CN101146518A - 化学限定的稳定剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有氨基酸和糖的稳定剂组合物，其中所有化合物是化学限定的；涉及含有这样的稳定剂组合物和生物分子和/或微生物的疫苗组合物；涉及制备药物组合物的方法，包括将该稳定剂组合物与生物分子和/或微生物混合；涉及这样的稳定剂组合物以及用其制备的疫苗的用途。
Description
本发明涉及含有氨基酸和糖的稳定剂组合物，其中所有化合物是化学限定的；涉及含有该稳定剂组合物和生物分子和/或微生物的疫苗组合物；涉及制备药物组合物的方法，包括将该稳定剂组合物与生物分子和/或微生物混合；涉及该稳定剂组合物以及用其制备的疫苗的用途。
在涉及生产微生物和生物分子作为产品的生物制药工业中，这些产品的稳定性是主要问题。通常，这些产品需要配制、储存和运输。随着时间不可避免地受到来自温度改变的影响和其他物理或化学影响，所产生的物质失去它们最初的有效量或所需的定性特征。因此，使用了防止质量和/或有效量流失的条件和添加剂。
常用的稳定条件是低温储存，高于或低于零℃，和降低含水量；特别有用的是冷冻干燥。
在冷冻干燥中，首先将含有生物或药物活性分子、微生物、细胞或组织的样品冷冻，然后在真空下干燥。然后将冷冻干燥的样品储存在例如4℃，通常能保持稳定数年。参见，综述：M.Pikal，1990(BioPharm，vol.3，no.8，p.1 8-27和no.9，p.26-30)；L.Gatlin，等，1994(Bioprocess Techn.，vol.18，p.317-367)；J.Carpenter等，1997(Pharm.Research，vol.14，p.969-975)；F.Bedu-Addo，2004(Pharm.Techn.，2月1日，p.10-18)。
理想地，冷冻干燥产品在特定的时间段内具有质量和含量几乎未改变的冻干成分，并具有吸引人的和雅致外观的冻干体或饼状物，可以抵抗运输的物理影响，且在稀释剂中重配时快速溶解。
为了获得冻干样品所有的这些要求，并且为了使得样品在自身冻干过程(冷冻、干燥、加热、冷却)、冻干状态延长的储存和重配中产生的各种不利条件下“存活”，通常在冻干之前将待冻干的样品与稳定组合物混合。
稳定剂组合物的化合物通常称为：填充剂、cake-former、冻干保护剂(lyoprotectant)、张力调节剂、表面活性剂、低温(基因)保护剂、冷冻保护剂、干燥剂、冷冻干燥剂等，其中一种具体的化合物可以具有几种功能。
术语“相容性溶质”还用来表示稳定低水分环境条件下的分子和生物体的化合物(M.S.da Costa等，1998，Adv.Bioch.Eng and Techn.，vol-61，p.117-153)。
稳定组合物，不管是用于冻干或用于其他稳定用途，是蛋白质、碳水化合物、脂质和盐的复杂混合物；对于待稳定的每种分子或微生物，或对于特定目的，可以调节其组成。
尽管很少知道稳定剂是怎样确切地起作用的，通常的认识是高分子量的大化合物通常提供良好的稳定效果。因此，以前稳定剂中所用的主要成分是这样的大化合物。为了保持原料成本下降，它们取自易获得的动物来源产品，例如：奶粉、胰蛋白
、明胶、血清白蛋白、胶原、酪蛋白水解产物、硫酸软骨素等。
不幸地，这样动物来源的化合物的使用潜在地引入了被其他无菌或受控产品的外源物质的污染风险。从发现物种内动物传染病性疾病和新发现的朊病毒相关疾病开始，这已经成为了主要的关注问题。结果，调控权力机构要求(稳定的)生物制品在投放市场之前就外源物质的不存在进行广泛的安全测试。
这导致放弃使用这样的动物成分，最初只在生产生物分子或微生物所用的培养基中。例如，B.Makoschey等，(2002，cytotechnologyVol.39，p.139-145)，描述了用于稳定已经无血清生产的病毒的冷冻干燥稳定剂；稳定剂包括糖、氨基酸、明胶和来自动物来源的蛋白质水解产物的肽。
之后，在生产后使用的稳定剂也改变了组成；结果，所产生的稳定剂组合物是：无血清(无动物血清)；无蛋白质(无动物蛋白质，但可以含有其他动物衍生成分)或甚至无动物化合物(ACF)(不含有任何源自动物的成分)。
然而，在稳定剂组合物中，仍然需要高分子量的大分子的稳定效果。因此，例如从植物或微生物来源获得用于ACF稳定剂的大化合物，如：yeastolate、大豆蛋白胨、重组明胶、(羟乙基)淀粉、海藻酸盐等。
或者，使用天然或合成来源的大聚合化合物，如：多糖、聚乙烯吡咯烷酮、ficol、聚赖氨酸、聚乙二醇、(羧基)-甲基纤维素、葡聚糖、聚山梨酸酯(例如，吐温
)等。例如，T.Osterberg等(1997，Pharm.Res.，vol.14，p.892-898)，将吐温替代血清白蛋白作为用于因子VIII蛋白质的稳定化合物。
然而，即使使用这些ACF稳定剂化合物还存在几个问题。例如，这些稳定剂化合物中的几种对热灭菌不耐受，并且由于稳定剂化合物的无菌通常是一个绝对要求，实现此目的的唯一其他途径是通过更长时间的过滤灭菌处理。
此外，在将稳定的产品给予目标人类或动物的情况中，一些ACF稳定剂化合物不能使用，因为它们是毒性的，或可能引起过敏反应。
然而，在所有这些情况中，最主要的问题是稳定剂组成，甚至是ACF时，仍然具有常见的缺陷，即它们含有或包括未知的、异源的和不确定的成分。例如，完全不清楚天然植物产品的水解产物的组成。相似地，对于提及的聚合物结构，也只是概括地知道它们的化学结构；所用的化合物仅仅限定于它们具有平均分子量或平均侧链长度。因此，这些分子实际上包括一个家族的化学结构，含有各种分子。
因此，这样的化合物仍然是性质不确定的，并具有批次之间的变异。这需要小心选择起始化合物，用于稳定剂组合物合适批次的生产。然后，具有所需质量的该批次化合物具有有限的可利用率。
在稳定组合物中使用这样不确定的化合物导致通过这些组合物稳定的产品的组成、质量和产量未知的和无法控制的变化。
这样无法控制的产品质量在试图生产一致、安全、高质量产品的工业是中高度不理想的，并只能通过选择原料，检验引入的货物、产品投放和终产品质量控制的高成本和费时方法来克服。
本发明的目的是提供可替换的和改进的没有现有技术这些缺陷的稳定剂组合物。
令人惊讶地，发现了含有至少一种氨基酸和至少一种糖的稳定剂组合物，其中所有化合物是化学限定的，可以提供生物分子和微生物的质量和数量的有效稳定，而不需要高分子量的、大的或不确定的化合物。这提供了许多优于现有技术的优势。
本发明的稳定组合物是无血清的、无蛋白质的和无动物化合物的，因此没有将任何外源物质引入待稳定的受控产品中。此外，稳定组合物避免了引入不确定的、异源或未知化合物的需要，这使得产品稳定，形成可预测的和可控制的终产品。这两方面都减少了控制终产品质量和外源物质的需要。
稳定组合物只包括确切知道的化合物，没有批次之间的变异，或具有所需有利特征的批次的有限利用率。这降低了进料控制和原料选择的要求。此外，根据本发明的稳定组合物对于目标人类或动物是无毒的，并且是可热灭菌的。
稳定组合物提供了生物分子和微生物对抗物理和化学影响的良好稳定，特别是稳定了该样品对抗时间和温度改变而经历的负面影响的质量和有效量。
当用于冷冻干燥中时，稳定组合物稳定了生物分子和微生物来对抗冷冻、干燥、加热、冷却的加工条件，以及对抗冷冻干燥状态的延长存储过程中和重配中的任何负面影响。
此外，稳定组合物提供了具有吸引力和雅致外观、能抵抗运输的物理影响并且在稀释剂中重配时快速溶解的冻干体或饼状物。
因此，本发明涉及含有至少一种氨基酸和至少一种糖的稳定剂组合物，其特征在于所有化合物是化学限定的。
将“稳定剂组合物”定义为与生物分子或微生物混合时具有稳定效果的组合物；即，稳定剂组合物可以防止含有生物分子和/或微生物的样品的质量或有效量的大程度损耗。
“有效量”是例如生物或药物活性分子的含量，或活的或传染性微生物的数量。
“质量损耗”可能另外通过物理和/或化学影响而发生，如随着时间通过温度变化、机械影响(例如，运输)和/或物理形式的改变(例如，冷冻、干燥)。
稳定组合物可以是水溶液、含水浓缩物的形式，或可以作为适用于制备根据本发明的稳定剂组合物的水溶液或含水浓缩物的化学物质的干混合物来提供。
待稳定的生物分子和/或微生物在与稳定剂组合物混合之前，本身可以是液体的、干燥的、冷冻的或冻干形式的。
微生物可以是活的或死的，例如，作为故意灭活的结果。
通常理解“糖”为给予甜味或甘味的化合物，更特别的是碳水化合物，如单糖或双糖，糖醇或多元醇，及其衍生物。
对于本发明，当专门由相同的分子构成时，化合物是“化学限定的”。
因此，这样的化学限定的化合物具有明确已知的、清楚的和统一的化学结构，并以具体知道的含量来使用。
