CN107281481B - 一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、制备方法和冻干疫苗及制备方法 - Google Patents

一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、制备方法和冻干疫苗及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量份的组分：明胶3～10份、海藻糖1～5份、蔗糖5～15份、牛血清白蛋白0.1～2份、胰蛋白胨1～8份、酶解酪蛋白2～10份、硫脲1～5份、L‑谷氨酸钠0.8～2份、精氨酸0.1～3份、聚乙烯吡咯烷酮(PVP‑K30)0.5～5份和甘露醇0.1～2份。本发明还公开了该耐热冻干保护剂的制备方法以及采用该保护剂制得的冻干疫苗。使用该耐热冻干保护剂保护疫苗，其采用特定的冻干工艺，可有效降低病毒的冻干损失，可以提高病毒对温度的耐受能力，疫苗在长期保持后依然能维持良好的物理性状和效价，即性状稳定，具有耐热、保存时间长的特点。

Description

一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、制备方法和冻干疫苗及 制备方法
技术领域
本发明属于疫苗耐热保护剂技术领域，具体涉及一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、保护剂的制备方法以及冻干疫苗及冻干疫苗的制备方法。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。而疫苗免疫接种是预防和控制伪狂犬病的根本措施。
病毒等生物活性物质及其相关制品的热敏感性一直是活疫苗长期保存的瓶颈。我国幅员辽阔，经济水平差异较大，运输、使用过程中疫苗短期暴露高温环境(甚至45℃以上)的现象依然存在，所以对活疫苗的耐热性能提出了更高的要求。
活疫苗的冷冻干燥工艺对其保存期也有很大的影响。常规冷冻干燥工艺中，活疫苗首先被超低温冻结(-40℃以下)，形成的冰结晶对病毒的囊膜或者细胞壁造成不同程度的伤害，进而影响干燥产品水合后的活性。因此，常规冷冻干燥工艺中，制品的耐热性能还是有限的，室温甚至更高温度的稳定性是不高的。
在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素，例如化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等都会影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。为了防止生物制品活性组分的变性，需要添加合适冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥和贮藏。
另外，近年来随着我国畜牧业的飞速发展，养殖密度加大，疫病种类增多且暴发频繁，与之相适应的动物防疫模式也发生了根本性的变化。防疫质量成为制约这一变化的瓶颈之一，疫苗质量更是其中的关键问题。众所周知，疫苗特别是活疫苗对于冷链运输以及储存温度要求非常高，而这一环节控制不好将直接影响疫苗质量，因此，对于耐热保护剂的开发显得尤为重要。
在实际生产中，疫苗耐热剂的开发难度大，而且保护效果不佳，因此，研制一种能适用于大规模生产且保护功能强的伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、保护剂的制备方法以及冻干疫苗及冻干疫苗的制备方法，可有效解决现有的伪狂犬活疫苗耐热保护剂保护效果不佳的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量份的组分：明胶3～10份、海藻糖1～5份、蔗糖5～15份、牛血清白蛋白0.1～2份、胰蛋白胨1～8份、酶解酪蛋白2～10份、硫脲1～5份、L-谷氨酸钠0.8～2份、精氨酸0.1～3份、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)0.5～5份和甘露醇0.1～2份。
进一步地，一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量份的组分：明胶5份、海藻糖1.5份、蔗糖9.6份、牛血清白蛋白0.2份、胰蛋白胨4份、酶解酪蛋白4份、硫脲1.6份、L-谷氨酸钠1.2份、精氨酸0.2份、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)1份和甘露醇0.1份。
上述伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备A液
按配方称取海藻糖、牛血清白蛋白、酶解酪蛋白、L-谷氨酸钠、硫脲、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，加入注射水中至完全溶解，采用0.22μm的滤膜过滤除菌；
