CN106237339A - 一种冻干疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冻干疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。它包括以下质量百分比的原料：0.3～0.6％的L‑谷氨酸钠、8～14％的蔗糖、2～5％的D‑山梨醇、1～3％的牛血清白蛋白、0.1～0.3％的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～1％的硫脲、3～5％的NZ‑Amine AS、0.8～1.5％的水解明胶，余量为pH 7.2的PBS。本发明的冻干疫苗耐热保护剂经过无菌处理后应用于猪伪狂犬病活疫苗和猪繁殖与呼吸道综合征活疫苗的冻干。两种病毒采用同样的耐热保护剂和冻干工艺，冻干损失低于0.2个滴度，37℃放置7日，病毒含量滴度降低小于1个滴度，能在2～8℃保存24个月；为冻干疫苗的生产提供了便利，同时也提高了产品质量及竞争力。

Description

一种冻干疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物制品领域，具体涉及一种冻干疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
冻干保护剂可能影响生物制品的质量、效价和稳定性，耐热冻干保护剂有免疫活性而无药理活性，它不仅具有保护制品生物学活性的作用，而且具有赋形剂和抗氧化剂的作用，直接与疫苗的滴度和稳定性相关联，可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性，确保制品在2～8℃条件下，保存期可长达24个月，效价无明显下降，即使在37℃条件下也可以保存十天以上，从而解决了常规疫苗在长途运输、长期保存和使用过程中不耐热、储存温度低、保存期短和苛刻的冷冻条件造成大量能源浪费等难题。但国内疫苗企业常用的冻干保护剂组方简单，保护性能差。如果在2～8℃条件下保存，保存期只有短短的3～6个月，大多需要在-15℃条件下保存。这就要求疫苗在保存、运输和使用过程中尽可能在低温条件下进行，否则疫苗的效价就会大打折扣。而在疫苗生产、运输和使用过程中，如果任何一个环节的冷链系统控制不当，高温环境就会导致疫苗效力下降，最终因免疫失败而造成疫病流行。因此，提供耐热型的疫苗就具有重要的意义。
近年来，耐热保护剂在兽用生物制品的冻干疫苗中得到了广泛应用，给冻干疫苗的运输和保存带来了极大的方便，同时保证了疫苗的质量。通过大量研究者的努力，我国现阶段已具备多种病毒的耐热保护剂，少部分已达到国际水平。
然而，一种耐热保护剂适用于不同病毒的保护剂研究较少。不同的病毒需要不同的耐热保护剂，同时需要不同的冻干工艺，这给疫苗企业的生产带来了极大的不便。因此，一种冻干疫苗耐热保护剂能适用于两种及以上病毒的冻干就显得尤为重要。
发明内容
[要解决的技术问题]
本发明的目的是解决上述现有技术问题，提供一种冻干疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。
[技术方案]
为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
一种冻干疫苗耐热保护剂，它包括以下质量百分比的原料：
0.3～0.6％的L-谷氨酸钠、8～14％的蔗糖、2～5％的D-山梨醇、1～3％的牛血清白蛋白、0.1～0.3％的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～1％的硫脲、3～5％的NZ-Amine AS、0.8～1.5％的水解明胶，余量为pH 7.2的PBS。
一种上述的冻干疫苗耐热保护剂的制备方法，它包括以下步骤：
A，组方Ⅰ的配制：按配比称取L-谷氨酸钠、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-Amine AS，分别用PBS充分溶解后混合均匀，然后经0.22μm除菌滤器过滤后，4℃保存备用；
B，组方Ⅱ的配制：按配比称取水解明胶，用PBS在70℃条件下充分溶解后，经115℃灭菌20min，然后置37℃保存备用；
C，用PBS调节组方Ⅰ与组方Ⅱ的体积比为3：1，然后将组方Ⅰ和组方Ⅱ混合均匀后，得到所述的冻干疫苗耐热保护剂。
上述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，该冻干疫苗耐热保护剂用于猪伪狂犬病毒或猪繁殖培养液与呼吸综合征病毒培养液的冻干。
根据本发明更进一步的技术方案，所述猪伪狂犬病毒为Bartha-k61株，猪繁殖与呼吸综合征病毒为JXA1-R株。
