CN116270501A - 一种冻干稳定剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种冻干稳定剂及其制备方法与应用。本发明的冻干稳定剂，不含明胶、糊精和外源蛋白，包括A组分和B组分，A组分包括：蔗糖、M199、维生素C、NZ‑Amine AS、乳酸钙和谷氨酸钠；B组分包括：PVP、D‑山梨醇和吐温‑80；其中，PVP、蔗糖、D‑山梨醇的质量比为(2‑4)：(1‑4)：(0.5‑2.5)。本发明的冻干稳定剂减少了制品在冷冻干燥过程中各种理化因素可能对待冻干对象活性的损伤，尤其对鸡传染性支气管炎活疫苗具有较好的保护功能，可在2～8℃储存和运输，有效解决了冻干制品，如活疫苗需冷冻运输、储存不便等问题。

Description

一种冻干稳定剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种冻干稳定剂及其制备方法与应用。(禽用生物制品，如冻干活疫苗)
背景技术
鸡新城疫、鸡传染性支气管炎是危害养鸡业的两类主要传染病，目前对其防控防护以免疫预防为主。当前生产和使用的疫苗主要有两大类，即活疫苗和灭活疫苗。其中活疫苗具有使用方便，副作用小，产生免疫力快，成本低等优点，从而得到广泛的应用。但活疫苗采用常规冷冻干燥工艺，需要于-20℃条件下储存，运输需要冷链系统，耗时并耗费资源，常常因为保存或使用不当而受到环境影响，从而失去原有的生物活性，严重影响疫苗免疫效果，不利于在温湿度较高的地区和冷藏条件较差的地区进行积推广和应用。因此，开发禽用活疫苗稳定剂具有很重要的应用前景。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的之一是提供一种制备简便、成本低、对活疫苗(尤其是鸡传染性支气管炎活疫苗)的保护效果好的冻干稳定剂。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种冻干稳定剂，其不含明胶、糊精和外源蛋白，包括A组分和B组分，A组分包括：蔗糖、M199、维生素C、NZ-Amine AS、乳酸钙和谷氨酸钠；B组分包括：PVP、D-山梨醇和吐温-80；
其中，PVP、蔗糖、D-山梨醇的质量比为(2-4)：(1-4)：(0.5-2.5)。
本发明研究发现，现有技术中已有可对鸡新城疫病毒抗原、鸡法氏囊病毒抗原起到保护效果的稳定剂，但它们大多无法在鸡传染性支气管炎病毒抗原保护中发挥理想的效果。这是因为鸡传染性支气管炎病毒具有囊膜结构、且具有对温度敏感等方面的特殊性，故而无法通用一般的鸡新城疫病毒抗原、鸡法氏囊病毒抗原保护剂，且为研制传染性支气管炎活疫苗耐热保护剂增加了难度。
此外，在研发时还发现传染性支气管炎活苗在与新城疫活苗联合使用过程中，传染性支气管炎病毒组分的用量也会干扰新城疫病毒的免疫应答，进而为研发出可兼顾各方效果的鸡传染性支气管炎病毒和新城疫病毒抗原联合使用的耐热保护剂也增加了难度。
最终仅反复研究，本发明发现在摒弃本领域常用的明胶、糊精和外源蛋白(如牛血清白蛋白)后，再以特定组分配合，尤其是将PVP、蔗糖、D-山梨醇以特定比例配合后形成的禽用冻干活疫苗稳定剂，其针对鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫活疫苗和/或鸡法氏囊活疫苗具有良好的保护性能，能确保疫苗在2-8℃有效保存，尤其解决了目前针对鸡传染性支气管炎活疫苗没有理想保护剂的问题，而且还减少了外源蛋白等引起的过敏等副作用。
本发明配方中，PVP是作为“支架”的大分子物质，其与特定比例的蔗糖合用，通过糖类间的特定氨键作用，以及对糖类的玻璃化温度的特定改变，增加了物理稳定性，防止活性物质发生变性，可起到良好的低温、干燥保护剂作用，能防止和减少本发明保护对象冷冻过程结晶水的形成；再配合特定比例山梨醇的使用，可减少产品裂纹，易碎性，防止有效成分随水蒸气一起升华逸散，并对微生物有保护作用，可促进升华形成耐热骨架，阻断热传导和热辐射，进一步实现理想的保护剂效果。PVP、蔗糖、D-山梨醇三者的特定配合，保证了本发明效果的实现。
本发明配方中还特别将特定的多种组分配合使用，以MEM199(M199培养基)、NZ-Amine AS(氨基酸类)，升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏；以谷氨酸钠提高活疫苗冷冻干燥过程中存活率；以Vc的抗氧化活性主要在保护剂耐老化的过程中起作用，抑制氧化酶的活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质；以乳酸钙作为稳定剂；以吐温-80在冻结和脱水过程中既降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重皱褶剂的作用。配合解决PVP和蔗糖联用时制品易发生萎缩导致冻干后的效价降低的问题，使最终的稳定剂效果理想。
优选，PVP、蔗糖、D-山梨醇的质量比为(3-4)：(2.5-4)：(1.5-2.5)，可获得更佳的保护效果。
本发明的冻干稳定剂中，A组分与B组分的体积比为1：1；
