MX2007011032A - Estabilizador quimicamente definido. - Google Patents

Estabilizador quimicamente definido.

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MX2007011032A
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vaccine
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MX2007011032A
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Petrus Gelder Van
Arnoldus Loermans
Mathias Maassen
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Intervet Int Bv
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Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion estabilizadora que comprende un amino acido, y un azucar en donde todos los compuestos se definen quimicamente; a una composicion de vacuna que comprende tal composicion estabilizadora y una molecula biologica y/o un micro-organismo; a un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende la mezcla de tal composicion estabilizadora con una molecula biologica y/o un micro-organismo; al uso de tal composicion estabilizadora, y de vacunas preparadas con la misma.

Description

ESTABILIZADOR QUÍMICAMENTE DEFINIDO La presente invención se refiere a una composición estabilizadora que comprende un amino ácido y un azúcar, en donde todos los compuestos se encuentran químicamente definidos; a una composición de vacuna que comprende tal composición estabilizadora y una molécula biológica y/o micro-organismo; a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende la incorporación de tal composición estabilizadora con una molécula biológica y/o un micro-organismo; al uso de tal composición estabilizadora y de vacunas preparadas con la misma. En la industria bio-farmacéutica involucrada en la producción de micro-organismos y moléculas biológicas como productos, la estabilidad de estos productos es un tema importante. Casi siempre, estos productos necesitan formularse, almacenarse y transportarse. Inevitablemente, por influencias experimentadas con el tiempo, derivadas de cambios de temperatura y otras influencias físicas o químicas, los materiales producidos pierden sus propiedades originales de cantidad eficaz o cualitativas deseadas. En consecuencia, se aplican las condiciones y aditivos para evitar tal pérdida de calidad y/o de cantidad eficaz. Muchas de las condiciones de estabilización utilizadas son el almacenamiento a temperatura reducida, encima o por debajo de cero °C, y reducción del contenido de agua; es especialmente útil la liofilización.
En la liofilización, una muestra que contiene una molécula biológica o farmacéuticamente activa, un micro-organismo, una célula o un tejido se congela primero, y después se seca al vacío. Las muestras liofilizadas pueden almacenarse entonces a, por ejemplo, 4°C y con frecuencia permanecen estables durante años. Ver para revisiones: M . Pikal , 1 990 (BioPharm , vol . 3, no. 8, p. 1 8-27 y no. 9, p. 26-30); L. Gatlin, et al. , 1 994 (Bioprocess Techn. Vol . 1 4, p. 969-975); F. Bedu-Addo , 2004 ( Pharm . Tech . , 1 Febrero, p. 101 8). De manera ideal, un producto liofilizado tiene una calidad y cantidad casi sin cambios del(de los) componente(s) liofilizado(s) durante un cierto periodo de tiempo, así como también un cuerpo o torta liofilizada de apariencia atractiva y elegante, que puede resistir las influencias físicas de transporte y que se disuelve fácilmente después de reconstituirse en un diluyente. Para lograr todos estos requisitos para una muestra liofilizada y para hacer que 'sobreviva' la muestra a las diversas condiciones desfavorables que ocurren durante el proceso de liofilización en sí (congelamiento, secado, calentamiento, enfriamiento), el almacenamiento prolongado en estado liofilizado y la reconstitución, la muestra por liofilizarse se mezcla normalmente con una composición estabilizadora antes de la liofilización . Los compuestos de una composición estabilizadora se llaman comúnmente: agente de abultamiento, formador de torta, lioprotector, modificador de tonicidad, surfactante, protector crio(génico), protector de congelamiento, desecante, agente de liofilización , etc. , en donde un compuesto específico puede tener varias funciones. El término "soluto compatible" también se utiliza para indicar un compuesto que estabiliza moléculas y organismos en condiciones de un ambiente bajo en agua (M .S. da Costa et al. , 1 998, Adv. Bioch . Eng and Tech . , vol . 61 , p. 1 1 7-1 53). Las composiciones estabilizadoras, ya sea para liofilización o para otros usos estabilizadores, con mezclas complejas de proteínas, carbohidratos, l ípidos y sales; la composición de las cuales puede adaptarse a cada molécula o micro-organismo por estabilizarse, o para un propósito específico. Aunque rara vez se conoce la manera como funciona exactamente un estabilizador, el hallazgo común es que grandes compuestos de elevado peso molecular generalmente proporcionan buenos efectos estabilizadores. Por consiguiente, de antaño, los principales ingredientes utilizados en estabilizadores fueron tales compuestos voluminosos. Para mantener bajos los costos de material , se tomaban de productos fácilmente disponibles de origen animal , por ejemplo: leche en polvo , triptosa , gelatina, albúmina de suero, colágeno, hidrolizado de caseína, sulfato de condroitina, etc. Desafortunadamente, el uso de tales compuestos de origen animal introduce potencíalmente el riesgo de contaminación con agentes extraños de un producto controlado o estéril de otro modo. Esto ha sido una preocupación importante incluso desde el descubrimiento de enfermedades zoonóticas por intra-especies y las enfermedades relacionadas con priones recientemente descubiertas.