根据本发明更进一步的技术方案，所述冻干的工艺包括以下步骤：
(1)将冻干疫苗耐热保护剂与猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液混合配苗；然后按2mL/瓶进行分装；
(2)将分装好的猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液依次经预冻阶段、一次干燥和解析干燥，密封后完成冻干，得到猪伪狂犬疫苗冻干产品或猪繁殖与呼吸综合征疫苗冻干产品。
根据本发明更进一步的技术方案，在所述冻干的工艺的步骤(2)中，冻干疫苗耐热保护剂与猪伪狂犬病毒培养液按体积比为1:3进行配苗；或者将冻干疫苗耐热保护剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液按体积比为1:4进行配苗。
根据本发明更进一步的技术方案，在所述冻干的工艺的步骤(2)中，
所述预冻阶段是指在1h内将病毒培养液从常温降至-42℃后，维持该温度放置3h；
所述一次干燥是将经预冻阶段的病毒培养液的温度在0.5h从-42℃升温至-5℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置2h；接着10min将病毒培养液的温度从-5℃升温至0℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置12h；
最后10min将病毒培养液的温度从0℃升温至10℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置1.5h；
所述解析干燥是至将经一次干燥的病毒培养液的温度在0.5h从10℃升温至30℃，维持该温度并控制压力为0.22mbar放置5h；然后1min将病毒培养液的温度从30℃降温至28℃，维持该温度并控制压力为0.00mbar放置1h。
下面将详细地说明本发明。
本发明中，NZ胺(NZ-Amine AS)，又称为酪蛋白的酶促水解物。蔗糖具有渗透作用，能抑制有害微生物生长，延长产品保藏期，具有很好的水溶性；可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，可防止活性组分变性；蔗糖与聚乙烯吡咯酮(PVP)联合使用，可起到良好的低温、干燥保护剂作用；同时，蔗糖、聚乙烯吡咯酮(PVP)可作为冻干剂，能防止和减少冷冻过程结晶水的形成；明胶、山梨醇可防止有效成分随水蒸气一起升华逸散，并对微生物有保护作用，可促进升华形成耐热骨架，阻断热传导和热辐射；此外，牛血清白蛋白、明胶均为高分子化合物，能够对微生物起保护作用，促进升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射；硫脲作为抗氧化剂可以通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化变质；PBS缓冲液的主要目的是为了保证病毒培养液加入冻干疫苗耐热保护剂后，可以有效保证pH值不产生较大的波动，以避免引起病毒蛋白的变性，此外，由于本发明中PVP的添加，可以有效抑制PBS缓冲液中磷酸氢二钠的结晶，从而抑制了这个混合液中的pH降低；L-谷氨酸钠是作为氨基酸类保护剂可用于病毒微生物的保护。
本发明制备的冻干疫苗耐热保护剂可以用于两种病毒培养液的冻干，因此需要合理配比各种原料的质量百分含量，保证猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液两种培养液在进行冻干过程中都有较好的效果，以使制备得到疫苗冻干产品效果好。将本发明耐热冻干保护剂应用于猪伪狂犬病毒或猪繁殖培养液与呼吸综合征病毒培养液的冻干，得到的冻干疫苗放置于37℃7日后，测定病毒含量，与放置前相比病毒含量降低不超过1个滴度。
[有益效果]
本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：
本发明的耐热冻干保护剂配方简单，制备容易，适于大规模生产，对疫苗具有良好的保护功效。制得的疫苗无菌安全，且性状稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不便等问题。
本发明的耐热冻干保护剂可以使两种耐热活疫苗在2～8℃条件下均能保存24个月，且疫苗效价达标。此外，两种疫苗的冻干工艺一致，为冻干疫苗的生产带来了极大的便利。提高了冻干疫苗的产品竞争力和影响力。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。
实施例1
1.猪伪狂病毒的培养及收获
