CN1433465A - 保存病毒和支原体的方法 - Google Patents

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Abstract

不经冻干在残留水分含量不超过2％的玻璃样海藻糖基质中，通过干燥保存含有活病毒或支原体的生物活性材料。该方法包括两个真空干燥阶段。在比经典冻干法短得多的一个周期时间内，可以保存病毒或支原体以提供能够通过重新水化产生有效疫苗的材料。

Description

保存病毒和支原体的方法
本发明涉及病毒和支原体的保存。具体地，本发明涉及一种采用二糖，即海藻糖，保存这些材料的超快方法。通过该方法，可以实现对病毒和/或支原体的长期保存，尤其是可以制备减毒活疫苗。
通过脱水和渗透浓缩保存生物可降解材料是一项普通的古老技术。当必需保存敏感生物分子时，通过脱水进行的简单干燥将无法胜任此任务，因为结构水的除去会引起随后的变性和生命活性的丧失。在液氮中低温贮藏和冻干已被接受为长期保存敏感生物分子的方法，后一种方法被广泛用于保存减毒活疫苗。
通过延长第二个冻干周期以便使残余水分(RM)减少至大约1％-2％，已经实现了对冻干牛瘟疫苗耐热性的提高。按Mariner，J.C.等，Vet.Microbiol.，1990，21，195-209所描述的，这需要长达72小时的长时间和高能量消耗操作周期。由此方法制备的疫苗称作“THERMOVAX”，而与标准疫苗区分开。
正如以上提及的，目前使用的这些方法均耗时，并涉及高能量的投入。而且，冻干仅赋予终产品中等水平的耐热性，而且仍需要冷藏降低贮存过程中的变质。对于在热带气候下使用的活疫苗而言，这尤其是一个问题，因为这些疫苗会丧失效力而导致失败的结果，即在难于监测“冷链(cold chain)”的热带国家中野外实施的接种计划将最终导致给患者接种低标准或，在某些情况下，无效的疫苗。
在进化的自然选择过程中，某些植物和动物物种获得了出色而精巧的耐受极度脱水的能力，以致可以在有害环境中极长时间地保持休眠，并能在重新水化后仍具有完全的生命活性。实例包括更苏植物鳞叶卷柏( Selaginella lepidophyla)、海虾 Artemia salina(Clegg，J.，J.Comp.Biochem.Physiol.，1967，20，801-809)、酵母类 酿酒酵母 (Sachharomyces cerevisiae)(Coutinho，E.，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)，1988，7，23-32)、和缓步动物 Macrobiotus hufelandi(Kinchin，I.M.，生物学家(Biologist)，1995，42，4)。这些生物被称为隐生的，而它们存活的方法被称作低湿生活。所有表现出此能力的动物和植物物种都含有二糖海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)。海藻糖在大多数隐生生物中一般以约0.2g/g细胞干重的量存在，这使得这些生物可以抵抗极度脱水、高温、X-射线，以及在一些缓步动物物种中还可以抵抗高达600Mpa的压力。
Colaco等，生物技术(Biotechnology)1992，10，1007-1011，描述了采用海藻糖快速干燥生物材料的益处。该方法主要涉及在预先形成的基质例如纤维素纤维上，或在用于诊断目的例如ELISA或实验室中类似诊断应用的塑料板表面上，干燥限制性酶和免疫球蛋白。然而，当上升至工业应用时，例如大规模的商业疫苗生产，由于必需在部分密封的小瓶中采用必需的无菌技术操作大得多的单位数量和体积，这些技术产生多个问题。为了满足大规模疫苗生产的操作要求，即典型的1.0ml以上的单位体积和20升的生产批量，需要一个不同的策略以在经济上可接受的时间内除去这种体积的水。在大气压力下，即使在最高的生理耐受温度下进行干燥也将需要一段无法接受的长时间以足够快地从部分塞住的疫苗小瓶中除去水分，而且将不可避免地导致变性和效力的丧失。