Como resultado , las autoridades reguladoras han requerido de extensa examinación de seguridad de productos biológicos (estabilizados) respecto a ausencia de agentes extraños antes de liberarse al mercado. Esto ha conducido al abandono del uso de tales componentes animales, inicialmente solo en el medio de cultivo usado en la producción de las moléculas biológicas o micro-organismos. Por ejemplo, B . Makoschey et al. (2002, Cytotechnology vol . 39, p. 1 39-145), describe un estabilizador de liofilización para usarse en la estabilización de virus que se han producido libres de suero; el estabilizador comprend ía azúcares, amino ácidos, gelatina, y péptidos de un hidrolizado de proteína de origen animal. Posteriormente, también los estabilizadores que se utilizan posteriormente a la producción , se modificaron en su composición ; como resultado, se desarrollaron las composiciones estabilizadoras que son : libres de suero (sin suero animal ); libres de proteína (sin proteína animal , pero puede contener cualquier otro componente derivado de animal ) o incluso libres de compuestos animales (ACF) (sin contener componente alguno derivado de un animal). Sin embargo, en las composiciones estabilizadoras, permanecía la necesidad de moléculas grandes, de elevado peso molecular por su efecto estabilizador. Por consiguiente, se obtuvieron compuestos voluminosos para estabilizadores ACF, por ejemplo, a partir de origen microbiano o de plantas, tales como: yeastolato, peptona de frijol de soya, gelatina recombinante, almidón (hidroxi-etilo), alginato, etc. De manera alternativa , se emplean los compuestos poliméricos grandes de origen natural o sintético tales como: polisacáridos, polivinilpirrolidona, ficol, poli-Usina, poli-etilenoglicol, (carboxi-)metil-celulosa, dextrano, poli-sorbatos (por ejemplo, Tween® 80), etc. Por ejemplo, T. Osterberg et al. ( 1 997 , Pharm. Res. , vol . 1 4, p. 892-898), albúmina de suero reemplazada por Tween® 80 como compuesto estabilizador de proteína Factor VI I I . Sin embargo, existen varios problemas incluso con estos compuestos estabilizadores ACF. Por ejemplo, varios de estos compuestos estabilizadores no son resistentes a esterilización térmica, y debido a que la esterilidad de la composición estabilizadora es con frecuencia un requisito absoluto, la única otra manera de lograr esto es mediante el proceso más tedioso de esterilización por filtro. También , en caso de que el producto estabilizado sea para administrarse a un humano o animal objetivo, algunos de los compuestos estabilizadores ACF no pueden utilizarse ya que son tóxicos o pueden causar reacciones alérgicas. Sin embargo , el problema más prominente en todos estos casos es que las composiciones estabilizadoras, incluso cuando ACF, aún comparten la desventaja común de contener o consistir en constituyentes heterogéneos y mal definidos, desconocidos. Por ejemplo, la composición de los hidrolizados de productos vegetales naturales no se conoce del todo. De manera similar, para las estructuras de polímero mencionadas, su estructura química solo se conoce en términos generales; los compuestos utilizados se definen solo en que tienen un peso molecular promedio o una longitud promedio de las cadenas laterales. Por consiguiente, estas moléculas realmente comprenden una familia de estructuras químicas, con una amplia variedad de moléculas. Por consiguiente, tales compuestos aún son de naturaleza mal definida y tienen incontables variaciones. Esto requiere la cuidadosa selección de los compuestos de inicio para lotes adecuados para la producción de una composición estabilizadora. Los lotes de compuestos que tienen la calidad deseada tienen entonces disponibilidad limitada. El uso de tales compuestos mal definidos en composiciones estabilizadoras origina variaciones desconocidas e incontrolables en la composición, calidad y rendimiento de los productos que se estabilizan mediante estas composiciones. Tal calidad de producto no controlable es altamente indeseable en una industria que intenta producir productos de alta calidad, seguros, consistentes, y solo puede superarse mediante costosos y prolongados procedimientos para la selección de la materia prima, verificación de los bienes entrantes, liberación del producto y control de calidad del producto final. El objeto de la invención es proporcionar una composición estabilizadora, alternativa y mejorada, que no sufre estas desventajas de la técnica anterior.
Sorprendentemente, se ha encontrado que una composición estabilizadora que comprende al menos un amino ácido y al menos un azúcar, en donde todos los compuestos se definen químicamente, puede proporcionar la estabilización eficiente de la calidad y la cantidad de moléculas biológicas y de micro-organismos, sin necesidad de compuestos de elevado peso molecular, grandes o mal definidos. Esto proporciona muchas ventajas sobre la técnica anterior. La composición estabilizadora de la invención se encuentra libre de suero, libre de proteína y libre de compuestos animales, y por consiguiente no introduce agente extraño alguno en el producto controlado que está por estabilizarse. También, la composición estabilizadora elimina la necesidad de incorporación de compuestos mal definidos, heterogéneos o desconocidos, esto da como resultado que la estabilización del producto conduzca a productos finales predecibles y controlables. Ambos aspectos reducen los requisitos de control en los productos finales respecto a calidad y agentes extraños. La composición de estabilización comprende solo compuestos exactamente conocidos, que no sufren de variaciones de lote en lote, o disponibilidad limita de lotes con características favorables requeridas. Esto reduce los requisitos en cuanto a control de ingesta y selección de materia prima. Además, la composición estabilizadora de acuerdo con la presente invención no es tóxica para humanos o animales y es esterilizable por calor.
La composición estabilizadora proporciona buena estabilización de moléculas biológicas y de micro-organismos contra influencias físicas y qu ímicas, en particular, estabiliza la calidad y cantidad eficaz de tales muestras contra las influencias negativas experimentadas con el tiempo y a través de cambios de temperatura . Cuando se utiliza en liofilización , la composición estabilizadora estabiliza moléculas biológicas y micro-organismos contra las condiciones de proceso de congelamiento, secado, calentamiento, enfriamiento, así como también contra cualquier influencia negativa durante el almacenamiento prolongado en estado líofilizado y en reconstitución . También , la composición estabilizadora proporciona un cuerpo liofilizado o torta que es de apariencia atractiva y elegante, que puede resistir las influencias físicas de transporte y que se disuelve rápidamente después de reconstitución en un diluyente. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición estabilizadora que comprende al menos un amino ácido y al menos un azúcar, caracterizada en que todos los compuestos son químicamente definidos. Una "composición estabilizadora" se define como una composición que, cuando se mezcla con moléculas biológicas o micro-organismos, tienen efecto estabilizador; es decir, la composición estabilizadora puede evitar un gran grado de pérdida de calidad o de cantidad eficaz de muestras que contienen moléculas biológicas y/o micro-organismos.