根据本发明的稳定剂的化学限定化合物不是不定的、异源的或未知的化合物，如蛋白质溶解产物、提取物、水解产物或肽混合物。此外，根据本发明的稳定剂组合物中不含仅已知平均分子量或平均侧链长度的聚合化合物。
易于从精细化工的商业供应商获得根据本发明的稳定剂的化学限定化合物；优选使用可获得的最高纯度。然而，化学限定要求不排除在这样化合物中痕量杂质的存在。这样的杂质是，例如，重金属、残余物、溶剂等。优选，这样的杂质以低于化学限定化合物的1％重量存在，更优选低于0.1、0.01、0.001或0.0001％重量。
优选，当以水溶液中的电离形式存在时，化学限定的要求与根据本发明的稳定剂的化合物的分子有关。因此，在优选的实施方案中，这样的化学限定化合物可以以其固体或非电离形式存在于不同的盐形式中，或是具有不同数量结晶水结合分子(水合物形式)的形式。
优选，根据本发明的稳定剂组合物提供生物分子和/或微生物的稳定，至至少与含有不定化合物的现有技术的稳定剂相同的水平。
优选，使用根据本发明的稳定剂组合物来稳定含有活微生物的产品时，滴定度的损耗低于1Log10。更优选低于0.5Log10。
然而，对于一些应用来说，并不总需要：稳定剂中并因此在终产品中不具有不定化合物具有极大的重要性；在该情况中，使用根据本发明的稳定剂组合物引起的略低的质量和/或数量上的产出是完全可接受的，因为与此交换得到是提供优于现有技术中稳定剂的许多优势。
例如，这是根据本发明的稳定剂用作微生物种子材料如甘油储备材料长期储存的稳定剂时的情况。在该情况中，由完全确定的稳定剂的ACF稳定可能更重要，高达2Log10的滴定度损耗是可接受的，这样，种子材料将正常培养成合适的质量用于接种新的培养物。
进一步地，本领域技术人员能够通过常规实验来进一步最佳化，例如，根据本发明的稳定剂组合物的组成或其使用条件。因此，这样的最佳化组合物和条件在本发明的范围之内。
为了测定稳定的水平，对应于稳定产品剩余的有效量和质量，可以使用任何合适的技术。例如，可以通过滴定或有限稀释来定量病毒和细菌化合物的数量和毒力(因此质量)；可以在生化上(例如，酶)、免疫上(免疫荧光测试)或物理上(例如，电泳、色谱或质谱)来检测生物分子。所有这些技术是本领域公知的并可利用的。
在优选的实施方案中，根据本发明的稳定剂组合物另外包括至少一种多胺。
将“多胺”定义为具有两个或多个氨基的化合物。
在更优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的稳定剂组合物：
-其中所述糖选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨糖醇和甘露醇中的至少一种；
-其中所述多胺是选自乙二胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺中的至少一种：
-其中所述氨基酸是谷氨酸(glutamate)(谷氨酸(glutamicacid))或甘氨酸，或其中包括这两种氨基酸。
在进一步更优选的实施方案中，根据本发明的稳定剂组合物是缓冲的水溶液，优选将水溶液缓冲为pH6-8，更优选约pH6.9。
缓冲剂可以是，例如，Tris/柠檬酸盐，优选约50mM/10mM的浓度。
优选地，缓冲剂是基于磷酸盐的，更优选磷酸二钠二水合物。
优选地，缓冲剂的存在量为0.1至100g/l，更优选约1g/l。
在可替换的更优选的实施方案中，根据本发明的稳定剂组合物的水溶液是浓缩溶液，含有稳定剂组合物的化合物，其浓度高于这些化合物在混合根据本发明的稳定剂和待稳定的生物分子或微生物时形成的最终药物组合物中的浓度。
优选，与最终药物组合物中的浓度或含量相比较，稳定剂组合物是2x、3x、4x、5x、10或20x浓缩的；更优选稳定剂组合物是4x浓缩的。
在更优选的实施方案中，提供了化学物质的干组合物，其适于溶解于合适的溶剂中来制备本发明稳定剂组合物的水溶液或浓缩物。
在用于之后溶解的化学物质的干混合物具有以较小体积存储的优势。这节约了存储空间并有助于运输和销售。
更优选，在根据本发明的稳定剂组合物中：
-所述糖是蔗糖、山梨糖醇或甘露醇；优选山梨糖醇；更优选D-山梨糖醇；
-所述氨基酸是谷氨酸盐或甘氨酸；更优选L-谷氨酸盐；更优选包括L-谷氨酸盐和甘氨酸两者；
-使用多胺的组合物；更优选精胺和腐胺，或精胺和乙二胺。
在根据本发明的稳定剂组合物的进一步更优选的实施方案中，4x浓缩物包括：
-10至200g/l含量的所述糖，优选约75g/l；
-0.1至400g/l含量的所述氨基酸；优选包括约20g/l的L-谷氨酸盐或包括约160g/l的甘氨酸；
-约0.1至100g/l含量的所述多胺；优选包括约10g/l的精胺或包括约25g/l的亚精胺。
在更优选的实施方案中，根据本发明的稳定剂组合物包括糖和作为氨基酸的谷氨酸盐，以及另外包括至少一种相容性溶质。相容性溶质优选是选自肌氨酸、甜菜碱、二-甘氨酸和胆碱中的至少一种。4x浓缩物中的相容性溶质优选以0.1至400g/l的含量存在；优选50-200g/l，更优选约160g/l。
如以上概述的，与使用稳定剂组合物的化合物的盐或水合物的形式无关；例如精胺可以以：精胺、精胺二水合物或精胺四盐酸盐的形式使用；类似地，亚精胺可以以亚精胺或亚精胺三盐酸盐来使用。
因为打算将根据本发明的稳定剂与生物分子和/或微生物混合，在一些用途中，稳定剂的化合物可能是给药于目标人类或动物产品的一部分。因此，根据本发明的稳定剂组合物的化合物优选是无毒的，至少在待给药的最终产品中存在的浓度是无毒的。
优选地，根据本发明的稳定剂组合物的化合物不诱导不利的过敏反应。
优选地，根据本发明的稳定剂组合物是无菌的。可以通过加热、过滤、照射或本领域已知的任何合适技术来实现根据本发明的稳定剂的灭菌。优选将稳定剂组合物加热灭菌。
作为非限制性实施例，适用于根据本发明的稳定剂组合物的化学限定化合物列于表1中。
表1：适用于根据本发明的稳定剂组合物的化学限定化合物
| 产品 | 供应商 | 目录编号 |
| Na2HPO4物二水合物 | Merck | 6576 |
| D-山梨糖醇 | Sigma | S7547 |
| Na-L-谷氨酸盐单水合物 | Merck | 6445 |
| 甘氨酸 | Sigma | G8790 |
| 精胺 | Fluka | 85590 |
| 精胺四盐酸盐 | Fluka | 85610 |
| 精胺二水合物 | Fluka | 85588 |
| 亚精胺 | Fluka | 85561 |
| 亚精胺三盐酸盐 | Fluka | 85580 |
| 腐胺 | Sigma | P7505 |
| 乙二胺 | Aldrich | 19，580-4 |
| Tris-HCl(Tris羟甲基-氨基甲烷) | Merck | 8382 |
| 柠檬酸三钠二水合物 | Merck | 6447 |
| 肌氨酸 | Sigma | S7672 |
| 甜菜碱 | Sigma | B7045 |
| 二-甘氨酸 | Sigma | G3915 |
| 胆碱 | Sigma | C2004 |
如本领域所知的，在此所述的根据本发明的稳定剂组合物的化合物的衍生物是可获得的，或可以是合成的。这样的衍生物也适于用作根据本发明的稳定剂组合物的化合物。因此，这样的衍生物在本发明的范围内。
表2：优选和最优选的根据本发明的稳定剂组合物的概述。
给定的含量对应于4x浓缩物的那些：
| 4x浓缩物中以g/l计的含量 | |||
| 优选 | 最优选 | ||
| 缓冲剂 | 0.1-100 | ||
| Na2HPO4 | 同上 | 1 | |
| 或Tris/柠檬酸盐 | 同上 | 50mM/10mM | |
| 糖 | 10-200 | ||
| 山梨糖醇 | 同上 | 75 | |
| 氨基酸 | 0.1-400 | ||
| 谷氨酸盐 | 同上 | 20 | |
| 和/或甘氨酸 | 同上 | 160 | |
| 多胺 | 0.1-100 | ||
| 精胺 | 同上 | 10 | |
| 或亚精胺 | 同上 | 2.5 | |
| 或腐胺 | 同上 | 10 | |
| 或乙二胺 | 同上 | 10 | |
| 或组合：精胺和腐胺或精胺和乙二胺 | 105105 | ||
| 相容性溶质 | 0.1-400 | ||
| 肌氨酸 | 同上 | 160 | |
| 或甜菜碱 | 同上 | 160 | |
| 或二-甘氨酸 | 同上 | 160 | |
| 或胆碱 | 同上 | 160 | |
| pH | 6-8 | 6.9 | |
使用根据本发明的稳定剂组合物进行了大量实验。设计这些来引入所有条件，在这些条件下根据本发明的稳定剂组合物提供了有效的稳定：
-冷却；用于液体形式的(批量(bulk))产品在例如4℃的储存
-冷冻；用于(批量(bulk))产品深冻的存储，例如在-20℃或-45℃