A组分按质量百分比计，包括：蔗糖2～8％、M199 0.5～1.5％、维生素C 0.3～0.7％、NZ-Amine AS 2～6％、乳酸钙1～5％、谷氨酸钠2～8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 4～8％、D-山梨醇1～5％、吐温-80 0.005～0.015％，余量为水。
优选，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖5～8％、M199 1～1.5％、维生素C 0.5～0.7％、NZ-Amine AS 4～6％、乳酸钙3～5％、谷氨酸钠5～8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 6～8％、D-山梨醇3～5％、吐温-80 0.01～0.015％，余量为水。
更优选，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖5％、M199 1％、维生素C 0.5％、NZ-Amine AS 4％、乳酸钙3％、谷氨酸钠5％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 6％、D-山梨醇3％、吐温-800.01％，余量为水；
或，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖8％、M199 1.5％、维生素C 0.7％、NZ-AmineAS 6％、乳酸钙5％、谷氨酸钠8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 8％、D-山梨醇5％、吐温-800.015％，余量为水。
本发明另提供一种制备上述冻干稳定剂的方法，其包括将A组分溶解在水中后，进行过滤除菌的步骤，以及将B组分溶解在水中后高温灭菌的步骤。
本发明的方法中，采用0.22μm过滤除菌(如采用0.22微米终端除菌过滤器)；高温灭菌条件为：116℃，30min。
本发明还提供一种冻干活疫苗，其包括上述冻干稳定剂。
本发明再提供一种上述冻干稳定剂，或上述方法制备得到的冻干稳定剂在疫苗冻干保护中的应用。
本发明的应用中，所述疫苗为禽用活疫苗，所述禽用活疫苗为单苗或联苗，优选为鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫活疫苗和/或鸡法氏囊活疫苗。
本发明的有益效果至少在于：
1、本发明的稳定剂能够减少制品在冷冻干燥过程中各种理化因素可能对待冻干组分(如，病毒)活性的损伤，使冻干前后活性的损失率大大降低。对于病毒(活疫苗)而言，冻干前后损失各不超过1个滴度；
2、本发明的稳定剂可使待冻干组分，如活疫苗耐老化性能提高，在37℃条件下保存10天病毒的损失率均不超过1个滴度，在2～8℃保存36个月，病毒的损失率不超过1个滴度，有效解决了常规保护剂活疫苗需冷冻运输、储存不便等问题；
3、本发明的稳定剂在保证耐热性能好、能有效保护活疫苗的前提下，还具有配方成分及配制方法简单、成本低、可实现大量生产等优点，有效解决了现有耐热冻干保护剂所存在的成分复杂和成本高等缺陷；
4、本发明的稳定剂适用于多种禽用疫苗，不仅适用于单苗，还适用于联苗，适用范围广。
本发明特别适用于鸡传染性支气管炎病毒疫苗的保护，鸡传染性支气管炎病毒的活性易被温度影响，导致冻干后疫苗产品的病毒效价损失较高，传统的可对鸡新城疫病毒抗原、鸡法氏囊病毒抗原起到保护效果的稳定剂不能很好地解决鸡传染性支气管炎病毒疫苗的保护问题，而本发明冻干稳定剂解决了此问题。而且，还能对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗起到理想的保护效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
实施例1
本实施例提供一种冻干稳定剂及其制备方法，具体制备步骤如下：
将蔗糖、M199粉、维生素C、NZ-Amine AS、乳酸钙、谷氨酸钠溶于注射用水中，0.22μm过滤除菌，得组分A，将PVP、D-山梨醇、吐温-80溶于注射用水，高温灭菌，条件为：116℃，30min，得组分B。
本实施例中各冻干稳定剂的各组分按质量百分比的用量见表1。其中，稳定剂1、2、3使用时，由组分A和组分B按照1：1的体积比例混合获得；稳定剂4(对比配方)使用时，由组分A和组分B按照1：2的体积比例混合获得。
表1
Figure BDA0004050690370000051
Figure BDA0004050690370000061
实施例2应用本发明的稳定剂制备鸡新城疫活疫苗
本实施例将本发明实施例1制备的稳定剂1、2、3和4与检验合格的鸡新城疫病毒抗原(病毒含量应不低于108.0EID50/ml，由乾元浩生物股份有限公司提供)按1∶1体积比充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。同时设以5％蔗糖脱脂牛奶作为稳定剂的疫苗作对照组(常规疫苗组)。
采用的冻干曲线如下：