La "cantidad eficaz" es, por ejemplo, la cantidad de moléculas biológicas, biológicamente o farmacéuticamente activas, o el número de micro-organismos vivos o infecciosos. La "pérdida de calidad" podría haber ocurrido de otro modo por influencias físicas y/o químicas, tal como con el tiempo mediante variación en la temperatura, influencias mecánicas (por ejemplo, transporte) y/o cambios en la forma física (por ejemplo, congelamiento , secado). La composición estabilizadora puede encontrarse en la forma de una solución acuosa, un concentrado acuoso o puede proporcionarse como una mezcla seca de químicos adecuados para la preparación de una solución acuosa o de un concentrado acuoso de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención . Las moléculas biológicas y/o los micro-organismos que están por estabilizarse, pueden encontrarse en sí en forma líquida, seca, congelada o liofilizada, antes de la incorporación con la composición estabilizadora. Los micro-organismos pueden encontrarse vivos o muertos, por ejemplo, como resultado de la inactivación deliberada. Un "azúcar" se sabe generalmente que es un compuesto que da un sabor dulce o algo dulce, y más específicamente es un carbohidrato tal como un mono- o di-sacárido, un azúcar-alcohol o un poliol , y derivados de los mismos. Para la invención , un compuesto es "qu ímicamente definido" cuando consiste exclusivamente en moléculas idénticas.
Por consiguiente, tal compuesto químicamente definido tiene una estructura química uniforme, específicamente conocida y no ambigua, y se utiliza en una cantidad específicamente conocida. Un compuesto químicamente definido del estabilizador de acuerdo con la invención, por consiguiente, no es compuesto heterogéneo, mal definido o desconocido, tal como un lisado proteináceo, extracto, hidrolizado, o mezcla péptida. Tampoco se comprende compuesto polimérico alguno en la composición estabilizadora de acuerdo con la invención, de la cual solo se conoce un peso molecular promedio o una longitud promedio de las cadenas laterales. Un compuesto químicamente definido del estabilizador de acuerdo con la invención se encuentra fácilmente disponible con los proveedores comerciales de químicos finos; preferentemente se emplea el de pureza más elevada disponible. Sin embargo, el requisito de ser químicamente definido no descarta la presencia de cantidades residuales de impurezas en tal compuesto. Tales impurezas son, por ejemplo, metales pesados, residuos, solventes o lo similar. Preferentemente, tales impurezas se presentan en una cantidad de menos de 1 % en peso del compuesto químicamente definido, más preferentemente menos de 0.1 , 0.01 , 0.001 o 0.0001 % en peso. Preferentemente, el requisito de ser químicamente definido se refiere a las moléculas de un compuesto del estabilizador de acuerdo con la invención, cuando se encuentra en una forma ionizada en una solución acuosa. En consecuencia, en una modalidad preferida, tal compuesto químicamente definido puede presentarse en su forma sólida o no ionizada en diferentes formas de sal o en formas que tienen un número diferente de moléculas enlazadas de agua de cristal (formas de hidrato). Preferentemente, la composición estabilízadora de acuerdo con la invención proporciona estabilización de moléculas biológicas y/o micro-organismos hasta por lo menos el mismo nivel que los estabilizadores de la técnica anterior que comprenden compuestos mal definidos. Preferentemente, la pérdida de título cuando se utiliza la composición estabilizadora de acuerdo con la invención para estabilización de un producto que contiene un micro-organismo vivo, es de menos de 1 Log10. Más preferentemente, menos de 0.5 Log?0. Sin embargo, esto no siempre se requiere: para algunas aplicaciones, que no tienen compuestos mal definidos en el estabilizador y en consecuencia en el producto final es de suma importancia; un rendimiento ligeramente menor en la calidad y/o cantidad que resulta del uso de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención es, en ese caso, perfectamente aceptable a cambio de las muchas ventajas que esto ofrece sobre los estabilizadores de la técnica anterior. Este es el caso, por ejemplo, cuando el estabilizador de acuerdo con la invención está por utilizarse como un estabilizador para almacenamiento prolongado de material de semilla de micro- organismos, tal como en depósitos de glicerol. En ese caso, la estabilización ACF por un estabilizador completamente definido puede ser más importante y puede ser aceptable una pérdida en el título de hasta 2 Log10, ya que tal material de semilla normalmente se cultivará a la cantidad correcta para inoculación de un nuevo cultivo de cualquier modo. Además, una persona experta en la materia es perfectamente capaz de optimizaciones adicionales, por ejemplo, a la composición de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención, o a las condiciones para su uso, mediante experimentación de rutina. Por consiguiente, tales composiciones y condiciones optimizadas se encuentran dentro del alcance de la invención. Para determinar el nivel de estabilización, correspondiente a la cantidad y calidad eficaces, remanentes del producto estabilizado, puede utilizarse cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, la cantidad y virulencia (no obstante, la calidad) de compuestos virales y bacterianos puede cuantificarse mediante titulación o dilución limitante; las moléculas biológicas pueden detectarse bioquímicamente (por ejemplo, de manera enzimática), inmunológicamente (prueba de inmuno-fluorescencia), o físicamente (por ejemplo, electroforesis, cromatografía o espectrometría de masa). Todas estas técnicas son muy conocidas y se encuentran disponibles en la materia. En una modalidad preferida, la composición estabilizadora de acuerdo con la invención adicionalmente comprende al menos una poliamina. Una "poliamina" se define como un compuesto con dos o más grupos amino. En las modalidades más preferidas, la invención se refiere a una composición estabilizadora de acuerdo con la invención: en donde el azúcar es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, lactosa, sucrosa, maltosa, trehalosa, sorbitol y mannitol ; en donde la poliamina es al menos una seleccionada del grupo que consiste en etileno-diamina, cadaverina, putrescina, espermidina y espermina; en donde el amino ácido es glutamato (ácido glutámico) o glicina , o en donde se comprenden ambos amino ácidos. En una modalidad más preferida adicional , la composición estabilizadora de acuerdo con la invención es una solución acuosa regulada; preferentemente la solución acuosa se regula entre pH 6-8, más preferentemente a aproximadamente pH 6.9. El regulador puede ser, por ejemplo, Trís/citrato, preferentemente a una concentración de aproximadamente 50 mM /1 0 mM . Preferentemente, el regulador es a base de fosfato, más preferentemente di-hidrato de di-sodio-fosfato. Preferentemente, el regulador se presenta en una cantidad de entre 0.1 y 1 00 g/l , más preferentemente aproximadamente 1 g/l . En una modalidad alterna más preferida, la solución acuosa de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención es una solución concentrada, que comprende los compuestos de la composición estabilizadora en una concentración que es mayor que la concentración a la cual estos compuestos se encontrarán en la composición farmacéutica final que se forma después de la mezcla de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención , con las moléculas biológicas o los micro-organismos que están por estabilizarse. Preferentemente, la composición estabilizadora es 2x, 3x, 4x, 5x, 1 0x o 20x concentrada en comparación con la concentración o la cantidad en la composición farmacéutica final ; más preferentemente la composición estabilizadora es 4x concentrada. En una modalidad más preferida , se proporciona una composición seca de químicos que es adecuada para disolución en un solvente adecuado, a fin de preparar una solución acuosa o un concentrado de la composición estabilizadora de la invención . La proporción de una mezcla