WO2015032302A1 - 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法 - Google Patents

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WO2015032302A1
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liquid preparation
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protein
amino acid
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马美湖
单媛媛
黄茜
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Definitions

  • the invention relates to a high antimicrobial activity egg yolk preparation and a preparation method thereof. Background technique
  • the surface antigenicity of pathogenic microorganisms often mutates constantly, making the process of breeding viral vaccine strains time-consuming and laborious. More importantly, the vaccine inoculation effect is reduced by the variation or drift of the viral surface antigen.
  • Antiviral chemicals and antibiotics are the most important ways to treat infectious diseases. These drugs have certain toxic side effects on the body, and some influenza viruses and pathogens have developed resistance to some drugs. Based on this situation, it has become an eye-catching new field to find and exploit new natural antiviral active ingredients from abundant natural resources while developing high-efficiency vaccines and drugs.
  • antiviral proteins are an important class. At present, a variety of antiviral proteins have been extracted from species such as plants, insects and marine organisms, while the research on antimicrobial proteins in eggs and eggs, which are abundant in China and the world, is relatively rare. In fact, there are a variety of active proteins that are resistant to microbial infection in eggs, such as egg mucin, transferrin, avidin, and lysozyme. Among them, egg mucin is one of the most important antibacterial antiviral proteins. Like many mucin family members, egg mucin is a large molecular weight sulfate glycoprotein containing sialic acid residues. Existing studies have found that egg mucin has good antibacterial and antiviral activity.
  • An object of the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art and to provide an egg yolk liquid preparation having antibacterial and antiviral activity.
  • An egg yolk liquid preparation containing the following percentage by weight of ingredients: Egg mucin 0.01-0.1%
  • the accessory protein is lysozyme and/or ovotransferrin.
  • the egg yolk liquid preparation further contains 50 to 500 mmol/L of calcium ions or 10 to 500 mmol/L of magnesium ions.
  • the egg yolk liquid preparation contains 50 to 200 mmol/L of calcium ions or magnesium ions.
  • the accessory protein is lysozyme and ovotransferrin, and the weight ratio of lysozyme to ovotransferrin is 1:1.
  • the amino acid is lysine and/or arginine.
  • the polyol is mannitol and/or polyethylene glycol.
  • a method for preparing an egg yolk liquid preparation comprises the following steps:
  • step 2) continue to add the auxiliary protein to the solution of step 1) so that the weight of the auxiliary protein is 0.001 0.01%, and stir at 50 100 rpm at 4 ° C to dissolve it sufficiently;
  • the polyol is added so that the weight content of the polyol is 0.5 to 5%, and it is filtered through a 0.45 ⁇ sterile microfiltration membrane.
  • the accessory protein is lysozyme and/or ovotransferrin.
  • the method further comprises the steps of adding calcium or magnesium ions in step 2) or 3), and increasing the concentration of calcium ions to 50 to 500 mmol/L or the concentration of magnesium ions to 10 to 500 mmol/L.
  • the amino acid is lysine and/or arginine.
  • the polyol is mannitol and/or polyethylene glycol.
  • the egg yolk liquid preparation prepared by the invention can be sprayed on the surface of the food, the nose of the animal or the population, the wound wound, etc., and can resist the invasion of microorganisms and reduce the activity and virulence of the virus.
  • the egg yolk liquid preparation prepared by the invention has good adhesion to bacteria, has strong resistance to viruses, has high egg mucin concentration in the preparation, and has long effective period of protein biological activity, can effectively resist microbial invasion and reduce virus.
  • Activity and virulence have a certain inhibitory effect on H5N1 and H1N1 influenza viruses. Detailed ways
  • ovomuxin can inhibit the activity of microorganisms through adhesion, and thus inhibit the growth, proliferation and toxicity of microorganisms.
  • natural egg white protein and other egg white proteins such as lysozyme form a thick protein in a polymerized form, providing a barrier against microbial invasion.
  • the present invention mimics the natural state and investigates the effect of different accessory proteins on the adhesion of egg mucin bacteria.
