BE1020496A3 - Composition anti-inflammatoire pour moduler la reponse cellulaire des neutrophiles et des eosinophiles. - Google Patents

Description

“Composition anti-inflammatoire pour moduler la réponse cellulaire des neutrophiles et des éosinophiles”

La présente invention se rapporte à une composition antiinflammatoire destinée aux humains et aux animaux comprenant un extrait d’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina comprenant un ovomucoïde et un ovoinhibiteur d’œuf de caille.

L’ovomucoïde est une enzyme inhibitrice de protéases (enzyme anti-protéases) qui est présente dans le blanc de l’œuf des oiseaux et qui comporte trois ponts disulfures et des résidus glucose, mannose, désoxy-glucose et acide sialique. Ce polypeptide comprend trois domaines fonctionnels très similaires capables chacun de fixer une protéase, par exemple la trypsine (on parle alors d’activité anti-trypsique).

L’ovoinhibiteur est une glycoprotéine dont la structure est différente de celle de l’ovomucoïde. Comme l’ovomucoïde, l’ovoinhibiteur fait partie des inhibiteurs des protéases à sérine. Il s’agit d’un inhibiteur puissant de la trypsine bovine, de Γα-chymotrypsine, de la chymotrypsine de poulet, de l’élastase, de la subtilisine (de Bacillus subtilis) et de protéases bactériennes et fongiques.

Les protéases sont des enzymes dotées de propriétés proinflammatoires protéolytiques contenues dans les granulations intracytoplasmiques des cellules immunitaires (mastocytes, basophiles, neutrophiles et éosinophiles, par exemple).

D’une part, certaines protéases, parmi lesquelles les sérine-protéases, sont impliquées chez l’homme, dans différents processus physiologiques de base tels que la coagulation, l’activation du complément, la réparation tissulaire et l’immunité. Les sérine-protéases interviennent également dans la cascade d’activation des basophiles et des mastocytes. Par exemple, les sérine-protéases sont présentes dans les mastocytes pulmonaires sous forme de tryptase et de chymase qui sont impliquées dans la cascade d’activation des basophiles et des mastocytes. Il a été montré que des anti-protéases peuvent inhiber l’activation des mastocytes comme le diispropylfluorophosphate (DFP) qui inhibe la libération de l'histamine par les mastocytes pulmonaires. Par ailleurs, des anti-protéases appartenant au groupe des serpines (antithrombine III et C1s estérase inhibiteur) permettent d’inhiber l’agrégation induite par le fMLP entre les neutrophiles et les plaquettes. De même, la protéinase 3 (PR3) qui est l’antigène cible des c-ANCA (cytoplasmic antineutrophil cytoplasmic antibodies) est inhibée par l’alpha-1 antitrypsine.

D’autre part les protéases libérées par les cellules proinflammatoires, par exemple lors d’une inflammation, peuvent conduire à une aggravation des symptômes comme c’est par exemple le cas pour l’asthme ou la fibrose kystique. Il a également été montré que des protéases libérées par des cellules pro-inflammatoires tels que les neutrophiles peuvent induire la production d’ions superoxydes et de cytokines pro-inflammatoires telle que NL8 conduisant au recrutement de neutrophiles au niveau du site de la réaction inflammatoire et ainsi à une aggravation des symptômes comme c’est le cas pour l’asthme et la fibrose kystique. Dans de tels cas, un parfait équilibre protéases/anti-protéases est recherché pour atténuer les symptômes et il est dès lors parfois utile de favoriser cet équilibre en apportant des inhibiteur de protéases, par exemple par l’intermédiaire d’un ovomucoïde.

Les principales cellules sanguines ayant une action proinflammatoire rapide (inférieure à une heure) sont les basophiles, les éosinophiles et les neutrophiles.

Les basophiles sont des cellules faiblement représentées chez l’homme et susceptibles d’infiltrer le site tissulaire de la réaction inflammatoire. Les basophiles sont de puissantes cellules proinflammatoires contenant, dans leurs granules, de nombreux médiateurs préformés tels que l’histamine et des protéases qui seront libérées après une activation par des cellules basophiles. L’activation des cellules basophiles peut être déclenchée par des mécanismes non dépendants des anticorps ou dépendants des anticorps et est principalement médiée par les IgE, les IgG et les IgA. Cette activation induit la libération de médiateurs, en particulier l'histamine qui provoque une réponse immunitaire. Ces différents mécanismes impliquant les cellules basophiles sont généralement observés lors de réactions inflammatoires allergiques.