将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻阶段疫苗最低温度-40℃，降温1小时后，板层与疫苗温度达到设定值，达到最低温度后的维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度-20℃，达到最终温度的时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解析干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时，其中，解析干燥5小时疫苗升温至28℃，之后继续保持运行3小时。
1.病毒含量测定
将病毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，每个稀释度尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价。至120小时，取出所有活胚，逐枚收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价。凝集价不低于1:128(微量法)者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应不低于108.0EID50。结果见表2。
表2各稳定剂鸡新城疫活疫苗冻干前后病毒含量变化
组别 冻干前病毒含量(EID50) 冻干后病毒含量(EID50)
稳定剂1疫苗组 108.5/0.1ml 108.3/0.1ml
稳定剂2疫苗组 108.5/0.1ml 108.4/0.1ml
稳定剂3疫苗组 108.5/0.1ml 108.4/0.1ml
稳定剂4疫苗组 108.5/0.1ml 108.3/0.1ml
常规疫苗组 108.5/0.1ml 108.1/0.1ml
从试验结果可以看出，采用本发明稳定剂制备的鸡新城疫活疫苗冻干前后病毒损失率比常规稳定剂损失率低。
2.疫苗保存期试验
将上述制得的疫苗分别置2～8℃、37℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其性状变化，并测定病毒含量以监测疫苗病毒含量变化情况。结果本发明的稳定剂1～3试验疫苗在2～8℃条件下保存36个月、37℃条件下保存10天，其性状均未发生改变；病毒含量下降不超过1个滴度，测定结果见表3～表4。
表3疫苗在2～8℃条件下保存鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
稳定剂1疫苗组 108.3/0.1ml 108.2/0.1ml 108.0/0.1ml 107.8/0.1ml 107.4/0.1ml
稳定剂2疫苗组 108.4/0.1ml 108.3/0.1ml 108.1/0.1ml 108.0/0.1ml 107.5/0.1ml
稳定剂3疫苗组 108.4/0.1ml 108.3/0.1ml 108.1/0.1ml 108.0/0.1ml 107.5/0.1ml
稳定剂4疫苗组 108.3/0.1ml 108.0/0.1ml 107.9/0.1ml 107.5/0.1ml 107.3/0.1ml
常规疫苗对照组 108.1/0.1ml 107.5/0.1ml 107.0/0.1ml 105.2/0.1ml 104.1/0.1ml
表4疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 7天 10天
稳定剂1疫苗组 108.3/0.1ml 107.9/0.1ml 107.3/0.1ml
稳定剂2疫苗组 108.4/0.1ml 108.0/0.1ml 107.4/0.1ml
稳定剂3疫苗组 108.4/0.1ml 108.0/0.1ml 107.4/0.1ml
稳定剂4疫苗组 108.3/0.1ml 107.7/0.1ml 107.2/0.1ml
常规疫苗对照组 108.1/0.1ml 105.7/0.1ml 105.0/0.1ml
从以上试验结果可以看出，在不同环境温度条件下，本发明稳定剂对鸡新城疫活疫苗具有良好的保护效果，保护效果明显优于用常规5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂对鸡新城疫活疫苗的保护效果。
实施例3应用本发明的稳定剂制备鸡传染性支气管炎活疫苗
将本发明实施例1制备的稳定剂1、2、3和4与检验合格的鸡传染性支气管炎病毒抗原(病毒含量应不低于106.0EID50/ml，由乾元浩生物股份有限公司提供)按1：1体积比充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。同时设以5％蔗糖脱脂牛奶作为稳定剂的疫苗作对照组(常规疫苗组)。
采用冻干曲线如下：
将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻阶段疫苗最低温度-40℃，降温1小时后，板层与疫苗温度达到设定值，达到最低温度后的维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度-20℃，达到最终温度的时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解析干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时，其中，解析干燥5小时疫苗升温至28℃，之后继续保持运行3小时。
