DE60035497T2

DE60035497T2 - Verfharen zur konservierung von viren und mycoplasma

Info

Publication number: DE60035497T2
Application number: DE60035497T
Authority: DE
Inventors: Eric Edward Worrall
Original assignee: Anhydro Ltd
Current assignee: Anhydro Ltd
Priority date: 1999-05-04
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-05-04
Also published as: OA11936A; EA004131B1; CA2365277A1; EA200101167A1; WO2000066710A3; AP1521A; US6664099B1; AU776982B2; JP2002542815A; DK1175486T3; KR100616195B1; EP1175486A2; MXPA01011145A; TR200103149T2; WO2000066710A2; DE60035497D1; ATE366797T1; CN1433465A; EP1175486B1; KR20020012201A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Haltbarmachung von Viren und Mycoplasma. Insbesondere bezieht sie sich auf ein ultraschnelles Verfahren, durch das solche Materialien unter Verwendung des Disaccharids Trehalose haltbar gemacht werden können. Durch dieses Verfahren kann eine Langzeithaltbarmachung von Viren und/oder Mycoplasma erreicht werden und speziell können lebende abgeschwächte Impfstoffe hergestellt werden.
Die Haltbarmachung von biologisch abbaubaren Materialien durch Dehydratisierung und Osmokonzentration ist eine bekannte und alte Technologie. Wenn die Haltbarmachung empfindlicher Biomoleküle notwendig wurde, versagte einfaches Trocknen durch Dehydratisierung, da Strukturwasser entfernt wurde, was die anschließende Denaturierung und den Verlust der Lebensaktivität verursachte. Kältekonservierung in flüssigem Stickstoff und Lyophilsierung wurden die akzeptierten Verfahren für die Langzeithaltbarmachung von empfindlichen Biomolekülen, wobei letzteres Verfahren umfangreich für die Haltbarmachung von lebenden abgeschwächten Impfstoffen verwendet wurde.
Verbesserte Wärmetoleranz von gefriergetrocknetem Rinderpest-Impfstoff ist durch Verlängern des zweiten Trocknungszyklus erreicht worden, um die Restfeuchtegehalte (RM-Gehalte) auf rund 1% bis 2% zu verringern. Dies hatte lange und energieaufwendige Betriebszyklen von bis zu 72 Stunden zur Folge, wie von Mariner, J. C. et al., Vet. Microbiol., 1990, 21, 195–209, beschrieben. Impfstoffe, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, sind bekannt und werden von dem Standardimpfstoff durch den Namen „THERMOVAX" unterschieden.
Wie oben erwähnt, sind diese derzeit verwendeten Verfahren zeitaufwendig und umfassen einen hohen Energieeinsatz. Außerdem verleiht die Lyophilisierung dem Endprodukt nur ein mäßiges Niveau an Wärmetoleranz, und eine Kühlung ist dennoch erforderlich, um eine Verschlechterung während der Lagerung zu verringern. Dies ist ein besonderes Problem bei Lebendimpfstoffen, die im tropischen Klima verwendet werden sollen, da diese ihre Wirksamkeit mit dem unerfreulichen Ergebnis verlieren, daß Impfprogramme, die in tropischen Län dern durchgeführt werden, wo die Überwachung der „Kühlkette" schwierig ist, schließlich zur Impfung von Patienten mit minderwertigem oder in einigen Fällen nutzlosem Impfstoff führt.
Während der evolutionären natürlichen Selektion bleiben bestimmte Spezies von Pflanzen und Tieren, die die bemerkenswerte und elegante Fähigkeit erwarben, extreme Dehydratisierung zu tolerieren, in feindlichen Umgebungen für sehr lange Zeit inaktiv und sind dennoch fähig, bei Rehydratisierung die vollständige Lebensaktivität anzunehmen. Beispiele umfassen die wiederauflebende Pflanze Selaqinella lepidophyla, der Salzkrebs Artemia salina (Clegg, J., J. Comp. Biochem. Physiol, 1967, 20, 801–809), die Hefe Saccharomyces cerevisiae (Coutinho, E., Journal of Biotechnology, 1988, 7, 23–32) und die Tardigraden Macrobiotus hufelandi (Kinchin, I. M., Biologist, 1995, 42, 4). Diese Organismen werden als cryptobiotisch bezeichnet, und das Verfahren, durch das sie überleben, ist als Anhydrobiose bekannt. Alle Spezies von Tieren und Pflanzen, die diese Fähigkeit zeigen, enthalten das Disaccharid Trehalose (α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid). Ihr Vorhandensein, im allgemeinen in der Größenordnung von 0,2 g/g Trockenzellgewicht in den meisten Cryptobionen, ermöglicht ihnen, extremer Dehydratisierung, hohen Temperaturen, Röntgenstrahlen und ebenso bei einigen Spezies von Tardigraden Drücken von bis zu 600 MPa zu widerstehen.
Colaco et al., Biotechnology, 1992, 10, 1007–1011, beschreiben den Vorteil der schnellen Trocknung von biologischen Materialien unter Verwendung von Trehalose. Dieses Verfahren bezieht sich hauptsächlich auf das Trocknen von Restriktionsenzymen und Immunoglobulinen auf vorgeformten festen Matrizen, wie Cellulosefasern, oder auf den Oberflächen von Kunststoffplatten für diagnostische Zwecke, wie ELISA oder ähnliche diagnostische Anwendungen im Labor. Jedoch treten mit diesen Techniken Probleme auf, wenn sie auf industrielle Anwendungen vergrößert werden, wie eine kommerzielle Impfstoffherstellung im großen Maßstab, bei der viel größere Einheitszahlen und -volumen unter Verwendung von obligatorischen aseptischen Techniken in teilweise verschlossenen Phiolen gehandhabt werden müssen. Um die betrieblichen Anforderungen der Impfstoffherstellung im großen Maßstab zu erfüllen, bei der Einheitsvolumen von 1,0 ml aufwärts und Produktionschargen von 20 Liter typisch sind, ist eine andere Strategie erforderlich, um das Volumen an Wasser in einer wirtschaftlich akzeptablen Zeit zu entfernen. Das Trocknen bei Atmosphärendruck, selbst bei den höchsten physiologisch tolerierten Temperaturen, würde eine unannehmbar lange Zeit erfor dern, um Wasser schnell genug aus teilweise verstöpselten Impfstoffphiolen zu entfernen, und würde zwangsläufig zur Denaturierung und zum Verlust an Wirksamkeit führen.