Vero细胞的传代及培养：待培养瓶中Vero细胞长满单层时，弃掉细胞培养液，用含0.25％胰酶的细胞消化液消化细胞，待培养瓶中消化细胞在倒置显微镜下观察呈圆缩状时，立即向培养瓶中加入细胞生长液，振荡培养瓶，使细胞消化分散成单个细胞，将消化后的细胞按1:3的比例进行细胞下一个代次的培养。
病毒的增殖培养及收获：从-70℃超低温冰箱中取PRV Bartha-k61株湿毒，按1％(V/V)接毒比例接种已长满单层的Vero细胞培养瓶中，接种继续培养观察，待细胞出现病变达80％以上时进行收获，将培养瓶于-20℃冻融1次后收集病毒液，将收集的病毒液于-70℃保存备用。
2.冻干疫苗耐热保护剂的制备
按照表1的配方进行冻干疫苗耐热保护剂的制备：
表1为冻干疫苗耐热保护剂个配方的配方表
组方Ⅰ的配制：将表1中的L-谷氨酸钠、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-Amine AS按配比分别用PBS充分溶解后混合，经0.22μm除菌滤器过滤后，37℃保存备用；
组方Ⅱ的配制：将水解明胶按上述配比用PBS在70℃条件下充分溶解后，经115℃，20min灭菌后，37℃保存备用；
用PBS调节组方Ⅰ与组方Ⅱ的体积比为3：1，然后将组方Ⅰ和组方Ⅱ混合均匀后，得到所述的冻干疫苗耐热保护剂A、B、C。
3.猪伪狂病耐热保护剂活疫苗的制备
收获的猪伪狂犬病毒培养液经无菌和病毒含量测定合格后，与上述制备的耐热保护剂3个配方(A、B、C)分别按体积比为3:1进行配苗，2.0ml/瓶进行分装，然后利用冷冻真空干燥机进行冻干，同时设立牛奶蔗糖保护剂(常规保护剂)为对照组。
冻干工艺如下：预冻阶段：常温进箱，1小时内将制品降至-42℃并维持3小时；一次干燥：0.5小时将制品从-42℃升至-5℃，维持2小时，压力0.12mbar；10分钟将制品温度从-5℃升至0℃，维持13小时，压力0.12mbar；10分钟将制品温度从0℃升至10℃，维持1.5小时，压力0.12mbar；解析干燥：0.5小时将制品温度从10℃升至30℃，维持5小时，压力0.22mbar；1分钟将制品温度从30℃降至28℃，维持1小时，压力0.00mbar；最后加塞出箱完成冻干。
4.猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗冻干后检测
将耐热保护剂的配方A、配方B、配方C及对照组冻干的成品按照现行《中国兽药典》要求进行检测，包括物理性状、无菌检验、鉴别检验、真空度检验、剩余水分含量检测，所有检测项目均合格。
病毒含量测定：将疫苗用无血清DMEM细胞培养液稀释为1头份/ml，再做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6共4个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Vero细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份病毒含量应≥105.5TCID50。各配方冻干前后病毒含量见表2。从表中可以看出耐热保护剂配制的苗冻干前后病毒含量损失最大为0.12个滴度，然而常规保护剂损失达到0.41个滴度。
表2为猪伪狂犬病活疫苗各耐热保护剂配方的病毒含量(TCID50/头份)测定结果
状态 配方A 配方B 配方C 对照
冻干前 106.25 106.25 106.25 106.25
冻干后 106.13 106.16 106.13 105.84
耐老化试验：将制备的3批疫苗及对照组各取5瓶在37℃放置7日，然后各随机取3瓶，测定PRV的TCID50。结果见表3。
表3猪伪狂犬病活疫苗各耐热保护剂配方耐老化结果(病毒含量：TCID50/头份)
配方 放置前 37℃放置7日后 下降滴度
配方A 106.13 105.75、105.69、105.64 分别下降0.38、0.44、0.49
配方B 106.16 105.84、105.75、105.84 分别下降0.32、0.41、0.32
配方C 106.13 105.69、105.64、105.5 分别下降0.44、0.49、0.63
对照组 105.84 104.24、104.16、104.0 分别下降1.60、1.68、1.84
从表中可以看出，耐热保护剂配方制备的苗耐老化后病毒含量下降滴度均不超过0.7，而常规保护剂下降滴度为1.6以上。
保存期试验：将制备的3批疫苗及对照组各取7瓶，放置于2～8℃保存，分别在放置后第1、3、6、12、18、24、30个月各取其中1瓶测定病毒含量，观察该疫苗的保存期。具体结果见表4。从表中可以看出，耐热保护剂配方冻干的疫苗在2～8℃保存条件下，均可以保存24个月。然而，常规保护剂冻干疫苗的保存期则只有6个月。