-冷冻干燥；引入：干燥、加热、冷却
-冻干产品的冷冻；用于深冻储存，例如在-20℃，或-45℃
-冻干产品的冷却；用于在4℃的存储
-冻干产品的加热，至高于室温的温度，和
-冻干产品在稀释剂中的重配。
当使用含有微生物的稳定组合物进行这些实验时，使用基于滴定或有限稀释的公知定量技术测定重配产品中活的传染性微生物的剩余数量。当使用生物分子进行时，使用特定的测试如滴定、Elisa或生物测试来测定质量和数量。
这些实验及其结果概述于实施例中，并显示出根据本发明的稳定剂组合物提供了微生物和或生物分子的有效稳定，不仅用于冻干中和冻干前后的各种用途，而且还稳定了冷却或冷冻存储中的批量抗原，在冷冻干燥之前或替代冷冻干燥。
在可替换的实施方案中，本发明的稳定剂组合物的特征在于不包括高分子量或大体积的化合物。
对于本发明，将“高分子量”和“大”化合物定义为任何具有超过203Da分子量或分子离子大小的化合物。例如，精胺就不是这样的大分子，因为当排除任何结晶水或盐形式如水合物或(氢)氯化物时，其分子离子只具有202Da的分子量。
如上所述，令人惊讶地发现不需要本领域中任何一种常用的大化合物来获得有效稳定，实际上，不需要大于精胺的化合物。
这个优势也已经提及过了；高分子量的大化合物通常是不定的和异源的，或最多也只是已知平均分子量或平均侧链长度的化合物。因此，稳定剂组合物中使用这样的不定化合物将导致具有不可预测特征的稳定产品。
在可替换的优选实施方案中，本发明涉及含有根据本发明的稳定剂组合物和至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的疫苗组合物。
本领域通常已知疫苗组合物是表示在药物学上可接受载体中含有免疫原性化合物的组合物，该免疫原性化合物能够诱导被动或主动的目标免疫系统激活。诱导的免疫应答将要干扰特定感染的建立或进展，或缓解疾病的症状。
药物学上可接受载体可以是，例如，无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以是，例如，缓冲剂。
对于本发明，将“生物分子”理解为可以在自然界中找到的分子；特别地，这指的是蛋白质、碳水化合物、脂质或核酸。分子的来源可以是生物的或合成的，源自体内或体外。
术语“蛋白质”意思是包括两个或多个氨基酸的分子链；因此，肽、寡肽和多肽包括在蛋白质的定义内。
根据本发明的疫苗组合物可以是任何形式的，例如：冻干、液体或冷冻的；或可以配制或加工成液体、凝胶、膏剂、粉末、片剂、胶囊或冻干体，这取决于所需的存储方法、运输或对目标的应用。
根据本发明的疫苗组合物可以包括单一免疫原性微生物和生物分子或其组合。
在优选的实施方案中，本发明涉及疫苗组合物：
-其中，所述微生物是病毒或细菌，或其中同时包括病毒和细菌；更优选，病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类；更优选病毒选自牛疱疹病毒、牛副流感病毒3、狂犬病病毒、人呼吸合胞病毒以及人或动物流感病毒；更优选，细菌选自细菌种链球菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属、枝原体属、爱德华氏菌属、弯曲菌属和沙门菌属。
-其中生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种；更优选，蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
抗体片段是，例如，Fab片段和单链抗体。和本发明的稳定剂组合物一起使用的激素是，例如，胰岛素、促性腺激素如促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素和红细胞生成素。
本发明的疫苗和稳定剂组合物适用于任何遗传或形态类型的、感染任何动物物种或人的各种病毒。特别地，对稳定特定动物病毒呈现的任何结果可以直接外推来预测感染其他宿主物种(动物或人)的相应病毒和该病毒家族内其他病毒物种的稳定结果。
具有病毒包膜的病毒对化学和物理影响是特别敏感的。因此，通过本发明的稳定剂组合物可以有效地稳定这样的病毒，这更证明了它的有效性。
表3：和本发明的稳定剂组合物一起使用的病毒实例
| 家族 | 实例 | 基因组 | 包膜 |
| 疱疹病毒 | 牛疱疹病毒(BHV)* | ds DNA | 是 |
| 同上 | 假性狂犬病毒(PRV) | 同上 | 是 |
| 痘病毒 | 粘液瘤病毒 | 同上 | 是 |
| 副粘病毒 | 牛副流感病毒3(PI3) | ss RNA，负链 | 是 |
| 肺病毒 | 牛呼吸合胞病毒(BRSV) | 同上 | 是 |
| 正粘病毒 | 马流感病毒(EIV) | 同上，片段 | 是 |
| 冠状病毒 | 牛冠状病毒(BCV) | ss RNA.正链 | 是 |
*牛疱疹病毒也称为感染性牛鼻气管炎病毒
和根据本发明的稳定剂一起使用的细菌可以是任何类型的，例如，通过革兰氏阳性或革兰氏阴性染色表征的。
表4：和本发明的稳定剂组合物一起使用的细菌实例
| 特征 | 名称 |
| 革兰氏阳性 | 马链球菌(Streptococcus equi) |
| 同上 | 肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) |
| 革兰氏阴性 | 大肠杆菌(Escherichia coli) |
| 同上 | 鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri) |
| 同上 | 鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum) |
稳定这些细菌中获得的结果可以外推至所提及属中的其他细菌种类。
和本发明的稳定剂一起使用的用于生产生物分子和微生物的生产系统可以是任何体外或体内系统。例如，可以在细胞培养物中、在受精的鸡蛋上，或在宿主动物中生产病毒；可以使用相似的技术，和另外在培养液中生产细菌，并且可以通过从动物或微生物分离来生产生物分子，尤其是可以有利地使用重组表达系统。许多其他实施方案是本领域已知的。
然而，通过从生产阶段和稳定剂组合物中除去未知的、异源的和不定成分来获得稳定终产品的最佳安全性和可预测性。
因此，在根据本发明的疫苗组合物的更优选实施方案中，无动物成分生产生物分子或微生物，或两者。
例如，ACF生产系统是ACF培养基中细胞上的病毒培养物；ACF培养液中的细菌培养物；和使用ACF培养基的重组表达培养物，例如，使用昆虫细胞的杆状病毒表达系统。
在更优选的实施方案中，根据本发明的疫苗组合物另外含有佐剂。
佐剂通常用于以非特异性的方式，通过刺激目标人或动物的免疫系统提高对疫苗成分的免疫应答。许多不同的佐剂是本领域已知的，例如：矿物油或生物油、皂角苷、肽、氧化铝和衍生物等。
在进一步优选的实施方案中，根据本发明的疫苗组合物是冻干的。
在冻干形式中，本发明的稳定剂组合物将是最受益的，根据本发明的冻干疫苗组合物例如在+4℃能稳定几个月至几年。
冷冻干燥的程序是本领域已知的；不同规格的冷冻干燥设备是可商购的。通常，将含有根据本发明的稳定剂的疫苗组合物填入容器如玻璃瓶中至特定的体积，例如，0.5至50ml，优选1、2或5ml。随后，将这些小瓶冷冻，并接受冻干处理。
示例性冷冻干燥过程的概述包括步骤：
-深冻10-60分钟，将液体固定成特定结构；
-在-20至20℃的第一个冻干步骤，1-12小时，高真空，以升华结晶水；
-第二次干燥在0至40℃，1/2-6小时，在中等真空，以释放未冷冻的水；
-包装冷冻干燥体(例如，通过橡皮塞来密封玻璃瓶)以维持干燥的状态，例如，在真空下，或在氮气下；并
-保持于+4℃。
本领域技术人员能够很好地对这样的过程进行常规改变和最佳化，以便获得特定类型样品的最佳结果。
可以通过监控干燥过程中装置中的温度和含水量来最佳化冷冻干燥过程。此外，通常使用差示扫描量热法来测定产品在冻干之前和之后的特征。
终产品中的残余含水量(rwc)是决定冻干产品稳定性的重要参数。优选地，根据本发明的冻干样品和疫苗的rwc低于5％。为了测定rwc，可以有利地使用本领域已知的Karl Fischer滴定。
在进一步优选的实施方案中，以冻干球的形式制备根据本发明的冻干疫苗，如欧洲专利EP799.613中所述的。
根据本发明的疫苗组合物产生的冷冻干燥体可以是任何形式的。根据本发明的稳定组合物为疫苗组合物提供受益特征来获得雅致和有吸引力的外观的冻干体。优选地，玻璃瓶中的冻干饼状物是有光泽的、均匀外观，并优选在轻弹时保持附着在瓶壁上，并且不是那么易碎的以致在正常运输条件下变成粉碎的。