  • the procedure was as follows: Different protein samples were dissolved in 50 mol/L borate buffer (pH 9.6), and the protein concentration was adjusted to 10 ( ⁇ g/mL. Each well in the 96-well microtiter plate was added with a ⁇ egg yolk mixture. Fix overnight at 4 ° C, gently aspirate the supernatant, wash 1-2 times with PBS-T to remove unfixed protein. Add 100 ⁇ BSA per well, incubate at 37 ° C for 2 h to shield non-specific binding sites, Then, wash it with PBS-T for 1-2 times.
  • A is the absorbance of the sample well at 490 nm
  • a Q is the absorbance of the bacterial control well at 490 nm
  • Ac is the absorbance of the blank control well (without the addition of bacteria).
  • lysozyme and/or ovotransferrin can be used as accessory proteins to significantly enhance the adhesion of egg mucin to bacteria, while other accessory proteins such as bovine serum albumin and ovalbumin are not effective.
  • the egg mucin was dissolved in a buffer containing different salts (150 mmol/L), stirred thoroughly, centrifuged, and the precipitate was again dissolved in the above salt solution to adjust the final concentration of the protein to 50 ⁇ ⁇ / ⁇ , using SDS-PAGE electrophoresis. The purity of the sample was measured.
  • the blood coagulation and hemagglutination inhibition (HI) activity of egg white protein against chicken Newcastle disease virus was determined by the method of GB/T 14926.53-2001 and GB/T14926.54-2001, and the half inhibitory concentration of blood coagulation titer (/C50).
  • HI blood coagulation and hemagglutination inhibition
  • As the antiviral activity index the effects of different kinds of salt treatment on the purity and antiviral activity of egg mucin were studied. The results are shown in Table 2.
  • Oval mucin is highly insoluble, and its saturation concentration in a common buffer is about 0.1 mg/mL. In order to fully exert the action of ovomucin, it is necessary to increase its solubility.
  • the amino acid is a small molecule organic substance, which not only increases the ionic strength in the solution, but also interacts with the protein to change the surface charge of the protein, thereby increasing the solubility of the protein.
  • the present invention investigated the effect of several amino acids on the solubility of egg mucin.
  • Nitrogen solubility index (./.) 100%
  • Example 4 Adding a protective agent to extend the effective period of ovomucin
  • the preparation method comprises the following steps: 1) dissolving the amino acid in a buffer or water to obtain a certain concentration of the amino acid solution, and then adding a certain amount of egg vism to the amino acid solution, and stirring until the egg yolk protein is completely dissolved;
  • step 2) continue to add a certain amount of auxiliary protein to the solution of step 1), and stir at a speed of 50 100 rpm at 4 ° C to fully dissolve it;
  • Influenza viruses cause the death of canine kidney cells (MDCK cells), while egg mucins can inhibit the virus and thus protect cells.
  • MDCK cells canine kidney cells
  • the preparation was first incubated with MDCK cells, and then the influenza virus was added to examine the cell survival rate and the inhibition rate against the virus.
  • the specific steps are as follows: After the canine kidney cells (MDCK cells) in the 96-well plate are grown to 70% ⁇ 80% monolayer, the culture solution is aspirated, and the ⁇ ovomucin liquid preparation is added, and the mixture is incubated at 37 ° C for 1 h, and the sample solution is discarded. Add 100 times TCID50 of influenza virus solution to 100 ⁇ and incubate for 1 h at 37 °C. The free virus was washed away, and the cells were continuously cultured by adding 200 ⁇ of the cell maintenance solution at 37 ° C in 5% CO 2 to observe cytopathic effects.
  • Mean control group A value - blank control A value experimental group (drug + virus) average A value - virus control group average A value
  • Sample group average A value - virus control group average A value
  • the inhibitory effect of the egg yolk preparation of the present invention on influenza virus is shown in Table 7.