本发明涉及在可除去水分同时允许保持病毒或支原体材料的生物学完整性的条件下，采用海藻糖保存这些材料的方法。
因此，本发明提供含有活病毒或支原体的生物活性材料的保存方法，该方法包括步骤：
(i)将该生物活性材料的水悬液与海藻糖的无菌水溶液混合，以使该混合物中的海藻糖浓度在0.2-10％w/v范围内；
(ii)在低于大气的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最终不超过40℃的条件下，对该混合物进行第一次干燥，时间为30-60分钟，以形成含有玻璃样海藻糖、残留水分含量不超过10％的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料；和
(iii)在不超过0.1mbar的压力下，在温度最终处于40-45℃范围内的条件下，对步骤(ii)的玻璃样多孔基质进行第二次干燥，其10-30个小时，以形成含有干燥生物活性材料的、残留水分含量不超过2％的海藻糖基质。
通过采用本发明的方法，可以制备与现有方法相比具有增强的生物学特性和突出的商业优点的活疫苗。采用本发明方法制备的疫苗比采用常规冻干方法制备的疫苗其干燥速度要快得多。例如，可以采用本发明方法在不到1小时内干燥海藻糖/生物活性材料混合物，使其含水量达到约10％。并可以在不足30个小时，例如约20小时的时间内，实现进一步脱水，使残留水分含量为约1-2％，而常规冻干方法需要50个小时。而且，根据本发明可使由于溶质浓缩造成的损伤最小化，尤其是避免了损伤性冰晶形成。保存在该海藻糖玻璃样基质中的生物活性材料的热稳定性比按现有方法保存的材料的热稳定性高，由此，对常规冻干疫苗是一个严重限制的“冷链”，其必要性被最小化。本发明的产品可以更长时期地暴露于高环境温度例如高达约45℃下，而生物学活性基本上没有损失。除了本发明的这些和其它优点外，本发明方法制备的产品当重新水化时还表现出即刻“速溶性”。
本发明的方法适于长期保存病毒和支原体。尤其是，可以采用本发明方法保存可以重新水化形成疫苗的高不稳定性减毒活病毒成分和支原体成分。可以根据本发明方法保存的这些生物活性材料的实例包括：
科：副粘病毒科(Paramyxoviridiae)
亚科：Paramyxovirinae
属：副流感病毒组麻疹(Measles)、牛瘟(Rinderpest)、犬瘟热(caninedistemper)、小反刍动物瘟疫(Peste des Petits Ruminants)(PPR)
副粘病毒属(Paramyxovirus)：腮腺炎病毒(流行性腮腺炎)
属：风疹病毒(Rubivirus)，病毒性风疹(Rubella)(德国麻疹(GermanMeasles))
属：黄病毒(Flavivirus)，黄热病毒(Yellow fever virus)(黄热病)
属：弹状病毒(Rhabdoviruses)，Lyssaviridiae(狂犬病病毒(Rabiesvirus))
细小核糖核酸病毒(Picorna viruses)(脊髓灰质炎病毒(Poliovirus))
新城疫病毒(Newcastle Disease virus)
支原体：Mycoplasma mycoides(牛接触感染性胸膜肺炎)
流产布鲁氏菌(Brucella abortus)：第19株疫苗
衣原体：Chlamydia psittaci(地方性动物病流产(Enzooticabortion))
Corridia： Toxoplasma gondii(弓形体病)