Gemäß WO-A-9640077 können biologische und/oder pharmazeutische Materialien durch deren Einführen in Schaumglasmatrizen (FGMs), die beispielsweise aus Kohlenhydraten gebildet werden, lagerstabil gemacht werden. Das Dokument beschreibt die Bildung von FGMs, die Masern oder das orale Poliovirus enthalten, indem eine konzentrierte (50% Gewicht/Volumen) Trehaloselösung, die das Virus enthält, dem Sieden unter reduziertem Druck unterzogen wird. Produkte mit den niedrigsten Restfeuchtegehalten wurden jedoch dann erhalten, wenn ein flüchtiges Salz in die Trehaloselösung eingeführt wurde, um die FGM-Bildung zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Haltbarmachung von Viren oder Mycoplasma unter Verwendung von Trehalose unter Bedingungen, die dafür sorgen, daß Wasser entfernt wird, während gleichzeitig die biologische Integrität des Materials aufrechterhalten werden kann.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Haltbarmachen eines biologisch aktiven Materials bereit, umfassend ein lebendes Virus oder Mycoplasma, wobei das Verfahren die Schritte:

(i) Mischen einer wäßrigen Suspension des biologisch aktiven Materials mit einer sterilen wäßrigen Trehaloselösung, um eine Trehalosekonzentration in dem Gemisch im Bereich von 2,5 bis 8% Gewicht/Volumen zu erhalten;
(ii) Unterziehen des Gemisches einer ersten Trocknung für 30 bis 60 Minuten bei einem Druck von weniger als Atmosphärendruck, wobei die Temperatur des Gemisches anfänglich nicht mehr als 37°C beträgt und so geregelt wird, daß sie nicht auf 0°C oder darunter fällt, und die schließlich nicht mehr als 40°C beträgt, wodurch eine glasartige poröse Matrix gebildet wird, die glasartige Trehalose mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 10% umfaßt und in der Matrix getrocknetes biologisch aktives Material enthält; und
(iii) Unterziehen der glasartigen porösen Matrix aus Schritt (ii) einer zweiten Trocknung für 10 bis 30 Stunden bei einem Druck von nicht mehr als 0,1 mbar und bei einer Temperatur, die schließlich im Bereich von 40 bis 45°C liegt, wodurch eine Trehalosematrix mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 2% gebildet wird, die in der Matrix getrocknetes biologisch aktives Material enthält.

Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung ist es möglich, ein lebendes Virus mit, im Vergleich zu den Verfahren des Standes der Technik, verbesserten biologischen Eigenschaften und deutlichen kommerziellen Vorteilen herzustellen. Impfstoffe, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung hergestellt werden, werden viel schneller als die unter Verwendung konventioneller Gefriertrocknungsverfahren getrocknet. Beispielsweise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um Gemische aus Trehalose und biologisch aktivem Material auf einen Feuchtegehalt von etwa 10% in weniger als einer Stunde zu trocknen. Ferner kann die Dehydratisierung auf einen Restfeuchtegehalt von etwa 1 bis 2% in weniger als 30 Stunden, beispielsweise etwa 20 Stunden, im Vergleich zu einem Zeitraum von 50 Stunden durch konventionelle Gefriertrocknungsverfahren erreicht werden. Außerdem wird der Schaden, der durch die Konzentration an gelöster Substanz verursacht wird, gemäß der vorliegenden Erfindung minimiert und insbesondere eine schädigende Eiskristallisation vermieden. Die Wärmestabilität des biologisch aktiven Materials, die in der glasartigen Trehalosematrix haltbar gemacht wird, ist größer als die von Materialien, die durch Verfahren des Standes der Technik haltbar gemacht werden, und daher wird die Notwendigkeit der „Kühlkette", die eine ernste Beschränkung bei konventionellem gefriergetrocknetem Impfstoff darstellt, minimiert. Das Produkt der vorliegenden Erfindung kann hohen Umgebungstemperaturen, z. B. bis zu etwa 45°C, für längere Zeiträume ohne jeglichen wesentlichen Verlust an biologischer Aktivität ausgesetzt werden. Zusätzlich zu diesen und anderen Vorteilen der vorliegenden Erfindung zeigt das Produkt des Verfahrens eine sofortige, sehr rasche Löslichkeit bei Rehydratisierung.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zum Erreichen der Langzeithaltbarmachung von Viren und Mycoplasma geeignet. Insbesondere kann es verwendet werden, um stark labile lebende abgeschwächte Viruskomponenten und Mycoplasmakomponenten haltbar zu machen, die rehydratisiert werden können, um Impfstoffe zu bilden. Beispiele von solchen biologisch aktiven Materialien, die gemäß dem Verfahren der Erfindung haltbar gemacht werden können, umfassen:

Familie: Paramyxoviridiae
Unterfamilie: Paramyxovirinae
Gattungen: Parainfluenzavirus-Gruppe, Masern, Rinderpest, Hundestaupe, Peste-des-petitsruminants (PPR)
Paramyxovirus: Mumpsvirus (Mumps)
Gattung: Rubivirus, Rubella (Röteln)
Gattung: Flavivirus, Gelbfieber-Virus (Gelbfieber)
Gattung: Rhabdoviren, Lyssaviridiae (Tollwutvirus)
Picorna-Viren (Poliovirus)
Newcastle-Virus
Mycoplasma: Mycoplasma mycoides (infektiöse Pleuropneumonie der Rindes)
Brucelia abortus: Stamm-19-Impfstoff
Chlamydia: Chlamydia psittaci (Enzootic abortion)
Coccidia: Toxoplasma gondii (Toxoplasmosis)

Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das biologisch aktive Material, das haltbar gemacht werden soll, als eine Suspension in einem entsprechenden wässerigen Medium hergestellt. Im Falle eines Virus kann es notwendig sein, dieses in einem entsprechenden Kulturmedium zu kultivieren, beispielsweise in Verozellen, und dann vor der Suspension zu ernten, um eine nutzbare Konzentration an Material bereitzustellen. Typischerweise wird der pH der wässerigen Suspension an biologisch aktivem Material, beispielsweise durch die Zugabe eines Alkalis, auf einen pH in dem Bereich von 7,0 bis 7,8, insbesondere etwa 7,4, eingestellt.