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Abstract

一种卵黏蛋白液体制剂，含有下述重量百分比的成分：卵黏蛋白0.01~0.1%、辅助蛋白0.001~0.01%、氨基酸1.5~4%、多元醇0.5~5%，余量为pH值6~8的缓冲液或水，所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。所述卵黏蛋白液体制剂中还含有50~500mmol/L钙离子或10~500mmol/L镁离子。本发明的卵黏蛋白液体制剂能抵御微生物入侵、降低病毒活性与毒力，可喷涂于食品表面、动物或人的口鼻、创伤伤口等处。

Description

卵黏蛋白液体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高抗微生物活性的卵黏蛋白制剂及其制备方法。 背景技术
病原微生物的表面抗原性会经常不断的发生变异， 使得选育病毒疫苗株的过程费时 费力， 更重要的是疫苗的接种效果会因为病毒表面抗原的变异或漂移而降低。 抗病毒化 学药物及抗生素是当前治疗传染病的最主要途径， 而这些药物对机体均有一定的毒副作 用， 并且一些流感病毒及病原菌已经对部分药物产生了耐药性。 基于这种形势， 在研制 高效疫苗和药物的同时， 从丰富的自然资源中寻找和挖掘新的天然抗病毒活性成分已成 为令人瞩目的新领域。
在天然抗病毒活性成分中， 抗病毒蛋白是重要的一类。 目前已经从植物、 昆虫和海 洋生物等物种中提取出多种抗病毒蛋白， 而对我国乃至世界上产量丰富的蛋白资源—— 禽蛋中的抗微生物蛋白研究却相对较少。 实际上， 禽蛋中存在多种抗微生物感染的活性 蛋白质， 如卵黏蛋白、 转铁蛋白、 抗生物素蛋白以及溶菌酶等， 其中的卵黏蛋白是非常 重要的抗菌抗病毒蛋白质之一。 同很多粘蛋白家族成员一样， 卵黏蛋白是一种含有唾液 酸残基的巨大分子量的硫酸酯糖蛋白， 现有的研究已经发现卵黏蛋白具有较好的抗菌抗 病毒活性， 其对多种病毒引起的血球凝集反应具有很好的抑制作用。 然而到目前为止， 尚未有卵黏蛋白产品能够达到商业应用的水平， 其中两个很重要的原因是卵黏蛋白经过 纯化制备过程后会造成抗菌抗病毒活性的损失， 另外其较低的溶解性无法达到其发挥活 性需要的浓度。 发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白 液体制剂。
上述目的可以通过以下技术方案实现：
一种卵黏蛋白液体制剂， 它含有下述重量百分比的成分： 卵黏蛋白 0.01-0.1%
辅助蛋白 0.001-0.01%
氨基酸 1.5-4%
多元醇 0.5-5%
pH值为 6~8的缓冲液或水
所述辅助蛋白为溶菌酶和 /或卵转铁蛋白。
优选地，所述卵黏蛋白液体制剂中还含有 50~500mmol/L的钙离子或 10~500mmol/L 镁离子。
进一步优选地， 所述卵黏蛋白液体制剂中含有 50~200mmol/L的钙离子或镁离子。 优选地， 所述辅助蛋白为溶菌酶和卵转铁蛋白， 所述溶菌酶与卵转铁蛋白的重量比 为 1 : 1。
优选地， 所述氨基酸为赖氨酸和 /或精氨酸。
优选地， 所述多元醇为甘露醇和 /或聚乙二醇。
一种卵黏蛋白液体制剂的制备方法， 包括以下步骤：
1 ) 将氨基酸溶解于 pH值为 6~8的缓冲液或水中， 得到重量含量为 1.5~4%的氨基 酸溶液， 再向氨基酸溶液中加入卵黏蛋白， 使卵黏蛋白的重量含量为 0.01~0.1%， 搅拌 至卵黏蛋白完全溶解；
2)继续向步骤 1 )的溶液中加入辅助蛋白， 使辅助蛋白的重量含量为 0.001 0.01%， 4°C下用 50 100转 /分钟的转速搅拌， 使其充分溶解；
3 )最后加入多元醇，使多元醇的重量含量为 0.5~5%，经 0.45μιη的无菌微滤膜过滤， 即得，
所述辅助蛋白为溶菌酶和 /或卵转铁蛋白。
优选地， 还包括在步骤 2) 或 3 ) 中加入钙离子或镁离子， 并使钙离子的浓度达到 50~500mmol/L或镁离子的浓度达到 10~500mmol/L的步骤。