根据本发明的方法，将待保存的生物活性材料在适当的水性介质中配制成悬液。对于病毒，可能需要例如在非洲绿猴肾细胞系上于适当的培养基中对其进行培养，然后在悬浮前收获以便提供有用浓度的材料。典型地，例如通过加入碱，调节生物活性材料水悬液的pH至7.0-7.8范围内，尤其是约7.4。
海藻糖是最稳定的化学上不反应的二糖之一。其具有小于1Kcal/Mol的极低键能，使得该二聚物结构非常稳定。除非剧烈加热否则海藻糖不会发生焦糖化，而且它也不会与蛋白质或肽发生美拉反应。该天然二水化物结构含有两个水分子，使得可以在该二糖键周围造成不寻常的柔性，这样就可以允许与三级结构的生物分子产生更为紧密的联系。海藻糖并非是吸湿性的，但在水化时表现出“速溶性”，此性质对于干燥的疫苗是尤其有用的。
将生物活性材料的水悬液与海藻糖的无菌水溶液混合，配制该混合物以便其将含有0.20％-10％w/v、优选2-10％、更优选2.5-8％w/v浓度的海藻糖。在该海藻糖浓度范围内，所用的实际浓度一般将取决于该生物活性材料的单位大小。小病毒颗粒比大细胞需要较少的海藻糖。
将该无菌水性海藻糖/生物活性材料混合物进行真空干燥操作，该操作包括第一个干燥步骤及之后的第二个干燥步骤。优选地，将常规冻干装置(例如EDWARDS、CHRIST、USIFROID或SAVANT制造的冻干装置)用于该干燥操作，以便为该方法中的关键阶段提供可控环境。然而，要强调的是，尽管采用这样的装置，但并不采用冻干条件而且也不对材料进行冻干。该干燥操作包括两个干燥阶段，在第一个干燥阶段材料的残留水分含量降低至不超过10％，而在第二个干燥阶段该材料的残留水分含量进一步降低至不超过2％。
在第一个干燥阶段，干燥装置的初始温度将保证该海藻糖混合物的温度不超过37℃并优选为37℃，以防止在该方法的此阶段出现任何的生物活性丧失。当该混合物中的水被蒸发掉时，该混合物的温度将下降。然而，实施该干燥，以保证不会发生在常规冻干操作中通常经历到的冰冻或冰的升华，即在该干燥操作的此阶段产品的温度被控制不降至0℃或更低，而且典型地被控制不降低至4℃以下。将所用压力减少至大气压力以下，优选800-300mbar。
该第一个干燥阶段的持续时间在30-60分钟之间，在此时间段内海藻糖混合物的温度最初随水的蒸发而降低，然后回升。在该操作过程中当温度达到约25℃(在所用的减压下)时，该海藻糖形成包含玻璃样海藻糖并含有处于干燥或部分干燥状态的生物活性材料的玻璃样基质。当该玻璃样基质的含水量达到10％或更低时，第一个干燥阶段完成，在该操作的此关键阶段中最根本的是使温度不超过40℃。如果在第一个干燥阶段结束时温度超过40℃，则生物活性材料将遭受损害。
然后将从第一个干燥阶段获得的产品用于第二个干燥阶段，优选产品不从用于该第一个干燥阶段的干燥装置中取出。在第二个干燥阶段，在不超过0.1mbar的减压下，对从第一个干燥阶段获得的玻璃样基质进行进一步脱水。目前可利用的专门装置具有在极低压力，例如低于0.001mbar的压力下操作的能力。然而，根据本发明在此第二个干燥步骤中采用0.001-0.1mbar，典型地0.01-0.1mbar范围内的减压，已获得了极为良好的结果。第二个干燥阶段持续的总时间在10-30个小时，优选20-30个小时范围内。
正如以上提及的，在第一个干燥阶段结束时该玻璃样基质的温度不超过40℃。在第二个干燥阶段中，该基质的温度可以稍稍上升，当该干燥操作结束时，达到40-45℃的最终温度。在第二个干燥阶段结束时，该海藻糖基质将具有2％或更少，优选1％或更少的残留水分含量，以便在该产品中保证极高程度的热稳定性。在这样的残留水分含量时，该干燥操作的最终温度应不高于45℃，因为高于45℃时该基质中的干燥生物活性材料可能遭到种程度的破坏。优选地，在第二个干燥阶段结束时，产品的温度将不超过44℃。
通过实验已经发现，有利的是在第二个干燥阶段中控制基质温度，以使基质在约37℃维持15-17个小时，然后在第二次干燥剩余的时间内逐渐升高温度(例如每小时0.5-1℃)，至40℃-45℃的最终温度。
