BRPI0609278A2 - composição, solução de vacina, métodos para preparar uma composição farmacêutica, e uma solução de vacina, e, usos de uma composição estabilizante, e de uma composição de vacina - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçãO, SOLUçãO DE VACINA, MéTODOS PARA PREPARAR UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E UMA SOLUçãO DE VACINA, E, USOS DE UMA COMPOSIçãO ESTABILIZANTE, E DE UMA COMPOSIçãO DE VACINA. A presente invenção refere-se a uma composição estabilizante compreendendo um aminoácido e um açúcar, em que todos os compostos são quimicamente definidos; a uma composição de vacina compreendendo tal composição estabilizante e uma molécula biológica e/ou um microorganismo; a um método para preparar uma composição farmacêutica, compreendendo misturar tal composição estabilizante com uma molécula biológica e/ou um microorganismo; ao uso de tal composição estabilizante e de vacinas preparadas com ela.

Description

"COMPOSIÇÃO, SOLUÇÃO DE VACINA, MÉTODOS PARAPREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E UMA SOLUÇÃODE VACINA, E, USOS DE UMA COMPOSIÇÃO ESTABILIZANTE, E DEUMA COMPOSIÇÃO DE VACINA"
A presente invenção refere-se a uma composição estabilizantecompreendendo um aminoácido e um açúcar, em que todos os compostos sãoquimicamente definidos; a uma composição de vacina compreendendo talcomposição estabilizante e uma molécula biológica e/ou um microorganismo;a um método para preparar uma composição farmacêutica, compreendendoadministrar tal composição estabilizante com uma molécula biológica e/ouum microorganismo; ao uso de tal composição estabilizante e de vacinaspreparadas com ela.
Na indústria biofarmacêutica, envolvida na produção demicroorganismos e moléculas biológicas como produtos, a estabilidade destesprodutos é um problema principal. Quase sempre estes produtos necessitamser formulados, armazenados e transportados. Inevitavelmente, porinfluências experimentadas, durante o tempo, de mudanças de temperatura eoutras influências físicas ou químicas, os materiais produzidos perdem suaquantidade eficaz original ou propriedades qualitativas desejadas.Conseqüentemente, condições e aditivos para evitar tal perda de qualidadee/ou de quantidade eficaz são aplicados.
Condições de estabilização muito usadas são armazenagem emtemperatura reduzida, acima ou abaixo de zero 0C e redução do teor de água;especialmente útil é a secagem por congelamento.
Na secagem por congelamento, uma amostra contendo umamolécula biológica ou farmaceuticamente ativa, um microorganismo, umacélula ou um tecido é primeiro congelada e então secada sob vácuo. Asamostras secadas por congelamento podem então ser armazenadas, p. ex., a 4°C e com freqüência permanecem estáveis por anos. Vide para recapitulação:Μ. Pikal, 1990 (BioPharm, vol. 3, no. 8, ρ. 18-27 e no. 9, ρ. 26-30); L Gatlin,et al., 1994 (Bioprocess Techn., vol. 18, p. 317-367); J. Carpenter et al., 1997(Pharm. Research, vol. 14, p. 969-975); F. Bedu-Addo, 2004 (Pharm. Techn.,1 de fevereiro, p. 10-18). Idealmente, um produto secado por congelamentotem uma qualidade e quantidade quase imutadas do(s) componente(s)secado(s) por congelamento durante um certo período de tempo, bem comoum corpo ou torta secado por congelamento de aparência atrativa e elegante,que pode resistir às influências físicas de transporte e que se dissolverapidamente na reconstituição em um diluente.
Para obterem-se todos estes requisitos para uma amostra secadapor congelamento e para fazer a amostra 'sobreviver' às várias condiçõesdesfavoráveis que ocorrem durante o próprio processo de secagem porcongelamento (congelamento, secagem, aquecimento, esfriamento), aarmazenagem prolongada em estado de secado por congelamento e areconstituição, a amostra a ser secada por congelamento é usualmente misturadacom uma composição estabilizante antes da secagem por congelamento.
Os compostos de uma composição estabilizante sãocomumente denominados: agente de encorpamento, formador de torta,lioprotetor, modificador da tonicidade, surfactante, protetor crio(gênico),protetor de congelamento, dessecante, agente liofilizante etc., em que umcomposto específico pode ter diversas funções.
O termo "soluto compatível" é também usado para indicar umcomposto que estabiliza moléculas e organismos em condições de um meio-ambiente de baixo teor de água (M.S. da Costa et al. 1998, Adv. Bioch. Engand Techn., vol. 61, ρ. 117 - 153).
As composições estabilizantes, para secagem porcongelamento ou para outros usos de estabilização, são misturas complexasde proteínas, carboidratos, lipídeos e sais; cuja composição pode ser adaptadapara cada molécula ou microorganismo a ser estabilizado ou para umafinalidade específica.
Embora seja raramente sabido como um estabilizante funcionaexatamente, o achado comum é que os grandes compostos de elevado pesomolecular geralmente fornecem bons efeitos estabilizadores. Portanto, osingredientes principais antigos usados em estabilizadores foram taiscompostos volumosos. Para manter baixos os custos de materiais, eles foramtirados de produtos prontamente disponíveis de origem animal, p. ex., leite empó, triptose, gelatina, albumina do soro, colágeno, hidrolisado de caseína,sulfato de condroitina etc.
Infelizmente, o uso de tais compostos de origem animalintroduz potencialmente o risco de contaminação com agentes estranhos deum produto de outro modo estéril ou controlado. Esta tem sido a preocupaçãoprincipal desde a descoberta de doenças zoonóticas de intra-espécies e dasrecentemente descobertas doenças relacionadas com priônio. Como resultado,as autoridades reguladoras exigiram extenso teste de segurança dos produtosbiológicos (estabilizados) quanto à ausência de agentes estranhos, antes daliberação no mercado.
Isto resultou no abandono do uso de tais componentes animais,inicialmente somente nos meios de cultura usados na produção das moléculasbiológicas ou microorganismos. Por exemplo, B. Makoschey et al. (2002,Cytotechnology vol. 39, p. 139-145), descreve um estabilizante de secagempor congelamento, para uso na estabilização de vírus que tinham sidoproduzidos livres de soro; o estabilizante consistia de açúcares, aminoácidos,gelatina e peptídeos de um hidrolisado de proteína de origem animal.
Mais tarde, também os estabilizadores que foram usados apósa produção foram modificados em sua composição; como resultado, foramdesenvolvidas composições de estabilizadores que são: livre de soro (semsoro animal); livre de proteína (sem proteína animal, porém podem conteroutros componentes derivados de animal) ou mesmo livre de compostoanimal (ACF) (não contendo qualquer componente derivado de um animal).
Entretanto, nas composições estabilizantes permaneceu anecessidade de grandes moléculas de elevado peso molecular para seu efeitoestabilizante. Portanto, os compostos volumosos para estabilizantes ACFforam obtidos, por exemplo, de origem de plantas ou microbianas, tais como:oleato de levedura, peptona de soja, gelatina recombinante, (hidróxi-etil)amido, alginato etc.
Alternativamente, grandes compostos poliméricos de origemnatural ou sintética são empregados, tais como: polissacarídeos,polivinilpirrolidona, ficol, poli-lisina, polietileno glicol, (carbóxi) metil celulose,dextrano, poli-sorbatos (p. ex., Tween® 80 etc. Por exemplo, T. Osterberg et al.(1997, Pharm. Res., vol. 14, p. 892-898), substituiu albumina do soro porTween® 80 como composto estabilizante para proteína de Fator VIII.
