CN107261132A - 利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术，具体涉及一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。本发明所用制苗用细胞为Vero细胞，并且Vero细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，且在病毒培养过程中所用细胞维持液同样也无血清添加，保证了产品的质量均一稳定和产量；获得的猪伪狂犬病毒活疫苗效价高，性质稳定。

Description

利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术，具体涉及一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起一种急性传染病。该传染病遍布世界主要养猪国家。免疫接种是预防猪伪狂犬病的主要措施。我国目前生产猪伪狂犬病活疫苗所用的细胞未鸡胚成纤维细胞和ST细胞。由于每批鸡胚原材料的差异，使得鸡胚成纤维原代细胞的批间差异大；用鸡胚成纤维细胞培养猪伪狂犬病病毒的病毒滴度不高，给疫苗产量、效力的提高带来困难，而且细胞碎片与杂蛋白多，容易引起过敏反应。
当前猪伪狂犬病活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式和用ST细胞生物反应器培养，转瓶培养方式是培养细胞贴壁生长于玻璃瓶的内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定；但转瓶培养技术已经使用数十年，与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为：(1)转瓶细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，培养细胞密度小，培养病毒滴度低，动物的免疫效果较差；(2)转瓶细胞培养，细胞碎片与杂蛋白多，疫苗的杂质多，导致免疫动物副反应大；(3)转瓶细胞培养，细胞批间差异大，产品质量不均一、不稳定；(4)转瓶细胞培养，生产效率低，生产成本高。
中国专利申请(CN101695572A)公开了一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。将生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒种的维持液，继续培养。接毒后2～3日收获细胞培养毒液，并加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗。其中，其选择制苗用的细胞系为猪睾丸(ST)细胞系，猪肾(PK15)细胞系和猪肾(IBRS-2)细胞系。并且在细胞生长液和维持液中均使用犊牛血清。而上述所用的细胞系和犊牛血清，往往容易携带外源病毒且不同批次间产品质量不易控制，从而对生产猪伪狂犬病活疫苗有很大的影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法。本发明所用制苗用细胞为Vero细胞，并且Vero细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，且在病毒培养过程中所用细胞维持液同样也无血清添加，保证了产品的质量均一稳定和产量。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，包括以下步骤：
S1.用细胞生长液培养制苗用细胞，待细胞密度达1.0x106～1.5x106个/mL，接种到含有15～20g/L微载体的无菌生物反应器内培养；
S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养4～5天，密度达到1.2x106～1.5x106个/mL接种猪伪狂犬病病毒弱毒株，将反应器温度调至36℃～38℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；
S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗。
优选地，所述制苗用细胞为Vero细胞，猪伪狂犬病病毒弱毒株为Bartha-K61弱毒株。
优选地，所述步骤S1中制苗用细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM基础培养液80～90％v/v，赖氨酸1.0～1.5g/L，甘氨酸0.5～1.0g/L，苯异亮氨酸0.75～1.5g/L，精氨酸1.5～2.0g/L，苏氨酸0.5～1.0g/L，缬氨酸0.5～1.5g/L，枸橼酸10～15mg/L，尾加压素II 0.35～0.75mg/L，苦丁冬青甙H 0.15～0.5g/L，转铁蛋白3～8g/mL，5-羟色胺0.1～2.5mg/L，EDTA5～7mg/L，柠檬酸铁1.5～3.5mg/L，皮质醇0.5～0.75mg/L，成纤维因子0.1～0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5～2.5mg/L。
进一步，所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液88％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.35g/L，精氨酸1.65g/L，苏氨酸0.83g/L，缬氨酸1.20g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II0.55mg/L，苦丁冬青甙H 0.45g/L，转铁蛋白6.75g/mL，5-羟色胺0.68mg/L，EDTA6.5mg/L，柠檬酸铁2.45mg/L，皮质醇0.60mg/L，成纤维因子0.35mg/L，细胞纤维连结蛋白1.75mg/L。
优选地，所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。
优选地，所述步骤S2中细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液85～92％v/v，赖氨酸1.0～1.5g/L，甘氨酸0.5～1.0g/L，苯异亮氨酸0.75～1.5g/L，精氨酸1.5～2.0g/L，苏氨酸0.5～1.0g/L，缬氨酸0.5～1.5g/L，枸橼酸10～15mg/L，尾加压素II0.35～0.75mg/L，淫羊藿苷0.2～0.5g/L，转铁蛋白3～8g/mL，EDTA 5～7mg/L，柠檬酸铁1.5～3.5mg/L，皮质醇0.1～0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5～2.5mg/L。
进一步，所述步骤S2中细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液90％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.25g/L，精氨酸1.85g/L，苏氨酸0.65g/L，缬氨酸1.35g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II0.50mg/L，淫羊藿苷0.35g/L，转铁蛋白6.5g/mL，EDTA 6.5mg/L，柠檬酸铁2.5mg/L，皮质醇0.25mg/L，细胞纤维连结蛋白2.25mg/L。
优选地，所述步骤S3稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
