CN103432576B - 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法 - Google Patents

卵黏蛋白液体制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卵黏蛋白液体制剂，它含有下述重量百分比的成分：卵黏蛋白0.01~0.1%、辅助蛋白0.001~0.01%、氨基酸1.5~4%、多元醇0.5~5%、pH值为6~8的缓冲液或水为余量，所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。所述卵黏蛋白液体制剂中还含有50~500mmol/L的钙离子或10~500mmol/L镁离子。本发明对细菌具有很好的粘附性，对病毒具有很强的抵抗活性，卵黏蛋白溶解度高，蛋白生物活性有效期长，能有效抵御微生物入侵、降低病毒活性与毒力，并且对H5N1和H1N1流感病毒具有一定的抑制作用，可以喷涂于食品表面、动物或人口鼻、创伤伤口等处，起到抵御微生物入侵、降低病毒活性与毒力的作用。

Description

卵黏蛋白液体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高抗微生物活性的卵黏蛋白制剂及其制备方法。
背景技术
病原微生物的表面抗原性会经常不断的发生变异，使得选育病毒疫苗株的过程费时费力，更重要的是疫苗的接种效果会因为病毒表面抗原的变异或漂移而降低。抗病毒化学药物及抗生素是当前治疗传染病的最主要途径，而这些药物对机体均有一定的毒副作用，并且一些流感病毒及病原菌已经对部分药物产生了耐药性。基于这种形势，在研制高效疫苗和药物的同时，从丰富的自然资源中寻找和挖掘新的天然抗病毒活性成分已成为令人瞩目的新领域。
在天然抗病毒活性成分中，抗病毒蛋白是重要的一类。目前已经从植物、昆虫和海洋生物等物种中提取出多种抗病毒蛋白，而对我国乃至世界上产量丰富的蛋白资源——禽蛋中的抗微生物蛋白研究却相对较少。实际上，禽蛋中存在多种抗微生物感染的活性蛋白质，如卵黏蛋白、转铁蛋白、抗生物素蛋白以及溶菌酶等，其中的卵黏蛋白是非常重要的抗菌抗病毒蛋白质之一。同很多粘蛋白家族成员一样，卵黏蛋白是一种含有唾液酸残基的巨大分子量的硫酸酯糖蛋白，现有的研究已经发现卵黏蛋白具有较好的抗菌抗病毒活性，其对多种病毒引起的血球凝集反应具有很好的抑制作用。然而到目前为止，尚未有卵黏蛋白产品能够达到商业应用的水平，其中两个很重要的原因是卵黏蛋白经过纯化制备过程后会造成抗菌抗病毒活性的损失，另外其较低的溶解性无法达到其发挥活性需要的浓度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂。
上述目的可以通过以下技术方案实现：
一种卵黏蛋白液体制剂，它含有下述重量百分比的成分：
所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。
优选地，所述卵黏蛋白液体制剂中还含有50～500mmol/L的钙离子或10～500mmol/L镁离子。
进一步优选地，所述卵黏蛋白液体制剂中含有50～200mmol/L的钙离子或镁离子。
优选地，所述辅助蛋白为溶菌酶和卵转铁蛋白，所述溶菌酶与卵转铁蛋白的重量比为1∶1。
优选地，所述氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
优选地，所述多元醇为甘露醇和/或聚乙二醇。
一种卵黏蛋白液体制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将氨基酸溶解于pH值为6～8的缓冲液或水中，得到重量含量为1.5～4%的氨基酸溶液，再向氨基酸溶液中加入卵黏蛋白，使卵黏蛋白的重量含量为0.01～0.1%，搅拌至卵黏蛋白完全溶解；
2）继续向步骤1）的溶液中加入辅助蛋白，使辅助蛋白的重量含量为0.001～0.01%，4℃下用50～100转/分钟的转速搅拌，使其充分溶解；
3）最后加入多元醇，使多元醇的重量含量为0.5～5%，经0.45μm的无菌微滤膜过滤，即得，