Há entretanto diversos problemas, mesmo com estescompostos estabilizantes ACF. Por exemplo, diversos destes compostosestabilizadores não são resistentes a esterilização por calor e, em razão de aesterilidade da composição estabilizante ser com freqüência uma exigênciaabsoluta, a única outra maneira para conseguir-se isto é então pelo processomais tedioso de esterilização por filtro.
Caso o produto estabilizado seja também para ser administradoa um humano ou animal alvo, parte dos compostos estabilizantes ACF nãopode ser usada visto que eles são tóxicos ou podem causar reações alérgicas.
O problema mais proeminente, entretanto, em todos estescasos, é que as composições estabilizantes, mesmo quando ACF aindacompartilham da desvantagem comum de conterem ou consistirem deconstituintes desconhecidos, heterogêneos e maus-definidos. Por exemplo, acomposição dos hidrolisados de produtos vegetais naturais não é em absolutoconhecida. Similarmente, para as estruturas poliméricas mencionadas, suaestrutura química é somente conhecida em termos gerais; os compostosusados são somente definidos pelo fato de terem um tamanho molecularmédio ou um comprimento médio das cadeias laterais. Estas moléculas,portanto, realmente compreendem uma família de estruturas químicas comuma larga variedade de moléculas.
Tais compostos, portanto, ainda são de natureza mau definidae têm variação lote-a-lote. Isto requer seleção cuidadosa dos compostos departida para bateladas adequadas para produção de uma composiçãoestabilizante. As bateladas dos compostos que têm a desejada qualidade entãotêm limitada disponibilidade.
O uso de tais compostos maus definidos nas composiçõesestabilizantes causa variações desconhecidas e incontroláveis na composição,qualidade e produção dos produtos que são estabilizados por estascomposições.
Tal qualidade de produto incontrolável é altamente indesejávelem uma indústria que está tentando produzir produtos consistentes, seguros ede alta qualidade e que pode somente ser superada por procedimentosdispendiosos e demorados para seleção de matérias primas, verificação demercadorias entrantes, liberação de produto e controle de qualidade doproduto final.
O objetivo da invenção é fornecer uma composiçãoestabilizante alternativa e aperfeiçoada, que não se ressinta destasdesvantagens da arte anterior.
Surpreendentemente, constatou-se que uma composiçãoestabilizante, compreendendo pelo menos um aminoácido e pelo menos umaçúcar, em que todos os compostos são quimicamente definidos, podefornecer estabilização eficiente da qualidade e da quantidade das moléculasbiológicas e de microorganismos, sem necessidade de compostos de grandescompostos de elevado peso molecular, ou maus definidos. Isto fornece muitasvantagens em relação à arte anterior.A composição estabilizante da invenção é livre de soro, livrede proteína e livre de composto animal e, portanto, não introduz agentesestranhos dentro do produto controlado que é para ser estabilizado. Acomposição estabilizante obvia a necessidade de incorporação de compostosmaus definidos, heterogêneos ou desconhecidos, isto resultando emestabilização de produto, resultando em produtos finais previsíveis econtroláveis. Ambos os aspectos reduzem as exigências de controle dosprodutos finais quanto à qualidade e agentes estranhos.
A composição estabilizante compreende somente compostosexatamente conhecidos, não se ressentindo de variação lote-a-lote ou limitadadisponibilidade de bateladas com requeridas características favoráveis. Istoreduz as exigências para controle de entrada e seleção dos materiais departida. Além disso, a composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção não é tóxica a humanos ou animais alvo e é esterilizável pelo calor.
A composição estabilizante fornece boa estabilização demoléculas biológicas e de microorganismos contra influências físicas equímicas, em particular estabiliza a qualidade e quantidade eficaz de taisamostras contra as influências negativas experimentadas durante o tempo eatravés de mudanças de temperatura.
Quando usadas em secagem por congelamento, a composiçãoestabilizante estabiliza as moléculas biológicas e os microorganismos emrelação às condições de processamento de congelamento, secagem,aquecimento, esfriamento, bem como em relação a quaisquer influênciasnegativas durante armazenagem prolongada em estado secado porcongelamento e na reconstituição.
A composição estabilizante também fornece um corpo ou tortasecado por congelamento, que é de aparência atrativa e elegante, que poderesistir às influências físicas de transporte e que dissolve-se rapidamente nareconstituição em um diluente.Portanto, a invenção refere-se a uma composição estabilizantecompreendendo pelo menos um aminoácido e pelo menos um açúcar,caracterizada pelo fato de que todos os compostos são quimicamentedefinidos.
Uma "composição estabilizante" é definida como umacomposição que, quando misturada com moléculas biológicas oumicroorganismos tem efeito estabilizante; isto é, a composição estabilizantepode evitar, em um grande grau, a perda de qualidade ou a quantidade efetivade amostras contendo moléculas biológicas e/ou microorganismos.
A "quantidade efetiva" é, por exemplo, a quantidade demoléculas biológicas biológica ou farmaceuticamente ativas ou o número demicroorganismos vivos ou infecciosos.
A "perda de qualidade" poderia de outro modo ter ocorrido porinfluências físicas e/ou químicas, tais como durante o tempo por variação datemperatura, influências mecânicas (p. ex., transporte) e/ou mudanças daforma física (p. ex., congelamento, secagem).
A composição estabilizante pode ser na forma de uma soluçãoaquosa, um concentrado aquoso ou pode ser provida como uma mistura secade produtos químicos adequados para preparar uma solução aquosa ou umconcentrado aquoso da composição estabilizante de acordo com a invenção.
As moléculas biológicas e/ou os microorganismos que sãopara ser estabilizados podem eles próprios ser em forma líquida, seca,congelada ou secada por congelamento antes da mistura com a composiçãoestabilizante.
Os microorganismos podem ser vivos ou mortos, p. ex., comoresultado de inativação deliberada.
Um "açúcar" é geralmente sabido ser um compostofornecendo um gosto doce ou adocicado e, mais especificamente, é umcarboidrato tal como um mono ou dissacarídeo, um álcool de açúcar ou umpoliol e seus derivados.
Para a invenção, um composto é "quimicamente definido"quando consistir exclusivamente de idênticas moléculas.
Tal composto quimicamente definido, portanto, tem umaestrutura química especificamente conhecida, não-ambígua e uniforme e éusado em uma quantidade especificamente conhecida.
Um composto quimicamente definido do estabilizante deacordo com a presente invenção, portanto, não é um composto mau-definido,heterogêneo ou desconhecido, tal como um lisado, extrato, hidrolisadoprotéico ou mistura de peptídeo. Também nenhum composto polimérico écompreendido na composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção, da qual somente um peso molecular médio ou um comprimentomédio das cadeias laterais é conhecido.
Um composto quimicamente definido do estabilizante deacordo com a presente invenção é prontamente disponível em fornecedorescomerciais de produtos químicos finos; preferivelmente, a mais elevadapureza é empregada. Entretanto, a exigência de ser quimicamente definidonão exclui a presença de quantidades traço de impurezas em tal composto.Tais impurezas são, por exemplo, metais pesados, resíduos, solventes ousimilares. Preferivelmente, tais impurezas estão presentes em uma quantidademenor do que 1 % em peso do composto quimicamente definido, maispreferivelmente menor do que 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,0001 % em peso.