因此，冻干疫苗体理想的外观不仅涉及主观和美学特征，而且包括真实的有利技术效果；特别地，涉及稳定效果，对运输严格的耐受性，和再溶解的速度。
特别关注的是避免本领域称为“崩解”的外观，因为具有这样的无定形和块状外观的冻干体再溶解缓慢和不完全，并且没有给待保存的生物分子和/或微生物提供足够的稳定。
在进一步优选的实施方案中，通过将根据本发明的冻干疫苗组合物于药物学上可接受的载体中重配来获得即可使用的疫苗溶液。
因为根据本发明的冻干疫苗组合物快速溶解，优选在将疫苗溶液应用至目标即刻之前进行重配。这确保了疫苗溶液是新鲜的并且是期望的剂量和质量的。
可以根据本领域已知的方法将根据本发明的疫苗组合物给药于人或动物目标。例如，通过非肠道施加，如通过所有注射途径进入或通过皮肤：例如，肌内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜内或皮下。可替换的可行施加途径是以滴剂、喷雾、凝胶或膏剂通过局部施加至眼睛、鼻子、嘴、肛门或阴道的粘膜上皮，或至身体任何部位的外皮层的表皮；以气溶胶或粉末通过喷雾施加。或者，可以通过食物途径，通过与食物、饲料或饮用水结合，例如，作为粉末、液体或片剂来应用，或以液体、凝胶、片剂或胶囊通过直接给药至口中，或作为栓剂给药至肛门。也可以有利地运用浸没接种(immersion vaccination)疫苗。
优选的施加途径是肌内或皮下注射，或鼻内喷雾。
不用说，最佳的施加途径将取决于待预防或缓解的感染或症状的特定特征，所用的疫苗制剂的特征和目标物种的特定特征。
将根据本发明的疫苗施加至目标人类或动物的方案可以是单剂量或多剂量的，可以在同时或顺次给予，以剂量和制剂相容的方式，并且这样的含量将是免疫上有效的，例如作为每年一次的剂量。
在可替换的实施方案中，本发明涉及制备药物组合物的方法，包括将根据本发明的稳定剂组合物与含有至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的组合物混合。
根据本发明的方法制备的药物组合物可以是任何形式的：液体或干燥、冷冻、冻干等。
可以使用本领域中可获得的任何合适的技术来进行混合。
优选地，根据本发明的方法包括混合1份作为4x浓度的无菌缓冲水溶液的根据本发明的稳定剂组合物，和3份含有至少一种生物分子和/或至少一种微生物的组合物来产生根据本发明的药物组合物。
与根据本发明的稳定剂组合物混合的含有至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的组合物优选是液体形式的。从病毒或细菌培养物，或表达系统培养物获得该组合物。例如，可以在下游加工如离心后获得该组合物，例如培养物上清液或(重悬浮的)离心的沉淀(含有病毒感染的细胞或细菌)；或可以使用未加工的完整培养物。
优选地，在生产和下游加工结束后不久根据本发明的方法进行稳定剂组合物和含有生物分子和/或微生物的组合物混合，以便获得最佳的稳定结果。
优选地，然后将由此获得的稳定药物组合物冷却储存或冷冻，等待进一步的处理和对生产成果的质量控制的结果。
在根据本发明方法的优选实施方案中：
-所述微生物是病毒或细菌，或包括病毒和细菌两者。
-所述病毒选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种。
-所述生物分子选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
-所蛋白质选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
-所述无动物成分生产生物分子或微生物或两者。
-使所得到的药物组合物进行冷冻干燥。
在更优选的实施方案中，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的药物组合物，其中组合物是疫苗。
在更优选的实施方案中，本发明涉及制备疫苗溶液的方法，通过将根据本发明的药物组合物在药物学上可接受的载体中重配。
在进一步可替换的实施方案中，本发明涉及根据本发明的稳定剂组合物的用途，用于稳定组合物中的至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的质量和/或数量。
在根据本发明用途的优选实施方案中：
-所述微生物是病毒或细菌，或包括病毒和细菌两者。
-所述病毒选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种。
-所述生物分子选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
-所述蛋白质选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
-所述无动物成分生产生物分子或微生物或两者。
在更优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的疫苗溶液或通过本发明方法获得的疫苗溶液的根据本发明的用途，用于目标人类或动物的免疫。
现在将参照以下的非限制性实施例来进一步描述本发明。
实施例
如上所述，引入所有条件进行冷冻干燥实验，在这些条件下有效的稳定剂必须能够稳定：冷却、冷冻、干燥、加热。
稳定微生物中进行的冷冻干燥实验概述如下：
-从培养物获得含有微生物的组合物，如果需要进行处理，并储存于4℃或低于0℃。
-通过称重所需含量的所需化合物来制备根据本发明的稳定剂组合物，将这些加入所需体积的无菌蒸馏水中，并混合直至溶解。然后将稳定剂组合物在121℃加热灭菌20分钟。
-在实验开始时将样品解冻，与三分之一样品体积的4x浓缩稳定剂混合。使用根据本发明的稳定剂或参照稳定剂组合物。实验中还包括了不含任何稳定剂的样品。
-将稳定的样品以特定填充体积倒入标准的10ml玻璃瓶中：BHV和PI3病毒为2ml，PRV、粘液瘤病毒、BRSV、EIV和BCV为1ml。细菌样品每瓶装填2.5ml。
-使用标准两级程序将样品冷冻干燥，至残留含水量低于5％，然后在真空下用橡皮塞密封。
-随后，将样品储存在4℃或更高温度持续特定的时间段；“直接4℃”一栏中的结果是样品在冷冻干燥后在4℃存储少于一个月的滴定结果；“28℃3天”一栏中的结果是样品在冷冻干燥后在可能的4℃存储后，在28℃存储3天后的滴定结果，然后在这三天后立即定量；“4℃一年”一栏中的结果是样品在冷冻干燥后在4℃储存至少一年的滴定结果。
引入在28℃存储三天作为加速的稳定性测定；大多数时间这些结果表示在室温或冷却条件下存储更长时间的结果。
为了测定这些处理条件后剩余的微生物数量和质量，滴定病毒样品的传染性，以及将细菌样品平板计数。
BRSV滴定测试：
将BRS病毒的稳定样品稀释于0.2ml补充FCS 10％(v/v)的标准细胞培养基中，至10-1至10-7的稀释度。将稀释液接种于微量滴定平板孔中的BEL细胞上：1.5×105BEL细胞/ml，0.2ml/孔。每个病毒稀释度使用10个孔。将微量滴定平板孵育8天(3-5％CO2，37℃)。使用丙酮/PBS 70/30％v/v固定平板，室温10-15分钟。最初用BRSV特异性的单克隆抗体孵育固定的单层，然后用抗-抗体FITC-缀合物+埃文斯蓝(作为计数染色)孵育。将其中已经产生阳性荧光细胞的那些培养皿计数为阳性。根据Reed和Muench计算病毒滴定度，并表示为TCID50的病毒滴定度。
在所有实验中，每轮病毒滴定包括同源标准病毒样品和阴性对照。所有病毒滴定在一天重复进行两份。给出平均的滴定度。
粘液瘤病毒滴定测试：
将RK13细胞接种于96孔平板中的含有5％胎牛血清(FCS)和合适抗生素的标准细胞培养基中，4×105细胞/ml，100μl每孔。将平板在37，5％CO2大气中孵育过夜。
第二天，将含有粘液瘤病毒的稳定样品从10-1稀释至10-8。将20μl每个病毒稀释度接种于RK13细胞平板的孔中，重复三份。在37℃/5％CO2孵育一小时后，将100μl含有FCS的新鲜培养基加入孔中，并将平板再孵育2-3天，直至病毒斑清楚可见，并可以阅读CPE。
然后倒空平板，用稀释的Naphtalene黑染色，在室温孵育1小时。将平板再次倒空，用自来水洗涤、干燥并使用光学显微镜阅读。
通过Speaman-Karber算法计算最初样品中活的感染性粘液瘤病毒的数量，并表示为TCID50值。
BHV、PI3和PRV病毒滴定测试：
以与粘液瘤病毒相似的方法滴定BHV、PI3和PRV病毒的稳定样品，除了对BHV和PI3病毒使用JCK细胞，对PRV使用Vero细胞。使用光学显微镜通过计数斑来测定CPE。
BCV滴定测试：