表4为猪伪狂犬病活疫苗各耐热保护剂配方保存期结果(病毒含量：TCID50/头份)
实施例2
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒的培养及收获
细胞的传代及培养：待细胞培养瓶中Marc-145细胞长满单层时，弃掉生长液，用含0.25％胰酶的消化细胞，待培养瓶中消化细胞在倒置显微镜下观察呈圆缩状时，立即向培养瓶中加入细胞生长液，振荡培养瓶，使细胞消化分散成单个细胞，将消化后的细胞按1:4的比例进行扩大培养。
病毒的增殖培养及收获：从-70℃冰箱中取PRRSV JXA1-R株种毒，按0.5％(V/V)接毒比例接种已长满单层的Marc-145细胞培养瓶中，接种后继续培养观察，待细胞出现病变达75％以上时收获，将培养瓶于-20℃冻融1次后收集病毒液，将收集的病毒液于-70℃保存备用。
2.冻干疫苗耐热保护剂的制备
该实例的耐热保护剂配方见表1。
组方I的配制：将上述L-谷氨酸钠、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-Amine AS按表1的配比分别用PBS充分溶解后混合，经0.22μm除菌滤器过滤后，37℃保存备用；
组方Ⅱ的配制：将水解明胶按上述配比用PBS在70℃条件下充分后，经115℃，20min灭菌后，37℃保存备用。
用PBS调节组方Ⅰ与组方Ⅱ的体积比为3：1，然后将组方Ⅰ和组方Ⅱ混合均匀后，得到所述的冻干疫苗耐热保护剂A、B、C。
3.猪繁殖与呼吸综合征耐热保护剂活疫苗的制备
收获的猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液经无菌检验和病毒含量测定合格后，与上述制备的耐热保护剂3个配方分别按体积比为4:1进行配苗，2.0ml/瓶进行分装，然后利用冷冻真空干燥机进行冻干，同时设立牛奶蔗糖保护剂为对照组。
冻干工艺如下：预冻阶段：常温进箱，1小时内将制品降至-42℃并维持3小时；一次干燥：0.5小时将制品从-42℃升至-5℃，维持2小时，压力0.12mbar；10分钟将制品温度从-5℃升至0℃，维持13小时，压力0.12mbar；10分钟将制品温度从0℃升至10℃，维持1.5小时，压力0.12mbar；解析干燥：0.5小时将制品温度从10℃升至30℃，维持5小时，压力0.22mbar；1分钟将制品温度从30℃降至28℃，维持1小时，压力0.00mbar；最后加塞出箱完成冻干。
4.猪繁殖与呼吸综合征耐热保护剂活疫苗冻干后检测
将耐热保护剂的配方A、配方B、配方C及对照组冻干的成品按照现行《中国兽药典》要求进行检测，包括物理性状、无菌检验、鉴别检验、真空度检验、剩余水分含量检测，所有检测项目均合格。
病毒含量测定：将疫苗用无血清DMEM细胞培养液稀释为1头份/ml，再做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份病毒含量应≥105.5TCID50。各配方冻干前后病毒含量见表5，表中数据表明采用耐热保护剂的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗冻干前后病毒含量损失最大为0.2个滴度，常规保护剂冻干前后病毒含量损失达到0.36个滴度。
表5猪繁殖与呼吸综合征活疫苗各耐热保护剂配方的病毒含量(TCID50/头份)测定结果
状态 配方A 配方B 配方C 对照
冻干前 106.36 106.36 106.36 106.36
冻干后 106.25 106.20 106.16 106.0
耐老化试验：将制备的3批疫苗及对照组各取5瓶在37℃放置7日，然后各取3瓶，测定PRRSV的TCID50。结果见表6。表中显示：耐热保护剂配方制备的苗耐老化后病毒含量下降滴度均不超过0.6，而常规保护剂下降滴度为1.6以上。
表6猪繁殖与呼吸综合征活疫苗各耐热保护剂配方耐老化结果(病毒含量：TCID50/头份)
配方 放置前 37℃放置7日后 下降滴度
配方A 106.25 105.84、105.75、105.75 分别下降0.41、0.5、0.5
配方B 106.20 105.69、105.64、105.88 分别下降0.51、0.56、0.32
配方C 106.16 105.64、105.69、105.64 分别下降0.52、0.47、0.52
对照组 106.0 104.31、104.25、104.36 分别下降1.69、1.75、1.64
保存期试验：将制备的3批疫苗及对照组各取7瓶，放置于2～8℃保存，分别在放置后第1、3、6、12、18、24、30个月各取其中1瓶测定病毒含量，观察该疫苗的保存期。具体结果见表7。表中数据显示：耐热保护剂配方冻干的疫苗在2～8℃保存条件下，均可以保存24个月。然而，常规保护剂冻干疫苗的保存期则只有3个月。