Les éosinophiles sont des cellules sanguines retrouvées dans les tissus au niveau des sites de réactions inflammatoires et jouant un rôle régulateur majeur sur le système immunitaire. Les cellules éosinophiles possèdent des récepteurs membranaires pour les IgG, pour les IgA et pour les IgE ainsi que pour diverses cytokines (IL2, IL3, IL5, IFNy). L’activation des éosinophiles aboutit à leur dégranulation avec une libération de nombreux médiateurs parmi lesquels des protéines (MBP, ECP et EDN) et des enzymes (protéase, peroxydase, collagénases, ß-glucuronidase, lysophosphatase, phospholipases, histaminases, catalases, estérases, hexosaminidases, ...). L’activation des éosinophiles conduit, en outre, à la sécrétion de radicaux oxygénés impliqués dans le stress oxydatif et à la libération de dérivés de la voie de la cyclo-oxygénase. Les cellules éosinophiles sont impliquées dans de nombreuses pathologies telles que la gastrite, l’oesophagite, la proctocolite à éosinophile, la colite ulcéreuse, la maladie de Crohn, le syndrome de Churg-Strauss, la pneumonie à éosinophiles et les maladies parasitaires. Toutefois, les causes les plus fréquentes d’éosinophilie sont les maladies inflammatoires allergiques comme la dermatite atopique, la rhinite allergique et l’asthme.

Les neutrophiles sont des cellules pro-inflammatoires essentielles qui sont les premières cellules recrutées après des dommages tissulaires et en réponse à des agents infectieux ou à des allergènes. Ces cellules sont également impliquées dans le stress oxydatif et sont ainsi capables de libérer des dérivés oxygénés extrêmement actifs et toxiques pour les tissus sur le site de la réaction inflammatoire. Les neutrophiles peuvent être activés par la voie des IgA, des IgG et même des IgE.

Les cellules neutrophiles et éosinophiles sont susceptibles de libérer, après leur activation, des enzymes protéolytiques (protéases) aux effets parfois délétères sur les tissus, ce qui a notamment été démontré dans le cas de l’asthme. C’est pourquoi un équilibre protéases/anti-protéases est recherché pour atténuer les symptômes, ce qui peut être obtenu par l’apport d’inhibiteurs de protéases, par exemple par l’intermédiaire d’un ovomucoïde inhibiteur des protéases.

L’utilisation de l’ovomucoïde de l’œuf de caille en tant qu’inhibiteur des protéases dans les réactions inflammatoires est connue de l’état de la technique. Des études antérieures ont démontré l’effet inhibiteur de l’ovomucoïde de l’oeuf de caille sur l’activation des basophiles humains stimulés par un peptide bactérien, le N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP).

Par exemple, le document FR2901137 décrit plusieurs formes galéniques médicamenteuses destinées à la médecine humaine et animale, constituées par un ou plusieurs inhibiteurs naturels des enzymes protéasiques. Ce document divulgue ainsi des compositions médicamenteuses à base d’inhibiteurs naturels de protéase extraits d’œufs de caille, associés à des vitamines et/ou à des minéraux et/ou à des acides aminés et incorporés dans un excipient. Ces compositions médicamenteuses présentent une activité anti-inflammatoire globale ciblée sur tous les tissus et organes, une activité anti-inflammatoire non spécifique basée sur l’inhibition de la trypsine ou de ses homologues (élastase, tryptase, ...) et une activité anti-inflammatoire anti-allergique spécifique basée sur l’inhibition de la libération de médiateurs chimiques par les mastocytes ou les basophiles. Ces compositions médicamenteuses peuvent se présenter sous forme de comprimés comprenant un ou plusieurs inhibiteurs naturels des sérine-protéases, comme l’ovomucoïde et l’ovoinhibiteur extrait du blanc de l’oeuf de caille de l’espèce Cortumix corturnix japonica de souche B-Mina et divers constituants tels que par exemple des vitamines et/ou des acides aminés. Plus particulièrement, ces compositions médicamenteuses sont indiquées pour la prévention et le traitement des inflammations.