Preferivelmente, a exigência de ser quimicamente definidorefere-se às moléculas do composto do estabilizante de acordo com a presenteinvenção, quando em forma ionizada em uma solução aquosa.Conseqüentemente, em uma forma de realização preferida, tal compostoquimicamente definido pode, em sua forma sólida ou não-ionizada, estarpresente em diferentes formas de sal ou em formas tendo um diferentenúmero de moléculas ligadas de água cristalização (formas de hidrato).Preferivelmente, a composição estabilizante de acordo com apresente invenção fornece estabilização de moléculas biológicas e/oumicroorganismos em pelo menos o mesmo nível que os estabilizantes da arteanterior compreendendo compostos maus-definidos. Preferivelmente, aperda de título quando empregando-se a composição estabilizante de acordocom a presente invenção para estabilização de um produto contendo ummicroorganismo vivo, é menor do que 1 Logi0. Mais preferivelmente, menordo que 0,5 Log10.
Entretanto, isto não é sempre necessário: para algumasaplicações não tendo compostos maus definidos no estabilizante e,conseqüentemente, no produto final, é de importância esmagadora; umaprodução de qualidade e/ou quantidade ligeiramente mais baixas, resultantedo uso da composição estabilizante de acordo com a presente invenção, é,nesse caso, perfeitamente aceitável na troca pelas muitas vantagens que istooferece em relação aos estabilizantes da arte anterior.
Este é por exemplo o caso quando o estabilizante de acordocom a presente invenção é para ser usado como estabilizante paraarmazenagem de longo termo de material semente de microorganismos, talcomo em estoques de glicerol. Nesse caso, a estabilização ACF por umestabilizante totalmente definido pode ser mais importante e uma perda detítulo de até 2 Logi0 pode ser aceitável, visto que tal material sementenormalmente será cultivado na quantidade certa para inoculação de uma novacultura de qualquer maneira.
Além disso, uma pessoa hábil é perfeitamente capaz de maisotimizações para, por exemplo, a composição da composição estabilizante deacordo com a presente invenção, ou as condições para seu uso, porexperimentação de rotina. Portanto tais composições e condições otimizadasestão dentro do escopo da invenção.
Para avaliar o nível de estabilização, correspondendo àquantidade e qualidade efetiva restante do produto estabilizado, qualquertécnica adequada pode ser usada. Por exemplo, a quantidade e virulência (emconseqüência a qualidade) dos compostos virais e bacterianos podem serquantificadas por titulação ou diluição limitativa; as moléculas biológicaspode ser detectadas bioquímica (p. ex., enzimática, imunológica (teste deimuno-fluorescência) ou fisicamente (p. ex., eletroforese, cromatografia ouespectrometria de massa). Todas estas técnicas são bem conhecidas edisponíveis na arte.
Em uma forma de realização preferida, a composiçãoestabilizante de acordo com a presente invenção adicionalmente compreendepelo menos uma poliamina.
Uma "poliamina" é definida como um composto com dois oumais amino grupos.
Em formas de realização mais preferidas, a invenção refere-sea uma composição estabilizante de acordo com a presente invenção:
em que o açúcar é pelo menos um selecionado do grupoconsistindo de glicose, lactose, sacarose, maltose, trealose, sorbitol e manitol;
em que a poliamina é pelo menos uma selecionada dogrupo consistindo de etileno-diamina, cadaverina, putrescina, espermidina eespermina;
em que o aminoácido é glutamato (ácido glutâmico) ouglicina ou em que ambos estes aminoácidos estão compreendidos.
Em uma outra forma de realização mais preferida, acomposição estabilizante de acordo com a presente invenção é uma soluçãoaquosa tamponada; preferivelmente, a solução aquosa é tamponada entre pH 6- 8, mais preferivelmente cerca de pH 6,9.
O tampão pode, por exemplo, ser Tris / citrato,preferivelmente em uma concentração de cerca de 50 mM /10 mM.
Preferivelmente, o tampão é baseado em fosfato, maispreferivelmente diidrato de fosfato di-sódico.
Preferivelmente, o tampão está presente em uma quantidadeentre 0,1 e 100 g/l, mais preferivelmente de cerca de 1 g/l.
Em uma forma de realização mais preferida alternativa, asolução aquosa da composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção é uma solução concentrada, compreendendo os compostos dacomposição estabilizante em uma concentração que é mais elevada do que aconcentração em que estes compostos estarão na composição farmacêuticafinal, que é formada na mistura da composição estabilizante de acordo com apresente invenção com as moléculas biológicas ou os microorganismos quesão para ser estabilizados.
Preferivelmente, a composição estabilizante é 2x, 3x, 4x, 5x,10 ou 20x concentrada, em comparação com a concentração ou a quantidadeda composição farmacêutica final; mais preferivelmente, a composiçãoestabilizante é 4x concentrada.
Em uma forma de realização mais preferida, uma composiçãoseca de produtos químicos é provida que é adequada para dissolver em umsolvente apropriado, para preparar uma solução aquosa ou um concentrado dacomposição estabilizante da invenção.
Prover uma mistura seca de produtos químicos para dissoluçãoposterior tem as vantagens de armazenagem em um volume menor. Istoeconomiza o espaço de armazenagem e facilita o transporte e as vendas.
Mesmo mais preferivelmente, na composição estabilizante deacordo com a presente invenção:
- o açúcar é sacarose, sorbitol ou manitol; preferivelmentesorbitol; mais preferivelmente D-sorbitol;
- o aminoácido é glutamato ou glicina; mais preferivelmenteL-glutamato; mesmo mais preferivelmente tanto L-glutamato como glicinaestão compreendidos;uma combinação de poliaminas é usada; maispreferivelmente espermina e putrescina, ou espermina e etileno diamina.
Em uma outra forma de realização mais preferida dacomposição estabilizante de acordo com a presente invenção, o concentrado4x compreende:
- o açúcar em uma quantidade entre 10 e 200 g/l,preferivelmente a cerca de 75 g/l;
- o aminoácido em uma quantidade entre 0,1 e 400 g/l;preferivelmente L-glutamato está incluído a cerca de 20 g/l ou glicina estáincluída a cerca de 160 g/l;
a poliamina em uma quantidade entre 0,1 e 100 g/l;preferivelmente espermina está incluída a cerca de 10 g/l ou espermidina estáincluída a cerca de 2,5 g/l.
Em uma outra forma de realização preferida, a composiçãoestabilizante de acordo com a presente invenção compreende um açúcar eglutamato como aminoácido e, adicionalmente, compreende pelo menos umsoluto compatível. O soluto compatível preferivelmente é pelo menos umselecionado do grupo consistindo de sarcosina, betaína, di-glicina e colina. Osoluto compatível do concentrado 4x está preferivelmente presente em umaquantidade entre 0,1 a 400 g/l; preferivelmente entre 50 - 200 g/l, maispreferivelmente a cerca de 160 g/l.
Como resumido acima, é irrelevante em que forma de sal ouhidrato um composto da composição estabilizante é usado; por exemplo,espermina pode ser usada nas formas de: espermina; diidrato de espermina outetra-cloridreto de espermina; similarmente, a espermidina pode serempregada como espermidina ou tricloridreto de espermidina.
Como o estabilizante de acordo com a presente invenção édestinado a ser misturado com moléculas biológicas e/ou microorganismos,em alguns usos os compostos do estabilizante podem ser parte de um produtoque é administrado a um humano ou animais alvo. Portanto, os compostos dacomposição estabilizante de acordo com a presente invenção preferivelmentesão não-tóxicos, pelo menos: não-tóxico nas concentrações presentes noproduto final a ser administrado.