所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。
优选地，还包括在步骤2）或3）中加入钙离子或镁离子，并使钙离子的浓度达到50～500mmol/L或镁离子的浓度达到10～500mmol/L的步骤。
优选地，所述氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
优选地，所述多元醇为甘露醇和/或聚乙二醇。
本发明制得的卵黏蛋白液体制剂可以喷涂于食品表面、动物或人口鼻、创伤伤口等处，可以起到抵御微生物入侵、降低病毒活性与毒力的作用。
本发明制备的卵黏蛋白液体制剂对细菌具有很好的粘附性，对病毒具有很强的抵抗活性，制剂中卵黏蛋白浓度高，蛋白生物活性有效期长，能有效抵御微生物入侵、降低病毒活性与毒力，对H5N1和H1N1流感病毒具有一定的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1 辅助蛋白对卵黏蛋白细菌粘附效果的影响
研究表明卵黏蛋白可通过黏附作用限制微生物的活动，进而对微生物的生长、增殖及毒性等起到抑制作用。在禽蛋蛋清中，天然状态下卵黏蛋白与溶菌酶等其他蛋清蛋白质以聚合态的形式形成浓厚蛋白，为禽蛋提供了抵御微生物入侵的屏障。因此，本发明模拟天然状态，研究不同的辅助蛋白对卵黏蛋白细菌粘附能力的影响。
在高纯度卵黏蛋白中分别按照表1的比例加入不同种类和比例的辅助蛋白，制成蛋白的混合物，然后以大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为对象，应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定不同蛋白混合物对细菌的粘附效果。
操作过程如下：不同蛋白样品溶解于50mol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.6)，调整蛋白浓度为100μg/mL。96孔酶标板中的每孔加入100μL的卵黏蛋白混合物，4℃固定过夜，轻轻吸出上清液，用PBS-T洗涤1-2次，以除去未固定的蛋白质。每孔加入100μL BSA，37℃孵育2h以屏蔽非特异性结合位点，然后用PBS-T洗涤1-2次。实验孔加入200μL的菌体后于37℃孵育60min，轻吸去多余菌液，再用PBS-T洗涤1-2次，除去未粘附的细菌。加入测试细菌的抗体100μL，37℃继续孵育1h，再加PBS-T洗涤。各孔加100μL辣根过氧化物酶标记的二抗（效价1:5000），室温放置30min后加入100μL的含有0.4mg/mL和0.2μL/mL H2O2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，室温避光放置30min。然后加入100μL的3mol/L的硫酸终止反应。在酶标仪上读取490nm处的吸光值。粘附率按下式计算：
其中，A为样品孔在490nm处吸光值，A0为细菌对照孔在490nm处吸光值，Ac为空白对照孔（不加菌体）的吸光值。
表1 辅助蛋白优选实验
上述结果表明以溶菌酶和/或卵转铁蛋白作为辅助蛋白可以显著提高卵黏蛋白对细菌的粘附效果，而其它的辅助蛋白如牛血清白蛋白和卵白蛋白效果不明显。
实施例2 盐对卵黏蛋白抗病毒活性的影响
分别将卵黏蛋白溶解于含有不同盐（150mmol/L）的缓冲液中，充分搅拌后离心，取沉淀再次用上述盐溶液溶解，调整蛋白终浓度为50μg/mL，采用SDS-PAGE电泳法测定样品纯度。同时参照国标GB/T 14926.53-2001和GB/T14926.54-2001的方法测定卵黏蛋白对鸡新城疫病毒的血凝及血凝抑制(HI)活性，以血凝效价的半数抑制浓度（IC50）为抗病毒活性指标，研究不同种类的盐处理对卵黏蛋白纯度及抗病毒活性的影响，结果如表2所示。
表2 盐种类对卵黏蛋白制剂的抗病毒效果的影响
盐种类 IC50（ug/mL）
对照（未处理） 26.75±0.25
钠盐 25.61±0.70
钾盐 27.83±0.65
锌盐 26.56±0.82
铁盐 25.52±1.28
钙盐 20.82±1.83
镁盐 16.46±0.88
镁盐+钙盐 13.00±0.01