Le document FR2813531 porte également sur des compositions médicamenteuses comprenant un homogénat d’œuf de caille associé à des oligo-éléments et possédant une activité antiprotéasique et anti-inflammatoire. Ces compositions médicamenteuses présentent une activité anti-allergique non spécifique basée sur l’activité anti-protéasique de l’ovomucoïde de l’œuf de caille, une activité antiinflammatoire par inhibition de la libération de l'histamine par les mastocytes et les basophiles et une activité dermatologique par action sur les protéases des cellules spécialisées du derme, par exemple les neutrophiles. Ces compositions médicamenteuses peuvent se présenter sous formes de comprimés composés d’un homogénat d’oeufs de caille (jaune et blanc) possédant une activité anti-protéasique, anti-inflammatoire et anti-infectieuse liée à la fraction ovomucoïde contenue dans le blanc de l’oeuf et d’un ou plusieurs éléments incorporés. Ces compositions médicamenteuses sont indiquées notamment pour la prévention et le traitement des maladies allergiques, des infections respiratoires et de certaines affections cutanées.

Le document FR2939044 décrit des compositions médicamenteuses constituées d’un lyophilisât de lait d’ânesse mélangé à un ou plusieurs inhibiteurs naturels d’enzymes protéasiques humaines tels que l’ovomucoïde et l’ovoinhibiteur extraits dé l’oeüf de caille de l’espèce Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina. Cette formulation est indiquée dans la prévention et le traitements de pathologies affectant le système immunitaire mais aussi pour la mise en oeuvre de compléments alimentaires ou de produits cosmétiques. En effet, cette formulation présente une forte valeur nutritionnelle, une activité anti-inflammatoire globale sur tous les tissus et organes, une activité anti-inflammatoire non spécifique liée aux inhibiteurs de protéases humaines, une activité antiinflammatoire et anti-allergique spécifique grâce à l’inhibition de la libération de médiateurs chimiques excrétés par les cellules basophiles et les mastocytes et activité anti-inflammatoire dermatologiquë en exerçant une action inhibitrice sur les enzymes de l’inflammation.

En regard de l’art antérieur, il existe d’une part une activité anti-protéasique des ovomucoïdes et des ovoinhibiteurs de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina agissant sur les protéases humaines impliquées dans les mécanismes inflammatoires et allergiques comme par exemple sur la trypsine et ses homologues (élastase, tryptase, ...). Cette activité anti-protéasique agit donc sur les protéases après leur libération par les cellules pro-inflammatoires telles que les mastocytes, les basophiles, les éosinophiles et les neutrophiles. Il existe d’autre part une activité modulatoire de la réponse à une stimulation par des agents infectieux ou des allergènes des cellules pro-inflammatoires mastocytes et basophiles qui est divulguée dans l’état de la technique.

Toutefois, aucune modulation de la réponse inflammatoire des éosinophiles et des neutrophiles n’est divulguée à ce jour, c’est-à-dire qu’aucune action avant la libération des protéases par ces cellules éosinophiles et neutrophiles n’est divulguée aujourd’hui. En effet, toutes les études réalisées jusqu’à présent ciblent l’action de l’ovomucoïde après la sécrétion des protéases par les cellules pro-inflammatoires, aucune étude n’envisageant une action de l’ovomucoïde sur les neutrophiles et les éosinophiles avant la libération des protéases.

