CN106497791B

CN106497791B - 一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂

Info

Publication number: CN106497791B
Application number: CN201610927509.XA
Authority: CN
Inventors: 李金霞; 杨海丽; 都海渤; 刘波; 刘毅; 胡海蓉; 李赞; 程池
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: CN106497791A

Abstract

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂，该保护剂主要含有海藻糖、谷氨酸钠、L‑半胱氨酸盐酸盐和牛血清白蛋白，其含量为海藻糖2%‑6%、谷氨酸钠12%‑18%、L‑半胱氨酸盐酸盐0.5%‑1.5%、牛血清白蛋白0.25%‑0.75%。上述冻干保护剂主要用于金黄色葡萄球菌冻干菌粉的制备。金黄色葡萄球菌菌体经过培养、离心、洗涤后将其收集，在冻干前与保护剂混合，分装，于‑80℃预冻2‑3h，然后冷冻干燥16‑18h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。在制备菌粉的过程中使用该保护剂，能提高菌体的抗冷冻能力，从而大大提高菌粉在冻干处理过程中的存活率。用本发明的冻干保护剂处理金黄色葡萄球菌的冻干过程，获得的金黄色葡萄球菌冻干菌粉存活率可达99.82%。

Description

一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂

技术领域

本发明涉及微生物技术领域的一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂。

背景技术

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，广泛分布于自然界，是一种可以引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。目前在食品、化妆品卫生标准中已将金黄色葡萄球菌的检验作为常规检验项目。

金黄色葡萄球菌多以冻干粉的形式供应市场，国内外广泛采用的金黄色葡萄球菌冻干保护剂有可溶性淀粉、脱脂奶粉、海藻糖、乳糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、抗坏血酸钠、维生素C等。据文献报道，以脱脂奶粉为单一保护剂，冻干后金黄色葡萄球菌存活率不足50%，而以可溶性淀粉、脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、抗坏血酸钠、磷酸盐缓冲液作为菌种复方冷冻干燥保护剂，冻干后金黄色葡萄球菌存活率也只有51.74%。这些保护剂的保护效果都不够理想，而实际上，冻干保护剂的作用会随保护剂的组成和配比表现出一定的差异性，因此，开发性质独特、作用高效的金黄色葡萄球菌冻干保护剂具有重要意义。

发明内容

本发明旨在提供一种能有效提高金黄色葡萄球菌冻干制备过程存活率的新型复合保护剂。

本发明通过以下技术方案实现：

一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂，包括海藻糖、谷氨酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐和牛血清白蛋白。

一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂，以质量体积百分比计，包括以下组分：

海藻糖2%-6%、谷氨酸钠12%-18%、L-半胱氨酸盐酸盐0.5%-1.5%、牛血清白蛋白0.25%-0.75%。

所述的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂，优选，以质量体积百分比计，包括以下组分：

海藻糖2%、谷氨酸钠15%、L-半胱氨酸盐酸盐0.5%、牛血清白蛋白0.5%。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，均指质量体积百分比；溶液的百分比，除另有规定外，均指溶液100ml中含有溶质若干克。

若未特别说明，本发明中涉及到的溶液的溶剂均为水。

本发明的一种金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的有益效果如下：

复合保护剂中加入海藻糖可以替代细胞中的水分子与细胞膜和蛋白质上的亲水基团形成水合键，保证了蛋白质结构和功能的稳定，同时海藻糖还可以提高菌悬液的玻璃化转变温度，使菌悬液形成玻璃态，使敏感性物质嵌入到玻璃态中，从而保护细胞；谷氨酸钠在冻干过程中可以与水作用使干粉保留微量的水分，以满足微生物细胞维持生命的最低需求，此外谷氨酸钠还具有抗氧化的作用，抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止对细胞膜造成不可逆的破坏；L-半胱氨酸是唯一具有活性巯基（-SH）的氨基酸，具有还原性，在冻干过程中，氨基酸的氨基团与微生物细胞蛋白质的羰基作用，可以使蛋白质的结构稳定；血清白蛋白是一种经典、优良的蛋白质稳定剂，可以使蛋白质活性不受损失，对冻干过程中的大多数蛋白都具有保护作用。

综上，本发明提供的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂，结合糖类、蛋白类保护剂和抗氧化剂，使其达到增效、协同的作用，有效提高了金黄色葡萄球菌冻干粉的存活率，可以达到99.82%。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不脱离本发明技术方案的精神和实质的前提下，凡是对本发明技术方案进行的修饰或者替换，均应涵盖在本发明的保护范畴中。

实施例中涉及到的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）标准菌株（CICC21600）由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