根据该方法制备的玻璃样海藻糖基质可以在适合的水性介质中，典型的是无菌蒸馏水中，非常快速地重新水化，在极短期内产生使用的疫苗。
不经过涉及冰升华的冻干步骤，将冻干仪用于病毒(例如牛瘟病毒和小反刍动物瘟疫病毒)及支原体干燥的该疫苗制备和操作程序，利用了二糖海藻糖在干燥过程中保护三级结构大分子这一独特性质。
与常规冻干方法相比，本发明的方法具有以下优点：
本发明方法采用相对短的简单程序，例如25个小时的制备周期，提供了高水平的病毒保护，由此降低了制备周期和能量消耗。
仅要求有基本干燥设备即可，尽管也可以采用精细复杂的微处理器控制的冻干仪，但这并不是严格必需的。
该方法耐受电力中断，而冻干则不同，甚至短暂的停电也会引起产品的融化，导致不可接受的病毒损失。
在过去由于上皮向性(epitheliotropism)的丧失，口服接种某些减毒病毒株是难于实现的。口服和鼻内接种对于许多应用而言将是有用和适合的，因为它们可以模拟飞沫传染的天然途径，产生级联保护性粘膜免疫，包括IgA和体液IgG2a T辅助细胞1型应答。实施这些接种途径是容易的，而且一旦制备了适合的疫苗，这些途径将是适用的。模拟感染的天然途径接种减毒活病毒株的方法诱导更为广泛的浆液粘液性和细胞介导的免疫。根据再一方面，本发明提供制备用于口服或鼻内给药的疫苗的方法，其包括根据上述方法制备含有干燥病毒和适合的带正电荷生物适合性水溶性佐剂的玻璃样海藻糖基质，然后用适合的水性组合物重新水化该玻璃样基质。根据本发明此方面的优选实施方案，口服或鼻内接种的疫苗是MMR疫苗。由于目前儿科MMR疫苗是通过常规冻干技术制备的，并皮下注射给患者，所以口服或鼻内疫苗将有极大的好处。
实施例 实施例1
在次级小牛肾细胞中37℃培养副粘病毒牛瘟病毒RBOK的减毒疫苗株10天。收获该病毒悬浮液，并通过在冷冻离心机中1000rpm离心进行澄清。
以和该澄清病毒液1∶1的比例，在4℃加入含有10％w/v海藻糖和5％乳白蛋白水解物的无菌赋形剂。
将1.0ml的该赋形剂/病毒混合物分装入无菌10ml中性玻璃小瓶中，然后用无菌干燥的丁基橡胶塞将该小瓶部分塞住。
将小瓶置于冻干室的架子上，并将该产品的温度升高至37℃。
开启冷凝器并使该冷凝器的温度稳定在-60℃。
开启真空泵，并排出含有该产品的室的气体，使压力达到800mbar，然后轻柔地给产品脱气30分钟以避免飞溅，同时仔细检查该产品的温度以避免蒸发冷冻。通过在该干燥室和该冷冻冷凝器之间维持一个压力梯度，在头30分钟内将75％的水蒸汽抽入该冷凝器中。
然后将压力降低至500mbar，形成结构亚稳定玻璃样基质。然后进一步降低压力至0.1mbar并维持30分钟。
在最终0.01mbar的真空下将小瓶塞住并密封，然后用铝盖盖住。
干燥前病毒滴度：104TCID/50/ml
干燥后病毒滴度：104TCID/50/ml
该产品基质可在蒸馏水中快速溶解。该实施例表明，在本发明方法的第一个干燥阶段中所用的处理基本上不影响该病毒的效力。该实施例还举例说明了可以以工业规模对病毒脱水制备病毒疫苗。实施例2 材料知方法 RP知PPR疫苗培养物的制备
首先采用非洲绿猴肾细胞系细胞，在补加了10％胰蛋白 磷酸盐培养液(TPB，Difco)和10％胎牛血清(FCB)的Glasgow修饰Eagles培养基(GMEM)中，按如下所述培养小反刍动物瘟疫(PPRV 75/1)和牛瘟病毒(RBOK)株：
将非洲绿猴肾细胞系细胞接种在5个150cm2的塑料瓶中，细胞浓度为287,000个细胞/ml，每个瓶60ml。两个瓶接种0.5ml PPR病毒悬液，感染复数为0.03个病毒颗粒/细胞。类似地，用RP病毒接种两个瓶。一个瓶未接种作为对照。