优选地， 所述氨基酸为赖氨酸和 /或精氨酸。
优选地， 所述多元醇为甘露醇和 /或聚乙二醇。
本发明制得的卵黏蛋白液体制剂可以喷涂于食品表面、 动物或人口鼻、 创伤伤口等 处， 可以起到抵御微生物入侵、 降低病毒活性与毒力的作用。 本发明制备的卵黏蛋白液体制剂对细菌具有很好的粘附性， 对病毒具有很强的抵抗 活性， 制剂中卵黏蛋白浓度高， 蛋白生物活性有效期长， 能有效抵御微生物入侵、 降低 病毒活性与毒力， 对 H5N1和 H1N1流感病毒具有一定的抑制作用。 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例 1 辅助蛋白对卵黏蛋白细菌粘附效果的影响
研究表明卵黏蛋白可通过黏附作用限制微生物的活动， 进而对微生物的生长、 增殖 及毒性等起到抑制作用。 在禽蛋蛋清中， 天然状态下卵黏蛋白与溶菌酶等其他蛋清蛋白 质以聚合态的形式形成浓厚蛋白， 为禽蛋提供了抵御微生物入侵的屏障。 因此， 本发明 模拟天然状态， 研究不同的辅助蛋白对卵黏蛋白细菌粘附能力的影响。
在高纯度卵黏蛋白中分别按照表 1的比例加入不同种类和比例的辅助蛋白， 制成蛋 白的混合物， 然后以大肠杆菌、 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为对象， 应用酶联免疫吸附 法 (ELISA)测定不同蛋白混合物对细菌的粘附效果。
操作过程如下： 不同蛋白样品溶解于 50mol/L硼酸盐缓冲液 (pH 9.6)， 调整蛋白浓度 为 10(^g/mL。 96孔酶标板中的每孔加入 ΙΟΟμί的卵黏蛋白混合物， 4°C固定过夜， 轻轻 吸出上清液， 用 PBS-T洗涤 1-2次， 以除去未固定的蛋白质。每孔加入 100^ BSA， 37°C 孵育 2h以屏蔽非特异性结合位点， 然后用 PBS-T洗涤 1-2次。 实验孔加入 200^的菌体 后于 37°C孵育 60min， 轻吸去多余菌液， 再用 PBS-T洗涤 1-2次， 除去未粘附的细菌。加 入测试细菌的抗体 ΙΟΟμΙ^ 37°C继续孵育 lh， 再加 PBS-T洗涤。 各孔加 ΙΟΟμΙ^辣根过氧 化物酶标记的二抗 （效价 1:5000)， 室温放置 30min后加入 ΙΟΟμΙ^的含有 0.4mg/mL和
0.2^/mL H2O2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液， 室温避光放置 30min。然后加入 ΙΟΟμί的 3mol/L 的硫酸终止反应。 在酶标仪上读取 490nm处的吸光值。 粘附率按下式计算：
粘附率 （％) = χ 100%
Figure imgf000004_0001
其中， A为样品孔在 490nm处吸光值， AQ为细菌对照孔在 490nm处吸光值， Ac为 空白对照孔 （不加菌体） 的吸光值。 表 1 辅助蛋白优选实验
Figure imgf000005_0001
上述结果表明以溶菌酶和 /或卵转铁蛋白作为辅助蛋白可以显著提高卵黏蛋白对细 菌的粘附效果， 而其它的辅助蛋白如牛血清白蛋白和卵白蛋白效果不明显。
实施例 2 盐对卵黏蛋白抗病毒活性的影响
分别将卵黏蛋白溶解于含有不同盐 （150mmol/L) 的缓冲液中， 充分搅拌后离心， 取沉淀再次用上述盐溶液溶解， 调整蛋白终浓度为 50μ§/ηΛ， 采用 SDS-PAGE电泳法测 定样品纯度。 同时参照国标 GB/T 14926.53-2001和 GB/T14926.54-2001的方法测定卵黏 蛋白对鸡新城疫病毒的血凝及血凝抑制 (HI)活性， 以血凝效价的半数抑制浓度 （/C50) 为抗病毒活性指标， 研究不同种类的盐处理对卵黏蛋白纯度及抗病毒活性的影响， 结果 如表 2所示。
表 2 盐种类对卵黏蛋白制剂的抗病毒效果的影响
Figure imgf000005_0002
上述数据显示， 与空白对照以及其他盐处理组相比， 经钙或镁盐处理后， 卵黏蛋白 的抗病毒活性显著增强。 进一步应用血凝抑制试验评价了不同浓度钙盐和镁盐对卵黏蛋白制剂的抗病毒活性 的影响， 结果列于表 3。