将MDKB细胞的细胞悬浮液平铺于96孔平板中含有10％FCS和合适抗生素的DMEM培养基中，200μl/孔，1×105细胞/ml。在37℃5％CO2大气中将平板孵育3天。三天后，形成汇合的单层。除去培养基，加入200μl不含FCS的新鲜培养基，并将平板孵育2小时。在10倍稀释的步骤中从稳定样品制备BCV的稀释度。将微量滴定平板再次倒空，将10-3至10-8的稀释度接种于MDBK细胞单层上。将平板孵育5-6天。为了免疫荧光计数，观察病毒斑，使用多克隆兔子抗BCV血清，和山羊-抗-兔子-FITC标记的缀合抗体。用埃文斯蓝染色后，使用UV-光学显微镜将斑计数。通过Reed-Muench算法计算稳定样品中活病毒TCID50滴定度。
马流感病毒
在鸡蛋上滴定EIV；将稳定EIV样品的稀释液接种至受精的活的10天大的鸡蛋尿囊腔中，并在40-42℃孵育3-5天。打开鸡蛋，使用鸡红血球在血凝集测定(heamagglutination assay)中测试尿囊流体的样品。从给予HA反应的最高稀释度计算最初样品中活的感染性EIV的数量。
在一些实验中，判断冻干饼状物的质量。这包括视觉观察和摇动小瓶。
给出专制的表示：
+雅致的外观，良好结实的结构
0适当的外观和结构
-差于所需的外观和结构
细菌
通过在摇瓶中的合适标准生长培养基中通过生长储备材料来获得细菌培养物。接着，通过将系列有限稀释样品重复两份涂布于血液-琼脂平板上，用于计数过夜孵育后出现的菌落数量，将这些培养物定量。对于一些实验，将冷冻干燥后回收的菌落数量表示为冷冻干燥前最初培养物中菌落数量的％。
然后将相应的培养物以1∶4与根据本发明的4x浓缩稳定剂组合物混合，并接受标准的两级冷冻干燥程序。
对于涉及大肠杆菌的实验，使用K12菌株，并使用不同的培养基：标准LB培养基、含有氨苄青霉素的LB和血液-琼脂培养基。将根据本发明的稳定剂组合物的效果与含有白蛋白的标准稳定剂的相比较。
在冻干前或冻干后直接测试样品，或在28℃或30℃孵育3天后测试，再次作为加速的稳定性测试。
表5：甘氨酸浓度的影响
所用的微生物：BHV
所用的稳定剂组合物：
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 不定 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 10 |
| 实验编号03AL | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | 饼状物质量 | |||
| 甘氨酸g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | |||
| 直接 | 28℃3天 | 4℃1年 | |||
| 240 | 9.0 | 8.2 | 7.9 | 7.9 | 0 |
| 200 | 8.4 | 8.1 | 7.9 | 0 | |
| 160 | 8.2 | 8.1 | 8.2 | + | |
| 120 | 8.4 | 8.1 | 8.2 | 0 | |
| 80 | 8.4 | 8.3 | 8.3 | - | |
| 40 | 8.5 | 7.9 | 7.8 | - | |
| 0 | 8.0 | 7.7 | 7.9 | - | |
表6：谷氨酸盐浓度的影响
所用的微生物：BHV
所用的稳定剂组合物：
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 不定 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 10 |
| 实验编号03AL | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | 饼状物质量 | |||
| 谷氨酸盐g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | |||
| 直接 | 28℃3天 | 4℃1年 | |||
| 0 | 9.0 | 8.2 | 7.9 | 8.4 | 0 |
| 20 | 8.4 | 8.1 | 7.7 | + | |
| 100 | 8.2 | 8.1 | 7.9 | - | |
表7：多胺的类型和多胺浓度的影响
所用的微生物：BHV
所用的稳定剂组合物：
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 不定 |
| 或亚精胺三盐酸盐 | 不定 | |
NB：在这些实验中，稳定剂组合物中包括精胺或亚精胺。
出于参照的目的，包括现有技术的常规稳定剂(Makoschey等，上文)作为比较实施例，将这表示为“常规稳定剂(Conv.stab.)”。
表7：多胺的类型和多胺浓度的影响(续表)
| 实验编号03AL | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | 饼状物质量 | |||
| 精胺g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | |||
| 直接 | 28℃3天 | 4℃1年 | |||
| 0 | 9.0 | 8.0 | 7.8 | n.a. | + |
| 0.5 | 8.3 | 7.8 | 8.0 | 0 | |
| 2.5 | 8.2 | 8.0 | 8.2 | + | |
| 10 | 8.2 | 8.1 | 8.2 | + | |
| 30 | 8.3 | 8.0 | 8.5 | + | |
| 50 | 8.1 | 8.2 | 7.9 | 0 | |
| 亚精胺g/l | 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | 4℃1年 | 饼状物质量 |
| 0.5 | 9.0 | 8.7 | 8.1 | 7.5 | 0 |
| 2.5 | 8.5 | 8.1 | 8.1 | 0 | |
| 10 | 8.4 | 7.8 | 8.4 | 0 | |
| 30 | 8.2 | 8.0 | 7.9 | - | |
| 50 | n.a. | n.a. | 8.1 | n.a. | |
| 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | 4℃1年 | 饼状物质量 | |
| 常规稳定剂 | 9.0 | 8.2 | 8.0 | 7.9 | + |
n.a.＝不可获得
表8：多胺-盐和水合物的类型以及浓度的影响
所用的微生物：BHV
所用的稳定剂组合物：
| 化合物 | g/l(4x conc) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 不定 |
| 或精胺二水合物 | 不定 | |
| 或腐胺* | 不定 | |
| 或乙二胺* | 不定 | |
*在这些实验中，包括任一种多胺或组合；这示于表中。
表8：多胺-盐和水合物的类型以及浓度的影响(续表)
| 实验编号03AA | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | |||
| 精胺四盐酸盐g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||
| 直接 | 3天28℃ | 1年4℃ | ||
| 10 | n.a. | 8.2 | 8.1 | 7.9 |
| 30 | 7.8 | 7.5 | 7.5 | |
n.a.＝不可获得
| 实验编号03AB | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | |||
| 精胺二水合物g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||
| 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | ||
| 5 | 9.1 | 7.8 | 6.9 | 7.3 |
| 10 | 7.4 | 6.7 | 7.4 | |
| 30 | 7.5 | 6.6 | 7.1 | |
| 精胺四盐酸盐g/l | 冻干前的滴定度 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 |
| 5 | 9.1 | 8.1 | 7.5 | 7.6 |
| 10 | 8.0 | 7.7 | 7.8 | |
| 30 | 7.7 | 7.0 | 7.4 | |
表8：多胺盐和水合物的类型以及浓度的影响(续表)
| 实验编码03AJ | 病毒滴定度(log10TCID50/瓶1) | |||