seca de químicos para posterior disolución tiene las ventajas de almacenarse en un menor volumen . Esto ahorra espacio de almacenamiento y facilita la transportación y venta. Incluso más preferentemente, en la composición estabilizadora de acuerdo con la invención : el azúcar es sucrosa , sorbitol , o mannitol ; preferentemente sorbitol ; más preferentemente D-sorbitol ; - el amino ácido es glutamato o glicina ; más preferentemente L-glutamato; incluso más preferentemente tanto L-glutamato como glicina se comprenden; se utiliza una combinación de poliaminas; más preferentemente espermina y putrescina, o espermina y etileno diamina. En una modalidad más preferida adicional de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención , el concentrado 4x comprende: el azúcar en una cantidad de entre 1 0 y 200 g/l , preferentemente a aproximadamente 75 g/l ; el amino ácido en una cantidad de entre 0.1 y 400 g/l ; preferentemente L-glutamato se comprende a aproximadamente 20 g/l o se comprende glicina a aproximadamente 1 60 g/l ; la poliamina en una cantidad de entre 0.1 y 1 00 g/l ; preferentemente se comprende espermina a aproximadamente 1 0 g/l o se comprende espermidina a aproximadamente 2.5 g/l . En una modalidad preferida adicional , la composición estabilizadora de acuerdo con la invención , comprende un azúcar y glutamato como amino ácido y adicionalmente comprende al menos un soluto compatible. El soluto compatible preferentemente se selecciona al menos del grupo que consiste en sarcosina, betaína, di-glicina y colina. El soluto compatible en el concentrado 4x se presenta preferentemente en una cantidad de entre 0.1 y 400 g/l ; preferentemente entre 50-200 g/l , más preferentemente a aproximadamente 1 60 g/l.
Como se perfiló arriba, no es relevante en cuál forma de sal o hidrato se utiliza un compuesto de la composición estabilizadora; por ejemplo, puede utilizarse espermina en las formas de espermina, espermina-dihidrato, o tetra-hidrocloruro de espermina; de manera similar, la espermidina puede emplearse como espermidina, o tri-hidrocloruro de espermidina. Ya que el estabilizador de acuerdo con la invención se intenta se mezcle con moléculas biológicas y/o micro-organismos, en algunos usos, los compuestos del estabilizador pueden ser parte de un producto que se administra a un humano o animales objetivo. Por consiguiente, los compuestos de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención preferentemente son no tóxicos, al menos: no tóxicos en las concentraciones presentes en el producto final por administrarse. Preferentemente, los compuestos de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención no inducen una reacción alérgica indeseada. Preferentemente, la composición estabilizadora de acuerdo con la invención es estéril. La esterilización del estabilizador de acuerdo con la invención puede lograrse mediante calor, filtración, irradiación o cualquier técnica adecuada conocida en la materia. Preferentemente, la composición estabilizadora se esteriliza por calor. A manera de ejemplos no limitantes, los compuestos químicamente definidos, adecuados para usarse en la composición estabilizadora de acuerdo con la invención , se mencionan en la Tabla 1 Tabla 1 : Compuestos químicamente defin idos adecuados para utilizarse en la composición estabilizadora de acuerdo con la invención Como se sabe en la materia, los derivados de los compuestos descritos en la presente de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención, se encuentran disponibles o pueden sintetizarse. Tales derivados también son adecuados para utilizarse como compuestos de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención . Por consiguiente, tales derivados se encuentran dentro del alcance de la invención. Tabla 2: Panorama general de las composiciones estabilizadoras más preferidas de acuerdo con la invención . Las cantidades dadas corresponden a aquel las de u n concentrado 4x: Se llevó a cabo un gran número de experimentos con composiciones estabilízadoras de acuerdo con la invención . Estos se diseñaron para incorporar todas las condiciones bajo las cuales la composición estabilizadora de acuerdo con la ¡nvención proporciona estabilización eficaz: enfriamiento; para almacenamiento de producto(a granel ) en forma l íquida a, por ejemplo , 4°C; - congelamiento, para almacenamiento de producto(a granel ) en congelamiento profundo a, por ejemplo, -20°C, o -45°C; liofilización; incorporando: secado, calentamiento , enfriamiento; congelamiento de producto liofilizado; para congelamiento profundo de almacenamiento a, por ejemplo, -20°C o -45°C; enfriamiento de producto liofilizado; para almacenamiento a 4°C; calentamiento de producto líofilízado, a temperaturas por encima de temperatura ambiente y - reconstitución de producto liofilizado en un diluyente. Cuando estos experimentos se llevaron a cabo con composiciones estabilizadas que comprenden micro-organismos, el número restante de los micro-organismos infecciosos vivos en los productos reconstituidos se determinó usando técnicas de cuantificación muy conocidas en base a titulación o limitando la dilución . Cuando se llevan a cabo con moléculas biológicas, la calidad y cantidad se determinó usando ensayos específicos tales como titulación , Elisa o bio-ensayos. Estos experimentos y sus resultados se resumen en los ejemplos y muestran que la composición estabilizadora de acuerdo con la invención proporciona la estabilización eficiente de microorganismos o moléculas biológicas, no solo para los diversos usos en y alrededor de la liofilización , sino también para la estabilización de antígeno a granel en almacenamiento enfriado o congelado, antes de o en lugar de dicha liofílización . En una modalidad alterna , la composición estabilizadora de la invención se caracteriza en que no se comprende compuesto alguno de peso molecular elevado o de gran tamaño. Para la invención , los compuestos de "peso molecular elevado" y "grandes" se definen como cualquier compuesto que tiene un peso molecular o tamaño del ion molecular que excede 203 Da . Por ejemplo, la espermina no sería tal compuesto grande, ya que su ion molecular tiene un peso molecular de solo 202 Da, cuando se excluye cualquier agua de cristal , o formas de sal , tales como hidratos o (hidro)cloruros. Como se describe arriba, fue sorprendente encontrar que ninguno de los compuestos voluminosos comúnmente usados en la materia se requiere para lograr estabilización eficiente, de hecho, no se requiere ningún compuesto mayor que la espermina . Las ventajas de esto también se han mencionado; el peso molecular elevado, los compuestos grandes con frecuencia son heterogéneos y mal definidos, o cuando mucho son compuestos de los cuales solo se conoce un tamaño molecular promedio o una longitud promedio de las cadenas laterales. En consecuencia, tales compuestos mal definidos utilizados en la composición estabilizadora darán como resultado un producto estabilizado con características impredecibles. En una modalidad preferida alterna, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende una composición estabilizadora de acuerdo con la invención , y al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo o una combinación de los mismos. Una composición de vacuna se sabe comúnmente en la materia que representa una composición que comprende un compuesto inmunogénico en un veh ículo farmacéuticamente aceptable, cuyo compuesto inmunogénico es capaz de inducir una activación pasiva o activa del sistema inmune de un objetivo. La respuesta inmune inducida significa que interfiere con el establecimiento o el progreso de una cierta infección o que disminuye los síntomas de la enfermedad . Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua estéril o una solución de sal fisiológica estéril . En una forma más compleja, el vehículo puede ser, por ejemplo, un regulador. Una "molécula biológica" para la invención se entiende que es una molécula que puede encontrarse en la naturaleza; en particular, esto se refiere a una proteína, carbohidrato, l ípido o ácido nucleico.