表 3 钙盐和镁盐浓度对卵黏蛋白抗病毒活性的影响
Figure imgf000006_0001
以上试验结果表明， 50~500mmol/L钙盐或 10~500mmol/L镁盐可以使卵黏蛋白 /(：50与 对照组相比降低， 钙盐或镁盐的浓度为 50~200mmol/L时效果更加显著。
实施例 3卵黏蛋白的溶解性试验
卵黏蛋白具有高度不溶解性，其在常见缓冲液中的饱和浓度约为 0.1mg/mL， 为了充 分发挥卵黏蛋白的作用， 需提高其溶解度。 氨基酸为小分子有机物， 其在溶液中不仅可 以提高离子强度， 还可以与蛋白质发生相互作用， 改变蛋白质表面电荷， 从而起到增加 蛋白质溶解度的作用。 因此， 本发明研究了几种氨基酸对卵黏蛋白溶解度的影响。
将 lg卵黏蛋白分别加入到 lOOmL含有不同种类氨基酸 （lOOmmol/L) 的缓冲液中， 定容后混匀，搅拌 6~8h。 1500 r/min 离心 5min，用凯氏定氮法分别测定添加的总蛋白质、 上清以及相应溶剂中的氮含量， 溶剂的溶解性能以氮溶性指数表示， 不添加增溶剂的蒸 熘水和中性磷酸盐缓冲液作为空白对照。 上清中的氮含量一溶剂中的氮含
氮溶性指数 (。/。) : 100%
固体样品中的氮含量
卵黏蛋白溶解度的测定参照现有文献公知的方法 （HiidenhOVi et al, 2008 ) 进行， 根 据 A28Q= CL， 其中 为吸光系数， 按蛋白质的平均系数 l L/( cm)计算， 则卵黏蛋白浓 度 (mg/mL)=A28o° 实验结果如表 4所示。 卵黏蛋白在不添加氨基酸的蒸熘水中溶解性很差， 但添加赖 氨酸可以使其氮溶性指数由 2%左右提高到 10%以上， 溶解度可提高 5倍以上， 添加精 氨酸可以使其氮溶性指数提高到 20%以上， 溶解度可提高 8倍以上， 而使用赖氨酸与精 氨酸混合物时， 溶解度可提高至约 11倍左右。
表 4 增溶剂对卵粘蛋白溶解度的影响
Figure imgf000007_0001
实施例 4 添加保护剂延长卵黏蛋白有效期
在水溶液中， 蛋白质易变性失去生物活性， 为了延长卵黏蛋白制剂的有效期， 研究 多元醇、 高分子多聚物 （聚乙二醇） 等对制剂有效期的影响。
卵黏蛋白制剂中添加 2%的甘油 （①） 、 甘露醇 （②） 、 山梨醇 （③） 、 聚乙二醇 (④） 或其混合物 （② +④） ， 搅拌均匀后分装至西林瓶中， 密封后分别置于 4°C静置， 隔 7天取样按照实施例 1所述方法测定卵黏蛋白制剂对大肠杆菌的粘附能力， 当粘附率 下降到 50%以下时， 即认为制剂失效。 测定结果如表 5所示。
表 5保护剂对卵黏蛋白有效期的影响
Figure imgf000007_0002
5 60.21 64.02 59.03 65.82 67.88
6 51.43 52.71 47.56 58.87 61.32
7 39.34 40.08 37.89 48.29 55.75
8 43.46
9 _ _ _ _ _ _ 上述数据显示， 未添加保护剂的卵黏蛋白制剂在低温贮藏条件下对细菌的粘附能力 迅速降低， 细菌粘附率在贮藏 3周后已低于 50%， 而添加一定量的保护剂以后， 其对大 肠杆菌的粘附能力可以保持 5周以上， 其中， 甘露醇（②）和聚乙二醇（④）效果较好， 而将两者复合使用时获得的效果最佳， 在保存 7周后制剂对细菌的粘附率仍然可以保持 在 50%以上。
实施例 5~9 卵黏蛋白液体制剂及其抗病毒效果检验
实施例 5~9中， 卵黏蛋白液体制剂的配方如表 6所示:
表 6 实施例 5~9的配方
Figure imgf000008_0001
注： 符号"％ "表示百分比， 系指重量的比例； R代表溶菌酶、 L代表卵转铁蛋白。 其制备方法为： 1 )将氨基酸溶解于缓冲液或水中， 得到一定浓度的氨基酸溶液， 再 向氨基酸溶液中加入一定量的卵黏蛋白， 搅拌至卵黏蛋白完全溶解；
2) 继续向步骤 1 ) 的溶液中加入一定量的辅助蛋白， 4°C下用 50 100转 /分钟的转 速搅拌， 使其充分溶解；
3 ) 最后加入一定量的镁盐或钙盐 （如氯化钙、 硫酸镁） 和多元醇， 经 0.45μιη的无 菌微滤膜过滤， 即得。 实施例 5~9的卵黏蛋白液体制剂对流感病毒的抑制作用：