本发明使用Vero细胞为宿主来制备猪伪狂犬病病毒活疫苗，并使用无血清细胞生长液和细胞维持液进行培养，免除了外源病毒感染的风险，并剔除了血清对病毒生长的抑制。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
(1)无血清添加细胞生长液和维持液能够促进Vero细胞的增殖和伪狂犬病病毒的大量繁殖，同时避免了外源病毒的感染；
(2)利用生物反应器大规模高密度培养，使Vero细胞密度大大增加，病毒浓度也极大提高；
(3)获得的猪伪狂犬病毒活疫苗效价高，性质稳定。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，包括以下步骤：
S1.用无血清添加的细胞生长液培养制苗用Vero细胞，待细胞密度达1.5x106个/mL，接种到含有18g/L微载体的无菌TideCell固定床微载体生物反应器内培养；所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液88％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.35g/L，精氨酸1.65g/L，苏氨酸0.83g/L，缬氨酸1.20g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II 0.55mg/L，苦丁冬青甙H 0.45g/L，转铁蛋白6.75g/mL，5-羟色胺0.68mg/L，EDTA6.5mg/L，柠檬酸铁2.45mg/L，皮质醇0.60mg/L，成纤维因子0.35mg/L，细胞纤维连结蛋白1.75mg/L；
S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养4天，密度达到1.5x106个/mL接种Bartha-K61弱毒株，将反应器温度调至37℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；所述细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液90％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.25g/L，精氨酸1.85g/L，苏氨酸0.65g/L，缬氨酸1.35g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II0.50mg/L，淫羊藿苷0.35g/L，转铁蛋白6.5g/mL，EDTA6.5mg/L，柠檬酸铁2.5mg/L，皮质醇0.25mg/L，细胞纤维连结蛋白2.25mg/L；
S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗，所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
实施例2一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，包括以下步骤：
S1.用无血清添加的细胞生长液培养制苗用Vero细胞，待细胞密度达1.0x106个/mL，接种到含有15g/L微载体的无菌TideCell固定床微载体生物反应器内培养；所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM基础培养液80％v/v，赖氨酸1.0g/L，甘氨酸0.5g/L，苯异亮氨酸0.75g/L，精氨酸1.5g/L，苏氨酸0.5g/L，缬氨酸0.5g/L，枸橼酸10mg/L，尾加压素II 0.35mg/L，苦丁冬青甙H 0.15g/L，转铁蛋白3g/mL，5-羟色胺0.1mg/L，EDTA 5mg/L，柠檬酸铁1.5～mg/L，皮质醇0.5mg/L，成纤维因子0.1mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5mg/L；
S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养5天，密度达到1.5x106个/mL接种Bartha-K61弱毒株，将反应器温度调至38℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；所述细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液92％v/v，赖氨酸1.5g/L，甘氨酸1.0g/L，苯异亮氨酸1.5g/L，精氨酸2.0g/L，苏氨酸1.0g/L，缬氨酸1.5g/L，枸橼酸15mg/L，尾加压素II 0.75mg/L，淫羊藿苷0.5g/L，转铁蛋白8g/mL，EDTA7mg/L，柠檬酸铁3.5mg/L，皮质醇0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白2.5mg/L；
S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗；所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
实施例3一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，包括以下步骤：
S1.用无血清添加的细胞生长液培养制苗用Vero细胞，待细胞密度达1.5x106个/mL，接种到含有20g/L微载体的无菌TideCell固定床微载体生物反应器内培养；所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM基础培养液90％v/v，赖氨酸1.5g/L，甘氨酸1.0g/L，苯异亮氨酸1.5g/L，精氨酸2.0g/L，苏氨酸1.0g/L，缬氨酸1.5g/L，枸橼酸15mg/L，尾加压素II 0.75mg/L，苦丁冬青甙H 0.5g/L，转铁蛋白8g/mL，5-羟色胺2.5mg/L，EDTA 7mg/L，柠檬酸铁3.5mg/L，皮质醇0.75mg/L，成纤维因子0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白2.5mg/L；
S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养4天，密度达到1.5x106个/mL接种Bartha-K61弱毒株，将反应器温度调至36℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；所述细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液85％v/v，赖氨酸1.0g/L，甘氨酸0.5g/L，苯异亮氨酸0.75g/L，精氨酸1.5g/L，苏氨酸0.5g/L，缬氨酸0.5g/L，枸橼酸10mg/L，尾加压素II0.35mg/L，淫羊藿苷0.2g/L，转铁蛋白3g/mL，EDTA5mg/L，柠檬酸铁1.5mg/L，皮质醇0.1mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5mg/L。
S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗；所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
对比例1一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法与实施例1的区别在于所述步骤S1无血清添加的细胞生长液中不含有尾加压素II和苦丁冬青甙H，其它步骤均与实施例1类似。
对比例2一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法与实施例1的区别在于所述步骤S1无血清添加的细胞生长液和S2无血清添加的细胞细胞维持液液中用抗菌素替换淫羊藿苷，其它步骤均与实施例1类似。