La présente invention se rapporte à une utilisation particulière de l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina dans une composition anti-inflammatoire destinée aux humains et aux animaux pour moduler la réponse cellulaire des neutrophiles et des éosinophiles, c’est-à-dire qui agit sur les cellules proinflammatoires avant la libération des médiateurs de la réaction inflammatoire comme les protéases. Dans le cadre de la présente invention, il a en effet été observé de façon tout à fait surprenante que l’ovomucoïde agit également en tant que modulateur de la réponse cellulaire des neutrophiles et des éosinophiles avant la libération des protéases. Cette action surprenante de l’ovomucoïde est particulièrement : avantageuse puisqu’elle permet d’agir directement sur les deux principales cellules pro-inflammatoires impliquées lors de réaction inflammatoires tissulaires pour en moduler les réponses cellulaires et ainsi empêcher la libération de médiateurs tels que les protéases. Ceci permet donc de minimiser les réactions inflammatoires en agissant avant la libération de protéases au départ des neutrophiles et des éosinophiles grâce au mécanisme d’inhibition intracellulaire de l’ovomucoïde de l’oeuf de caille sur les neutrophiles et les éosinophiles mis en avant dans le cadre de la présente invention, complémentaire à l’activité anti-protéasique décrite dans l’état de la technique et à la réponse modulatoire sur les mastocytes et les basophiles. Cette activité modulatoire est d’autant plus surprenante qu’il n’était pas évident de mettre en évidence un mécanisme se produisant en amont d’un phénomène recherché et attendu qu’il y avait lieu de provoquer pour en observer la libération de protéases pour pouvoir les inhiber. De plus, l’art antérieur est muet au sujet de la modulation de la réponse cellulaire des éosinophiles et des neutrophiles. D’ailleurs, si l’état de la technique divulgue la modulation de la réponse cellulaires des mastocytes et des basophiles, rien ne laisse présager que les mécanismes impliqués dans l’inhibition de la libération des médiateurs chimiques par les mastocytes et les basophiles par les ovomucoïdes serait identique pour l’inhibition de la libération des médiateurs chimiques par les éosinophiles et par les neutrophiles. Si l’état de la technique divulgue l’inhibition de l’activation des basophiles et que les résultats obtenus sur les mastocytes sont déduits de la littérature et concernent d’autres anti-protéases, il est apparu de manière surprenante qu’une inhibition de l’activation des éosinophiles et des neutrophiles avait lieu alors que ces mécanismes sont inconnus à ce jour.

Avantageusement, la composition anti-inflammatoire selon l’invention comprend en outre au moins une vitamine choisie dans le groupe constitué des vitamine A, B, C, D, E, F, K et P. Ces vitamines sont connues pour leur aptitude à renforcer le système immunitaire.

De façon tout aussi avantageuse, la composition antiinflammatoire selon l’invention comprend en outre au moins un minéral choisi dans le groupe constitué de Al, Bi, Co, Cu, Fe, F, Li, Mg, Ni, P, K, Se, S et Zn. Ces minéraux sont également connus pour leur aptitude à renforcer le système immunitaire.

De préférence, la composition anti-inflammatoire selon l’invention comprend en outre au moins un acide aminé choisi dans le groupe constitué de Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, Glu et Gin. Ces acides aminés sont également connus pour leur aptitude à renforcer le système immunitaire.

Avantageusement, la composition anti-inflammatoire selon l’invention comprend en outre au moins un extrait végétal choisi dans le groupe constitué des extraits végétaux de racines, de tiges, de feuilles, de fleurs et de fruits.

Préférentiellement, la composition anti-inflammatoire selon l’invention comprend en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable ou un excipient compatible avec l’alimentaire.

De préférence, la composition anti-inflammatoire selon l’invention est conditionnée sous forme de comprimés, de globules, de gélules, de granules, de poudre, de fluides, de liquides, de crèmes ou de sprays.

Avantageusement, la composition anti-inflammatoire selon l’invention comprend du Zn sous une forme protégée, par exemple du bisglycinate de Zn (Zn protégé entre deux glycines). Il est en effet apparu que le Zn sous forme protégée, en particulier le bisglycinate de Zn agit à la fois sur l’immunité et l’inflammation chronique par le biais de l’induction de la synthèse de cytokines spécifiques et par antagonisme du stress oxydant en tant qu’élément fondamental des enzymes impliquées dans le métabolisme des radicaux oxygénés.

Avantageusement, la composition anti-inflammatoire selon l’invention est administrée sous forme d’un complément alimentaire.

D’autres formes de réalisation de la composition antiinflammatoire sont mentionnés dans les revendications annexées.

D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux exemples et aux figures annexés.

La figure 1 illustre l’effet de l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina à la concentration dé 10 pg/ml sur l’activation des éosinophiles par le peptide bactérien fMLP.