(2)制备B液
按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射水中，再于121℃灭菌30min；
(3)将A液和B液按体积比为1:1混合，制得伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂。
一种冻干伪狂犬疫苗，其制备方法包括：将上述制备好的耐热冻干保护剂与伪狂犬疫苗原液按体积比为1:1混合得冻干液，然后对冻干液进行冻干处理，得冻干伪狂犬疫苗。
进一步地，冻干工艺包括：在3h内将冻干液的温度降至-22～-25℃，保持2h以达到各组分的共晶点，迅速将温度降至-45℃，保持4～5h，然后抽真空至真空度达12Pa以内以1℃/min的速率逐渐升温至-5℃，保持15～20h，将大部分水升华，再升温至0℃，保持1～3h，接着升温至5℃，保持1～3h，最后升温至26℃，保持5～8h。
本发明提供的一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂、保护剂的制备方法以及冻干疫苗及冻干疫苗的制备方法，具有以下有益效果：
(1)海藻糖、蔗糖、精氨酸、L-谷氨酸钠等小分子物质形成均匀悬液，保护悬浮于耐热保护剂中的病毒或细菌；海藻糖和蔗糖属于低聚糖，能起到低温保护功能和脱水保护作用；明胶、牛血清白蛋白、胰蛋白胨、酶解酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮形成耐热性构架，阻断热源对构架内病毒或细菌的热传导性和热辐射性杀伤，同时促进冷冻干燥过程中的升华；酶解酪蛋白和聚乙烯吡咯烷酮还能提高海藻糖和蔗糖的低温保护功能及脱水保护作用；明胶同时还可作为填充剂，与甘露醇一起作为填充剂提供支撑结构，并且不与有效组分发生反应，还能防止有效组分随水蒸气一起升华，赋予产品一定外形；硫脲抗氧化剂防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质。
(2)冻干工艺是根据保护剂中各组分的共晶点以及病毒特性来进行研究才优化出的工艺过程，采用该预冻方法所得物质进行升华干燥后得到的产品外观为疏松圆柱形块状物，表面无外观缺陷，无玻璃体结晶。
在3h内将冻干液温度降至-22～-25℃，保持2h以达到各组分的共晶点，再迅速将温度降至-45℃，保持4～5h，是为了让各组分匀速结晶，接着抽真空升温，是为了将冰升华，除去大部分水，再升温至0℃，保持1～3h，是为了接近共熔点温度，若高于共熔点温度，物料会发生塌陷，冻干后的物料还可能会出现气泡，体积缩小，不易溶解，然后再继续升温是为了提供较高的热量，除去剩余的部分结合水。
(3)本发明提供的伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，其各组分之间的相互作用，可有效提高疫苗在冻干时对温度的耐受性，减少疫苗在冻干过程中产生的效力损失，同时使用该耐热冻干保护剂保护疫苗，其采用特定的冻干工艺，可有效降低病毒的冻干损失，可以提高病毒对温度的耐受能力，疫苗在长期保持后依然能维持良好的物理性状和效价，即性状稳定，具有耐热、保存时间长的特点。
具体实施方式
实施例1
一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量的组分：明胶30g、海藻糖10g、蔗糖50g、牛血清白蛋白1g、胰蛋白胨10g、酶解酪蛋白20g、硫脲10g、L-谷氨酸钠8g、精氨酸1g、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)5g和甘露醇1g。
上述伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备A液
按配方称取海藻糖、牛血清白蛋白、酶解酪蛋白、L-谷氨酸钠、硫脲、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，加入适量注射水至完全溶解，然后再定容至1L，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌；
(2)制备B液
按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射水中，然后定容至1L，再经121℃高温灭菌30min；
(3)将所得A液和B液混合，制得伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂。
一种冻干伪狂犬疫苗，其制备方法包括：将上述制备好的耐热冻干保护剂与伪狂犬疫苗原液按体积比为1:1混合得冻干液，然后对冻干液进行冻干处理，得冻干伪狂犬疫苗；其中，冻干工艺包括：在3h内将冻干液的温度降至-22～-25℃，保持2h以达到各组分的共晶点，迅速将温度降至-45℃，保持4～5h，然后抽真空至真空度达12Pa以内以1℃/min的速率逐渐升温至-5℃，保持15～20h，将大部分水升华，再升温至0℃，保持1～3h，接着升温至5℃，保持1～3h，最后升温至26℃，保持5～8h。