1.病毒含量测定
将鸡传染性支气管炎病毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7 3个稀释度，分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃孵育144小时，根据接种后24～144小时内死胚及144小时时存活的鸡胚中出现胎儿失水、蜷缩、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病变鸡胚的总和计算EID50。结果见表5。
表5各稳定剂鸡传染性支气管炎活疫苗冻干前后病毒含量变化
组别 冻干前病毒含量(EID50) 冻干后病毒含量(EID50)
稳定剂1疫苗组 106.5/0.1ml 106.3/0.1ml
稳定剂2疫苗组 106.5/0.1ml 106.4/0.1ml
稳定剂3疫苗组 106.5/0.1ml 106.4/0.1ml
稳定剂4疫苗组 106.5/0.1ml 106.3/0.1ml
常规疫苗组 106.5/0.1ml 106.2/0.1ml
从试验结果可以看出，采用本发明稳定剂制备的鸡传染性支气管炎活疫苗冻干前后病毒损失率比常规稳定剂损失率低。
2.疫苗保存期试验
将上述制得的病毒抗原分别置2～8℃、37℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其性状变化，并测定病毒含量以监测疫苗病毒含量变化情况。结果本发明的稳定剂1～3试验疫苗在2～8℃条件下保存36个月、37℃条件下保存10天，其性状均未发生改变；病毒含量下降不超过1个滴度，测定结果见表6～表7。
表6疫苗在2～8℃条件下保存鸡传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
稳定剂1疫苗组 106.3/0.1ml 106.1/0.1ml 106.0/0.1ml 105.8/0.1ml 105.4/0.1ml
稳定剂2疫苗组 106.4/0.1ml 106.2/0.1ml 106.1/0.1ml 105.9/0.1ml 105.5/0.1ml
稳定剂3疫苗组 106.4/0.1ml 106.2/0.1ml 106.1/0.1ml 105.9/0.1ml 105.5/0.1ml
稳定剂4疫苗组 106.3/0.1ml 106.0/0.1ml 105.8/0.1ml 105.5/0.1ml 105.3/0.1ml
常规疫苗对照组 106.2/0.1ml 105.9/0.1ml 105.0/0.1ml 104.1/0.1ml 103.2/0.1ml
表7疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
Figure BDA0004050690370000091
Figure BDA0004050690370000101
从以上试验结果可以看出，在不同环境温度条件下，本发明稳定剂对鸡传染性支气管炎活疫苗具有良好的保护效果，保护效果明显优于用常规5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂对鸡新城疫活疫苗的保护效果。
实施例4应用本发明的稳定剂制备鸡法氏囊活疫苗
将本发明实施例1制备的稳定剂1、2、3和4与检验合格的鸡法氏囊病毒抗原(病毒含量应不低于104.0ELD50/ml，由乾元浩生物股份有限公司提供)按1:1体积比充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。同时设以5％蔗糖脱脂牛奶作为稳定剂的疫苗作对照组(常规疫苗组)。
采用冻干曲线如下：
将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻阶段疫苗最低温度-40℃，降温1小时后，板层与疫苗温度达到设定值，达到最低温度后的维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度-20℃，达到最终温度的时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解吸干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时，其中，解析干燥5小时疫苗升温至28℃，之后继续保持运行3小时。
1.病毒含量测定
将鸡法氏囊病毒用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，以绒毛尿囊膜途径每个稀释度接种10～12日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，观察168小时，计算半数致死量(ELD50)。结果见表8。
表8各稳定剂鸡法氏囊活疫苗冻干前后病毒含量变化
Figure BDA0004050690370000102
Figure BDA0004050690370000111
从试验结果可以看出，采用本发明稳定剂制备的鸡法氏囊活疫苗冻干前后病毒损失率比常规稳定剂损失率低。
2.疫苗保存期试验