El origen de la molécula puede ser biológico o sintético, derivado ya sea ex vivo o ex vitro. El término "proteína" se entiende que incorpora una cadena molecular de dos o más amino ácidos; por consiguiente, los péptidos, olígopéptidos y polipéptidos se incluyen dentro de la definición de proteína. La composición de vacuna de acuerdo con la ¡nvención puede encontrarse en cualquier forma, por ejemplo; liofilizada, líquida o congelada; o puede formularse o procesarse en un líquido, un gel , un ungüento, un polvo, una tableta , una cápsula, o un cuerpo liofilizado, dependiendo del método de almacenamiento deseado, transporte o aplicación al objetivo. La composición de vacuna de acuerdo con la invención puede comprenden micro-organismos inmunogénicos y moléculas biológicas individuales o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, la invención se refiere a una composición de vacuna: - en donde el micro-organismo es un virus o una bacteria, o en donde se comprenden tanto un virus como una bacteria; más preferentemente el virus es al menos una especie viral seleccionada a partir del grupo que consiste en herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-, pneumo- y poxvírus; incluso más preferentemente el virus se selecciona a partir del grupo que consiste en virus de herpes bovino, parainfluenzavirus bovino 3, virus pseudoarabies, virus de centelleo respiratorio humano y virus de influenza humano o animal ; más preferentemente, la bacteria se selecciona a partir del grupo que consiste en especies bacterianas Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia, Micoplasma, Edwardsiella, Campylobacteria y Salmonella. en donde la molécula biológica es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un l ípido, y un ácido nucleico; más preferentemente la proteína es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona y una enzima. Los fragmentos de anticuerpo son , por ejemplo, fragmentos Fab y anticuerpos de cadena individual . Las hormonas para usarse con la composición estabilizadora de la invención son, por ejemplo, insulina, hormonas gonadotróficas tales como hormona estimuladora de fol ículo, gonadotropina de corión humano y eritropoietina. Las vacunas y composiciones estabilizadoras de la invención son aplicables con una amplia variedad de virus, de cualquier tipo genómico o morfológico, infeccioso para cualquier especie de animal , o para humanos. En particular, cualquier resultado presentado sobre la estabilización de un virus de animal en particular, puede extrapolarse directamente a fin de predecir los resultados de estabilización del virus correspondiente que infecta otras especies huésped , ya sea animal o humano, y a las otras especies virales dentro de su familia viral . Los virus que tienen una envoltura viral son particularmente sensibles a influencias qu ímicas y físicas. En consecuencia, ya que tales virus pueden estabilizarse de manera eficaz por la composición estabilizadora de la invención, esto prueba su eficacia aún más.
Tabla 3: Eiemplos de virus para uso con la composición estabilizadora de la i nvención *EI virus de herpes bovino también se conoce como virus de rinotraqueitis bovino infeccioso.