上述数据显示，与空白对照以及其他盐处理组相比，经钙或镁盐处理后，卵黏蛋白的抗病毒活性显著增强。
进一步应用血凝抑制试验评价了不同浓度钙盐和镁盐对卵黏蛋白制剂的抗病毒活性的影响，结果列于表3。
表3 钙盐和镁盐浓度对卵黏蛋白抗病毒活性的影响
以上试验结果表明，50～500mmol/L钙盐或10～500mmol/L镁盐可以使卵黏蛋白IC50与对照组相比降低，钙盐或镁盐的浓度为50～200mmol/L时效果更加显著。
实施例3 卵黏蛋白的溶解性试验
卵黏蛋白具有高度不溶解性，其在常见缓冲液中的饱和浓度约为0.1mg/mL，为了充分发挥卵黏蛋白的作用，需提高其溶解度。氨基酸为小分子有机物，其在溶液中不仅可以提高离子强度，还可以与蛋白质发生相互作用，改变蛋白质表面电荷，从而起到增加蛋白质溶解度的作用。因此，本发明研究了几种氨基酸对卵黏蛋白溶解度的影响。
将1g卵黏蛋白分别加入到100mL含有不同种类氨基酸（100mmol/L）的缓冲液中，定容后混匀，搅拌6～8h。1500r/min离心5min，用凯氏定氮法分别测定添加的总蛋白质、上清以及相应溶剂中的氮含量，溶剂的溶解性能以氮溶性指数表示，不添加增溶剂的蒸馏水和中性磷酸盐缓冲液作为空白对照。
卵黏蛋白溶解度的测定参照现有文献公知的方法（Hiidenhovi et al,2008）进行，根据A280=KCL，其中K为吸光系数，按蛋白质的平均系数1L/(g·cm)计算，则卵黏蛋白浓度C(mg/mL)=A280。
实验结果如表4所示。卵黏蛋白在不添加氨基酸的蒸馏水中溶解性很差，但添加赖氨酸可以使其氮溶性指数由2%左右提高到10%以上，溶解度可提高5倍以上，添加精氨酸可以使其氮溶性指数提高到20%以上，溶解度可提高8倍以上，而使用赖氨酸与精氨酸混合物时，溶解度可提高至约11倍左右。
表4 增溶剂对卵粘蛋白溶解度的影响
增溶剂 氮溶性指数（%） 溶解度（mg/mL）
蒸馏水 1.96±0.02 0.09±0.01
磷酸盐缓冲液 2.58±0.02 0.10±0.01
丝氨酸 3.72±0.42 0.16±0.01
丙氨酸 3.08±0.29 0.13±0.01
谷氨酸 5.81±0.64 0.22±0.01
甘氨酸 4.86±0.86 0.18±0.01
赖氨酸 10.67±1.24 0.52±0.02
精氨酸 20.14±1.47 0.79±0.02
精氨酸+赖氨酸 25.63±1.02 0.98±0.03
实施例4 添加保护剂延长卵黏蛋白有效期
在水溶液中，蛋白质易变性失去生物活性，为了延长卵黏蛋白制剂的有效期，研究多元醇、高分子多聚物（聚乙二醇）等对制剂有效期的影响。
卵黏蛋白制剂中添加2%的甘油（①）、甘露醇（②）、山梨醇（③）、聚乙二醇（④）或其混合物（②+④），搅拌均匀后分装至西林瓶中，密封后分别置于4℃静置，隔7天取样按照实施例1所述方法测定卵黏蛋白制剂对大肠杆菌的粘附能力，当粘附率下降到50%以下时，即认为制剂失效。测定结果如表5所示。
表5 保护剂对卵黏蛋白有效期的影响
上述数据显示，未添加保护剂的卵黏蛋白制剂在低温贮藏条件下对细菌的粘附能力迅速降低，细菌粘附率在贮藏3周后已低于50%，而添加一定量的保护剂以后，其对大肠杆菌的粘附能力可以保持5周以上，其中，甘露醇（②）和聚乙二醇（④）效果较好，而将两者复合使用时获得的效果最佳，在保存7周后制剂对细菌的粘附率仍然可以保持在50%以上。
实施例5～9 卵黏蛋白液体制剂及其抗病毒效果检验
实施例5～9中，卵黏蛋白液体制剂的配方如表6所示：
表6 实施例5～9的配方
注：符号“%”表示百分比，系指重量的比例；R代表溶菌酶、L代表卵转铁蛋白。
其制备方法为：1）将氨基酸溶解于缓冲液或水中，得到一定浓度的氨基酸溶液，再向氨基酸溶液中加入一定量的卵黏蛋白，搅拌至卵黏蛋白完全溶解；
2）继续向步骤1）的溶液中加入一定量的辅助蛋白，4℃下用50～100转/分钟的转速搅拌，使其充分溶解；
3）最后加入一定量的镁盐或钙盐（如氯化钙、硫酸镁）和多元醇，经0.45μm的无菌微滤膜过滤，即得。
实施例5～9的卵黏蛋白液体制剂对流感病毒的抑制作用：
流感病毒会导致犬肾细胞（MDCK细胞）的死亡，而卵黏蛋白可以抑制病毒，从而对细胞具有保护作用。为了验证卵黏蛋白液体制剂的有效性，将制剂先与MDCK细胞进行孵育，再接入流感病毒，考察细胞的存活率和对病毒的抑制率。