将上述制得的病毒抗原分别置2～8℃、37℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其性状变化，并测定病毒含量以监测疫苗病毒含量变化情况。结果本发明的稳定剂1～3试验疫苗在2～8℃条件下保存36个月、37℃条件下保存10天，其性状均未发生改变；病毒含量下降不超过0.4个滴度，测定结果见表9～表10。
表9疫苗在2～8℃条件下保存12、18、24、36个月鸡法氏囊病毒含量测定结果(ELD50)
组别 基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
稳定剂1疫苗组 105.5/0.1ml 105.4/0.1ml 105.4/0.1ml 105.3/0.1ml 105.2/0.1ml
稳定剂2疫苗组 105.5/0.1ml 105.5/0.1ml 105.4/0.1ml 105.3/0.1ml 105.3/0.1ml
稳定剂3疫苗组 105.5/0.1ml 105.5/0.1ml 105.4/0.1ml 105.3/0.1ml 105.3/0.1ml
稳定剂4疫苗组 105.5/0.1ml 105.4/0.1ml 105.4/0.1ml 105.3/0.1ml 105.1/0.1ml
常规疫苗对照组 105.2/0.1ml 104.9/0.1ml 104.8/0.1ml 104.4/0.1ml 103.7/0.1ml
表10疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡法氏囊病毒含量测定结果(ELD50)
组别 基础效价 7天 10天
稳定剂1疫苗组 105.5/0.1ml 105.4/0.1ml 105.2/0.1ml
稳定剂2疫苗组 105.5/0.1ml 105.5/0.1ml 105.3/0.1ml
稳定剂3疫苗组 105.5/0.1ml 105.5/0.1ml 105.3/0.1ml
稳定剂4疫苗组 105.5/0.1ml 105.3/0.1ml 105.1/0.1ml
常规疫苗对照组 105.2/0.1ml 104.0/0.1ml 103.6/0.1ml
从以上试验结果可以看出，在不同环境温度条件下，本发明稳定剂对鸡法氏囊活疫苗具有良好的保护效果，保护效果明显优于用常规5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂对鸡法氏囊活疫苗的保护效果。
实施例5应用本发明的稳定剂制备鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗
将本发明实施例1制备的稳定剂1、2、3和4与检验合格的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎病毒抗原(分别参见实施例2和3)按1：0.5：0.5比例充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。同时设以5％蔗糖脱脂牛奶作为稳定剂的疫苗作对照组(常规疫苗组)。
采用冻干曲线如下：
将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻阶段疫苗最低温度-40℃，降温1小时后，板层与疫苗温度达到设定值，达到最低温度后的维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度-20℃，达到最终温度的时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解吸干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时，其中，解析干燥5小时疫苗升温至28℃，之后继续保持运行3小时。
1.二联活疫苗病毒含量测定，方法参见实施例2和实施例3。
结果见表11。
表11各稳定剂鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗冻干前后病毒含量变化
Figure BDA0004050690370000121
从试验结果可以看出，采用本发明稳定剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗冻干前后病毒损失率比常规稳定剂损失率低。
2.二联活疫苗保存期试验
将上述制得的病毒抗原分别置2～8℃、37℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其性状变化，并测定病毒含量以监测疫苗病毒含量变化情况。结果本发明的稳定剂1～3试验疫苗在2～8℃条件下保存36个月、37℃条件下保存10天，其性状均未发生改变；病毒含量下降不超过1个滴度，测定结果见表12～表15。
表12二联活疫苗在2～8℃条件下保存鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
稳定剂1疫苗组 108.0/0.1ml 107.8/0.1ml 107.6/0.1ml 107.4/0.1ml 107.1/0.1ml
稳定剂2疫苗组 108.0/0.1ml 107.9/0.1ml 107.7/0.1ml 107.5/0.1ml 107.1/0.1ml