| 精胺四盐酸盐g/l | 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||
| 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | ||
| 10 | 8.5 | 8.5 | 7.9 | 7.8 |
| 腐胺g/l | 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 |
| 5 | 8.5 | 8.0 | 7.5 | 7.3 |
| 10 | 8.1 | 7.6 | 7.9 | |
| 30 | 8.0 | 7.5 | 7.7 | |
| 乙二胺g/l | 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 |
| 5 | 8.5 | 8.0 | 8.0 | 7.7 |
| 10 | 8.2 | 7.8 | 7.9 | |
| 30 | 8.2 | 7.4 | 8.2 | |
| 无多胺 | 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 |
| 0 | 8.5 | 8.1 | 7.3 | 7.4 |
| 组合的多胺* | 冻干前 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 |
| A | 8.5 | 8.4 | 7.8 | 8.2 |
| B | 8.5 | 8.2 | 8.2 | |
*多胺组合：
A＝精胺四盐酸盐10g/l和腐胺5g/l。
B＝精胺四盐酸盐10g/l和乙二胺5g/l。
表9：不同病毒的稳定，和多胺的影响
所用的稳定剂组合物
“本发明1”
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 10 |
“本发明2”
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 精胺四盐酸盐 | 2.5 |
“本发明3”
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 无 | 0 |
用现有技术的常规稳定剂(Makoschey等，上文)进行比较实施例，将其表示为“常规稳定剂(Conv.stab)”。
表9：不同病毒的稳定，以及多胺的影响(续表)
| 病毒滴定度(log10 TCID50/瓶) | |||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||||
| 所用的病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | |
| BRSV04.20.001BD | 无稳定剂 | 5.8 | 4.6 | 3.5 | 2.8 |
| 常规稳定剂 | 5.6 | 5.0 | 5.0 | ||
| 本发明1 | 5.5 | 4.0 | 5.1 | ||
| 本发明3 | 5.0 | 4.3 | n.a. | ||
| BRSV04.20.001BF | 无稳定剂 | 6.2 | 3.6 | 3.6 | 2.6 |
| 常规稳定剂 | 5.5. | 5.1 | 5.1 | ||
| 本发明1 | 3.6 | 3.5 | 3.2 | ||
| 本发明2 | 3.5 | 3.5 | 3.0 | ||
| 本发明3 | 3.5 | 3.5 | n.a. | ||
| BRSV04.20.001BL | 无稳定剂 | 5.8 | 4.6 | 4.2 | 3.4 |
| 常规稳定剂 | 5.4 | 5.2 | 5.0 | ||
| 本发明1 | n.a. | 5.2 | 5.0 | ||
| 本发明2 | 5.4 | 5.4 | 5.0 | ||
| 本发明3 | 5.3 | 5.0 | n.a. | ||
| EIV03.20.00 3AA | 无稳定剂 | 9.3 | 7.2 | 6.5 | 6.6 |
| 常规稳定剂 | 7.4 | 8.1 | 8.3 | ||
| 本发明1 | 7.9 | 7.4 | 7.9 | ||
| 本发明3 | 8.0 | 8.2 | n.a. | ||
| EIV03.2 0.2 03S | 无稳定剂 | 9.1 | 6.9 | 5.6 | 4.3 |
| 常规稳定剂 | 8.9 | 8.3 | 7.7 | ||
| 本发明1 | 8.8 | 8.3 | 7.1 | ||
| 本发明3 | 8.9 | 8.4 | n.a. | ||
n.a.＝不可获得
表9：不同病毒的稳定，和多胺的影响(续表)
| 病毒滴定度(log10 TCID50/瓶) | |||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||||
| 所用的病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | |
| BCV04.20.800AH | 无稳定剂 | 7.0 | 4.7 | <3.5 | 3.2 |
| 常规稳定剂 | 6.1 | 5.8 | 5.5 | ||
| 本发明1 | 5.7 | 4.0 | 4.2 | ||
| 本发明3 | 5.6 | <3.5 | n.a. | ||
| BCV04.20.800AN | 无稳定剂 | 6.6 | 5.9 | 4.4 | 3.9 |
| 常规稳定剂 | 5.7 | 5.3 | 5.1 | ||
| 本发明1 | 5.9 | 5.4 | 5.2 | ||
| 本发明2 | 6.0 | 5.3 | 4.9 | ||
| 本发明3 | 5.9 | 5.4 | n.a. | ||
| 粘液瘤04.20.001R | 本发明1 | 7.9 | 7.6 | n.a. | n.a. |
| 本发明3 | 7.7 | ||||
| PRV04.20.004AB | 无稳定剂 | 9.1 | 7.3 | n.a. | n.a. |
| 常规稳定剂 | 8.3 | ||||
| 本发明1 | 8.3 | ||||
| 本发明3 | 8.0 | ||||
| PRV03.20.003G | 常规稳定剂 | 9.0 | 8.0 | 7.9 | 7.9 |
| 本发明1 | 8.1 | 7.9 | 7.9 | ||
| 本发明3 | 7.8 | 7.4 | 8.0 | ||
n.a.＝不可获得
表9：不同病毒的稳定，和多胺的影响(续表)
| 病毒滴定度(log10 TCID50/瓶) | |||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||||
| 所用的病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | |
| BHV03AB | 常规稳定剂 | 9.1 | 8.4 | 8.1 | 8.0 |
| 本发明1 | 8.0 | 7.7 | 7.8 | ||
| 本发明3 | 7.7 | 6.7 | n.a. | ||
| BHV03AE | 常规稳定剂 | 8.7 | 7.7 | n.a. | 7.5 |
| 本发明1 | 8.5 | 8.2 | 8.4 | ||
| 本发明3 | 8.3 | 8.1 | 8.2 | ||
| BHV03 AN | 常规稳定剂 | 8.6 | 8.4 | 8.1 | 8.1 |
| 本发明1 | 8.2 | 8.1 | 8.1 | ||
| 本发明2 | 8.4 | 8.5 | 8.3 | ||
| BHV03 AO | 无稳定剂. | 8.8 | 7.6 | 7.9 | n.a. |
| 常规稳定剂 | 8.3 | 8.1 | 8.0 | ||
| 本发明1 | 8.0 | 8.2 | 8.0 | ||
| 本发明2 | 7.9 | 8.2 | 7.9 | ||
| 本发明3 | 7.5 | 7.9 | n.a. | ||
| BHV03 AR | 无稳定剂. | 8.9 | 7.7 | n.a. | n.a. |
| 常规稳定剂 | 8.1 | 8.2 | |||
| 本发明1 | 8.3 | 8.1 | |||
| 本发明2 | 8.3 | 8.1 | |||
| 本发明3 | 8.1 | 7.5 | |||
n.a.＝不可获得
表10：以ACF方式生产的不同病毒的稳定
所用的稳定剂组合物：
“本发明1”、“本发明3”和常规稳定剂“Conv.stab” (参见表9)
| 病毒滴定度(log10 TCID50/瓶) | |||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | ||||