Trehalose ist eines der stabilsten und chemisch nicht-reaktiven Disaccharide. Sie weist eine sehr niedrige Bindungsenergie von weniger als 1 Kcal/Mol auf, was die Dimerstruktur sehr stabil macht. Sie unterliegt weder einer Karamelisierung, wenn sie nicht stark erhitzt wird, noch ruft sie die Maillard-Reaktion mit Proteinen oder Peptiden hervor. Die natürliche Dihydratstruktur, enthaltend zwei Wassermoleküle, ermöglicht ungewöhnliche Flexibilität um die Disaccharidbindung, was möglicherweise eine engere Assoziierung mit tertiär strukturierten Biomolekülen erlaubt. Sie ist zwar nicht hygroskopisch, zeigt aber eine sehr rasche Löslichkeit bei der Hydratisierung, eine Eigenschaft, die speziell für getrocknete Impfstoffe nützlich ist.
Die wäßrige Suspension des biologisch aktiven Materials wird mit einer sterilen wäßrigen Lösung aus Trehalose gemischt, und das Gemisch wird so hergestellt, daß es eine Trehalosekonzentration von 2,5 bis 8% Gewicht/Volumen haben wird. Innerhalb des Bereiches der Trehalosekonzentrationen wird die tatsächlich verwendete Konzentration im allgemeinen von der Einheitsgröße des biologisch aktiven Materials abhängen. Für kleine Virusteilchen ist weniger Trehalose erforderlich als für große Zellen.
Das Gemisch aus steriler wäßriger Trehalose und biologisch aktivem Material wird einem Vakuumtrocknungsverfahren unterzogen, umfassend einen ersten Trocknungsschritt, gefolgt von einem zweiten Trocknungsschritt. Bevorzugt wird eine konventionelle Gefriertrocknungsvorrichtung (wie z. B. durch EDWARDS, CHRIST, USIFROID oder SAVANT hergestellt) für das Trocknungsverfahren verwendet, um eine kontrollierte Umgebung für die kritischen Phasen in dem Verfahren bereitzustellen. Es wird jedoch hervorgehoben, daß, wenn eine solche Vorrichtung verwendet wird, die Gefriertrocknungsbedingungen nicht angewendet werden und das Material nicht dem Gefriertrocknen unterzogen wird. Das Trocknungsverfahren umfaßt zwei Trocknungsstufen, eine erste Trocknungsstufe, in der der Restfeuchtegehalt des Materials auf einen Wert von nicht größer als 10% verringert wird, und eine zweite Trocknungsstufe, in der der Restfeuchtegehalt des Materials weiter auf einen Wert verringert wird, der 2% nicht überschreitet.
In der ersten Trocknungsstufe wird die anfängliche Temperatur der Trocknungsvorrichtung so sein, daß sichergestellt wird, daß die Temperatur des Trehalosegemisches nicht größer als 37°C sein wird und bevorzugt 37°C betragen wird, um jeglichen Verlust der biologischen Aktivität in dieser Stufe in dem Verfahren zu verhindern. Wenn Wasser aus dem Gemisch abgedampft wird, fällt die Temperatur des Gemisches. Die Trocknung wird jedoch so durchgeführt, daß sichergestellt wird, daß kein Gefrieren oder keine Sublimation aus Eis stattfindet, wie es normalerweise in konventionellen Gefriertrocknungsverfahren der Fall ist, d. h. die Temperatur des Produktes während dieser Stufe des Trocknungsverfahrens wird so geregelt, daß sie nicht auf 0°C oder darunter fällt, und wird typischerweise so geregelt, daß sie nicht unter 4°C fällt. Der Druck wird unter Atmosphärendruck verringert, bevorzugt auf einen Wert von 800 bis 300 mbar.
Die erste Trocknungsstufe wird für einen Zeitraum zwischen 30 und 60 Minuten fortgesetzt, währenddessen die Temperatur des Trehalosegemisches anfänglich fällt, wenn Wasser abgedampft wird, und dann steigt. Wenn eine Temperatur (unter dem eingesetzten reduzierten Druck) von etwa 25°C während dieser Verfahrensweise erreicht wird, bildet die Trehalose eine glasartige Matrix, umfassend glasartige Trehalose und enthaltend das biologisch aktive Material, das in einem getrockneten oder teilweise getrockneten Zustand vorliegt. Die erste Trocknungsstufe wird beendet, wenn der Feuchtegehalt der glasartigen Matrix 10% oder weniger erreichte, und es ist in dieser kritischen Stufe des Verfahrens wesentlich, daß die Temperatur 40°C nicht überschreiten kann. Wenn die Temperatur am Ende der ersten Trocknungsstufe 40°C überschreitet, wird das biologisch aktive Material Schäden erleiden.
Das Produkt, das aus der ersten Trocknungsstufe erhalten wird, wird dann einer zweiten Trocknungsstufe unterzogen, bevorzugt ohne Entfernung aus der Trocknungsvorrichtung, die für die erste Trocknungsstufe verwendet wird. In der zweiten Trocknungsstufe wird die glasartige Matrix, die aus der ersten Trocknungsstufe erhalten wird, weiter unter einem reduzierten Druck dehydratisiert, der 0,1 mbar nicht überschreitet. Die derzeit verfügbare Spezialvorrichtung weist die Fähigkeit auf, bei sehr niedrigen Drücken, beispielsweise unter 0,001 mbar, betrieben zu werden. Jedoch sind sehr gute Ergebnisse gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von reduzierten Drücken für die zweite Trocknungsstufe in dem Bereich von 0,001 bis 0,1 mbar, typischerweise von 0,01 bis 0,1 mbar, erhalten worden. Die zweite Trocknungsstufe wird für einen Gesamtzeitraum in dem Bereich von 10 bis 30 Stunden, bevorzugt 20 bis 30 Stunden fortgesetzt.
Wie oben erwähnt, überschreitet die Temperatur der glasartigen Matrix am Ende der ersten Trocknungsstufe nicht 40°C. Während der zweiten Trocknungsstufe kann sich die Temperatur der Matrix leicht auf eine Endtemperatur, am Ende des Trocknungsverfahrens, von 40°C bis 45°C erhöhen. Die Trehalosematrix wird am Ende der zweiten Trocknungsstufe einen Restfeuchtegehalt von 2% oder weniger, bevorzugt 1% oder weniger aufweisen, um einen sehr hohen Grad an Wärmestabilität in dem Produkt sicherzustellen. Bei solchen Restfeuchtegehalten sollte die Endtemperatur in dem Trocknungsverfahren nicht höher als 45°C sein, da über 45°C das getrocknete biologisch aktive Material in der Matrix einem gewissen Grad an Zerstörung unterliegen kann. Bevorzugt wird die Temperatur des Produktes am Ende der zweiten Trocknungsstufe 44°C nicht überschreiten.