La figure 2 illustre l’effet de l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina à la concentration de 10 pg/ml sur l’activation des neutrophiles par le peptide bactérien fMLP.

Les réactions inflammatoires exagérées pouvant être pathogènes pour l’homme sont appelées réactions d’hypersensibilité. Depuis 2003, et sur les recommandations de l’Académie Européenne d’Allergologie et d’immunologie Clinique, on distingue les hypersensibilités immunes (anticorps dépendantes ou impliquant des cellules du système immunitaire tels que les lymphocytes) et les hypersensibilités non immunes n’impliquant pas les éléments du système immunitaire et générant directement des éléments pro-inflammatoires ou ayant une action toxique directe.

En immuno-allergologie, des allergènes communs comme les moisissures, la blatte ou les acariens montrent une activité protéolytique, cystéine protéases pour les allergènes Der fl et Der p1 et sérine protéase pour les allergènes Der p3, 6, 9 Ces protéases sont actives par l’intermédiaire de récepteurs PAR (protéase-activated receptors) et sont impliquées dans le recrutement des éosinophiles et dans l’hyperactivité bronchique dans un modèle murin d’inflammation allergique.

Les principales cellules sanguines ayant une action proinflammatoire rapide (inférieure à une heure) mais étant également impliquées dans des mécanismes retardés, sont les basophiles, les neutrophiles et les éosinophiles.

L’éosinophile est essentiellement tissulaire et particulièrement au niveau digestif. Les principales causes d’hyperéosinophiles sont l’eczéma atopique, la rhinite allergique et l’asthme mais on connaît aujourd’hui de nombreuses pathologies digestives dans lesquels on observe un recrutement très important des éosinophiles. Le rôle de l’éosinophile dans l’immunomodulation est aujourd’hui reconnu. Cette cellule est rapidement présente sur le site de la réaction inflammatoire et est essentiellement localisée au niveau des muqueuses.

L’éosinophile contient de nombreux médiateurs cytotoxiques tels que l’eosinophil peroxydase (EPO) qui sont libérés par dégranulation mais les inhibiteurs de la dégranulation des éosinophiles sont peu connus. Les éosinophiles isolés de patients asthmatiques contiennent une activité élevée de type chymotrypsine ce qui semble impliquer ces protéases dans les mécanismes de dégranulation. Ainsi, le mésilate de nafamostat, puissant inhibiteur des sérine-protéases, inhibe non seulement l’activité protéolytique mais augmente aussi le nombre d’éosinophiles dans le BAL (lavage broncho-alvéolaire). De même, le SLPI (secretory leucocyte protéase inhibiteur) inhibe, dans un modèle d’allergie conjonctivale, le développement de la conjonctivite chez le cobaye.

L’inflammation allergique se décompose èn deux phases principales, à savoir une phase immédiate et une phase tardive. L’effet délétère des éosinophiles est surtout impliqué dans la phase tardive et au cours du passage à la chronicité. Les interactions intercellulaires sont multiples et un couple pro-inflammatoire puissant est représenté par le couple éosinophile-mastocyte.

L’éosinophile est une cellule sanguine retrouvée dans les tissus sur le site des réactions inflammatoires, colonisant spontanément les muqueuses et douée d’une dualité fonctionnelle caractéristique, participant à la défense anti-tumorale et parasitaire mais jouant également un rôle régulateur majeur sur le système immunitaire. Cette cellule décrite pour la première fois par Paul Ehrilch (1854-1915) est caractérisée par la couleur rouge brique prise par ses granules colorés par l’éosine, du fait de la présence de protéines fortement basiques.

L’éosinophile possède des récepteurs membranaires pour les IgG (FcyRI et FcyRIl), pour les IgA (FcaRI) et pour les IgE (FcsRI et FcsRIl) ainsi que pour diverses cytokines (IL2, IL3, IL5, IFNy). L’activation des éosinophiles aboutit à leur dégranulation avec libération de nombreux médiateurs : des médiateurs parmi lesquels des protéines . (MBP (major basic protein), ECP (eosinophil cationic protein) et EDN (eosinophil derived neurotoxin) et des enzymes EPO (eosinophil peroxydase), collagénases, ßglucuronidase, lysophosphatase, arysulfatase et phosphatase acide, phospholipases, histaminases, catalases, estérases, hexosaminidases. L’activation des éosinophiles conduit, en outre, à la sécrétion de radicaux oxygénés du stress oxydatif. Ils libèrent également du LTC4, du PAF et des dérivés de la voie de la cyclooxygénase.