| 所用ACF病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | +4℃1年 | |
| PI303H | 常规稳定剂 | 9.5 | 8.3 | 8.0 | 8.1 |
| 本发明1 | 8.9 | 8.7 | 8.6 | ||
| 本发明3 | 8.8 | 8.6 | 8.5 | ||
| BHV03AD | 常规稳定剂 | 8.8 | 8.3 | 7.9 | n.a. |
| 本发明1 | 8.4 | 8.0 | |||
| 本发明3 | 8.0 | 7.8 | |||
| PRV03N | 常规稳定剂 | 9.3 | 8.3 | 8.0 | 7.7 |
| 本发明1 | 8.3 | 8.1 | 8.1 | ||
| 本发明3 | 8.4 | 7.8 | 7.2 | ||
| PRV03P | 本发明1 | n.a. | 8.5 | 8.2 | n.a |
| 本发明3 | 8.3 | 7.8 | |||
| 粘液瘤04.20.01L | 常规稳定剂 | 7.4 | 7.2 | 7.4 | n.a |
| 本发明1 | 7.2 | 7.2 | |||
n.a.＝不可获得
表11：通过相容性溶质替代甘氨酸
所用的稳定剂组合物：
“本发明3”和“常规稳定剂”(参见表9)
本发明3的改进：
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 75 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 无甘氨酸 | 无 | |
| 相容性溶质 | 肌氨酸 | 80或160 |
| 或甜菜碱 | 80或160 | |
| 或二-甘氨酸 | 80或160 | |
| 或胆碱 | 80或160 | |
| 多胺 | 无 | 0 |
表11：通过相容性溶质替代甘氨酸(续表)
| 病毒滴定度(log10 TCID50/瓶) | ||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | |||
| 所用的病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | |
| BHV03AC | 常规稳定剂 | 9.0 | 8.1 | 8.1 |
| 本发明3 | 7.8 | 7.7 | ||
| 本发明3-/-甘氨酸： | ||||
| +肌氨酸80g/l | 7.5 | 7.5 | ||
| +肌氨酸160 | 8.1 | 7.6 | ||
| +甜菜碱80 | 8.4 | 7.1 | ||
| +甜菜碱160 | 8.1 | 7.1 | ||
| +二甘氨酸80 | 7.9 | 7.3 | ||
| +二甘氨酸160 | 8.0 | 7.7 | ||
| +胆碱80 | 7.9 | 6.9 | ||
| +胆碱160 | 7.5 | 5.7 | ||
| PRV03M | 常规稳定剂 | 9.0 | 8.1 | 7.6 |
| 本发明3 | 7.6 | 7.0 | ||
| 本发明3-/-甘氨酸： | ||||
| +肌氨酸80g/l | 7.8 | 7.4 | ||
| +肌氨酸160 | 8.2 | 7.2 | ||
| +甜菜碱80 | 7.2 | 6.8 | ||
| +甜菜碱160 | 7.4 | 7.1 | ||
| +二甘氨酸80 | 7.6 | 7.4 | ||
| +二甘氨酸160 | 8.2 | 8.3 | ||
| +胆碱80 | 7.3 | 6.7 | ||
| +胆碱160 | 7.4 | 5.7 | ||
表12：缓冲剂pH的影响
所用的微生物：BHV
所用的稳定剂组合物：
“本发明3”和“常规稳定剂”(参见表9)
“本发明3”稳定剂的改进
| 化合物 | g/l(4x浓缩) | |
| 缓冲剂 | Na2HPO4二水合物 | 1 |
| 或Tris HCl-柠檬酸盐 | 50mM-10mM | |
| 糖 | D-山梨糖醇 | 7 5 |
| 氨基酸 | Na-L-谷氨酸盐单水合物 | 20 |
| 和甘氨酸 | 160 | |
| 多胺 | 无 | 0 |
PH的变化示于下表中：
| 病毒滴定度(log10TCID50/瓶) | ||||
| 冻干前的湿滴定度 | 冻干后的滴定度 | |||
| 所用的病毒和实验编号 | 稳定剂 | 直接 | 28℃3天 | |
| BHV03U | 常规稳定剂，pH 7.1 | 8.8 | 8.0 | 7.8 |
| 常规稳定剂，pH 7.4 | 7.6 | 7.9 | ||
| 本发明3，pH 6.9 | 7.9 | 7.3 | ||
| 本发明3，pH 7.4 | 7.9 | 6.5 | ||
| 本发明3-/-磷酸盐+Tris/柠檬酸盐，pH 6.9 | 8.0 | 6.9 | ||
| 本发明3-/-磷酸盐+Tris/柠檬酸盐，pH 7.4 | 8.2 | 6.7 | ||
表13：大肠杆菌的稳定
所用的微生物：大肠杆菌K12
所用的稳定剂组合物：“本发明1”(参见表9)。为了比较，使用含有白蛋白的标准细菌稳定剂。将其表示为“bac stab”。
| 菌落形成单位 | |||
| 培养基 | 稳定剂 | 冻干前 | 冻干后直接 |
| LB | bac stab | 31×1010 | 6.5×108 |
| 本发明1 | 2.4×109 | ||
| LB amp | bac stab | 3×1010 | 3.5×108 |
| 本发明1 | 2.4×109 | ||
| 血液琼脂 | bac stab | 2.7×1011 | 3.4×109 |
| 本发明1 | 2.1×1010 | ||
表14：不同细菌的稳定
所用的微生物：不同的细菌
所用的稳定剂组合物：“本发明1”和“本发明3” (参见表9)。为了比较，使用含有白蛋白的标准细菌稳定剂。将其表示为“bac stab”。
| 回收％ | 饼状物质量 | |||
| 细菌，起始CFU/ml | 稳定剂 | 冷冻后直接 | 28℃3天后 | |
| 大肠杆菌K12，2.4×109 | 无 | 13 | 9 | |
| 本发明1 | 33 | 1 | 0 | |
| 本发明3 | 48 | 9 | 0 | |
| 鸡沙门氏菌，4.0×109 | 无 | 24 | 16 | |
| 本发明1 | 18 | 14 | + | |
| 本发明3 | 34 | 17 | + | |
| bac stab | 100 | 57 | + | |
| 马链球菌，1.2×109 | 无 | 56 | 27 | 0 |
| 本发明1 | 60 | 6 | 0 | |
| 本发明3 | 39 | 15 | + | |
| bac stab | 58 | 29 | + | |
| 肉葡萄球菌，2.4×109 | 无 | 57 | 65 | 0 |
| 本发明1 | 64 | 67 | 0 | |
| 本发明3 | 61 | 57 | 0 | |
1.含有至少一种氨基酸、至少一种糖和至少一种多胺：的疫苗稳定剂组合物，其中所有化合物是化学限定的，因此无血清、无蛋白质、无动物化合物、无仅已知平均分子量或平均侧链长度的聚合物并且无蛋白质溶解产物、提取物水解产物或肽混合物，其特征在于所述多胺是选自乙二胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺中的至少一种。
2.根据权利要求1的稳定剂组合物，其中所述糖是选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨糖醇和甘露醇中的至少一种。
3.根据权利要求1或2任一项的稳定剂组合物，其中所述氨基酸是谷氨酸或甘氨酸，或其中包括这两种氨基酸。
4.根据权利要求1至3任一项的稳定剂组合物，其中所述组合物是缓冲的水溶液。
5.根据权利要求4的稳定剂组合物，其中缓冲剂是基于磷酸盐的。
6.含有根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物和至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的疫苗组合物。
7.根据权利要求6的疫苗组合物，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
8.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中所述生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