这些瓶在5％CO2中37℃进行孵育，每天检查细胞的致细胞病变效应(cpe)的出现。在第4天将GMEM培养基替换为含有2％FCS和0.1％海藻糖二水化物的Hanks乳白蛋白酵母提取物(Hanks LYE)。在第6天，该cpe为大约80％，将病毒收获物汇合在一起，-20℃冻存。对照瓶在培养箱中保留10天，并证明其无污染或细胞降解，而且没有明显的外来物质的迹象。脱水方法
所用脱水方法可以被认为由两个类似于冻干的主要部分组成：第一次干燥和第二次干燥。与冻干的根本不同在于产品不经冰冻，而且干燥是通过简单的脱水，而不是冰的升华来实现的。
化冻该汇集的病毒悬液，并用海藻糖二水化物的无菌5％w/v水溶液按1∶1进行稀释，由此在该混合物中含有2.5％w/v终浓度的海藻糖。将1ml体积各分装在5ml疫苗小瓶中，用干燥的开孔丁基橡胶塞部分密封。该操作在室温于层流防生物危害室中进行，并注意严格的无菌预防措施。第一次干燥
该脱水过程采用Edwards Supermodulyo冻干仪进行，该装置对室内压力、冷凝器压力、架子和产品的温度具有精确的控制。在室内架子上放置含有产品的小瓶之前，提前准备该冻干仪。将该架子的温度升高至40℃并使冷凝器的温度达到-40℃的操作极限。然后将小瓶放置在架子上，并使内容物达到35℃。关闭室门，完全打开大和小进气阀并打开真空泵，使气镇完全开放。小心关上大进气阀，将室内压力调节至800mbar。使冷凝器中的压力维持在500mbar，以便在该室和冷凝器之间产生压力梯度，这提供驱动力量以促使水蒸气从产品的表面流向冷凝器。用塞子部分封上这些小瓶也有减小孔隙由此更进一步增加产品表面压力的有益作用。我们注意到，部分封闭的小瓶比含有温度记录热电偶的完全敞开的小瓶干燥快。
在第一个干燥阶段中产品温度随时间的改变以及室内压力随时间的改变显示在附图中。从图中可以看出，正如由产品温度下降所指示的，蒸发立即开始。产品的温度在头15分钟内主要通过仔细关闭大进气阀来控制，之后通过操作小进气阀来控制，以确保产品不会发生冷冻。通过蒸发冷却使温度维持在约1-2℃，这增加了蒸发速率，以致90％的水在1小时内蒸发，然后使产品温度开始上升以达到与架子温度相似的温度。随着脱水继续进行，40分钟后达到一个关键点，在此时产品温度突然快速上升至25℃，数秒之后产品温度突然降低，至15℃。这时伴随出现显著的产品起泡。第二次干燥
再制备一批减毒活牛瘟病毒株(RP)(第2批)，按以上所述对其进行1小时的第一次干燥。然后将之进行第二次干燥，其间在接着的17个小时内温度上升至42.4℃的终产品温度，压力为0.06mbar，气镇完全关闭。这具有将材料中残留水分含量减少至约0.72％的作用。
再制备一批(第2批)减毒活小反刍动物瘟疫病毒株(PPR)，并按以上所述将其进行1小时的第一次干燥。然后将其进行第二次干燥。2小时后在产品温度达到42.8℃和室内压力达到0.06mbar时终止第二次于燥。在此短期第二次干燥过程后，产品的残留水分含量为5.36％。热稳定性测试
将按上述方法制备的PPR和RP的第2批样品保存在4℃、25℃、37℃和45℃。在第0、3、7、10和14天孵育后，从各保存温度取3个小瓶，测量病毒滴度。这三个小瓶的几何平均数被作为每批类型在各温度孵育特定时间的残余病毒滴度(表3和4)。病毒滴定
进行这些试验，通过评价该海藻糖玻璃样状态所诱导的保护程度，以确定该超快1小时脱水的效力。按Mark，M.Rweyemamu等在FAO动物产品和健康报(FAO Animal Production and Health Paper)1994年第118期(NB FAO是联合国食品和农业组织)中所述的用于牛瘟疫苗的标准操作方法，进行病毒滴定。注：进行动物疫苗质量调节和协调的主体是动物流行病国际部(OIE)。RP效力的OIE标准是102.5TCID50s/剂量，对于PPR是103TCID50s/剂量(此处TCID是组织培养物的感染剂量)。在下表1、2、3和4中病毒滴度表示为X log10 TCID50/ml，其中“X”是各表中试验1、2和3下的所示数字。结果和讨论