Es ist durch Experimente herausgefunden worden, daß es einen gewissen Vorteil darstellt, die Temperatur der Matrix während der zweiten Trocknungsstufe so zu regeln, daß sie bei etwa 37°C für einen Zeitraum von 15 bis 17 Stunden gehalten und dann allmählich (beispielsweise um 0,5 bis 1°C pro Stunde) über die restliche Zeit der zweiten Trocknung auf eine Endtemperatur innerhalb des Bereiches von 40°C bis 45°C erhöht wird.
Die glasartige Trehalosematrix, die gemäß dem Verfahren hergestellt wird, kann in einem geeigneten wäßrigen Medium, typischerweise sterilem destilliertem Wasser, sehr schnell rehydratisiert werden, um einen Impfstoff zur Verwendung in einem sehr kurzen Zeitraum herzustellen.
Die Herstellung des Impfstoffes und das Betriebsverfahren unter Verwendung eines Gefriertrockners für die Trocknung von Viren, wie Rinderpest und Peste-des-petits-ruminants-Viren und Mycoplasma ohne einen Lyophilisierungsschritt, umfassend Sublimation aus Eis, nutzt die einmalige Eigenschaft des Disaccharids Trehalose, tertiäre Makromoleküle während der Trocknung zu schützen.
Im Vergleich zu konventionellen Gefriertrocknungsverfahren bietet das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Vorteile:
Es stellt ein hohes Niveau an Virusschutz bereit, setzt ein relativ kurzes, einfaches Verfahren ein, z. B. einen 25-Stunden-Produktionszyklus, und verringert dadurch die Produktionszykluszeit und die Energiekosten.
Eine Grundtrocknungsvorrichtung allein ist ausreichend, obwohl technisch ausgereifte Mikroprozessor-gesteuerte Gefriertrockner ebenso verwendet werden können, aber nicht unbedingt notwendig sind.
Das Verfahren ist gegenüber der Unterbrechung der Stromversorgung tolerant, ungleich der Lyophilisierung, wo sogar ein kurzer Stromausfall das Schmelzen des Produktes verursachen kann, was zu einem inakzeptablen Verlust an Virus führen würde.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine rehydratisierbare Zusammensetzung zur Herstellung eines Impfstoffes bereit, umfassend Trehalose in Form einer metastabilen Glasmatrix mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 1%, die getrocknetes biologisch aktives Material, ausgewählt aus getrocknetem lebendem Virus und getrocknetem Mycoplasma, in der Matrix enthält. Bevorzugt ist das biologisch aktive Material ein lebender Virus, ausgewählt aus Rinderpestvirus, Peste-des-petits-ruminants-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Gelbfiebervirus, Poliovirus und Newcastle-Virus, stärker bevorzugt Rinderpestvirus oder Peste-des-petits-ruminants-Virus. Alternativ kann das biologisch aktive Material ein Mycoplasma sein, bevorzugt Mycoplasma der infektiösen Pleuropneumonie des Rindes. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes bereit, umfassend die Rehydratisierung der oben beschriebenen rehydratisierbaren Zusammensetzung in einem geeigneten wäßrigen Medium.
Aufgrund des Verlusts an Epitheliotropismus ist es in der Vergangenheit schwierig gewesen, eine orale Impfung mit einigen abgeschwächten Virusstämmen zu erreichen. Sowohl eine orale als auch eine intranasale Impfung würde nützlich und für viele Anwendungen geeignet sein, da sie den natürlichen Weg der Tröpfcheninfektion nachahmt, was eine Kaskade an schützender Schleimhautimmunität, mit IgA- und humoraler IgG2a-T-Helferzellen-Typ-1-Antwort, erzeugt. Es wäre leichter, auf solchen Impfwege zu verabreichen, und dies wäre in dem Fall erreichbar, in dem ein geeigneter Impfstoff hergestellt wird. Ein Impfverfahren mit lebenden abgeschwächten Stämmen, die den natürlichen Weg der Infektion nachahmen, induziert eine umfassendere seromuköse und zellvermittelte Immunität. Ein Impfstoff zur oralen oder intranasalen Verwendung kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend das Herstellen einer glasartigen Matrix von Trehalose, enthaltend getrocknetes Virus, gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, kombiniert mit einem geeigneten, positiv geladenen, bioverträglichen wasserlöslichen Hilfsstoff, und Rehydratisieren der glasartigen Matrix mit einer geeigneten wäßrigen Zusammensetzung. Bevorzugt ist der Impfstoff zur oralen oder intranasalen Impfung ein MMR-Impfstoff. Da der derzeitige pädiatrische MMR-Imfpstoff durch eine konventionelle Gefriertrocknungstechnik hergestellt wird und in den Patienten subkutan injiziert wird, würde ein oraler oder intranasaler Impfstoff große Vorteile bringen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Der abgeschwächte Impfstoffstamm Paramyxovirus Rinderpest RBOK wuchs in sekundären Kalbsnierenzellen für 10 Tage bei 37°C. Die Virussuspension wurde geerntet und durch Zentrifugation bei 1000 U/min in einer gekühlten Zentrifuge geklärt.
Ein steriler Trägerstoff, enthaltend 10% Gewicht/Volumen Trehalose und 5% Lactalbuminhydrolysat, wurde in einem Verhältnis von 1 : 1 zu der geklärten Virusflüssigkeit bei 4°C zugegeben.
1,0 ml des Trägerstoff/Virus-Gemisches wurde in sterilen neutralen 10-ml-Glasphiolen aliquotiert, die dann mit sterilen trockenen Butylkautschukstöpseln teilweise zugestöpselt wurden.
Die Phiolen wurden auf die Platte der Gefriertrocknungskammer gegeben und die Temperatur des Produktes auf 37°C erhöht.
Der Kondensator wurde gestartet, und die Kondensatortemperatur konnte sich bei –60°C stabilisieren.
Die Vakuumpumpe wurde gestartet, und die Kammer, die das Produkt enthielt, wurde auf einen Druck von 800 mbar evakuiert und das Produkt vorsichtig für 30 Minuten entgast, um Sputtering zu vermeiden, während vorsichtig die Produkttemperatur geprüft wurde, um Verdampfungsgefrieren zu vermeiden. Durch das Halten eines Druckgradienten zwischen der Trocknungskammer und dem gekühlten Kondensator wurden in den ersten 30 Minuten 75% des Wasserdampfes zu dem Kondensator hin getrieben.