流感病毒会导致犬肾细胞（MDCK细胞） 的死亡， 而卵黏蛋白可以抑制病毒， 从而 对细胞具有保护作用。为了验证卵黏蛋白液体制剂的有效性，将制剂先与 MDCK细胞进 行孵育， 再接入流感病毒， 考察细胞的存活率和对病毒的抑制率。
具体步骤为： 96孔板中的犬肾细胞（MDCK细胞）长成 70%〜80%单层后， 吸去培 养液， 加入 ΙΟΟμί 卵黏蛋白液体制剂， 37°C孵育 lh， 弃掉样品液， 加入 100倍 TCID50 的流感病毒液 100μί， 37°C孵育 lh。 洗去游离病毒， 加入细胞维持液 200μί于 37°C、 5% C02中继续培养，观察细胞病变。将终止观察的 96孔培养板的每孔加入 ΙΟμί CCK-8 溶液 （lOOuL体系） ， 轻轻混匀， 置 37°C培养箱中孵育 lh后， 于酶联免疫测定仪上读 取 450nm处吸光值 (A450)值， 按下列公式计算卵黏蛋白对流感病毒的抑制率， 同时取维 持液进行血凝实验， 以判断细胞病变是由病毒引起的特异性病变。
实验组平均 A值 -空白对照 A值
细胞存活率 （％) = x l OO
细胞对照组平均 A值 -空白对照 A值 实验组 （药物 +病毒） 平均 A值-病毒对照组平均 A值
病毒抑制率 （％) : 100
样品组平均 A值 -病毒对照组平均 A值 本发明卵黏蛋白制剂对流感病毒的抑制效果如表 7 所示。
表 7 卵黏蛋白对流感病毒的抑制效果
Figure imgf000009_0001
结果表明， 流感病毒侵染前在 MDCK细胞中加入不同浓度的卵黏蛋白， 其对 H5N1 和 H1N1病毒的感染均具有一定的抑制作用， 并且细胞存活率和病毒感染抑制率均随着 卵黏蛋白浓度的增大而升高， 说明本发明所制备的卵黏蛋白液体制剂在流感病毒侵染细 胞的过程中具有良好的抗病毒效果。

Claims

权利要求书
1、 一种卵黏蛋白液体制剂 其特征在于： 含有下述重量百分比的成分:
卵黏蛋白 0.01-0.1%
辅助蛋白 0.001-0.01%
氨基酸
多元醇 0.5-5%
pH值为 6~8的缓冲液或水 余量，
所述辅助蛋白为溶菌酶和 /或卵转铁蛋白。
2、根据权利要求 1所述的卵黏蛋白液体制剂， 其特征在于： 所述卵黏蛋白液体制剂 中还含有 50~500mmol/L的钙离子或 10~500mmol/L镁离子。
3、根据权利要求 2所述的卵黏蛋白液体制剂， 其特征在于： 所述卵黏蛋白液体制剂 中含有 50~200mmol/L的钙离子或镁离子。
4、 根据权利要求 1~3 任何一项所述的卵黏蛋白液体制剂， 其特征在于： 所述辅助 蛋白为溶菌酶和卵转铁蛋白， 所述溶菌酶与卵转铁蛋白的重量比为 1： 1。
5、 根据权利要求 1~3 任何一项所述的卵黏蛋白液体制剂， 其特征在于： 所述氨基 酸为赖氨酸和 /或精氨酸。
6、 根据权利要求 1~3 任何一项所述的卵黏蛋白液体制剂， 其特征在于： 所述多元 醇为甘露醇和 /或聚乙二醇。
7、 一种卵黏蛋白液体制剂的制备方法， 其特征在于包括以下步骤：
1 ) 将氨基酸溶解于 pH值为 6~8的缓冲液或水中， 得到重量含量为 1.5~4%的氨基 酸溶液， 再向氨基酸溶液中加入卵黏蛋白， 使卵黏蛋白的重量含量为 0.01~0.1%， 搅拌 至卵黏蛋白完全溶解；
2)继续向步骤 1 )的溶液中加入辅助蛋白， 使辅助蛋白的重量含量为 0.001 0.01%， 4°C下用 50 100转 /分钟的转速搅拌， 使其充分溶解；
3 )最后加入多元醇，使多元醇的重量含量为 0.5~5%，经 0.45μιη的无菌微滤膜过滤， 即得，
所述辅助蛋白为溶菌酶和 /或卵转铁蛋白。
8、根据权利要求 7所述的卵黏蛋白液体制剂的制备方法， 其特征在于： 还包括在步 骤 2)或 3 ) 中加入钙离子或镁离子， 并使钙离子的浓度达到 50~500mmol/L或镁离子的 浓度达到 10~500mmol/L的步骤。
9、根据权利要求 7或 8所述的卵黏蛋白液体制剂的制备方法， 其特征在于： 所述氨 基酸为赖氨酸和 /或精氨酸。