采用以上方法干燥1小时的成对RP和PPR疫苗样品，与冻干疫苗对照样品以及与含有2.5％海藻糖的亲本未处理病毒库进行比较，所获结果列在表1和2中。在800mbar的减压条件下37℃快速脱水后，含有2.5％海藻糖的赋形剂给予RP病毒良好的保护，干燥后损失为0.45log10TCID50/ml。表1-第一次干燥后牛瘟疫苗的滴定结果
测试物质     试验1     试验2     试验3
病毒库+2.5％海藻糖     5.7     5.9     5.8
病毒库+2.5％海藻糖37℃干燥1小时 5.0 5.7 5.35
冻干的参考疫苗     4.8     4.8     4.8
在相同的赋形剂中对PPR的保护是出色的，干燥后仅损失0.15log10TCID50/ml。表2-小反刍动物瘟疫病毒滴定
测试物质     试验1     试验2     试验3
病毒库+2.5％海藻糖     5.0     4.9     4.95
病毒库+2.5％海藻糖37℃干燥1小时 4.9 4.7 4.8
冻干的参考疫苗     4.9     4.9     4.9
在该脱水方法中加入第二阶段明显地对产品的热稳定性产生了显著影响。这通过如下事实获得证明，即接受17个小时第二次干燥的第2批RP在45℃储存2周后仅损失log 1.9TCID/50/ml。表3-第2批牛瘟疫苗的热稳定性测试
    孵育天数 在各温度下储存后的病毒滴度
4℃     25℃     37℃     45℃
    0 4.97     4.97     4.97     4.97
    3 4.83     4.70     4.10     3.80
    7 4.83     4.63     4.17     3.37
    10 4.80     4.57     4.10     3.30
    14 4.87     4.30     3.83     3.03
另一方面，仅进行了2个小时第二干燥的第2批PPR在45℃孵育14天后没有检测到病毒。
表4-第2批PPR的热稳定性测试
    孵育天数 在各温度下储存后的病毒滴度
4℃     25℃     37℃     45℃
    0 5.40     5.40     5.40     5.40
    3 5.33     4.80     4.57     3.90
    7 5.33     4.77     4.40     2.70
    10 5.40     4.77     3.97     2.50
    14 5.27     4.50     3.60     0.00
采用所述低湿休眠法进行的牛瘟和PPR病毒脱水，在1小时内产生含有约10％残留水分含量的玻璃样蜂巢结构。推测，40分钟干燥后观察到的放热可能指示了在减压下该海藻糖赋形剂的玻璃过度温度，此时该海藻糖由液体转变形成亚稳定玻璃(见Robert，J.Williams和A.CarlLeopold，玉米胚中的玻璃样状态(The glassy state in corn embryos)，Plant Physiol.1989，89，977-981)。在此状态的产品残留水分含量约10％，具有微晶结构，并且当用稀释剂重新水化时表现出惊人的快速溶解性。在含有5.36％残留水分含量的产品上进行的增高热稳定性测试导致不可接受的损坏，表现出巨大的病毒滴度丧失(表4)。
含有半强度Hanks LYE、1％FCS和2.5％w/v海藻糖的赋形剂足以在此1小时超快速脱水期间，残留水分含量快速降低至10％时保护RP和PPR病毒(表1和2)。
对于5.36％的含水量，45℃暴露14天破坏该病毒(表4)。然而，将第二次脱水延长至17个小时具有进一步降低残留水分含量(至不足1％)的预期效果，籍此赋予增强的热稳定性(表3)。