实施例2
一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量的组分：明胶100g、海藻糖50g、蔗糖150g、牛血清白蛋白20g、胰蛋白胨80g、酶解酪蛋白100g、硫脲50g、L-谷氨酸钠20g、精氨酸30g、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)50g和甘露醇20g。
上述伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备A液
按配方称取海藻糖、牛血清白蛋白、酶解酪蛋白、L-谷氨酸钠、硫脲、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，加入适量注射水至完全溶解，然后再定容至1L，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌；
(2)制备B液
按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射水中，然后定容至1L，再经121℃高温灭菌30min；
(3)将所得A液和B液混合，制得伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂。
一种冻干伪狂犬疫苗，其制备方法包括：将上述制备好的耐热冻干保护剂与伪狂犬疫苗原液按体积比为1:1混合得冻干液，然后对冻干液进行冻干处理，得冻干伪狂犬疫苗；其中，冻干工艺包括：在3h内将冻干液的温度降至-22～-25℃，保持2h以达到各组分的共晶点，迅速将温度降至-45℃，保持4～5h，然后抽真空至真空度达12Pa以内以1℃/min的速率逐渐升温至-5℃，保持15～20h，将大部分水升华，再升温至0℃，保持1～3h，接着升温至5℃，保持1～3h，最后升温至26℃，保持5～8h。
实施例3
一种伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂，包括以下重量份的组分：明胶50g、海藻糖15g、蔗糖96g、牛血清白蛋白2g、胰蛋白胨40g、酶解酪蛋白40g、硫脲16g、L-谷氨酸钠12g、精氨酸2g、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)10g和甘露醇1g。
上述伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备A液
按配方称取海藻糖、牛血清白蛋白、酶解酪蛋白、L-谷氨酸钠、硫脲、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，加入适量注射水至完全溶解，然后再定容至1L，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌；
(2)制备B液
按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射水中，然后定容至1L，再经121℃高温灭菌30min；
(3)将所得A液和B液混合，制得伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂。
一种冻干伪狂犬疫苗，其制备方法包括：将上述制备好的耐热冻干保护剂与伪狂犬疫苗原液按体积比为1:1混合得冻干液，然后对冻干液进行冻干处理，得冻干伪狂犬疫苗；其中，冻干工艺包括：在3h内将冻干液的温度降至-22～-25℃，保持2h以达到各组分的共晶点，迅速将温度降至-45℃，保持4～5h，然后抽真空至真空度达12Pa以内以1℃/min的速率逐渐升温至-5℃，保持15～20h，将大部分水升华，再升温至0℃，保持1～3h，接着升温至5℃，保持1～3h，最后升温至26℃，保持5～8h。
实验例对冻干疫苗的检测
1、对本发明制得的冻干伪狂犬疫苗(冻干粉剂)进行成品检测，检测内容及结果如下：
(1)性状：为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加PBS液后迅速溶解。
(2)无菌检验：按《无菌检验标准操作规程》进行检验，无菌生长。
(3)支原体检验：按《支原体检验标准操作规程》进行检验，无支原体生长。
(4)外源病毒检验：按《外源病毒检验(非禽源)标准操作规程》进行检验，无外源病毒污染。
(5)安全检验：按瓶签注明头份，将疫苗用PBS稀释为每5.0ml含14头份，肌肉注射6～18月龄、无伪狂犬病病毒中和抗体的绵羊2只，各5.0ml，观察14日，无临床反应。
(6)效力检验
①免疫攻毒法