具体步骤为：96孔板中的犬肾细胞（MDCK细胞）长成70%～80%单层后，吸去培养液，加入100μL卵黏蛋白液体制剂，37℃孵育1h，弃掉样品液，加入100倍TCID50的流感病毒液100μL，37℃孵育1h。洗去游离病毒，加入细胞维持液200μL于37℃、5%CO2中继续培养，观察细胞病变。将终止观察的96孔培养板的每孔加入10μL CCK-8溶液（100uL体系），轻轻混匀，置37℃培养箱中孵育1h后，于酶联免疫测定仪上读取450nm处吸光值(A450)值，按下列公式计算卵黏蛋白对流感病毒的抑制率，同时取维持液进行血凝实验，以判断细胞病变是由病毒引起的特异性病变。
本发明卵黏蛋白制剂对流感病毒的抑制效果如表7所示。
表7 卵黏蛋白对流感病毒的抑制效果
结果表明，流感病毒侵染前在MDCK细胞中加入不同浓度的卵黏蛋白，其对H5N1和H1N1病毒的感染均具有一定的抑制作用，并且细胞存活率和病毒感染抑制率均随着卵黏蛋白浓度的增大而升高，说明本发明所制备的卵黏蛋白液体制剂在流感病毒侵染细胞的过程中具有良好的抗病毒效果。

Claims (10)

1.一种具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：含有下述重量百分比的成分：
所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：所述卵黏蛋白液体制剂中还含有50～500mmol/L的钙离子或10～500mmol/L镁离子。
3.根据权利要求2所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：所述卵黏蛋白液体制剂中含有50～200mmol/L的钙离子或镁离子。
4.根据权利要求1～3任何一项所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：所述辅助蛋白为溶菌酶和卵转铁蛋白，所述溶菌酶与卵转铁蛋白的重量比为1∶1。
5.根据权利要求1～3任何一项所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：所述氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
6.根据权利要求1～3任何一项所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂，其特征在于：所述多元醇为甘露醇和/或聚乙二醇。
7.一种具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将氨基酸溶解于pH值为6～8的缓冲液或水中，得到重量含量为1.5～4％的氨基酸溶液，再向氨基酸溶液中加入卵黏蛋白，使卵黏蛋白的重量含量为0.01～0.1％，搅拌至卵黏蛋白完全溶解；
2)继续向步骤1)的溶液中加入辅助蛋白，使辅助蛋白的重量含量为0.001～0.01％，4℃下用50～100转/分钟的转速搅拌，使其充分溶解；
3)最后加入多元醇，使多元醇的重量含量为0.5～5％，经0.45μm的无菌微滤膜过滤，即得，
所述辅助蛋白为溶菌酶和/或卵转铁蛋白。
8.根据权利要求7所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂的制备方法，其特征在于：还包括在步骤2)或3)中加入钙离子或镁离子，并使钙离子的浓度达到50～500mmol/L或镁离子的浓度达到10～500mmol/L的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂的制备方法，其特征在于：所述氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
10.根据权利要求7或8所述的具有抗菌和抗病毒活性的卵黏蛋白液体制剂的制备方法，其特征在于：所述多元醇为甘露醇和/或聚乙二醇。
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