10、 根据权利要求 7或 8所述的卵黏蛋白液体制剂的制备方法， 其特征在于： 所述 多元醇为甘露醇和 /或聚乙二醇。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103432576B (zh) * 2013-09-09 2014-08-20 华中农业大学 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法
CN111012901B (zh) * 2020-01-10 2021-11-16 华中农业大学 一种含有卵粘蛋白和溶菌酶的人工唾液及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013063695A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Kane Biotech Inc. Compositions and methods for preventing and treating oral diseases
WO2013117692A1 (fr) * 2012-02-10 2013-08-15 Ovogenics Sa Composition anti-inflammatoire pour moduler la reponse cellulaire des neutrophiles et des eosinophiles
CN103432576A (zh) * 2013-09-09 2013-12-11 华中农业大学 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6293386A (ja) * 1985-10-17 1987-04-28 Nippon Shinyaku Co Ltd 抗菌物質の製法及び食品の防腐法
JP3255161B2 (ja) * 1998-12-11 2002-02-12 株式会社ゲン・コーポレーション ヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤
JP2004203850A (ja) * 2002-12-25 2004-07-22 Lion Corp 胃腸用組成物及び口腔用組成物
JP2005000133A (ja) * 2003-06-16 2005-01-06 Pharmafoods Kenkyusho:Kk 卵白ペプチドを配合した食品用日持ち向上剤
CN101984968A (zh) * 2010-10-29 2011-03-16 北京润德康医药技术有限公司 抗肿瘤剂替莫唑胺的药物制剂制备方法
CN102604915B (zh) * 2012-03-27 2013-08-21 华中农业大学 从鸡蛋清中联合提取多种蛋白质的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013063695A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Kane Biotech Inc. Compositions and methods for preventing and treating oral diseases
WO2013117692A1 (fr) * 2012-02-10 2013-08-15 Ovogenics Sa Composition anti-inflammatoire pour moduler la reponse cellulaire des neutrophiles et des eosinophiles
CN103432576A (zh) * 2013-09-09 2013-12-11 华中农业大学 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法

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