按瓶签注明头份，将疫苗用PBS稀释为每1.0ml含0.2头份，用6～18月龄、无伪狂犬病病毒中和抗体的绵羊7只，4只各肌肉注射1.0ml，另3只作对照。接种14日后，每只绵羊各肌肉注射强毒1.0ml(含103.0LD50)，观察14日，对照羊至少2只发病死亡，免疫羊应全部保护。
②病毒含量测定
按瓶签注明头份，将疫苗用PBS做10倍系列稀释，取适宜稀释度，每个稀释度各接种鸡胚成纤维细胞8孔，每孔0.1ml，补充维持液0.1ml/孔。置37℃,5％CO2培养箱培养5日，观察并记录CPE，计算TCID50，每头份病毒含量不低于104.5TCID50。
(7)剩余水分测定：按《剩余水分测定检验标准操作规程》进行测定，各样品剩余水份含量均≤3.5％。
2、使用本发明实施例3制备的耐热冻干保护剂(以下简称为耐热冻干保护剂)采用本发明提供的冻干工艺保护疫苗和使用普通保护剂(5％蔗糖和12％脱脂乳混合所得的保护剂)采用常规冻干工艺保护疫苗，其物理参数以及在37℃条件下放置不同时间后病毒含量情况，单位为lgTCID50/头份，结果见表1。
表1使用不同耐热保护剂保护疫苗结果
Figure BDA0001368388090000081
Figure BDA0001368388090000091
分别测定耐热冻干保护剂和普通保护剂保护的疫苗在37℃条件下放置不同时间后病毒含量损失情况，单位为lgTCID50/头份，结果见表2。
表2 37℃条件下放置不同时间后病毒含量损失结果
Figure BDA0001368388090000101
由表1和表2可知，伪狂犬病毒用普通保护剂和耐热冻干保护剂进行冻干，其冻干损失都是非常小(0.2个滴度以内)，但是耐热后病毒含量损失差异就非常大了。普通保护剂通过三次重复试验数据可以看出37℃耐热15天病毒含量降低1.87～2.10个滴度，而耐热保护剂的损失在0.3个滴度以内。另外，从表1可以看出，普通保护剂在耐热1-3天和10-15天这两个时间段的损失非常大，耐热冻干保护剂在整个耐热过程中都能很好的保护病毒。
采用本发明制备的耐热冻干保护剂保护疫苗，其冻干工艺采用常规的冻干工艺时，观察其物理性质，不符合冻干疫苗对物理性状的要求，有严重塌陷。采用普通的保护剂，通过本发明提供的冻干工艺来进行疫苗保护时，其疫苗质量均受到影响，保存时间明显缩短，滴度降低，其结果见表3和表4。
表3 37℃条件下放置不同时间后病毒含量结果
Figure BDA0001368388090000111
表4 37℃条件下放置不同时间后病毒含量损失结果
Figure BDA0001368388090000112
由表3和4可知，采用普通的保护剂，通过本发明提供的冻干工艺来进行疫苗保护时，其疫苗质量均受到影响，保存时间明显缩短，滴度降低，但比采用普通保护剂和普通的冻干工艺保护疫苗相比，滴度降低少，保存时间长，与本发明耐热冷冻保护剂和本发明冻干工艺结合保护疫苗相比，滴度降低，保存时间短，说明只有将本发明耐热冷冻保护剂和本发明冻干工艺结合保护疫苗时效果最佳。

Claims (4)

1.一种冻干伪狂犬疫苗的制备方法，其特征在于，包括：将耐热冻干保护剂与伪狂犬疫苗原液按体积比为1:1混合，得冻干液，然后对冻干液进行冻干处理，得冻干伪狂犬疫苗；
其中，耐热冻干保护剂包括以下重量份的组分：明胶3~10份、海藻糖1~5份、蔗糖5~15份、牛血清白蛋白0.1~2份、胰蛋白胨1~8份、酶解酪蛋白2~10份、硫脲1~5份、L-谷氨酸钠0.8~2份、精氨酸0.1~3份、聚乙烯吡咯烷酮0.5~5份和甘露醇0.1~2份；
冻干工艺包括：在3h内将冻干液的温度降至-22~-25℃，保持2h，再将温度降至-45℃，保持4~5h，然后抽真空至真空度达12Pa以内以1℃/min的速率升温至-5℃，保持15~20h，再升温至0℃，保持1~3h，接着升温至5℃，保持1~3h，最后升温至26℃，保持5~8h。
2.根据权利要求1所述的冻干伪狂犬疫苗的制备方法，其特征在于，耐热冻干保护剂包括以下重量份的组分：明胶5份、海藻糖1.5份、蔗糖9.6份、牛血清白蛋白0.2份、胰蛋白胨4份、酶解酪蛋白4份、硫脲1.6份、L-谷氨酸钠1.2份、精氨酸0.2份、聚乙烯吡咯烷酮1份和甘露醇0.1份。
3.根据权利要求1或2所述的冻干伪狂犬疫苗的制备方法，其特征在于，耐热冻干保护剂通过以下方法制得：
（1）制备A液
按配方称取海藻糖、牛血清白蛋白、酶解酪蛋白、L-谷氨酸钠、硫脲、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，加入注射水中至完全溶解，过滤除菌；
（2）制备B液
按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射水中，再于121℃灭菌30min；
（3）将A液和B液按体积比为1:1混合，制得伪狂犬活疫苗耐热冻干保护剂。
4.权利要求1-3任一项所述方法制备得到的冻干伪狂犬疫苗。
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