Preferivelmente, os compostos da composição estabilizante deacordo com a presente invenção não induzem uma reação alérgica indesejada.
Preferivelmente, a composição estabilizante de acordo com apresente invenção é estéril. A esterilização do estabilizante de acordo com apresente invenção pode ser conseguida por calor, filtragem, irradiação ouqualquer técnica adequada conhecida na arte. Preferivelmente, a composiçãoestabilizante é esterilizada pelo calor.
Por meio de exemplos não-limitantes, compostosquimicamente definidos, adequados para uso na composição estabilizante deacordo com a presente invenção, são listados na Tabela 1
Tabela 1: Compostos quimicamente definidos, adequados parauso na composição estabilizante de acordo com a presente invenção
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Como é sabido na arte, os derivados dos compostos aquidescritos da composição estabilizante de acordo com a presente invenção sãodisponíveis ou podem ser sintetizados. Tais derivados são também adequadospara uso como compostos da composição estabilizante de acordo com apresente invenção. Portanto, tais derivados estão dentro do escopo dainvenção.
Tabela 2: Resumo das composições estabilizantes preferidas emais preferidas de acordo com a presente invenção.
As quantidades dadas correspondem àquelas de umconcentrado 4x:
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Um grande número de experimentos foi realizado com ascomposições estabilizantes de acordo com a presente invenção. Estas foramprojetadas para incorporar todas as condições sob as quais a composiçãoestabilizante de acordo com a presente invenção fornece estabilização efetiva:esfriamento; para armazenagem de produto(em massa) emforma líquida em, p. ex., 4 °Ccongelamento; para armazenagem de produto(em massa)extremamente congelado, em p. ex., -20 °C ou -45 °C
- secagem por congelamento; incorporando: secagem,aquecimento esfriamento
congelamento de produto secado por congelamento; paraarmazenagem extremamente congelada em, p. ex., -20 °C ou -45 °C
esfriamento de produto secado por congelamento; paraarmazenagem a 4°C
aquecimento do produto secado por congelamento atemperaturas acima da temperatura ambiente e
reconstituição de produto secado por congelamento em umdiluente.
Quando estes experimentos foram realizados comcomposições estabilizadas compreendendo microorganismos, o númerorestante dos microorganismos infecciosos nos produtos reconstituídos foideterminado usando-se técnicas de quantificação bem conhecidas, baseadasem titulação ou diluição limitadora. Quando realizado com moléculasbiológicas, a qualidade e quantidade foi determinada usando-se ensaiosespecíficos, tais como titulação, Elisa ou bioensaios.
Estes experimentos e seus resultados são resumidos nosexemplos e mostram que a composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção fornece eficiente estabilização de microorganismos e ou moléculasbiológicas, não somente para os vários usos na ou em torno da secagem porcongelamento, porém também para estabilização de antígeno em massa emarmazenagem esfriada ou congelada, antes ou em vez da secagem porcongelamento.
Em uma forma de realização alternativa, a composiçãoestabilizante da invenção é caracterizada pelo fato de que não seremcompreendidos compostos de elevado peso molecular ou grande tamanho.
Para a invenção, "elevado peso molecular" e compostos"grandes" são definidos como qualquer composto tendo um peso molecularou tamanho do íon molecular que exceda 203 Da. Por exemplo, a esperminanão seria um tal composto grande, visto que seu íon molecular tem um pesomolecular de somente 202 Da, quando excluindo qualquer água decristalização ou formas de sal, tais como hidratos ou (hidro) cloretos.
Como descrito acima, foi surpreendente descobrir que nenhumdos compostos volumosos, comumente usados na arte, são necessários paraobter-se eficiente estabilização, de fato nenhum composto maior do que aespermina sendo necessário.
As vantagens disto foram também mencionadas; os grandescompostos de elevado peso molecular com freqüência são maus-definidos eheterogêneos, ou pelo menos são compostos dos quais somente um tamanhomolecular médio ou um comprimento médio das cadeias laterais é conhecido.Conseqüentemente, tais compostos maus-definidos, usados em umacomposição estabilizante, resultará em um produto estabilizado comimprevisíveis características.
Em uma forma de realização preferida alternativa, a invençãorefere-se a uma composição de vacina compreendendo uma composiçãoestabilizante de acordo com a presente invenção e pelo menos uma moléculabiológica ou pelo menos um microorganismo, ou uma combinação deles.
Uma composição de vacina é comumente sabido na arterepresentar uma composição compreendendo um composto imunogênico emum veículo farmaceuticamente aceitável, composto imunogênico este sendocapaz de induzir uma ativação passiva ou ativa de um sistema imune alvo. Aresposta imune induzida significa interferir com o estabelecimento ou aprogressão de uma certa infecção ou melhorar os sintomas da doença.Um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, p. ex., águaestéril ou uma solução salina fisiológica estéril. Em uma forma maiscomplexa o veículo pode, p. ex., ser um tampão.
Uma "molécula biológica" para a invenção é entendida seruma molécula que pode ser encontrada na natureza; em particular esta refere-se a uma proteína, carboidrato, lipídeo ou ácido nucleico. A origem damolécula pode ser biológica ou sintética, derivada ex vivo ou ex vitro.
O termo "proteína" significa incorporar uma cadeia molecularde dois ou mais aminoácidos; portanto, os peptídeos, oligopeptídeos epolipeptídeos são incluídos dentro da definição de proteína.
A composição de vacina de acordo com a presente invençãopode ser em qualquer forma, p. ex.,: secada por congelamento, líquida oucongelada; ou pode ser formulada ou processada em um líquido, um gel, umapomada, um pó, um tablete, uma cápsula ou um corpo secado porcongelamento, dependendo do método de armazenagem desejado, dotransporte ou aplicação ao alvo.
A composição de vacina de acordo com a presente invençãopode compreender microorganismos imunogênicos únicos e moléculasbiológicas ou combinações deles.
Em formas de realização preferidas, a invenção refere-se auma composição de vacina:
em que o microorganismo é um vírus ou uma bactéria ouem que estão compreendidos tanto um vírus como uma bactéria; maispreferivelmente, o vírus é pelo menos uma espécie viral, selecionada do grupoconsistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-,pneumo- e poxivírus; mesmo mais preferivelmente o vírus é selecionado dogrupo consistindo de vírus do herpes bovino, vírus parainfluenza 3 bovino,vírus da pseudo-raiva, vírus sincicial respiratório humano e vírus da influenzahumano ou animal; mais preferivelmente, a bactéria é selecionada do grupoconsistindo da espécie bacteriana Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia,Micoplasma, Edwardsiella, Campylobacter e Salmonella.
em que a molécula biológica é pelo menos umaselecionada do grupo consistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeoe um ácido nucleico; mais preferivelmente, a proteína é pelo menos umaselecionada do grupo consistindo de um anticorpo, um fragmento deanticorpo, uma citocina, um hormônio e uma enzima.
Fragmentos de anticorpo são, p. ex., fragmentos Fab eanticorpos de cadeia única. Hormônios para uso com a composiçãoestabilizante da invenção são, por exemplo, insulina, hormôniosgonadotróficos tais como hormônio estimulante dos folículos, gonadrotrofinade córion e eritropoeitina.