La bacteria para utilizarse con el estabilizador de acuerdo con la ¡nvención puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, según se caracteriza por teñido Gram positivo o Gram negativo. Tabla 4: Eiemplos de bacterias para util izarse con la composición estabilizadora de la ¡nvención : Los resultados obtenidos en la estabilización de estas bacterias pueden extrapolarse a otras especies bacterianas dentro de los géneros mencionados. El sistema de producción usado para la producción de moléculas biológicas y micro-organismos para utilizarse con el estabilizador de la invención puede ser cualquier sistema in vitro o in vivo. Por ejemplo, los virus pueden producirse en un cultivo celular, en huevos de gallina fertilizados, o en un animal huésped ; las bacterias pueden producirse mediante el uso de técnicas similares y adicionalmente en caldo de cultivo , y las moléculas biológicas pueden producirse mediante aislamiento de un animal o microorganismo, especialmente pueden utilizarse ventajosamente sistemas de expresión recombinante. Se conocen en la materia muchas otras modalidades. Sin embargo, la seguridad óptima y capacidad de predicción del producto final estabilizado se logra mediante retiro de constituyentes mal definidos, desconocidos, tanto de la etapa de producción como de la composición estabilizadora. Por consiguiente, en una modalidad más preferida de la composición de vacuna de acuerdo con la invención , la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componente animal . Los sistemas de producción ACF, por ejemplo, son cultivos virales en células en medios ACF; cultivos bacterianos en un caldo de cultivo ACF; y cultivos de expresión recombinantes que utilizan medio ACF, por ejemplo, el sistema de expresión de baculovirus que utiliza células de insecto. En una modalidad preferida adicional , la composición de vacuna de acuerdo con la ¡nvención adicíonalmente comprende un adyuvante. Los adyuvantes se utilizan comúnmente para reforzar la respuesta inmune a un componente de vacuna, mediante estimulación del sistema inmune de un humano o animal objetivo, en una manera no específica . Se conocen muchos adyuvantes diferentes en la materia, por ejemplo: aceites minerales o biológicos, saponinas, péptídos, alúmina y derivados, etc. En una modalidad preferida adicional , la composición de vacuna de acuerdo con la invención se liofiliza. En forma liofilizada, la composición estabilizadora de la invención será más benéfica; las composiciones de vacuna liofilizadas de acuerdo con la ¡nvención son estables a , por ejemplo , +4°C, por meses hasta varios años. Los procedimientos para liofilización son conocidos en la materia ; el equipo para liofilización a diferentes escalas se encuentra comercialmente disponible. Típicamente, las composiciones de vacuna que comprenden un estabilizador de acuerdo con la invención , se colocan en contenedores tales como frascos de vidrio a un cierto volumen , por ejemplo, de entre 0.5 y 50 ml , preferentemente de 1 , 2 o 5 ml . Posteriormente, estos frascos se congelan y someten a un proceso de liofilización . Un panorama general de un proceso de liofilización ejemplar comprende las etapas de: congelamiento profundo durante 1 0-60 minutos, para ajustar el l íquido en una cierta estructura; primera etapa de secado a -20 hasta 20°C, durante 1 -1 2 horas, a vacío elevado, para sublimar el agua cristalizada; secado secundario a 0 hasta 40°C, durante Vz -6 horas, a vacío medio, para desorber el agua no congelada; - empaque de cuerpos liofilizados (por ejemplo, cierre de frascos de vidrio por un obturador de caucho) para mantener condiciones secas, por ejemplo, al vacío, o bajo gas nitrógeno; y mantener a +4°C. La persona experta es muy capaz de llevar a cabo variaciones y optimizaciones de rutina a tal proceso, con objeto de lograr los mejores resultados para un tipo específico de muestra. El proceso de liofilización puede optimizarse mediante monitoreo de la temperatura y el contenido de agua en el aparato durante el secado. También , la calorimetría de exploración diferencial se utiliza de rutina para determinar las características del producto antes y después de la liofilización . El contenido de agua residual (rwc) en el producto final es un parámetro importante que determina la estabilidad de los productos liofilizados. Preferentemente, el rwc de las muestras y vacunas liofilizados de acuerdo con la invención se encuentra por debajo de 5% . Para determinar el rwc, puede emplearse ventajosamente la titulación Kart Fischer conocida en la materia. En una modalidad preferida adicional , una vacuna liofilizada de acuerdo con la invención se prepara en la forma de una lioesfera según se describe en la Patente Europea EP 799.61 3.
El cuerpo liofilizado producido de una composición de vacuna de acuerdo con la invención puede encontrarse en cualquier forma. La composición estabilizadora de acuerdo con la invención proporciona características benéficas a la composición de vacuna para lograr una apariencia elegante y atractiva del cuerpo liofilizado. Preferentemente, la torta liofilizada en un frasco de vidrio es de apariencia homogénea, brillante y preferentemente permanece anexa a la pared del frasco después de golpearle ligeramente y no es tan quebradiza como para pulverizarse bajo condiciones de transporte normales. En consecuencia, la apariencia deseada del cuerpo de vacuna liofilizado no solo se refiere a las características subjetivas o estéticas, sino que también comprende efectos técnicos ventajosos genuinos; en particular, se involucran la eficacia de estabilización, la resistencia a las fuerzas de transportación y la velocidad de redisolución. Es de especial interés evitar una apariencia conocida en la materia como "colapsada", ya que los cuerpos liofilizados que tienen tal apariencia amorfa y agrupada se redisuelven de manera lente e incompleta y no proporcionan la estabilización adecuada de las moléculas biológicas y/o micro-organismos que deben conservarse. En una modalidad preferida adicional, una solución de vacuna lista para usarse puede obtenerse mediante reconstitución de una composición de vacuna liofilizada de acuerdo con la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Ya que las composiciones de vacuna liofilizadas de acuerdo con la invención se disuelven rápidamente, la reconstitución se lleva a cabo preferentemente inmediatamente antes de que la solución de vacuna se aplique a un objetivo. Esto asegura que la solución de vacuna sea fresca y de la dosis y calidad propuestas. La composición de vacuna de acuerdo con la invención puede administrarse a un objetivo humano o animal, de acuerdo con los métodos conocidos en la materia . Por ejemplo, mediante aplicaciones parenterales tales como a través de todas las rutas de inyección en o a través de la piel : por ejemplo, intramuscular, intravenoso, intraperitoneal , intradérmica, submucosal o subcutánea . Las rutas de aplicación alternativas que son factibles son mediante aplicación tópica como una gota, rocío, gel o ungüento en el epitelio mucosal del ojo, nariz, boca , ano o vagina, o sobre la epidermis de la piel externa en cualquier parte del cuerpo; mediante rocío como aerosol o polvo. De manera alternativa, la aplicación puede ser a través de la ruta alimenticia , mediante combinación con la comida, alimentos o agua para beber, por ejemplo, como un polvo, un líquido, o tableta, o mediante administración directamente en la boca como un l íquido, un gel , una tableta , o una cápsula, o en el ano como un supositorio . También la vacunación por inmersión puede aplicarse ventajosamente. Las rutas de aplicación preferidas son la inyección intramuscular o subcutánea o el rocío intranasal . Sin mencionar que la ruta óptima de aplicación dependerá de las particularidades específicas de la infección o síntomas a prevenirse o disminuirse, las características de la formulación de vacuna que se utiliza, y las características particulares de las especies objetivo. El esquema de la aplicación de la composición de vacuna de acuerdo con la invención , a un humano o animal objetivo, puede ser en dosis individuales o múltiples, las cuales pueden darse al mismo tiempo o de manera secuencial , en una manera compatible con la dosis y formulación , y en una cantidad tal que sea inmunológicamente eficaz, por ejemplo, como una sola dosis al año.