De plus, ils produisent de nombreuses cytokines et particulièrement des cytokines immuno régulatrices (IFNy, IL2, IL12, IL4, IL10, IL3), des cytokines pro-inflammatoires (IL1, IL6, TNFa), des cytokines antiinflammatoires (TGFa et ß) et des chemokines (RANTES, éotaxine). L’activation des éosinophiles peut être médiée par les IgE, les IgG ou les IgA, cette dernière pouvant même être, dans certaines situations, plus activatrice que l’IgE et est souvent sous-estimée.

Le neutrophile occupe une place centrale en tant que cellule essentielle de défense et pro-inflammatoire. Cette cellule est impliquée dans le stress oxydatif car susceptible, à l’image de l’éosinophile, de libérer des dérivés oxygénés extrêmement actifs et toxiques pour les tissus sur le site de la réaction inflammatoire.

Les neutrophiles peuvent être activés par des voies non immunes et immunes et, parmi celles-ci, par la voie des IgA, des IgG et même des IgE. En effet, les neutrophiles expriment le récepteur de haute affinité pour l’IgE et sont les premières cellules recrutées après dommage tissulaire, agent infectieux ou allergènes. Ainsi, la provocation allergénique bronchique induit un recrutement massif de neutrophiles au niveau pulmonaire chez l’homme et l’animal.

De plus, les neutrophiles activés synthétisent de ΙΊL8 au cours d’une activation IgE dépendante laquelle induit un afflux supplémentaire de neutrophiles. Le neutrophile, comme l’éosinophile, est susceptible de libérer, après activation, des enzymes protéolytiques aux effets délétères sur les tissus.

Il a donc été, selon la présente invention, démontré que l’ovomucoïde de l’oeuf de caille était capable d’inhiber, outre l’activation des basophiles induite par le fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine), peptide bactérien possédant des récepteurs spécifiques membranaires sur les polynucléaires humains, l’activation des éosinophiles et des neutrophiles par le fMLP.

Exemple 1 : effet inhibiteur de l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix - .

corturnix iaponica de souche B-Mina sur les éosinophiles.

Un volume de 0,5 ml de sang est prélevé et dilué 3 fois dans le tampon calcium (127 mM NaCI, 5 mM KCI, 20 mM Trizma, 5mM CaCI2, 5 mM MgCI2, 5 lU/ml héparine, pH 7,4) selon les conditions suivantes : - témoin négatif : 60 μΙ de tampon calcium sont ajoutés à 60 μΙ de la solution précédente (solution n°1) ; - témoin positif : 60 μΙ de la solution de N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP 10-7M, Sigma, USA) sont ajoutés à 60 μΙ de la solution précédente (solution n°2); - échantillon test : 60 μΙ de la solution de la dilution de l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina à la concentration de 10 pg/ml sont ajoutés à 60 μΙ de la solution précédente (solution n°3).

Les solutions ainsi obtenues sont pré-incubées durant 30 min à température ambiante. Ensuite, 60 μΙ de tampon calcium sont ajoutés à la solution n°1 (témoin négatif - bloc A à la figure 1) tandis que 60μΙ de la solution de N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP 10-7M, Sigma, USA) sont ajoutés aux solutions n°2 et n°3 (blocs B et C à la figure 1) avant une deuxième incubation de 30 min à 37°C.

Dans chacun des trois échantillons, les leucocytes sont spécifiquement marqués et incubés 15 min à température ambiante et à l’obscurité après ajout d’un cocktail d’anticorps marqués (anti-lgE, anti-CD63, anti-CD11b, anti-CD49d). Le CD49d est un marqueur permettant la sélection des éosiniphiles ainsi que la sélection négative des neutrophiles. Les suspensions leucocytaires ainsi préparées sont ensuite lysées (tampon chlorure d’ammonium) avant une analyse (n=10) par cytométrie en flux (XL Coulter Beekman) permettant de caractériser et de trier les cellules qui sont entraînées par un flux dans le faisceau d’un laser, la lumière réémise permettant de distinguer les différents types de cellules. Il est ainsi possible de distinguer si les marqueurs s’expriment ou non, c'est-à-dire si les éosinophiles sont activés ou non en mesurant l’intensité de fluorescence (Fl).