As vacinas e composições estabilizantes da invenção sãoaplicáveis a uma larga variedade de vírus, de qualquer tipo genômico oumorfológico, infecciosos para qualquer espécie de animal, ou para humanos.Em particular, quaisquer resultados apresentados na estabilização de um vírusanimal particular podem ser extrapolados diretamente para predizer osresultados da estabilização do correspondente vírus infectante e outrasespécies hospedeiras, animal ou humana e outra espécie viral dentro de suafamília viral.
Os vírus tendo um envoltório viral são particularmentesensíveis a influências químicas e físicas. Conseqüentemente, como tais víruspodem ser efetivamente estabilizados pela composição estabilizante dainvenção, isto prova sua eficácia ainda mais.Tabela 3: Exemplos de vírus para uso com a composição estabilizante dainvenção
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* O vírus do herpes bovino é também conhecido como vírus da rinotraqueítebovina infecciosa
As bactérias para uso com o estabilizante de acordo com apresente invenção podem ser de qualquer tipo, por exemplo, comocaracterizado por manchamento Gram positivo ou Gram negativo.
Tabela 4: Exemplos de bactérias para uso com a composição estabilizante dainvenção:
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Os resultados obtidos na estabilização destas bactérias podemser extrapolados para outras espécies bacterianas dentro dos gênerosmencionados.
O sistema de produção usado para produzir moléculasbiológicas e microorganismos para uso com o estabilizante da invenção podeser qualquer sistema in vitro ou in vivo. Por exemplo, os vírus podem serproduzidos em uma cultura de células, em ovos de galinha fertilizados ou emum animal hospedeiro; as bactérias podem ser produzidas utilizando-setécnicas similares e, adicionalmente, em cultura de calda, e as moléculasbiológicas podem ser produzidas por isolamento de um animal oumicroorganismo, especialmente sistemas de expressão recombinante podendoser usados vantajosamente. Muitas outras formas de realização são conhecidasna arte.
Entretanto, a segurança e previsibilidade ótimas do produtofinal estabilizado são conseguidas removendo-se constituintes desconhecidos,heterogêneos e maus-definidos tanto do estágio de produção como dacomposição estabilizante.
Portanto, em uma forma de realização mais preferida dacomposição de vacina de acordo com a presente invenção, a moléculabiológica ou o microorganismo, ou ambos, foram produzidos livres decomponente animal.
Os sistemas de produção ACF, por exemplo, são culturasvirais de células de meio ACF; culturas bacterianas in uma calda de culturaACF; e culturas de expressão recombinante utilizando meio ACF, p. ex., osistema de expressão do baculovírus, empregando células de inseto.
Em uma outra forma de realização, a composição de vacina deacordo com a presente invenção adicionalmente compreende um adjuvante.
Os adjuvantes são comumente usados para reforçar a respostaimune a um componente de vacina, pelo estímulo do sistema imune de umhumano ou animal alvo, em uma maneira não-específica. Muitos diferentesadjuvantes são conhecidos na arte, por exemplo: óleos minerais ou biológicos,saponinas, peptídeos, alumina e derivados etc.
Em outra forma de realização preferida, a composição devacina de acordo com a presente invenção é secada por congelamento.
Em uma forma secada por congelamento, a composiçãoestabilizante da invenção será mais beneficiária; as composições de vacinasecadas por congelamento de acordo com a presente invenção são estáveis,por exemplo, a +4 0C por meses a diversos anos.
Os procedimentos para secagem por congelamento sãoconhecidos na arte; equipamento para secagem por congelamento emdiferentes escalas é disponível comercialmente. Tipicamente, as composiçõesde vacina compreendendo um estabilizante de acordo com a presenteinvenção são enchidas em recipientes, tais como frascos de vidro, a um certovolume, p. ex., entre 0,5 e 50 ml, preferivelmente 1, 2 ou 5 ml.Subseqüentemente, estes frascos são congelados e submetidos a um processode secagem por congelamento.
Um resumo de um processo de secagem por congelamentoexemplificativo compreende as etapas de:
congelar intensamente por 10-60 minutos, para fixar olíquido dentro de uma certa cultura;
primeira etapa de secar a -20 a 20 0C por 1-12 horas, emelevado vácuo, para sublimar a água cristalizada;
secagem secundária a 0 a 40 0C por Vi- 6 horas, em vácuomédio, para dessorver a água descongelada;
guarnecer os corpos secados por congelamento (p. ex.,fechAr os frascos de vidro com um tampão de borracha) para manter ascondições secas, p. ex., sob vácuo ou sob gás nitrogênio; emanter a + 4 0C.
A pessoa hábil na arte é muito bem capaz de variações eotimizações de rotina em tal processo, a fim de obter-se os melhoresresultados para um tipo específico de amostra.
O processo de secagem por congelamento pode ser otimizadomonitorando-se a temperatura e o conteúdo de água dentro aparelho durante asecagem. Calorimetria de varredura diferencial é também rotineiramenteusada para avaliar as características do produto antes e após a secagem porcongelamento.
O teor de água residual (rwc) no produto final é um importanteparâmetro determinando a estabilidade dos produtos secados porcongelamento. Preferivelmente, o rwc de amostras e vacinas secadas porcongelamento de acordo com a presente invenção é abaixo de 5%. Paradeterminar o rwc, a titulação Karl Fischer conhecida na arte podevantajosamente ser empregada.
Em uma outra forma de realização preferida, uma vacinasecada por congelamento de acordo com a presente invenção é preparada naforma de uma lioesfera, como descrito na patente Européia EP 799.613.
O corpo secado por congelamento, produzido de umacomposição de vacina de acordo com a presente invenção, pode ser emqualquer forma. A comercialmente disponível de acordo com a presenteinvenção fornece características beneficiárias à composição de vacina paraobter-se uma aparência elegante e atrativa do corpo secado por congelamento.Preferivelmente, a torta secada por congelamento dentro de um frasco devidro é de aparência brilhante e homogênea e, preferivelmente, permanecefixada à parede do frasco batendo-se de leve nele e não é tão quebradiça quese torne pulverizada sob condições normais de transporte.
Conseqüentemente, a aparência desejada do corpo de vacinasecado por congelamento não somente refere-se a características subjetivas ouestéticas, mas também compreende efeitos técnicos vantajosos genuínos; emparticular, a eficácia da estabilização, a resistência aos rigores de transporte ea velocidade de redissolução estão envolvidos.
De especial interesse é evitar uma aparência conhecida na artecomo "colapsada", visto que os corpos secados por congelamento, tendo umatal aparência amorfa e grumosa, redissolvem-se lenta e incompletamente enão fornecem adequada estabilização das moléculas biológicas e/oumicroorganismos que são para ser conservados.
Em uma outra forma de realização preferida, uma solução devacina pronta para uso é obtenível reconstituindo-se uma composição devacina secada por congelamento de acordo com a presente invenção em umveículo farmaceuticamente aceitável.Como as composições de vacina secadas por congelamento deacordo com a presente invenção se dissolvem rapidamente, preferivelmente areconstituição é realizada imediatamente antes de a solução de vacina seraplicada a um alvo. Isto determina que a solução de vacina esteja fresca e nadose e qualidade pretendidas.