En una modalidad alterna, la invención se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica, que comprende la mezcla de una composición estabilizadora de acuerdo con la invención , con una composición que comprende al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo, o una combinación de los mismos. La composición farmacéutica preparada de acuerdo con el método de la invención puede encontrarse en cualquier forma: l íquida o seca, congelada, liofilizada , etc. La incorporación puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier técnica adecuada disponible en la materia. Preferentemente, el método de acuerdo con la invención comprende la mezcla de 1 parte de la composición estabílizadora de acuerdo con la ¡nvención, como una solución regulada , acuosa, estéril , a 4x concentración , con 3 partes de una composición que comprende al menos una molécula biológica y/o al menos un microorganismo, a fin de producir una composición farmacéutica de acuerdo con la invención . La composición que comprende al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo, o una combinación de los mismos, que está por mezclarse con la composición estabilizadora de acuerdo con la invención , se encuentran preferentemente en forma l íquida . Esta composición puede obtenerse a partir de un cultivo viral o bacteriano, o un cultivo de sistema de expresión . Esta composición puede obtenerse, por ejemplo, después del procesamiento corriente abajo, tal como centrifugación , por ejemplo, el sobrenadante de cultivo, o el granulo centrifugado (re-suspendido) (que comprende células infectadas con virus o bacterias); o puede utilizarse el cultivo completo no procesado. Preferentemente, la mezcla de la composición estabilizadora y la composición que comprende una molécula biológica y/o un microorganismo de acuerdo con el método de la invención, se lleva a cabo poco después de que han terminado la producción y procesamiento corriente abajo, con objeto de lograr los mejores resultados de estabilización . Preferentemente, la composición farmacéutica estabilizada así obtenida se enfría o congela entonces almacenada, esperando el procesamiento ulterior y los resultados de control de calidad sobre la cosecha de producción. En modalidades preferidas del método de acuerdo con la ¡nvención : el micro-organismo es un virus o un bacteria, o se comprenden ambos, un virus y una bacteria. el virus es al menos una especie viral seleccionada a partir del grupo que consiste en herpes-, paramyxo-, ortomyxo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-, pneumo- y poxvirus. la molécula biológica es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un l ípido y un ácido nucleico. - la proteína es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona y una enzima; la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componentes animales; - la composición farmacéutica resultante se sujeta a liofilización. En una modalidad más preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica que puede obtenerse medíante el método de acuerdo con la ¡nvención , en donde la composición es una vacuna . En una modalidad incluso más preferida, la ¡nvención se refiere a un método para la preparación de una solución de vacuna mediante reconstitución de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención , en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad alterna adicional , la invención se refiere al uso de una composición estabilizadora de acuerdo con la invención , para estabilización de la calidad y/o la cantidad de al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo, o una combinación de los mismos, en una composición . En modalidades preferidas del uso de acuerdo con la invención: el micro-organismo es un virus o una bacteria, o se comprenden tanto un virus como una bacteria; el virus es al menos una especie viral seleccionada del grupo que consiste en herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-, pneumo- y poxvirus; la molécula biológica es al menos una seleccionada del grupo que consiste en una proteína , un carbohidrato, un l ípido, y un ácido nucleico; la proteína es al menos una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona y una enzima; la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componentes animales. En una modalidad más preferida, la invención se refiere al uso de acuerdo con la invención de una solución de vacuna de acuerdo con la invención , o a una solución de vacuna obtenible mediante el método de la invención , para inmunización de un animal o humano objetivo . La invención se describirá ahora además con relación a los siguientes ejemplos no limitantes.
Eiemplos Como se mencionó antes, los experimentos de liofilización se llevaron a cabo incorporando todas las condiciones bajo las cuales un estabilizador eficaz debe ser capaz de estabilizarse: enfriamiento, congelamiento , secado, calentamiento. Los principios generales de los experimentos de liofilización llevados a cabo en la estabilización de micro-organismos fueron los siguientes. las composiciones que comprenden micro-organismos se obtuvieron de un cultivo, se procesaron si se requería y se almacenaron a 4°C o por debajo de cero °C. se preparó una composición estabilizadora de acuerdo con la invención mediante ponderación de los compuestos requeridos en las cantidades deseadas, agregando esto a un volumen requerido de agua destilada estéril y mezclando hasta disolver. La composición estabilizadora se esterilizó entonces por calor a 1 21 °C durante 20 minutos. al inicio del experimento, la muestra se descongeló, se mezcló con un volumen de un estabilizador concentrado 4x que era un tercio del volumen de la muestra. Se utilizaron ya sea el estabilizador de acuerdo con la invención o las composiciones estabilizadoras de referencia . También se comprendieron muestras sin estabilizador alguno en los experimentos. las muestras estabilizadas se colocaron en frascos de vidrio estándares de 1 0 ml a un cierto volumen de llenado: virus BHV y PI3 a 2 ml , y PRV, virus myxoma, BRSV, EIV y BCV a 1 ml . Las muestras bacterianas se llenaron a 2.5 ml por frasco. las muestras se liofilizaron usando un programa estándar de dos etapas, hasta un contenido de agua residual por debajo de 5% y después se sellaron al vacío con un obturador de caucho. posteriormente, las muestras se almacenaron a 4°C o a temperaturas mayores durante un cierto periodo de tiempo; los resultados en las columnas "4°C directo" son resultado de las titulaciones en muestras almacenadas a 4°C durante menos de 1 mes después de la liofilización; los resultados en las columnas "3 d ías 28°C" son resultados de titulación de muestras almacenadas a 28°C durante 3 días posteriormente a posible almacenamiento a 4°C después de la liofilización y entonces cuantificado, inmediatamente después de estos tres d ías; los resultados en las columnas "1 año 4°C" son resultados de titulación de muestras almacenadas a 4°C durante por lo menos un año después de la liofilización. El almacenamiento a 28°C durante tres días se incorpora como un ensayo de estabilidad acelerada ; la mayoría de las veces estos resultados son indicativos de las consecuencias de almacenamiento por tiempo prolongado a condiciones ambientales o enfriadas. Con objeto de determinar la cantidad y la calidad del microorganismo que permanecieron después de estas condiciones de tratamiento, las muestras de virus se titularon por capacidad de infección, y las muestras de bacterias se cuantificaron por placa. Ensayo de titulación BRSV: Las muestras estabilizadas de virus BRS se diluyeron en medio de cultivo celular estándar complementado con FCS 1 0% (v/v), hasta diluciones entre 1 0"1 y 1 0"7, en 0.2 ml . Las diluciones se inocularon en células BEL en las cavidades de una placa de micro título: 1 .5 x 1 05 células BEL/ml , a 0.2 ml/cavidad . Se utilizaron 1 0 cavidades por dilución viral . Las placas de micro título se incubaron durante 8 d ías (3-5 % CO2, 37°C). Las placas se fijan mediante el uso de Acetona/PBS 70/30 % v/v, durante 1 0-1 5 minutos a temperatura ambiente. La monocapa fija se incuba inicialmente con un anticuerpo monoclonal específico para BRSV y secundario con un conjugado de FITC anti-cuerpo + azul Evans (como tintura de contador). Aquellos platos en los cuales se han desarrollado células fluorescentes positivas, se califican como positivo. Los títulos de virus se calculan de acuerdo con Reed y Muench , y se expresan como título viral en TCI D60. En todos los experimentos se incluyó una muestra de virus estándar homólogo y control negativo para cada ejecución de titulaciones de virus. Todas las titulaciones de virus se llevaron a cabo por duplicado en un d ía. Se presentan los títulos promedio . Ensayo de titulación de virus Mvxoma: Se siembran células RK1 3 en placas de 96 cavidades, a 4x1 05 células por ml , a 1 00 µl por cavidad , en medio de cultivo celular estándar con 5% de suero bovino fetal (FCS) y antibióticos adecuados. Las placas se incuban durante la noche a 37°C, en atmósfera de CO2 al 5% .