Der Druck wurde dann auf 500 mbar verringert und eine strukturierte metastabile glasartige Matrix gebildet. Der Druck wurde darin weiter auf 0,10 mbar reduziert und für 30 Minuten gehalten.
Die Phiolen wurden unter einem Endvakuum von 0,01 mbar verstöpselt und abgedichtet und mit einem Aluminiumdeckel abgedeckt.

Virustiter vor dem Trocknen: 10⁴TCID/50/ml
Virustiter nach dem Trocknen: 10⁴TCID/50/ml

Die Produktmatrix war in destilliertem Wasser schnell löslich. Dieses Beispiel zeigt, daß die Wirksamkeit des Virus durch die Behandlung, die in der ersten Trocknungsstufe des Verfahrens der Erfindung eingesetzt wurde, im wesentlichen unbeeinflußt blieb. Es zeigt außerdem die Möglichkeit der Dehydratisierung des Virus, um Virusimpfstoffe im industriellen Maßstab herzustellen.
BEISPIEL 2
Materialien und Verfahren
Herstellung der RP- und PPR-Impfstoffkulturen
Stämme von Peste-des-petits-ruminants (PPRV 75/1) und Rinderpest (RBOK) wuchsen anfänglich unter Verwendung von Verozellen in Glasgow-Modifikations-Eagles-Medium (GMEM), ergänzt mit 10% Tryptosephosphatbrühe (TPB, Difco) und 10% fetalem Kalbsserum (FCS), wie folgt:
Verozellen wurden in 5 × 150 cm² Kunststoffkolben bei einer Zellkonzentration von 287.000 Zellen/ml, 60 ml pro Kolben, gesät. Zwei Kolben wurden mit 0,5 ml PPR-Virussuspension bei einer Infektionsmultiplizität von 0,03 Virusteilchen/Zelle inokuliert. Zwei Kolben wurden ebenso mit RP-Virus inokuliert. Ein Kolben blieb als Kontrolle nicht inokuliert.
Die Kolben wurden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert und die Zellen täglich hinsichtlich der Entwicklung zytopathogener Effekte (cpe) untersucht. Am Tag 4 wurde das GMEM-Medium durch Hanks-Lactalbuminhefeextrakt (Hanks LYE), enthaltend 2% FKS und 0,1% Trehalosedihydrat, ersetzt. Am Tag 6 betrug der cpe ungefähr 80% und die Virusernten wurden zusammengefaßt, eingefroren und bei –20°C gelagert. Der Kontrollkolben blieb in dem Inkubator für 10 Tage und war nachweislich frei von Kontamination oder Zellabbau ohne offensichtliche Anzeichen von adventiven Keimen.
Dehydratisierungsverfahren
Das verwendete Dehydratisierungsverfahren kann aus zwei Hauptkomponenten bestehen ähnlich der Lyophilisierung: erstes Trocknen und zweites Trocknen. Der grundlegende Unterschied zur Lyophilisierung ist, daß das Produkt nicht eingefroren wird und das Trocknen durch einfaches Dehydratisieren, nicht durch Sublimation aus Eis, erfolgt.
Die zusammengefaßten Virussuspensionen wurden aufgetaut und 1 : 1 mit einer sterilen 5% Gewicht/Volumen wäßrigen Lösung aus Trehalosedihydrat verdünnt, wodurch eine Endkonzentration von 2,5% Gewicht/Volumen Trehalose in dem Gemisch erhalten wurde. 1 ml Volumen wurde auf jede der 5-ml-Imfstoffphiolen verteilt, die mit trockenen, entlüfteten Butylkautschukeinlagen teilweise verschlossen wurden. Dieser Vorgang wurde bei Raumtemperatur in einem Raum für biologische Risiken mit laminarer Luftströmung unter Beachtung strikter aseptischer Vorkehrungen durchgeführt.
Erstes Trocknen
Das Dehydratisierungsverfahren wurde unter Verwendung eines Edwards-Supermodulyo-Gefriertrockners mit genauer Kontrolle des Kammerdrucks, des Kondensatordrucks, der Platten- und der Produkttemperatur durchgeführt. Der Gefriertrockner wurde vor dem Beladen der Plattenkammer mit den Phiolen, die das Produkt enthielten, vorbereitet. Die Plattentemperatur stieg auf 40°C, und die Kondensatortemperatur erreichte die betriebliche Grenze von –40°C. Die Phiolen wurden dann auf die Platten gegeben, und die Inhalte erreichten 35°C. Die Kammertür wurde geschlossen, wobei die Makro- und Mikrolufteintrittsventile vollständig geöffneten waren und die Vakuumpumpe auf vollen Gasballast geschaltet wurde. Der Druck in der Kammer wurde durch vorsichtiges Schließen des Makrolufteintrittsventils auf 800 mbar eingestellt. Der Druck in dem Kondensator wurde bei 500 mbar gehalten, um einen Druckgradienten zwischen der Kammer und dem Kondensator herzustellen, und dies stellte die Antriebskraft bereit, um die Strömung von Wasserdampf von der Produktoberfläche zu dem Kondensator zu induzieren. Die Teilschließung der Phiolen mit den Stöpseln wies ebenso die vorteilhafte Wirkung der Drosselung der Öffnung auf, wodurch sich der Druck an der Produktoberfläche noch weiter erhöhte. Es wurde bemerkt, daß die teilweise verschlossenen Phiolen schneller trockneten als die vollständig geöffneten, die die Thermoelemente zur Temperaturaufzeichnung enthielten.
Die Veränderung der Temperatur des Produktes mit der Zeit und die Veränderung des Kammerdrucks mit der Zeit während der ersten Trocknungsstufe sind in der beigefügten Figur gezeigt. Wie aus der Figur hervorgeht, beginnt die Verdampfung sofort, wie durch den Abfall der Produkttemperatur angegeben. Die Produkttemperatur wurde in erster Linie durch vorsichtiges Schließen des Makrolufteintrittsventils während der ersten 15 Minuten und danach durch Manipulation des Mikrolufteintrittsventils kontrolliert, was sicherstellt, daß das Produkt nicht gefrieren kann. Das Halten einer Temperatur um 1 bis 2°C, hervorgerufen durch Verdampfungskühlung, erhöhte die Verdampfungsrate, so daß 90% des Wassers innerhalb einer Stunde verdampften, und die Produkttemperatur begann zu steigen, so daß sie der Plattentemperatur entsprach. Bei Fortschreiten der Dehydratisierung wurde nach 40 Minuten ein kritischer Punkt erreicht, als es einen plötzlichen schnellen Anstieg auf 25°C gab, gefolgt von einem plötzlichen Abfall der Produkttemperatur auf 15°C innerhalb von Sekunden. Dies war mit einer drastischen Blasenbildung des Produktes verbunden.