Les résultats obtenus par cytométrie en flux sont illustrés à la Figure 1. Les résultats indiquent que l’ajout de l’ovomucoïde à la solution comprenant des éosinophiles et le peptide bactérien fMLP réduit significativement (P<0,001) l’expression du marqueur CD11b, ce qui démontre le rôle immunomodulateur de l’ovomucoïde sur la réponse cellulaire des éosinophiles. En effet, la moyenne d’intensité de fluorescence mesurée pour les échantillons contenant l’ovomucoïde est significativement inférieure à la moyenne d’intensité de fluorescence mesurée pour le : témoin positif. La diminution de l’intensité de fluorescence du marqueur CD11b démontre une inhibition de l’activation par le fMLP. Le CD11b est une intégrine très impliquée dans la communication avec les cellules épithéliales et a un rôle physiologique majeur dans la migration des éosinophiles sur le site de la réaction inflammatoire. Une inhibition de l’expression de CD11b correspond donc à la fois à une inhibition de l’activation cellulaire et donc potentiellement à l’inhibition de la libération de médiateurs mais également à une diminution du recrutement de ces cellules sur le site de la réaction inflammatoire.

Exemple 2 : effet inhibiteur de l'ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix iaponica de souche B-Mina sur les neutrophiles.

Un volume de 0,5 ml de sang est prélevé et dilué 3 fois dans le tampon calcium (127 mM NaCI, 5 mM KCI, 20 mM Trizma, 5mM CaCI?, 5 mM MgCb, 5 lU/ml héparine, pH 7,4) selon les conditions suivantes : - témoin positif : 60 μΙ de la solution de N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP 10-7M, Sigma, USA) sont ajoutés à 60 pl de la solution précédente (solution n°1); - échantillon test : 60 μΙ de la solution de la dilution de rovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina à la concentration de 10 pg/ml sont ajoutés à 60 μΙ de la solution précédente (solution n°2).

Les solutions ainsi obtenues sont pré-incubées durant 30 min à température ambiante. Ensuite, 60μΙ de la solution de N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP 10-7M, Sigma, USA) sont ajoutés aux solutions n°1 (bloc A à la figure 2) et n°2 (bloc B à la figuré 2) avant une deuxième incubation de 30 min à 37°C.

Dans chacun des trois échantillons, les leucocytes sont spécifiquement marqués et incubés 15 min à température ambiante et à l’obscurité après ajout d’un cocktail d’anticorps marqués (anti-lgE, anti-CD63, anti-CD11b, anti-CD49d). Il a ainsi été possible de détecter la réponse spécifique des neutrophiles en mesurant l’index d’activation du marqueur CD11b. Ces résultats sont présentés à la Figure 2. Ces résultats montrent que l’ovomucoïde de l’œuf de caille Corturnix corturriix japonica de souche B-Mina permet d’inhiber spécifiquement la réponse cellulaire des neutrophiles en réduisant leur activation par le peptide fMLP.

Applications potentielles

La dermatite atopique est une maladie inflammatoire de la peau qui affecte entre 10 à 15% des enfants et dont la prévalence est en constante augmentation. Plus de 2/3 des patients commencent leur affection dans la première année de vie. Pour ce qui concerne l'histoire naturelle de la maladie, les auteurs ne sont pas d’accord : certains affirment que 90% des dermatites atopiques sont en rémission avant l’âge de 10 ans tandis que d’autres affirment que seuls 60% de ces enfants ne souffriront plus d’atopie à l’âge adulte. La vérité se situé probablement entre ces deux approches, sachant que les études hospitalières sont biaisées, les petits eczémas n’arrivant pas dans les services hospitaliers. Les critères de mauvais pronostic seraient le début à un âge précoce de manifestations sévères, l’association à une allergie respiratoire de type asthme ou rhinite allergique. Parmi les différentes hypothèses immunologiques, un déséquilibre de la balance Th1/Th2 au profit des cytokines de type 2, étant à l’origine du développement d’une, dermatite atopique, est soutenue par des travaux montrant l’existence chez des nourrissons d’un taux sérique élevé d’IL4 plusieurs mois avant le déclenchement de la dermatite atopique. L’IL5, cytokine majoritairement impliquée dans le recrutement tissulaire des éosinophiles, serait également intimement liée au développement d’une dermatite atopique.