对比例3一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法
所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法与实施例1的区别在于所述步骤S1细胞生长液由88％体积百分比DMEM培养液和12％体积百分比的犊牛血清组成；步骤S2中细胞细胞维持液由90％体积百分比DMEM培养液和10％体积百分比的犊牛血清组成，其它步骤均与实施例1类似。
试验例1病毒效价检测
以Vero细胞为传代细胞，分别按照实施例1-3及对比例1-3用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法制备猪伪狂犬病病毒液B1、B2、B3、B4、B5和B6，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，结果证明无细菌、霉菌、支原体生长；并对病毒液进行效价测定，具体结果如表1所示。
表1不同病毒液效价
毒液 效价(TCID50/mL)
B1 108.1
B2 107.8
B3 108.0
B4 107.4
B5 107.3
B6 108.2
由表1可知，利用实施例1-3生产方法得到的病毒效价与对比例3制备得到的效价相近，说明本发明无血清添加的细胞生长液和细胞维持液能够有效促进Vero细胞增殖、病毒的繁殖及毒液分泌。实施例1病毒效价高于对比例1和对比例2，说明本发明无血清添加的细胞生长液中添加尾加压素II和苦丁冬青甙H，以及在无血清添加的细胞维持液中添加淫羊藿苷，有利于病毒繁殖和病毒液分泌。试验例2疫苗成品检验
取实施例1-3及对比例1-3制备得到的疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)进行成品检验，每头份疫苗含病毒分别为108TCID50、107.6TCID50、107.8TCID50、106.8TCID50、106.5TCID50、107.7TCID50，符合“伪狂犬病活疫苗”的规定，每头份疫苗含病毒≥106TCID50。
试验例3疫苗的稳定性试验
将试验例2中制备得到的每份疫苗分为两份分别置于4℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量，分别如表2所示。
表2 4℃条件下保存期试验
由表2数据可以看出本发明实施例1-3制备得到的猪伪狂犬活疫苗在4℃条件下，能够保持15天，其效价下降不超过0.5个滴度，与对比例3制备得到的疫苗稳定性相当，这说明本发明利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法制备得到的疫苗性质稳定。

Claims (8)

1.一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.用细胞生长液培养制苗用细胞，待细胞密度达1.0x106～1.5x106个/mL，接种到含有15～20g/L微载体的无菌生物反应器内培养；
S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养4～5天，密度达到1.2x106～1.5x106个/mL接种猪伪狂犬病病毒弱毒株，将反应器温度调至36℃～38℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；
S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗。
2.根据权利要求1所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，制苗用细胞为Vero细胞，猪伪狂犬病病毒弱毒株为Bartha-K61弱毒株。
3.根据权利要求1或2所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S1中制苗用细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM基础培养液80～90％v/v，赖氨酸1.0～1.5g/L，甘氨酸0.5～1.0g/L，苯异亮氨酸0.75～1.5g/L，精氨酸1.5～2.0g/L，苏氨酸0.5～1.0g/L，缬氨酸0.5～1.5g/L，枸橼酸10～15mg/L，尾加压素II 0.35～0.75mg/L，苦丁冬青甙H 0.15～0.5g/L，转铁蛋白3～8g/mL，5-羟色胺0.1～2.5mg/L，EDTA 5～7mg/L，柠檬酸铁1.5～3.5mg/L，皮质醇0.5～0.75mg/L，成纤维因子0.1～0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5～2.5mg/L。
4.根据权利要求3所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述无血清添加的细胞生长液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液88％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.35g/L，精氨酸1.65g/L，苏氨酸0.83g/L，缬氨酸1.20g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II 0.55mg/L，苦丁冬青甙H 0.45g/L，转铁蛋白6.75g/mL，5-羟色胺0.68mg/L，EDTA6.5mg/L，柠檬酸铁2.45mg/L，皮质醇0.60mg/L，成纤维因子0.35mg/L，细胞纤维连结蛋白1.75mg/L。
5.根据权利要求1或2所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。
6.根据权利要求1或2所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S2中细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液85～92％v/v，赖氨酸1.0～1.5g/L，甘氨酸0.5～1.0g/L，苯异亮氨酸0.75～1.5g/L，精氨酸1.5～2.0g/L，苏氨酸0.5～1.0g/L，缬氨酸0.5～1.5g/L，枸橼酸10～15mg/L，尾加压素II 0.35～0.75mg/L，淫羊藿苷0.2～0.5g/L，转铁蛋白3～8g/mL，EDTA5～7mg/L，柠檬酸铁1.5～3.5mg/L，皮质醇0.1～0.5mg/L，细胞纤维连结蛋白1.5～2.5mg/L。
7.根据权利要求1或2所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S2中细胞维持液由以下成分及其重量份组成：DMEM基础培养液90％v/v，赖氨酸1.25g/L，甘氨酸0.75g/L，苯异亮氨酸1.25g/L，精氨酸1.85g/L，苏氨酸0.65g/L，缬氨酸1.35g/L，枸橼酸12.5mg/L，尾加压素II 0.50mg/L，淫羊藿苷0.35g/L，转铁蛋白6.5g/mL，EDTA 6.5mg/L，柠檬酸铁2.5mg/L，皮质醇0.25mg/L，细胞纤维连结蛋白2.25mg/L。
8.根据权利要求1或2所述利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S3稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
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