45℃暴露14天，滴度降低log 1.9TCID/50/ml，同时维持log103.03TCID50/ml的最小滴度，这与目前的冻干“热稳定性”(Thermovax)疫苗中发现的预期滴度降低相比更为有利。在仅进行了2个小时第二次干燥、然后同样暴露于45℃的第2批PPR中，病毒的完全丧失突出了高残留水分含量的破坏性作用，并强调了延长第二次干燥以确保低残留水分含量的必要性。实施例3
在含有10％胎牛血清和10％胰蛋白
Figure A0080714900171
磷酸盐培养液(Difco)的GMEM培养基(sigma No.G6148)中于非洲绿猴肾细胞系细胞上增殖小反刍动物瘟疫(PPR)病毒。在150cm2瓶中以每毫升26×104-28×104个细胞的浓度，每个瓶加入60ml细胞悬液，增殖这些细胞。
每个150cm2瓶接种足量的PPR种病毒，感染复数(MOI)为10-3个病毒颗粒/细胞。
接种后第4天，当注意到早期致细胞病变效应(CPE)时，将该培养基替换成含有2％胎牛血清和0.1％海藻糖二水化物(代替葡萄糖)的Hanks乳白蛋白酵母提取物。这将在随后的脱水过程中降低溶质浓缩并使渗透应力最小化，以及除去可以参与美拉反应的还原性糖，例如葡萄糖，在脱水期间该反应会使核蛋白变性。
接种后第6天，cpe为80-90％，收获该病毒液体并冷冻过夜。融化该冰冻液体以释放内源性病毒并保存在-20℃。
将该融化的病毒液体与16％w/v无菌海藻糖二水化物水溶液(DFS Ltd)按1∶1比例混合，在该病毒赋形剂混合物中产生8％终浓度的海藻糖。
将1ml体积的该病毒赋形剂混合物分装在无菌5ml疫苗小瓶(每个小瓶中1ml液体)，并用开孔的干燥丁基橡胶塞(130℃3个小时新鲜干燥的)将这些小瓶部分塞上。采用Edwards Super Modulyo冻干仪进行脱水。
在将小瓶置于架子上之前，提前准备该冻干仪。打开冷凝器并使冷凝器温度到达-40℃的操作极限。打开架子的加热系统并将架子的温度设置在40℃。关闭冷凝器门和排气阀，打开真空泵，使气镇完全开放。当架子的温度达到40℃时，将小瓶放置在架子上，并在每个架子的一个小瓶中插入温度热电偶，关闭室门并将大和小进气阀完全打开。
当小瓶中内容物的温度达到35℃时，部分关闭大进气阀以实现800-900mbar的压力。在头15分钟内，对小瓶中含有来自介质中碳酸氢钠的溶解CO2的赋形剂轻柔地进行脱气。在此阶段中海藻糖可以接近病毒脂膜。
进一步关闭大进气阀，以使压力降低至500mbar。这使得小瓶中的赋形剂温度可以降低至约4.0℃，这说明蒸发冷却正在发生。仔细关闭小进气阀，同时监测赋形剂的温度，以使该温度稳定在约4.0℃。由于在该操作中这是最关键的阶段，所以注意避免飞溅和/或导致产品冷冻的过快蒸发。向室内计量通入无菌空气，以提供压力梯度促进水蒸汽流向冷凝器。通过仔细控制小进气阀，使整个过程中产品的温度维持在4℃。产品温度在4℃左右维持20-30分钟后，将小进气阀缓慢关闭，同时注意将产品温度维持在约4℃，室内压力维持在300mbar。在该阶段，产品体积极大地降低，到达糖浆稠度。到此时，将小气阀完全关闭。
从第一个干燥步骤开始起40分钟后，观察到产品温度的上升。45分钟后，赋形剂中大多数水分已蒸发掉，并且伴随大约15℃的突然散热，产品扩大成微晶蜂巢结构，同时海藻糖玻璃化为亚稳定起泡玻璃基质。这之后，产品中进一步的水汽蒸发成为具有10％最终含水量的产品，产品的温度也随之降低。
在关闭大和小进气阀并关闭真空泵的气镇阀的情况下，于0.1mbar的室内压力下持续干燥过夜，在此期间产品的温度达到40℃，即室内架子的温度。继续干燥以完成总共24小时的干燥时间，其间室内架子的温度在最后4小时的干燥时间内每小时上升1.0℃，达到44℃的最终温度顶点(架子和产品)。在维持0.06mbar室内压力的同时，将这些小瓶密封并盖上铝封盖。