Zweites Trocknen
Eine weitere Charge (Charge 2) des lebenden abgeschwächten Rinderpest-Stammes (RP) wurde hergestellt und der ersten Trocknung für 1 Stunde unterzogen, wie oben beschrieben. Diese wurde dann über einem Zeitraum der zweiten Trocknung unterzogen, bei der die Temperatur über einen Zeitraum von weiteren 17 Stunden auf eine Endprodukttemperatur von 42,4°C erhöht wurde und der Druck 0,06 mbar betrug, wobei der Gasballast vollständig geschlossen war. Dies bewirkte eine Verringerung des Restfeuchtegehalts des Materials auf ungefähr 0,72%.
Eine weitere Charge (Charge 2) des lebenden abgeschwächten Peste-des-petits-ruminants-Stammes (PPR) wurde hergestellt und der ersten Trocknung für 1 Stunde unterzogen, wie oben beschrieben. Diese wurde dann über einen Zeitraum der zweiten Trocknung unterzogen. Die zweite Trocknung wurde nach 2 Stunden bei einer Produkttemperatur von 42,8°C und einem Kammerdruck von 0,06 mbar gestoppt. Das Produkt wies nach diesem kurzen zweiten Trocknungsverfahren einen Restfeuchtegehalt von 5,36% auf.
Der Test für die Wärmestabilität
Proben aus Charge 2 von sowohl PPR als auch RP, hergestellt, wie oben beschrieben, wurden bei 4°C, 25°C, 37°C und 45°C gelagert. Drei Phiolen von jeder Lagertemperatur wurden für die Virustitration an den Tagen 0, 3, 7, 10 und 14 nach der Inkubation verwendet. Das geometrische Mittel der drei Phiolen wurde als restlicher Virustiter für jeden Chargentyp bei jeder Temperatur für den spezifizierten Inkubationszeitraum betrachtet (Tabellen 3 und 4).
Virustitrationen
Diese wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit der ultraschnellen, einstündigen Dehydratisierung zu bestimmen, wie durch den Grad des Schutzes, induziert durch glasartigen Trehalosezustand, bewertet. Die Virustitrationen wurden durchgeführt, wie in den Standardbetriebsverfahren für Rinderpest-Impfstoff beschrieben, beschrieben von Mark, M. Rweyemamu et al., in FAO Animal Production and Health Paper. 1994, Nr. 118. (NB FAO ist die Food and Agriculture Organisation der Vereinten Nationen). Anmerkung: Das Hauptorgan für die Regulierung und Koordination der Tierimpfstoffqualität ist The Office International Epizooties (OIE). Der OIE-Standard für die Wirksamkeit für RP ist 10^2,5 TCID₅₀/Dosis und für PPR 10³ TCID₅₀/Dosis (wo TCID die Gewebekulturinfektionsdosis ist). In den nachstehenden Tabellen 1, 2, 3 und 4 werden die Virustiter als X log₁₀ TCID₅₀/ml ausgedrückt, wobei „X" die Zahl ist, die unter Test 1, 2 und 3 in jeder der Tabellen gezeigt ist.
Ergebnisse und Erläuterung
Die Ergebnisse, die mit paarweisen Proben von RP- und PPR-Impfstoff, die für eine Stunde unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens getrocknet wurden, erhalten wurden, sind in den Tabellen l und 2 im Vergleich zu einer Kontrollprobe von lyophilisiertem Impfstoff und ebenso zu dem unbehandelten Stammviruspool, enthaltend 2,5% Trehalose, dargestellt. Der Trägerstoff, enthaltend 2,5% Trehalose, stellte einen guten Schutz des RP-Virus nach der schnellen Dehydratisierung bei 37°C unter den Bedingungen des reduzierten Drucks bei 800 mbar mit einem Verlust nach dem Trocknen von 0,45 log₁₀TCID₅₀/ml bereit. Tabelle 1 – Rinderpest-Virustitrations-Ergebnisse nach der ersten Trocknung
Der Schutz des PPR-Virus in demselben Trägerstoff war ausgezeichnet mit einem Verlust von nur 0,15 log₁₀TCID₅₀/ml nach dem Trocknen. Tabelle 2 – Peste-des-petits-ruminants-Virustitration
Die Einführung einer zweiten Phase in das Dehydratisierungsverfahren wies klar eine merkliche Wirkung auf die Wärmetoleranz des Produktes auf. Diese zeigte sich anhand der Tatsache, daß die RP-Charge 2, die 17 Stunden der zweiten Trocknung unterzogen wurde, nur log 1,9 TCID/50/ml nach zwei Wochen bei 45°C verlor. Tabelle 3 – Wärmestabilitätstest von Rinderpest Charge 2
Andererseits wies eine PPR Charge 2, die nur zwei Stunden der zweiten Trocknung unterlag, kein nachweisbares Virus nach 14 Tagen der Inkubation bei 45°C auf. Tabelle 4 – Wärmestabilitätstest von PPR Charge 2
Die Dehydratisierung von Rinderpest- und PPR-Viren unter Verwendung der beschriebenen anhydrobiotischen Verfahrensweise erzeugte innerhalb einer Stunde eine glasartige wabenförmige Struktur mit ungefähr 10% Restfeuchte. Es wird angenommen, daß die beobachtete Exotherme nach 40 Minuten Trocknen die Glasübergangstemperatur des Trehaloseträgerstoffes unter reduziertem Druck angeben könnte, wobei sich die Trehalose aus einer Flüssigkeit verändert und ein metastabiles Glas bildet (siehe Robert J. Williams and A. Carl Leopold, The glassy state in corn embryos, Plant Physiol., 1989, 89, 977–981). Das Produkt in diesem Zustand mit einem Restfeuchtegehalt von etwa 10% wies eine mikrokristalline Struktur auf und zeigte eine drastische, sehr rasche Löslichkeit bei der Rehydratisierung mit einem Verdünnungsmittel. Tests der erhöhten Wärmestabilität an dem Produkt mit 5,36% Restfeuchte verursachten eine inakzeptable Verschlechterung, wie durch großen Verlust an Virustiter nachgewiesen (Tabelle 4).