A composição de vacina de acordo com a presente invençãopode ser administrada a um alvo humano ou animal de acordo com osmétodos conhecidos na arte. Por exemplo, por aplicações parenterais taiscomo através de todas as vias de injeção dentro ou através da pela: p. ex.,intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, sub mucosa, ousubcutânea. Vias alternativas de aplicação que são exeqüíveis são poraplicação tópica como uma gota, spray, gel ou pomada no epitélio mucoso doolho, nariz, boca, ânus ou vagina ou sobre a epiderme da pela externa, emqualquer parte do corpo; por spray como aerossol ou pó. Alternativamente, aaplicação pode ser via a rota alimentar, combinando-se com comida, alimentoou água potável, p. ex., como um pó, líquido ou tablete ou por administraçãodiretamente dentro da boca como um líquido, um gel, um tablete ou umacápsula ou no ânus como um supositório. Também pode ser aplicadavantajosamente vacinação por imersão.
As vias de aplicação preferidas são injeção intramuscular ousubcutânea, ou spray intranasal.
Não precisa ser dito que a via de aplicação ótima dependerádas particularidades específicas da infecção ou sintomas que são para serevitados ou melhorados, das características da formulação da vacina que éusada e das características particulares da espécie alvo.
O esquema da aplicação da composição de vacina de acordocom a presente invenção ao humano ou animal alvo pode ser em uma únicadose ou em múltiplas doses, que podem ser dadas ao mesmo tempo ouseqüencialmente, de uma maneira compatível com a dosagem e formulação eem uma tal quantidade que seja imunologicamente eficaz, por exemplo, comouma única dose anual.
Em uma forma de realização alternativa, a invenção refere-se aum método para preparar uma composição farmacêutica, compreendendoadministrar uma composição estabilizante de acordo com a presente invenção,com uma composição compreendendo pelo menos uma molécula biológica oupelo menos um microorganismo ou um combinação deles.
A composição farmacêutica preparada de acordo com ométodo da invenção pode ser em qualquer forma: líquida ou seca, congelada,secada por congelamento etc. A mistura pode ser realizada usando-sequalquer técnica adequada, disponível na arte.
Preferivelmente, o método de acordo com a presente invençãocompreende misturar uma parte da composição estabilizante de acordo com apresente invenção como uma solução tamponada aquosa estéril emconcentração de 4x, com 3 partes de uma composição compreendendo pelomenos uma molécula biológica e/ou pelo menos um microorganismo, paraproduzir uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.
A composição compreendendo pelo menos uma moléculabiológica ou pelo menos um microorganismo, ou uma combinação deles, queé para ser misturada com a composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção, é preferivelmente em forma líquida. Esta composição pode serobtida de uma cultura viral ou bacteriana, ou uma cultura de sistema deexpressão. Esta composição pode, por exemplo, ser obtida apósprocessamento a jusante, tal como centrifugação, p. ex., o sobrenadante decultura, ou a pelota centrifugada (ressuspensa) (compreendendo células oubactérias infectadas por vírus); ou a inteira cultura não processada pode serusada.
Preferivelmente, a mistura da composição estabilizante ecomposição compreendendo uma molécula biológica e/ou microorganismo deacordo com o método da invenção, é realizada pouco após a produção e oprocessamento a jusante ter terminado, a fim de obterem-se os melhoresresultados de estabilização.
Preferivelmente, a composição farmacêutica estabilizada assimobtida é então armazenada esfriada ou congelada, esperando maisprocessamento e os resultados do controle de qualidade da colheita daprodução.
Em formas de realização preferidas do método de acordo coma presente invenção:
o microorganismo é um vírus ou uma bactéria, ou tantoum vírus como uma bactéria são compreendidos.
o vírus é pelo menos uma espécie viral selecionada dogrupo consistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-,corona-, pneumo- e poxvírus.
a molécula biológica é pelo menos uma selecionada dogrupo consistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeo e um ácidonucleico.
a proteína é pelo menos uma selecionada do grupoconsistindo de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma citocina, umhormônio e uma enzima.
a molécula biológica ou o microorganismo, ou ambos,foram produzidos livres de componente animal.
a composição farmacêutica resultante é submetida asecagem por congelamento.
Em uma mais preferida forma de realização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica obtenível pelo método de acordo com apresente invenção, em que a composição é uma vacina.
Em uma mesmo mais preferida forma de realização, ainvenção refere-se a um método de preparar uma solução de vacina porreconstituição de uma composição farmacêutica de acordo com a presenteinvenção, em um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em uma outra forma de realização alternativa, a invençãorefere-se ao uso de uma composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção, para estabilizar a qualidade e/ou a quantidade de pelo menos umamolécula biológica ou pelo menos um microorganismo, ou uma combinaçãodeles, em uma composição.
Em formas de realização preferidas do uso de acordo com apresente invenção:
o microorganismo é um vírus ou uma bactéria, ou tantoum vírus como uma bactéria são compreendidos.
o vírus é pelo menos uma espécie viral selecionada dogrupo consistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-,corona-, pneumo- e poxvírus.
a molécula biológica é pelo menos uma selecionada dogrupo consistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeo e um ácidonucleico.
a proteína é pelo menos uma selecionada do grupoconsistindo de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma citocina, umhormônio e uma enzima.
a molécula biológica ou o microorganismo, ou ambos,foram produzidos livres de componente animal.
Em uma forma de realização mais preferida, a invenção refere-se ao uso de acordo com a presente invenção de uma solução de vacina deacordo com a presente invenção ou uma solução de vacina obtenível pelométodo da invenção, para imunização de um humano ou animal alvo.
A invenção será agora ainda descrita com referência aosseguintes exemplos não limitativos.
ExemplosComo mencionado acima, experimentos de secagem porcongelamento foram realizados incorporando todas as condições sob as quaisum estabilizante eficaz deve ser capaz de estabilizar: esfriamento,congelamento, secagem, aquecimento..
O resumo geral dos experimentos de secagem porcongelamento realizados em microorganismos estabilizantes é como segue:
as composições compreendendo microorganismos foramobtidas de uma cultura, processadas se necessário e armazenadas a 4 °C ouabaixo de zero °C.
uma composição estabilizante de acordo com a presenteinvenção foi preparada pesando-se os compostos necessários nas desejadasquantidades, adicionando-se estes a um volume requerido de água destiladaestéril e misturando-se até dissolver. A composição estabilizante foi entãoesterilizada por calor a 121 °C por 20 minutos.
no início do experimento, a amostra foi descongelada,misturada com um volume um estabilizante concentrado 4x, que era um terçodo volume da amostra. O estabilizante de acordo com a presente invenção ouas composições estabilizantes de referência foram usadas. Também amostrassem qualquer estabilizante foram incluídas nos experimentos.
as amostras estabilizadas foram colocadas dentro defrascos de vidro de 10 ml padrão em um certo volume de enchimento: vírusBHV e PI3 a 2 ml e PRV, mixoma vírus, BRSY, EIV e BCV a 1 ml. Asamostras bacterianas foram carregadas a 2,5 ml por frasco.
as amostras foram secadas por congelamento,empregando-se um programa de dois estágios padrão, em um teor de águaresidual abaixo de 5% e então seladas sob vácuo com um tampão de borracha.
subseqüentemente, as amostras foram armazenadas a 4°Cou em temperaturas mais elevadas por um certo período de tempo; osresultados das colunas "direto 4 0C" são resultados de titulações em amostrasarmazenadas a 4 °C por menos do que 1 mês após secagem por congelamento;os resultados das colunas "3 dias 28 °C" são resultados de titulação deamostras armazenadas a 28 °C por 3 dias, subseqüentemente a possívelarmazenagem a 4 °C após secagem por congelamento e então quantificadasimediatamente após estes três dias; os resultados das colunas "1 ano 4 °C" sãoresultados de filtragem de amostras armazenadas a 4 °C por pelo menos umano após a secagem por congelamento.