在实施例中，菌粉的制备及冻干存活率的计算采用如下方式：在常规的适宜条件下转接复活菌株后摇瓶扩增，将稳定初期菌悬液6000rpm离心10min，弃上清，留菌泥用等量生理盐水洗涤，6000rpm离心10min，弃上清，将得到的菌泥与保护剂混匀，取1ml按10倍递增稀释法稀释，选择适宜稀释度倾注法计数，其余菌液分装西林瓶， -80℃预冻2-3h，然后真空冷冻干燥16-18h，压盖，下机，-20℃保藏。结束干燥后，随机取3瓶立即复水，用1.1ml生理盐水使其溶解完全，取1ml按前述方法计数，计算冻干前后的活菌数之比，即保护剂对于菌种的冻干存活率。

实施例1

本实施例的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的组成为：海藻糖2g、谷氨酸钠12g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、牛血清白蛋白0.25g、蒸馏水100ml。

其制备方法：

1）按量在蒸馏水中添加2g的海藻糖、12g的谷氨酸钠，113℃灭菌15min，冷却至室温；

2）按量将0.5g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；

3）将步骤1）、2）所制备的溶液混合，并调整水的总质量体积百分比为100%，得到金黄色葡萄球菌复合冻干保护剂。

将金黄色葡萄球菌活化培养、离心、洗涤后，收集菌泥，在冻干前与保护剂混合，分装，于-80℃预冻3h，然后冷冻干燥18h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。经检测金黄色葡萄球菌菌粉的冻干存活率为94.10%。

实施例2

本实施例的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的组成为：海藻糖4g、谷氨酸钠12g、L-半胱氨酸盐酸盐1g、牛血清白蛋白0.75g、蒸馏水100ml。

其制备方法：

1）按量在蒸馏水中添加4g的海藻糖、12g的谷氨酸钠，113℃灭菌15min，冷却至室温；

2）按量将1g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；

3）将步骤1）、2）所制备的溶液混合，并调整水的总质量体积百分比为100%，得到金黄色葡萄球菌冻干保护剂。

将金黄色葡萄球菌活化培养、离心、清洗后，收集菌泥，在冻干前与保护剂混合，分装，于-80℃预冻3h，然后冷冻干燥16h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。经检测金黄色葡萄球菌菌粉的冻干存活率为71.40%。

实施例3

本实施例的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的组成为：海藻糖6g、谷氨酸钠18g、L-半胱氨酸盐酸盐1g、牛血清白蛋白0.25g、蒸馏水100ml。

其制备方法：

1）按量在蒸馏水中添加6g的海藻糖、18g的谷氨酸钠，113℃灭菌15min，冷却至室温；

2）按量将1g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；

将金黄色葡萄球菌活化培养、离心、清洗后，收集菌泥，在冻干前与保护剂混合，分装，于-80℃预冻3h，然后冷冻干燥17h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。经检测金黄色葡萄球菌菌粉的冻干存活率为77.88%。

实施例4

本实施例的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的组成为：海藻糖2g、谷氨酸钠15g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、牛血清白蛋白0.5g、蒸馏水100ml。

其制备方法：

1）按量在蒸馏水中添加2g的海藻糖、15g的谷氨酸钠，113℃灭菌15min，冷却至室温；

2）按量将0.5g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.5g的牛血清白蛋溶解于蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；

将金黄色葡萄球菌活化培养、离心、清洗后，收集菌泥，在冻干前与保护剂混合，分装，于-80℃预冻3h，然后冷冻干燥18h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。经检测金黄色葡萄球菌菌粉的冻干存活率为99.82%。

实施例5

本实施例的金黄色葡萄球菌冻干制备用新型复合保护剂的组成为：海藻糖6g、谷氨酸钠15g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、牛血清白蛋白0.75g、蒸馏水100ml。

其制备方法：

1）按量在蒸馏水中添加6g的海藻糖、15g的谷氨酸钠，113℃灭菌15min，冷却至室温；

2）按量将0.5g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；

将金黄色葡萄球菌活化培养、离心、清洗后，收集菌泥，在冻干前与保护剂混合，分装，于-80℃预冻3h，然后冷冻干燥18h，得到金黄色葡萄球菌菌粉。经检测金黄色葡萄球菌菌粉的冻干存活率为93.87%。

Claims

1.一种用于制备冻干金黄色葡萄球菌的复合保护剂，其特征在于，由以下组份组成，其组成以质量体积百分比计：海藻糖2%-6%、谷氨酸钠12%-18%、L-半胱氨酸盐酸盐0.5%-1.5%、牛血清白蛋白0.25%-0.75%，余量为蒸馏水。

2.根据权利要求1所述的用于制备冻干金黄色葡萄球菌的复合保护剂，由以下组份组成，其组成以质量体积百分比计：海藻糖2%、谷氨酸钠15%、L-半胱氨酸盐酸盐0.5%、牛血清白蛋白0.5%，余量为蒸馏水。