Der Trägerstoff, enthaltend halb starkes Hanks LYE, 1% FCS und 2,5% Gewicht/Volumen Trehalose, war ausreichend, um sowohl RP- als auch PPR-Viren während der einstündigen, ultraschnellen Dehydratisierung zu schützen, wobei der Restfeuchtegehalt schnell auf 10% verringert wurde (Tabellen l und 2).
Die Einwirkung von 45°C für 14 Tage bei 5,36% Feuchtigkeit zerstörte das Virus (Tabelle 4). Jedoch hatte die Verlängerung der zweiten Dehydratisierung für 17 Stunden die erwartete Wirkung von weiterer Verringerung der Restfeuchte (auf weniger als 1%), wodurch für eine erhöhte Wärmestabilität gesorgt wurde (Tabelle 3).
Der Abfall des Titers von log 1,9 TCID/50/ml nach der Einwirkung von 45°C für 14 Tage, während ein minimaler Titer von log₁₀ 3,03 TCID50/ml gehalten wurde, läßt sich günstigerweise mit dem erwarteten Abfall des Titers vergleichen, der in den aktuellen lyophilisierten „wärmestabilen" (Thermovax) Impfstoffen gefunden wurde. Der vollständige Verlust von Virus in PPR Charge 2, die nur 2 Stunden der zweiten Trocknung unterlag und dann ebenso 45°C ausgesetzt wurde, hebt die schädigende Wirkung eines hohen Restfeuchtegehalt hervor und betont die Notwendigkeit einer Verlängerung der zweiten Trocknung, um einen niedrigen Restfeuchtegehalt sicherzustellen.
BEISPIEL 3
Peste-des-petits-ruminants-Virus (PPR-Virus) wurde in Verozellen in GMEM-Medium (Sigma NR. G6148), enthaltend 10% fetales Rinderserum und 10% Tryptosephosphatbrühe (Difco), vermehrt. Die Zellen wurden in 150-cm²-Kolben bei einer Konzentration von 26 × 10⁴ bis 28 × 10⁴ Zellen pro ml unter Zugabe von 60 ml Zellsuspension pro Kolben vermehrt.
Jeder 150-cm²-Kolben wurde mit ausreichend PPR-Samenvirus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10^–3 Virusteilchen/Zelle inokuliert.
An Tag 4 nach der Inokulation, als frühe zytopathogene Effekte (CPE) bemerkt wurden, wurde das Medium mit Hanks-Lactalbuminhefeextrakt, enthaltend 2% fetales Kalbsserum durch 0,1% Trehalosedihydrat (anstelle von Glucose) ersetzt. Dies wurde durchgeführt, um die Konzentration an gelöster Substanz zu verringern und den osmotischen Streß während der anschließenden Dehydratisierung zu minimieren und reduzierende Zucker, wie Glucose, zu entfernen, die zur Maillard-Reaktion beitragen können, die während der Dehydratisierung Nucleoproteine denaturieren kann.
An Tag 6 nach der Inokulation betrug der cpe 80 bis 90%, die Virusflüssigkeit wurde geerntet und über Nacht eingefroren. Die gefrorene Flüssigkeit wurde aufgetaut, um endogenes Virus freizusetzen, und bei –20°C gelagert.
Die aufgetaute Virusflüssigkeit wurde mit 16% Gewicht/Volumen sterilem wäßrigem Trehalosedihydrat (DFS Ltd) in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt, um eine Endkonzentration von Trehalose von 8% in dem Virus-Trägerstoff-Gemisch zu erhalten.
1 ml Volumen des Virus-Trägerstoff-Gemisches wurde in sterilen 5-ml-Impfstoffphiolen verteilt (1 ml Feuchtigkeit in jeder Phiole), und die Phiolen wurden teilweise mit entgasten trockenen Butylkautschukstöpseln zugestöpselt (frisch getrocknet bei 130°C für 3 Stunden). Die Dehydratisierung wurde unter Verwendung eines Edwards-Super-Modulyo-Gefriertrockners durchgeführt.
Der Gefriertrockner wurde vor dem Beladen der Platte mit den Phiolen vorbereitet. Der Kondensator wurde eingeschaltet, und die Kondensatortemperatur konnte die Betriebsgrenze von –40°C erreichen. Die Plattenheizung wurde eingeschaltet, und die Plattentemperatur wurde auf 40°C eingestellt. Die Kondensatortür und das Ablaßventil wurden geschlossen und die Vakuumpumpe mit vollständigem Gasballast eingeschaltet. Als die Plattentemperatur 40°C erreichte, wurden die Phiolen auf die Platte geladen, und ein Temperaturthermoelement wurde in eine Phiole auf jeder Platte eingeführt und die Kammertür geschlossen, wobei die Makro- und Mikrolufteintrittsventilen vollständig geöffnet waren.
Als die Temperatur der Inhalte der Phiolen 35°C erreichte, wurden die Makrolufteintrittsventile teilweise geschlossen, um einen Druck von 800 bis 900 mbar zu erreichen. Während der ersten 15 Minuten wurde der Trägerstoff in den Phiolen, die gelöstes CO₂ aus dem Bicarbonat in dem Medium enthielten, vorsichtig entgast. Während dieser Phase konnte der Zugang von Trehalose zu der Viruslipidmembran stattfinden.
Das Makrolufteintrittsventil wurde weiter verschlossen, um den Druck auf 500 mbar zu verringern. Die Temperatur des Trägerstoffes in den Phiolen konnte auf ungefähr 4,0°C fallen, was zeigt, daß Verdampfungskühlung stattfand. Das Mikrolufteintrittsventil wurde vorsichtig geschlossen, während die Trägerstofftemperatur überwacht wurde, um die Temperatur um 4,0°C herum zu stabilisieren. Dies ist die kritischste Phase in dem Vorgang, man muß vorsichtig sein, um Sputtering und/oder eine zu schnelle Verdampfung zu vermeiden, die zum Gefrieren des Produktes führen würde. Sterile Luft wurde in die Kammer dosiert, um einen Druckgradienten bereitzustellen, der den Strom von Wasserdampf zu dem Kondensator för dert. Die Produkttemperatur wurde die ganze Zeit bei 4°C durch vorsichtige Kontrolle des Mikrolufteintrittsventils gehalten. Nach dem Halten der Temperatur des Produktes in dem Bereich von etwa 4°C für 20 bis 30 Minuten wurde das Mikrolufteintrittsventil langsam geschlossen, während man vorsichtig sein mußte, die Produkttemperatur von etwa 4°C und einen Kammerdruck von 300 mbar zu halten. In dieser Stufe wurde das Produktvolumen beträchtlich auf eine sirupartige Konsistenz verringert. Das Mikroluftventil war zu dieser Zeit vollständig geschlossen.