稳定剂3疫苗组 108.0/0.1ml 107.9/0.1ml 107.7/0.1ml 107.5/0.1ml 107.1/0.1ml
稳定剂4疫苗组 108.0/0.1ml 107.8/0.1ml 107.5/0.1ml 107.2/0.1ml 107.0/0.1ml
常规疫苗对照组 107.9/0.1ml 107.4/0.1ml 106.9/0.1ml 105.1/0.1ml 103.9/0.1ml
表13二联活疫苗在2～8℃条件下保存传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
稳定剂1疫苗组 105.9/0.1ml 105.7/0.1ml 105.5/0.1ml 105.30.1ml 105.0/0.1ml
稳定剂2疫苗组 106.0/0.1ml 105.7/0.1ml 105.6/0.1ml 105.3/0.1ml 105.2/0.1ml
稳定剂3疫苗组 106.0/0.1ml 105.7/0.1ml 105.6/0.1ml 105.3/0.1ml 105.2/0.1ml
稳定剂4疫苗组 105.9/0.1ml 105.7/0.1ml 105.4/0.1ml 105.1/0.1ml 104.9/0.1ml
常规疫苗对照组 105.5/0.1ml 105.0/0.1ml 104.8/0.1ml 104.2/0.1ml 102.4/0.1ml
表14二联疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
Figure BDA0004050690370000131
Figure BDA0004050690370000141
表15二联疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
组别 基础效价 7天 10天
稳定剂1疫苗组 105.9/0.1ml 105.2/0.1ml 104.9/0.1ml
稳定剂2疫苗组 106.0/0.1ml 105.3/0.1ml 104.9/0.1ml
稳定剂3疫苗组 106.0/0.1ml 105.3/0.1ml 105.0/0.1ml
稳定剂4疫苗组 105.9/0.1ml 105.1/0.1ml 104.6/0.1ml
常规疫苗对照组 105.5/0.1ml 104.2/0.1ml 102.9/0.1ml
从以上试验结果可以看出，在不同环境温度条件下，本发明稳定剂对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗具有良好的保护效果，保护效果明显优于用常规5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂对鸡新城疫活疫苗的保护效果。
对比例1应用中国专利CN1233418C的稳定剂制备鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗
将中国专利CN1233418C的稳定剂(明胶2％、糊精6％、牛血清白蛋白1％、蔗糖5％、PVP K90 3％、酪蛋白胨1％、山梨醇2％、谷氨酸钠1％、Vc 0.2％，制剂中为干物质组份，百分比剩余份均为注射用水)与检验合格的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎病毒抗原(分别参见实施例2和3)按1：0.5：0.5比例充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
采用冻干曲线如下：
将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻阶段疫苗最低温度-40℃，降温1小时后，板层与疫苗温度达到设定值，达到最低温度后的维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度-20℃，达到最终温度的时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解吸干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时，其中，解析干燥5小时疫苗升温至28℃，之后继续保持运行3小时。
1.二联活疫苗病毒含量测定，方法参见实施例2和实施例3。
结果见表16。
表16鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗冻干前后病毒含量变化
Figure BDA0004050690370000151
从试验结果可以看出，采用本发明稳定剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗冻干前后病毒损失与中国专利CN1233418C的上述稳定剂损失相当。
2.二联活疫苗保存期试验
将上述制得的活疫苗分别置2～8℃、37℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其性状变化，并测定病毒含量以监测疫苗病毒含量变化情况。结果疫苗在2～8℃条件下保存36个月、37℃条件下保存10天，其性状均未发生改变；鸡新城疫病毒含量下降不超过1个滴度，传染性支气管炎病毒含量下降超过1个滴度，测定结果见表17～表20。