10.根据权利要求9的疫苗组合物，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
11.根据权利要求6至10任一项的疫苗组合物，其中所述生物分子或微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
12.根据权利要求6至11任一项的疫苗组合物，另外含有佐剂。
13.根据权利要求6至12任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是冻干形式的。
14.通过将根据权利要求13的冻干疫苗组合物在药物学上可接受载体中重配可获得的疫苗溶液。
15.制备药物组合物的方法，包括将根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物与含有至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的组合物混合。
16.根据权利要求15的方法，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
17.根据权利要求16的方法，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
18.根据权利要求15的方法，其中所述生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
19.根据权利要求18的方法，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
20.根据权利要求15至19任一项的方法，其中所述生物分子或所述微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
21.根据权利要求15至20任一项的方法，其中使所得到的药物组合物进行冷冻干燥。
22.通过权利要求15至21任一项的方法可获得的药物组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
23.通过将根据权利要求22的药物组合物在药物学上可接受载体中重配来制备疫苗溶液的方法。
24.根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物的用途，用于稳定疫苗组合物中至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的质量和/或数量。
25.根据权利要求24的用途，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
26.根据权利要求25的用途，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
27.根据权利要求24的用途，其中所述生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
28.根据权利要求27的用途，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
29.根据权利要求24至28任一项的用途，其中所述生物分子或所述微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
30.根据权利要求14的疫苗组合物或通过权利要求23的方法可获得的疫苗溶液的用途，用于免疫目标人类或动物。
Claims (30)
1.含有至少一种氨基酸、至少一种糖和至少一种多胺的稳定剂组合物，其中所有成分是化学限定的，其特征在于多胺是选自乙二胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺中的至少一种。
2.根据权利要求1的稳定剂组合物，其中所述糖是选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨糖醇和甘露醇中的至少一种。
3.根据权利要求1或2任一项的稳定剂组合物，其中所述氨基酸是谷氨酸或甘氨酸，或其中包括这两种氨基酸。
4.根据权利要求1至3任一项的稳定剂组合物，其中所述组合物是缓冲的水溶液。
5.根据权利要求4的稳定剂组合物，其中缓冲剂是基于磷酸盐的。
6.含有根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物和至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的疫苗组合物。
7.根据权利要求6的疫苗组合物，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
8.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中所述生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
10.根据权利要求9的疫苗组合物，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
11.根据权利要求6至10任一项的疫苗组合物，其中所述生物分子或所述微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
12.根据权利要求6至11任一项的疫苗组合物，另外含有佐剂。
13.根据权利要求6至12任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是冻干形式的。
14.通过将根据权利要求13的冻干疫苗组合物在药物学上可接受载体中重配可获得的疫苗溶液。
15.制备药物组合物的方法，包括将根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物与含有至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的组合物混合。
16.根据权利要求15的方法，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
17.根据权利要求16的方法，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RNA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
18.根据权利要求15的方法，其中所述生物分子是选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
19.根据权利要求18的方法，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
20.根据权利要求15至19任一项的方法，其中所述生物分子或所述微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
21.根据权利要求15至20任一项的方法，其中使所得到的药物组合物进行冷冻干燥。
22.通过权利要求15至21任一项的方法可获得的药物组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
23.通过将根据权利要求22的药物组合物在药物学上可接受载体中重配来制备疫苗溶液的方法。
24.根据权利要求1至5任一项的稳定剂组合物的用途，用于稳定组合物中至少一种生物分子或至少一种微生物或其组合的质量和/或数量。
25.根据权利要求24的用途，其中所述微生物是病毒或细菌，或其中包括病毒和细菌两者。
26.根据权利要求25的用途，其中所述病毒是选自疱疹病毒、副粘病毒、正粘病毒、腺病毒、棒状病毒、双RMA病毒、冠状病毒、肺病毒和痘病毒中的至少一种病毒种类。
27.根据权利要求24的用途，其中所述生物分子选自蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸中的至少一种。
28.根据权利要求27的用途，其中所述蛋白质是选自抗体、抗体片段、细胞因子、激素和酶中的至少一种。
29.根据权利要求24至28任一项的用途，其中所述生物分子或所述微生物，或两者，是以无动物成分形式生产的。
30.根据权利要求14的疫苗组合物或通过权利要求23的方法可获得的疫苗溶液的用途，用于免疫目标人类或动物。
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