将根据本实施例制备的脱水产品样品储存在45℃14天，然后按实施例2中所述方法测定病毒滴度。根据以上方法脱水的产品的残留水分含量经测定为约1.0％。45℃储存14天后，发现该产品的样品仅有轻微程度的病毒效力损失，适用于制备有用的疫苗材料。实施例4
按照以上实施例3的操作程序，采用RP病毒培养物代替实施例3中所述的PPR培养物，制备稳定化RP。此干燥过程同样制备了在45℃保存14天后滴度损失相对较低的稳定RP。

Claims (17)

1.含有活病毒或支原体的生物活性材料的保存方法，该方法包括步骤：
(i)将该生物活性材料的水性悬液与海藻糖的无菌水溶液混合，以使该混合物中的海藻糖浓度在0.2-10％w/v范围内；
(ii)在低于大气的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最终不超过40℃的条件下，对该混合物进行第一次干燥，时间为30-60分钟，以形成含有玻璃样海藻糖、残留水分含量不超过10％的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料；和
(iii)在不超过0.1mbar的压力下，在温度最终处于40-45℃范围内的条件下，对步骤(ii)的玻璃样多孔基质进行第二次干燥，时间为10-30个小时，以形成含有干燥的生物活性材料的、残留水分含量不超过2％的海藻糖基质。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(iii)中的第二次干燥进行20-30个小时。
3.根据权利要求2的方法，其中第二次干燥在约37℃的温度下进行15-17个小时，之后在第二次干燥剩余的时间内温度逐渐上升到40-45℃的最终温度。
4.根据权利要求1-3之任一项的方法，其中，在步骤(i)中该混合物内海藻糖的浓度在2-10％w/v的范围内。
5.根据权利要求4的方法，其中该混合物中海藻糖的浓度在2.5-8％w/v的范围内。
6.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中步骤(ii)中的第一次干燥在不超过800mbar的压力下进行。
7.根据权利要求1-6之任一项的方法，其中在步骤(ii)的第一次干燥结束时该玻璃样海藻糖基质的残留水分含量为约10％。
8.根据权利要求1-7之任一项的方法，其中在步骤(iii)的第二次干燥结束时所述残留水分含量为1.0％或更低。
9.根据权利要求1-8之任一项的方法，其中该活病毒选自牛瘟病毒、小反刍动物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒和新城疫病毒。
10.根据权利要求9的方法，其中该活病毒是牛瘟病毒或小反刍动物瘟疫病毒。
11.根据权利要求1-8之任一项的方法，其中该支原体是牛接触感染性胸膜肺炎支原体。
12.用于制备疫苗的可重新水化的组合物，其含有残留水分含量不超过2％的亚稳定玻璃基质形式的海藻糖，在该基质中含有选自干燥活病毒和干燥支原体的干燥生物活性材料。
13.根据权利要求9的组合物，其具有不超过1％的残留水分含量。
14.根据权利要求12或权利要求13的组合物，其中该生物活性材料是选自牛瘟病毒、小反刍动物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒和新城疫病毒的活病毒。
15.根据权利要求14的组合物，其中该生物活性材料是选自牛瘟病毒和小反刍动物瘟疫病毒的活病毒。
16.根据权利要求12或权利要求13的组合物，其中该生物活性材料是牛接触感染性胸膜肺炎支原体。
17.制备疫苗的方法，其包括将权利要求12-17之任一项的组合物在适当的水性介质中重新水化。
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