表17疫苗在2～8℃条件下保存鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
108.0/0.1ml 107.8/0.1ml 107.5/0.1ml 107.3/0.1ml 107.0/0.1ml
表18疫苗在2～8℃条件下保存传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
基础效价 12个月 18个月 24个月 36个月
105.9/0.1ml 105.6/0.1ml 105.3/0.1ml 104.80.1ml 104.5/0.1ml
表19疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡新城疫病毒含量测定结果(EID50)
基础效价 7天 10天
108.0/0.1ml 107.4/0.1ml 107.0/0.1ml
表20疫苗在37℃条件下保存7、10天鸡传染性支气管炎病毒含量测定结果(EID50)
基础效价 7天 10天
105.9/0.1ml 105.1/0.1ml 104.7/0.1ml
从以上试验结果可以看出，本发明稳定剂对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗保护效果明显优于中国专利CN1233418C的上述稳定剂对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的保护效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种冻干稳定剂，其特征在于，不含明胶、糊精和外源蛋白，包括A组分和B组分，A组分包括：蔗糖、M199、维生素C、NZ-AmineAS、乳酸钙和谷氨酸钠；B组分包括：PVP、D-山梨醇和吐温-80；
其中，PVP、蔗糖、D-山梨醇的质量比为(2-4)：(1-4)：(0.5-2.5)。
2.根据权利要求1所述的冻干稳定剂，其特征在于，PVP、蔗糖、D-山梨醇的质量比为(3-4)：(2.5-4)：(1.5-2.5)。
3.根据权利要求1或2所述的冻干稳定剂，其特征在于，A组分与B组分的体积比为1：1；
A组分按质量百分比计，包括：蔗糖2～8％、M199 0.5～1.5％、维生素C 0.3～0.7％、NZ-Amine AS 2～6％、乳酸钙1～5％、谷氨酸钠2～8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 4～8％、D-山梨醇1～5％、吐温-80 0.005～0.015％，余量为水。
4.根据权利要求3所述的冻干稳定剂，其特征在于，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖5～8％、M199 1～1.5％、维生素C 0.5～0.7％、NZ-Amine AS 4～6％、乳酸钙3～5％、谷氨酸钠5～8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 6～8％、D-山梨醇3～5％、吐温-80 0.01～0.015％，余量为水。
5.根据权利要求4所述的冻干稳定剂，其特征在于，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖5％、M199 1％、维生素C 0.5％、NZ-Amine AS 4％、乳酸钙3％、谷氨酸钠5％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 6％、D-山梨醇3％、吐温-800.01％，余量为水；
或，A组分按质量百分比计，包括：蔗糖8％、M199 1.5％、维生素C 0.7％、NZ-Amine AS6％、乳酸钙5％、谷氨酸钠8％，余量为水；
B组分按质量百分比计，包括：PVP 8％、D-山梨醇5％、吐温-800.015％，余量为水。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的冻干稳定剂的方法，其特征在于，包括将A组分溶解在水中后，进行过滤除菌的步骤，以及将B组分溶解在水中后高温灭菌的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用0.22μm过滤除菌；高温灭菌条件为：116℃，30min。
8.一种冻干活疫苗，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的冻干稳定剂。
9.一种权利要求1-5任一项所述的冻干稳定剂，或以权利要求6或7的方法制备得到的冻干稳定剂在疫苗冻干保护中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疫苗为禽用活疫苗，所述禽用活疫苗为单苗或联苗，优选为鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫活疫苗和/或鸡法氏囊活疫苗。
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