₄)₂SO₄, 0,66 gl^–1; K₂HPO₄, 10,5 gl^–1; KH₂PO₄, 4,5 gl^–1; MgSO₄, 0,1 gl^–1; Tryptophan, 20 mgl^–1; Glucose bei einer Endkonzentration von 2,5 % Gew./Vol.) über eine Zeitspanne von 106 Stunden bei 37°C gezüchtet. Proben wurden periodisch für eine Protein-Messung mittels des Bradford-Assays und eine Bestimmung von intrazellulärer Trehalose mittels HPLC, wie in Beispiel 7 beschrieben, entfernt. Die Trehalose-Konzentrationen wurden in μMol Trehalose (mg Protein)^–1 ausgedrückt.
Zwischen 30 und 76 Stunden nach Impfung wurden signifikante Trehalose-Konzentrationen beobachtet, die ein Maximum von 0,53 μMol Trehalose (mg Protein)^–1 nach 48 Stunden erreichten, wie in 9 gezeigt.
Beispiel 10
Stabilisierung von S. typhimurium 1344 bei 37°C unter Verwendung von Trehalose
S. typhimurium 1344 wurde in Batch-Kultur in minimalem Salmonella-Wachstumsmedium mit 0,5 M NaCl gezüchtet. Die Zellen wurden 60 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator gezüchtet und in der frühen stationären Phase durch Zentrifugation geerntet. Eine Kontrollkultur, bei der das Grundmedium kein Salz enthielt, wurde ebenso hergestellt und in der stationären Phase geerntet, in welcher die Trehalose-Synthese deutlich verringert sein würde, da es keinen osmotischen Stress gibt.
Zwei 25 ml-Aliquoten aus jedem Kolben wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min geerntet. Die Zellpellets wurden resuspendiert und im geeigneten Wachstumsmedium gewaschen. Das resultierende Zellpellet wurde in 8 ml 45 % Trehalose, 0,1 % CMC (Blanose 7HF, Aqualon) resuspendiert. Die Suspensionen wurden dann zu einem Gesamtvolumen von 16 ml mit einer typischen Zelldichte von 2 – 4 × 10⁹ CFU/ml gepoolt, und 300 μl-Aliquoten wurden in pharmazeutische 3 ml-Fläschchen abgefüllt. Die Bakterien wurden unter Vakuum ohne Einfrieren getrocknet, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das Schäumen fand zwischen 60 – 120 Minuten nach Trocknungsbeginn statt.
Proben der Kulturen (3 × 1 ml) wurden für die Trehalose-Bestimmung und Protein-Abschätzung mittels des Bradford-Assays (3 × 10 ml; Bio-Rad) entfernt. Die Trehalose-Konzentration wurde als μMol (mg Protein)^–1 ausgedrückt, wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Lebensfähigkeit wurde unmittelbar vor und nach Beendigung des Trocknungsverfahrens und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Lagerung bei 37°C unter Verwendung eines Platten-Assays bestimmt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der Restfeuchte-Gehalt und die Glasübergangstemperatur wurden ebenfalls bestimmt.
Die Lagerungsergebnisse bei 37°C sind in 12 gezeigt. Bei S. typhimurium 1344, das osmotisch induziert wurde, um intrazelluläre Trehalose zu akkumulieren, wurde nach 6 Wochen Lagerung kein signifikanter Verlust an Lebensfähigkeit beobachtet. Signifikanterweise wurden mehr als 99 % Verlust bei den nicht-induzierten Bakterien beobachtet.
Beispiel 11
Bestätigung der Anwesenheit des Trehalose-6-phosphat-Synthase (otsA)-Gens in E. coli (NCIMB 9484) und Salmonella spp
Extrahierte genomische DNA aus E. coli 9484, S. typhimurium 1344 und S. typhi Ty21a wurde durch OD260/280 nm und Agarosegel-Analyse qualitativ bestimmt. Jedes DNA-Präparat wurde getrennt hergestellt, um die Abwesenehit einer Kreuzkontamination sicherzustellen. Die DNA wurde dann verwendet, um PCR-Reaktionen mit degenerierten Primern (worin jede dritte Base entweder durch eine Auswahl von Basen oder ein Inosin substituiert worden ist, um jegliche Sequenzänderungen zu gestatten), Guessmer-Primern (Sequenzauswahl auf der Grundlage von spezifischer Salmonella-Codon-Verwendung) und E. coli-Primern (allein auf der Grundlage der E. coli-Sequenz), wie in Tabelle 4 gezeigt, durchzuführen. Jeder Satz produzierte mindestens eine positive Reaktion. Die relevanten Fragmente wurden auf Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt laufen gelassen und gereinigt.