A armazenagem a 28 °C por três dias é incorporada como umensaio de estabilidade acelerado; na maioria das vezes estes resultados sãoindicativos das conseqüências de armazenagem durante tempo mais longo emcondições ambientes ou esfriadas.
A fim de determinar a quantidade e a qualidade domicroorganismo que permaneceu após estas condições de tratamento, asamostras de vírus foram tituladas por infectividade e as amostras bacterianasforam contadas em placa.
Ensaio de titulação BRS V:
As amostras estabilizadas do vírus BRS foram diluídas emmeio de cultura de célula padrão, suplementado com FCS 10% (v/v), emdiluições entre IO"1 e IO"7, em 0,2 ml. As diluições são inoculadas em célulasBEL dentro dos poços de uma placa de micro título: 1,5 χ IO5 BELcélulas/ml, a 0,2 ml/poço. 10 poços foram usados por diluição viral. As placasde micro título são incubadas durante 8 dias (3 - 5 % CO2 37 °C). As placassão fixadas utilizando-se Acetona/PBS 70/30 % v/v, durante 10-15 minutosem temperatura ambiente. A monocamada fixada é incubada inicialmentecom um anticorpo monoclonal específico para BRSV e secundário com umconj ugado-FITC anti-anticorpo + azul de Evans (como contra-mancha).Aquelas placas em que as células fluorescentes positivas se desenvolveramsão classificadas como positivas. Os títulos de vírus são calculados de acordocom Reed e Muench e expressos como título viral em TCID5Q.Em todos os experimentos, uma amostra de vírus padrãohomólogos e controle negativo foi incluída para cada realização de titulaçãode vírus. Todas as titulações de vírus foram realizadas em duplicata em umdia. Os títulos que tiveram sua média calculada são apresentados.
Ensaio de titulação de Mixoma vírus:
Células RK13 são semeadas em placas de 96 poços, a 4 χ IO5células por ml, a 100 μΐ por poço, em meio de cultura de célula padrão com5% de soro de bezerro fetal (FCS) e apropriados antibióticos. As placas sãoincubadas durante a noite a 37 0C, em atmosfera de 5% CO2.
No dia seguinte, uma amostra estabilizada contendomixomavírus é diluída de IO"1 a IO"8. 20 μΐ de cada diluição viral sãoinoculados em um poço da placa de células RKl3, em triplicata. Após umaincubação de uma hora a 37 °C/5% CO2, 100 μΐ de meio de cultura frescocom FCS são adicionados aos poços e as placas são incubadas por outros 2 -3 dias, até as placas virais estarem claramente visíveis e CPE poder ser lido.
As placas são então esvaziadas, tingidas com uma diluição denegro de Naftaleno, incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As placassão esvaziadas novamente, lavadas com água de bica, secadas e lidas usando-se um microscopia óptica.
O número de vírus mixoma infecciosos na amostra original écalculado por algoritmo Spearman-Karber e expresso como um valor TCID50.
Ensaio de titulação de vírus BHV, PlS e PRV
Amostras estabilizadas de vírus BHV, P13 e PRV foramtituladas de uma maneira similar àquela para vírus mixoma, exceto que foramusadas para vírus BHV e P13 células JCK e para PRV células Vero. CPE foitambém determinado contando-se as placas usando-se microscopia óptica.
Ensaio de titulação BCV
Uma suspensão de células de células MDBK é disseminada emplacas de 96 poços, a 200 μΐ/poço de 1 χ IO5 células/ml em meio DMEM com10% FCS e antibióticos apropriados. As placas são incubadas por 3 dias a 37°C em atmosfera de 5% CO2. Após três dias, uma monocamada confluenteformou-se. O meio foi removido, 200 μl de meio fresco sem FCS éadicionado e as placas são incubadas por 2 horas. As diluições de BCV dasamostras estabilizadas são preparadas em etapas de diluições de 10 vezes. Asplacas de microtítulo são esvaziadas novamente e diluições entre 10° e 10"são inoculadas na mono-camada de célula MDBK. As placas são incubadaspor 5-6 dias. Placas virais são visualizadas para contagem deimunofluorescência, empregando-se um soro policlonal de coelho anti BCV eum anticorpo conjugado rotulado Cabra-anti-coelho-FITC. Após contra-manchamento com azul de Evans, as placas são contadas utilizando-semicroscopia óptica-UV. O cálculo do título TCID50 viral, da amostraestabilizada, é por algoritmo de Reed-Muench.
Vírus influenza de eqüino
EIV é titulado em ovos de galinha; diluições de uma amostraEIV estabilizada são inoculadas dentro da cavidade alantóica de um ovo degalinha com a idade de 10 dias vivo fertilizado e incubado a 40 — 42 0C por 3- 5 dias. Os ovos são abertos e uma amostra do fluido alantóico é testada emensaio de hemaglutinação, empregando-se glóbulos vermelhos de galinha. Aquantidade de EIV infeccioso vivo na amostra original é calculada peladiluição mais elevada, fornecendo uma reação HA.
Em alguns experimentos, a qualidade da torta secada porcongelamento foi julgada. Esta compreendeu inspeção visual e agitação dofrasco.
Uma indicação arbitrária foi dada:
+ boa estrutura firme de aparência elegante
0 aparência e estrutura adequadas
- aparência e estrutura menos do que desejadas
BactériasCulturas bacterianas foram obtidas por cultivo de materialestoque em frascos agitadores em meio de crescimento padrão apropriados.Em seguida, estas culturas foram quantificadas por disseminação em placa emduplicata uma série de amostras de diluição limitadoras em placas de sangue-ágar, para contagem do número de colônias aparecendo após incubaçãodurante a noite. Para alguns experimentos, o número de colônias recuperadasapós secagem por congelamento foi expresso como % do número de colôniasda cultura original antes da secagem por congelamento.
As culturas correspondentes foram então misturadas 1:4 comuma composição estabilizante concentrada 4x de acordo com a presenteinvenção e submetidas a um programa de secagem por congelamento de doisestágio padrão.
Para os experimentos envolvendo E. coli, uma cepa Kl2 foiusada e diferentes meios de cultura foram usados: meio LB padrão, LB comampicilina e meio de sangue-ágar. A eficácia da composição estabilizante deacordo com a presente invenção foi comparada com aquela de umestabilizante padrão contendo albumina.
As amostras foram testadas antes ou diretamente após asecagem por congelamento ou após 3 dias de incubação a 28 ou 30 0C,novamente por meio de ensaio de estabilidade acelerada.
Tabela 5: Efeito da concentração de Glicina
Microorganismo usado: BHV
<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>
Tabela 6: Efeito da concentração de Glutamato
Microorganismo usado: BHV
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Tabela 7: Tipo de poliamina e efeito da concentração depoliamina
Microorganismo usado: BHV
Composição estabilizante usada:<table>table see original document page 34</column></row><table>
NB: nestes experimentos Espermina ou Espermidina foiincluída na composição estabilizante.
Para fins de referência, um estabilizante convencional da arteanterior (Makoschey et al., supra) foi incluído como exemplo comparativo,isto é indicado como "Conv. stab.".
Tabela 7: Tipo de poliamina e efeito da concentração deooliamina (Continuação)
<table>table see original document page 34</column></row><table>
n.a. = não avaliado
Tabela 8: Tipo de sais de poliamina e hidratos e efeito daconcentração
Microorganismo usado: BHV<table>table see original document page 35</column></row><table>
* Nestes experimentos uma poliamina foi incluída ou umacombinação; isto é indicado na tabela.