表7猪繁殖与呼吸综合征活疫苗各耐热保护剂配方保存期结果(病毒含量：TCID50/头份)
综上所述，本发明的保护剂经过无菌处理后应用于猪伪狂犬病活疫苗和猪繁殖与呼吸道综合征活疫苗的冻干。两种病毒采用同样的耐热保护剂和冻干工艺，冻干损失低于0.2个滴度，37℃放置7日，病毒含量滴度降低小于1个滴度，能在2～8℃保存24个月。为冻干疫苗的生产提供了便利，同时也提高了产品质量及竞争力。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (7)

1.一种冻干疫苗耐热保护剂，其特征在于它包括以下质量百分比的原料：
0.3～0.6％的L-谷氨酸钠、8～14％的蔗糖、2～5％的D-山梨醇、1～3％的牛血清白蛋白、0.1～0.3％的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～1％的硫脲、3～5％的NZ-Amine AS、0.8～1.5％的水解明胶，余量为pH 7.2的PBS。
2.一种权利要求1所述的冻干疫苗耐热保护剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
A，组方Ⅰ的配制：按配比称取L-谷氨酸钠、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-Amine AS，分别用PBS充分溶解后混合均匀，然后经0.22μm除菌滤器过滤后，4℃保存备用；
B，组方Ⅱ的配制：按配比称取水解明胶，用PBS在70℃条件下充分溶解后，经115℃灭菌20min，然后置37℃保存备用；
C，用PBS调节组方Ⅰ与组方Ⅱ的体积比为3：1，然后将组方Ⅰ和组方Ⅱ混合均匀后，得到所述的冻干疫苗耐热保护剂。
3.一种权利要求1所述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，其特征在于该冻干疫苗耐热保护剂用于猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液的冻干。
4.根据权利要求3所述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，其特征在于所述猪伪狂犬病毒为Bartha-k61株，猪繁殖与呼吸综合征病毒为JXA1-R株。
5.根据权利要求3所述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，其特征在于所述冻干的工艺包括以下步骤：
(1)将冻干疫苗耐热保护剂与猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液混合配苗；然后按2mL/瓶进行分装；
(2)将分装好的猪伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液依次经预冻阶段、一次干燥和解析干燥，密封后完成冻干，得到猪伪狂犬疫苗冻干产品或猪繁殖与呼吸综合征疫苗冻干产品。
6.根据权利要求5所述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，其特征在于在所述冻干的工艺的步骤(2)中，冻干疫苗耐热保护剂与猪伪狂犬病毒培养液按体积比为1:3进行配苗；或者将冻干疫苗耐热保护剂与猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液按体积比为1:4进行配苗。
7.根据权利要求5所述的冻干疫苗耐热保护剂的应用，其特征在于在所述冻干的工艺的步骤(2)中，
所述预冻阶段是指在1h内将病毒培养液从常温降至-42℃后，维持该温度放置3h；
所述一次干燥是将经预冻阶段的病毒培养液的温度在0.5h从-42℃升温至-5℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置2h；接着10min将病毒培养液的温度从-5℃升温至0℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置12h；最后10min将病毒培养液的温度从0℃升温至10℃，维持该温度并控制压力为0.12mbar放置1.5h；
所述解析干燥是至将经一次干燥的病毒培养液的温度在0.5h从10℃升温至30℃，维持该温度并控制压力为0.22mbar放置5h；然后1min将病毒培养液的温度从30℃降温至28℃，维持该温度并控制压力为0.00mbar放置1h。
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