Nach ungefähr 40 Minuten von Beginn des ersten Trocknungsverfahrens stieg die Produkttemperatur. Nach 45 Minuten war die Masse an Wasser in dem Trägerstoff verdampft, und das Produkt dehnte sich zu einer mikrokristallinen wabenförmigen Struktur aus, begleitet durch eine plötzliche Exotherme von ungefähr 15°C, als die Trehalose zu einer metastabilen Schaumglasmatrix verglast wurde. Danach fiel die Temperatur des Produktes, als weitere Feuchtigkeit in dem Produkt verdampfte, wodurch ein Produkt mit einem Endfeuchtegehalt von 10% erhalten wurde.
Mit sowohl geschlossenen Makro- als auch Mikroeintrittsventilen und geschlossenem Vakuumpumpengasballast wurde das Trocknen über Nacht bei einem Kammerdruck von 0,1 mbar fortgesetzt, währenddessen die Produkttemperatur 40°C, die Temperatur der Platte in der Kammer, erreichte. Das Trocknen wurde fortgesetzt, um eine Gesamttrocknungszeit von 24 Stunden zu erreichen, in der die Plattentemperatur in der Kammer 1,0°C pro Stunde für mindestens 4 Stunden der Trocknungszeit stieg, was in einer Endtemperatur (Platte und Produkt) von 44°C gipfelte. Während des Haltens eines Kammerdrucks von 0,06 mbar wurden die Phiolen verschlossen und mit Aluminiumdichtungen abgedeckt.
Proben des dehydratisierten Produktes, das gemäß diesem Beispiel hergestellt wurde, wurden bei 45°C für 14 Tage gelagert, und der Virustiter wurde, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, bestimmt. Es wurde bestimmt, daß der Restfeuchtegehalt des Produktes, das gemäß der obigen Verfahrensweise dehydratisiert wurde, ungefähr 1,0% betrug. Nach der Lagerung bei 45°C für 14 Tage wurde festgestellt, daß die Proben des Produktes nur in einem geringen Grad an Viruswirksamkeit verloren und zur Herstellung von nutzbarem Impfstoffmaterial geeignet waren.
BEISPIEL 4
Zur Herstellung von stabilisiertem RP wurde der obigen Verfahrensweise von Beispiel 3 unter Verwendung einer RP-Viruskultur anstelle der PPR-Kultur, die in Beispiel 3 beschrieben ist, gefolgt. Das Trocknungsverfahren erzeugte ebenso stabilisiertes RP mit relativ geringem Verlust an Titer nach der Lagerung bei 45°C für 14 Tage.

Claims

Verfahren der Haltbarmachung eines biologisch aktiven Materials, umfassend ein lebendes Virus oder Mycoplasma, wobei das Verfahren die Schritte: (i) Mischen einer wäßrigen Suspension des biologisch aktiven Materials mit einer sterilen wäßrigen Trehaloselösung, um eine Trehalosekonzentration in dem Gemisch im Bereich von 2,5 bis 8% Gewicht/Volumen zu erhalten; (ii) Unterziehen des Gemisches einer ersten Trocknung für 30 bis 60 Minuten bei einem Druck von weniger als Atmosphärendruck, wobei die Temperatur des Gemisches anfänglich nicht mehr als 37°C beträgt und so geregelt wird, daß sie nicht auf 0°C oder darunter fällt, und die schließlich nicht mehr als 40°C beträgt, wodurch eine glasartige poröse Matrix gebildet wird, die glasartige Trehalose mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 10% umfaßt und in der Matrix getrocknetes biologisch aktives Material enthält; und (iii) Unterziehen der glasartigen porösen Matrix aus Schritt (ii) einer zweiten Trocknung für 10 bis 30 Stunden bei einem Druck von nicht mehr als 0,1 mbar und bei einer Temperatur, die schließlich im Bereich von 40 bis 45°C liegt, wodurch eine Trehalosematrix mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 2% gebildet wird, die in der Matrix getrocknetes biologisch aktives Material enthält, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Trocknung in Schritt (iii) für 20 bis 30 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Trocknung für 15 bis 17 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt wird und die Temperatur danach nach und nach über den verbleibenden zweiten Trocknungszeitraum auf eine Endtemperatur im Bereich von 40 bis 45°C erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Trocknung in Schritt (i) bei einem Druck von nicht mehr als 800 mbar durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Restfeuchtegehalt der glasartigen Trehalosematrix am Ende der ersten Trocknung in Schritt (ii) etwa 10% beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Restfeuchtegehalt am Ende der zweiten Trocknung in Schritt (iii) 1,0% oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das lebende Virus aus Rinderpestvirus, Peste-des-petits-ruminants-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Gelbfiebervirus, Poliovirus und Newcastle-Virus ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das lebende Virus das Rinderpestvirus oder das Pestedes-petits-ruminants-Virus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Mycoplasma ansteckendes Rinderpleuropneumoniemycoplasma ist.
Rehydrierbare Zusammensetzung zur Erzeugung eines Impfstoffes, umfassend Trehalose in Form einer metastabilen Glasmatrix mit einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 1%, die in der Matrix getrocknetes biologisch aktives Material, ausgewählt aus getrocknetem lebendem Virus und getrocknetem Mycoplasma, enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das biologisch aktive Material ein lebendes Virus ist, ausgewählt aus Rinderpestvirus, Peste-des-petits-ruminants-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Gelbfiebervirus, Poliovirus und Newcastle-Virus.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das biologisch aktive Material ein lebendes Virus ist, ausgewählt aus Rinderpestvirus und Peste-des-petits-ruminants-Virus.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das biologisch aktive Material ansteckendes Rinderpleuropneumoniemycoplasma ist.
Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffes, umfassend die Rehydrierung der in einem der Ansprüche 10 bis 13 beanspruchten Zusammensetzung in einem geeigneten wäßrigen Medium.