<table>table see original document page 35</column></row><table>
n.a. = não disponível
<table>table see original document page 35</column></row><table>Tabela 8: Tipo de sais de poliamina e hidratos e efeito de concentração(continuado)
<table>table see original document page 36</column></row><table>
* Combinações de poliamina:
A = Tetracloridreto de espermina 10 g/l e Putrescina 5 g/l
B = Tetracloridreto de espermina 10 g/l e etileno diamina 5 g/l.
Tabela 9: Estabilização de diferentes vírus e efeito da poliamina
Composições estabilizantes usadas:<table>table see original document page 37</column></row><table>
Os exemplos comparativos foram realizados com oestabilizante convencional da arte anterior (Makoschey et al., supra), istosendo indicado como "Estab. Conv."
Tabela 9: Estabilização de diferentes vírus e efeito dapoliamina
(Continuação)
<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>
η. a. = não disponível
Tabela 9: Estabilização de diferentes vírus e efeito da poliamina(Continuação)
<table>table see original document page 38</column></row><table>
n.a. = não disponívelTabela 9: Estabilização de diferentes vírus e efeito da poliamina
(Continuação)
<table>table see original document page 39</column></row><table>
n.a. = não disponível
Tabela 10: Estabilização de diferentes vírus, que foram produzidos ACF
Composições estabilizantes usadas:
"invenção 1", "invenção 3" e estabilizante convencional("estab. conv." (vide Tabela 9).<table>table see original document page 40</column></row><table>
n.a. = não disponível
Tabela 11: Substituição de glicina por soluto compatívelComposições estabilizantes usadas:
"invenção 3" e "Estab. conv." (vide Tabela 9)
Modificações da invenção 3:
<table>table see original document page 40</column></row><table>Tabela 11: Substituição de glicina por soluto compatível
<table>table see original document page 41</column></row><table>
Tabela 12: Efeito do pH tampão
Microorganismo usado: BHV
<table>table see original document page 41</column></row><table>
As variações do pH são indicadas na tabela:<table>table see original document page 42</column></row><table>
Tabela 13: Estabilização de bactérias E coli
Microorganismo usado: E. coli Kl2
Composição estabilizante usada: "invenção 1" (vide Tabela 9).Para comparação, um estabilizante bacteriano padrão, contendo Albumina, foiusado. Isto é indicado como "Estab. bac.".
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Tabela 14: Estabilização de diferentes bactérias
Microorganismo usado: Diferentes bactériasComposição estabilizante usada: "invenção 1" e "invenção 3"(vide Tabela 9). Para comparação, um estabilizante bacteriano padrão,contendo Albumina, foi usado. Isto é indicado como "estab. bac."
<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Claims (30)

1. Composição estabilizante de vacina compreendendo pelomenos um aminoácido, pelo menos um açúcar e pelo menos uma poliamina,em que todos os compostos são quimicamente definidos, assim sendo isentode soro, isento de proteína, isento de compostos animais, isento de polímerodo qual somente um peso molecular médio ou comprimento médio dascadeias laterais são conhecidos e isento de lisado proteináceo, hidrolisado deextrato ou mistura de peptídeo, caracterizada pelo fato de que a poliamina épelo menos uma selecionada do grupo consistindo de etileno-diamina,cadaverina, putrescina, espermidina e espermina.
2. Composição estabilizante de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o açúcar ser pelo menos um selecionado do grupoconsistindo de glicose, lactose, sacarose, maltose, trealose, sorbitol e manitol.
3. Composição estabilizante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de o aminoácido ser glutamatoou glicina ou em que ambos estes aminoácido são incluídos.
4. Composição estabilizante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 3, caracterizada pelo fato de a composição ser umasolução aquosa tamponada.
5. Composição estabilizante de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de o tampão ser baseado em fosfato.
6. Composição de vacina, caracterizada pelo fato decompreender uma composição estabilizante como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 5 e pelo menos uma molécula biológica ou pelo menosum microorganismo ou uma combinação deles.
7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de o microorganismo ser um vírus ou uma bactéria ouem que tanto um vírus como uma bactéria estão incluídos.
8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de o vírus ser pelo menos uma espécie viral,selecionada do grupo consistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-,rabdo-, birna-, corona-, pneumo- e poxivírus.
9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de a molécula biológica ser pelo menos umaselecionada do grupo consistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeoe um ácido nucleico.
10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de a proteína ser pelo menos uma selecionada dogrupo consistindo de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma citocina,um hormônio e uma enzima.
11. Composição de vacina de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6 a 10, caracterizada pelo fato de a molécula biológica ou omicroorganismo, ou ambos, serem produzidos livres de componente animal.
12. Composição de vacina de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreenderum adjuvante.
13. Composição de vacina de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6 a 12, caracterizada pelo fato de a composição de vacina se eforma secada por congelamento.
14. Solução de vacina, caracterizada pelo fato de ser obtenívelpor reconstituição de uma composição de vacina secada por congelamentocomo definida na reivindicação 13, em um veículo farmaceuticamenteaceitável.
15. Método para preparar uma composição farmacêutica,caracterizado pelo fato de compreender misturar uma composiçãoestabilizante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, comuma composição compreendendo pelo menos uma molécula biológica ou pelomenos um microorganismo, ou um combinação deles.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de o microorganismo ser um vírus ou uma bactéria, ou em que tantoum vírus como uma bactéria estão incluídos.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de o vírus ser pelo menos uma espécie viral, selecionada do grupoconsistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-,pneumo- e poxvírus.
18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de a molécula biológica ser pelo menos uma selecionada do grupoconsistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeo e um ácido nucleico.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de a proteína ser pelo menos uma selecionada do grupo consistindode um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma citocina, um hormônio euma enzima.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de a molécula biológica ou o microorganismo,ou ambos, terem sido produzidos livres de componente animal.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de a composição farmacêutica resultante sersubmetida a secagem por congelamento.
22. Composição farmacêutica obtenível pelo método comodefinido em qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizada pelo fatode a composição ser uma composição de vacina.
23. Método para preparar uma solução de vacina,caracterizado pelo fato de ser por reconstituição de uma composiçãofarmacêutica como definida na reivindicação 22 em um veículofarmaceuticamente aceitável.
24. Uso de uma composição estabilizante como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 5, dito uso caracterizado pelo fato de serpara estabilizar a qualidade e/ou a quantidade de pelo menos uma moléculabiológica ou pelo menos um microorganismo, ou uma combinação deles, emuma composição de vacina.
25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de o microorganismo ser um vírus ou uma bactéria ou em que tanto umvírus como uma bactéria estão incluídos.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de o vírus ser pelo menos uma espécie viral selecionada do grupoconsistindo de herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-,pneumo- e poxvírus.
27. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de a molécula biológica ser pelo menos uma selecionada do grupoconsistindo de uma proteína, um carboidrato, um lipídeo e um ácido nucleico.
28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelofato de a proteína ser pelo menos uma selecionada do grupo consistindo deum anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma citocina, um hormônio e umaenzima.
29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de a molécula biológica ou o microorganismo, ouambos, terem sido produzidos livres de componente animal.
30. Uso de uma composição de vacina como definida nareivindicação 14 ou uma solução de vacina obtenível pelo método comodefinido na reivindicação 23, dito uso caracterizado pelo fato de ser paraimunização de um humano ou animal alvo.
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