Tabelle 4. otsA-Gen-Sonden für E. coli, S. typhimurium 1344 und S. typhi Ty21a
Die 700 bp-Fragmente wurden in pCR3.1 ligiert und dann in Einzelzellen überführt und sequenziert. Die resultierenden Sequenzdaten für otsA zeigten eine Sequenzhomologie von 77 % zwischen S. typhimurium 1344 und E. coli 9484. Die Sequenzdaten demonstrierten auch, dass nur 6 Basen aus insgesamt 715 zwischen den zwei Salmonella spp-Stämmen verschieden waren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Konservieren von prokaryotischen Zellen, umfassend die Schritte: a) Erhöhen der intrazellulären Trehalose-Konzentration in den prokaryotischen Zellen auf mindestens 30 mM; b) Mischen der in Schritt a) erhaltenen prokaryotischen Zellen mit einer Trocknungslösung, die ein Kohlenhydrat enthält; und c) Trocknen des Produkts von Schritt b) unter ausreichenden Bedingungen, um eine Glasform des Kohlenhydrats mit weniger als 5% Restfeuchte zu ergeben.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren zur Erhöhung der intrazellulären Trehalose-Konzentration ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kultivieren bei einer Osmolarität, die ausreichend ist, um die intrazelluläre Trehalose-Konzentration zu erhöhen, Expression eines rekombinanten Trehalose-Synthase-Gens oder Genen und Einführen von exogener Trehalose.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Osmolarität mindestens 350 mOsmol–1,5 Osmol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Osmolarität mindestens 400 mOsmol–1 Osmol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Osmolarität mindestens 300 mOsmol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Osmolarität mindestens 500 mOsmol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Osmolarität erhöht wird durch Zusatz mindestens eines Salzes, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Na₂PO₄, KH₂PO₄, NH₄Cl, NaCl, MgSO₄, CaCl₂, Thiamin-HCl oder irgendeiner Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die prokaryotischen Zellen Bakterien sind.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Bakterien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Bacillus, Salmonella oder Vibrio.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kohlenhydrat Trehalose ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die intrazelluläre Trehalose-Konzentration mindestens 100 mM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kohlenhydrat ein nicht-reduzierendes Kohlenhydrat ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Trocknungslösung mindestens 25% nicht-reduzierendes Kohlenhydrat enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Trocknungslösung mindestens 45% nicht-reduzierendes Kohlenhydrat enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das nicht-reduzierende Kohlenhydrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Maltitol (4-O-β-D-Glucopyranosyl-D-glucitol), Lactitol (4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucitol), einer Mischung von GPS (α-D-Glucopyranosyl-1→6-sorbitol) und GPM (α-D-Glucopyranosyl-1→mannitol), GPS, GPM und hydrierten Maltooligosacchariden und Maltooligosacchariden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Trocknung die folgenden Schritte umfasst: a) Eindampfen der Lösung, um einen Sirup zu erhalten; b) Aussetzen des Sirups einem reduzierten Aussendruck und einer ausreichenden Temperatur, um ein Sieden des Sirups zu bewirken; und c) Entfernen von Feuchtigkeit, so dass die Restfeuchte nicht mehr als 5% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Vakuum anfänglich etwa 30 mT bei einer Anfangstemperatur von 40°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt c) ferner folgende Schritte umfasst: i) Halten der Temperatur bei 40°C für 16 Stunden; und ii) schrittweises Erhöhen der Temperatur auf 80°C mit einer Rate von 2,5°C pro Minute und Einzelschritten von 2°C, wobei jeder Einzelschritt eine Dauer von 12 Minuten hat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glas eine Restfeuchte hat, die 2,5% nicht überschreitet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Glas eine geschäumte Glasmatrix ist.
Zusammensetzung umfassend prokaryotische Zellen, die in einer Kohlenhydratmatrix in Glasform mit einer Restfeuchte von weniger als 5% dispergiert sind, wobei die Zellen eine intrazelluläre Trehalose-Konzentration von mindestens 30 mM aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das Kohlenhydrat wie in irgendeinem der Ansprüche 10 bis 15 definiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die prokaryotischen Zellen wie in Anspruch 8 oder Anspruch 9 definiert sind.