Le traitement de cette pathologie repose sur l’utilisation associée de topiques, d’un régime adapté et d’une chimiothérapie allant des corticoïdes aux immunosuppresseurs.

L’éosinophile est impliqué dans de nombreuses pathologies telles que la gastrite, l’oesophagite et la proctocolite à éosinophile et d’autres maladies inflammatoires intestinales telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn. On doit citer également le syndrome Churg-Strauss, la pneumonie à éosinophile, et, bien entendu, lès infestations parasitaires. Toutefois, les causes les plus fréquentes d’éosinophilie, dans le monde occidental, sont les maladies inflammatoires allergiques comme la dermatite atopique, la rhinite allergique et l’asthme. Dans ces pathologies, l’éosinophile n’agit pas seul mais de nombreuses coopérations cellulaires sont aujourd’hui démontrées telle que la coopération éosinophile-mastocyte.

L’ovomucoïde a de plus un potentiel immunomodulateur et des effets sur la production de cytokines T cell dépendante ont été décrits. Les effets délétères des protéases issues de l’activation des neutrophiles sur la muqueuse pulmonaire ont conduit à la recherche de molécules thérapeutiques spécifiques. Il a été également démontré que l’inhibition des protéases du neutrophile induisait une meilleure efficacité de la phagocytose par augmentation du burst oxygénatif. De cette façon, une application d’ovomucoïde dans le traitement de la dermatite atopique et affectio similaire permet de bénéficier d’une action intracellulaire anti-protéasique de l’ovomucoïde de l’oeuf de caille laquelle s’ajoute à son activité extracellulaire naturelle. Ainsi, l’ovomucoïde de l’oeuf de caille montrant un effet inhibiteur sur l’activation des polynucléaires humains (éosinophiles, basophiles, neutrophiles) et est donc un excellent candidat anti-inflammatoire, pas seulement pour la dermatite atopique.

Il est bien entendu que la présente invention n’est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims (9)

1. Composition anti-inflammatoire destinée aux humains et aux animaux pour moduler la réponse cellulaire des neutrophiles et des éosinophiles, comprenant un extrait d’œuf de caille Corturnix corturnix japonica de souche B-Mina comprenant un ovomucoïde et un ovoinhibiteur d’œuf de caille.

2. Composition anti-inflammatoire selon les revendication 1 et 2, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins une vitamine choisie dans le groupe constitué des vitamine A, B, C, D, E, F, K et P.

3. Composition anti-inflammatoire selon l’une des quelconque revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un minéral choisi dans le groupe constitué de Al, Bi, Co, Cu, Fe, F, Li, Mg, Ni, P, K, Se, S etZn.

4. Composition anti-inflammatoire selon l’une des quelconque revendications 1 à 3, caractérisée en qu’elle comprend en outre au moins un acide aminé choisi dans le groupe constitué de Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, Glu et Gin.

5. Composition anti-inflammatoire selon l’une des quelconque revendications 1 à 4, caractérisée en qu’elle comprend en outre au moins un extrait végétal choisi dans le groupe constitué des extraits végétaux de racines, de tiges, de feuilles, de fleurs et de fruits.

6. Composition anti-inflammatoire selon l’une des quelconque revendications 1 à 5, caractérisée en qu’elle comprend en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable ou compatible avec l’alimentaire.

7. Composition anti-inflammatoire selon l’une des quelconque revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’elle est conditionnée préférentiellement sous forme de comprimés, de globules, de gélules, de granules, de poudre, de fluides, de liquides, de crèmes ou de sprays.

8. Composition anti-inflammatoire selon la revendication 3, caractérisée en ce que le Zn est du Zn protégé.

9. Composition anti-inflammatoire selon les revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle est administrée sous forme d’un complément alimentaire.