El siguiente día, se diluye una muestra estabilizada que contiene myxomavirus desde 1 0"1 hasta 1 0"8. Se inoculan 20 µl de cada dilución viral en una cavidad de la placa celular RK1 3 por triplicado. Después de una incubación de una hora a 37°C/5% CO2, se agregan a las cavidades 1 00 µl de medio de cultivo celular con FCS , y las placas se incuban durante otros 2-3 días, hasta que las placas virales son claramente visibles y puede leerse CPE. Las placas se vacían entonces, se tiñen con una dilución de negro de Naftaleno, se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se vacían nuevamente, se enjuagan con agua corriente, se secan y leen mediante el uso de microscopio de luz. El número de virus de myxoma infecciosos en la muestra original se calcula mediante algoritmo Spearman-Kárber y se expresan como un valor TCI D50. Ensayo de titulación de virus BHV. P13 y PRV: Las muestras estabilizadas de virus BHV, P1 3 y PRV se titularon en una manera similar a la del virus myxoma, excepto que se utilizaron para las células JCK de virus B HV y PI3 y para las células PRV Vero. CPE también se determinó mediante conteo de placas usando microscopio de luz. Ensayo de titulación BCV: Una suspensión celular de células M DBK se coloca en placas de 96 cavidades, a 200 µl/cavidad de 1 x105 células/ml en medio DM EM con FCS al 1 0% y antibióticos adecuados. Las placas se incuban durante 3 d ías a 37°C en atmósfera de CO2 al 5% . Después de tres d ías se ha formado una monocapa confluente. Se retira el medio, se agregan 200 µl de medio fresco sin FCS y las placas se incuban durante 2 horas. Las diluciones de BCV de muestras estabilizadas se preparan en etapas de diluciones 10 veces. Las placas de microtítulo se vacían nuevamente y se inoculan diluciones entre 1 0 3 y 1 0"8 en la monocapa celular de M DBK. Las placas se incuban durante 5-6 días. Las placas virales se visualizan respecto a conteo de inmunofluorescencia , usando un suero anti BCV de conejo policlonal , y un anticuerpo conjugado etiquetado de cabra-anti-conejo-FITC. Después del contra-teñido con azul Evans, las placas se contaron usando microscopio de luz UV. El cálculo de título TCI D50 viral vivo en la muestra estabilizada es mediante algoritmo Reed-Muench . Virus de Influenza Equina: EIV se titula en huevos de gallina; las diluciones de una muestra E IV estabilizada se inoculan en la cavidad alantoica de un huevo de gallina de 1 0 d ías de edad , vivo, fertilizado, y se incuban a 40-42°C durante3-5 d ías. Se abren los huevos, y se examina una muestra de fl uido alantoico en el ensayo de hemaglutinación mediante el uso de células sanguíneas rojas de pollo. La cantidad de EIV infeccioso vivo en la muestra original se calcula a partir de la dilución más elevada que da una reacción HA. En algunos experimentos, se juzgó la calidad de la torta liofilizada. Esto comprendió inspección visual y agitación del frasco. Se dio una indicación arbitraria: + apariencia elegante, buena estructura firme O apariencia y estructura adecuadas menos que la apariencia y estructura deseadas Bacterias Se obtuvieron cultivos bacterianos mediante desarrollo de material de depósito en matraces de agitación en medio de crecimiento estándares adecuados. Enseguida, se cuantificaron estos cultivos, mediante colocación en placa por duplicado de una serie de muestras de dilución limitante en placas de agar sanguíneo, para conteo del número de colonias que aparecen después de la incubación durante la noche. Para algunos experimentos, el número de colonias recuperadas después de la liofilización se expresó como % del número de colonias en el cultivo original antes de la liofilización. Los cultivos correspondientes se mezclaron entonces 1 :4 con una composición estabilizadora 4x concentrada de acuerdo con la invención , y se sometieron a un programa de liofilización en dos etapas, estándar. Para los experimentos que involucran E. coli, se utilizó una cepa K1 2 y se utilizaron diferentes medios de cultivo: medio LB estándar, LB con ampicilina, y medio de sangre-agar. La eficacia de la composición estabilizadora de acuerdo con la invención se comparó con la de un estabilizador estándar que contiene albúmina.
Las muestras se examinaron ya sea antes o directamente después de la liofilización , o después de 3 días de incubación a 28 o 30°C, nuevamente por medio de ensayo de estabilidad acelerado . Tabla 5: Efecto de concentración de Gl icina Micro-organismo usado: BHV Composición estabilizadora usada: Tabla 6: Efecto de concentración de Glutamato Micro-organismo usado: BHV Composición estabilizadora usada: Tabla 7 : Tipo de pol iami na v efecto de concentración de poliami na Micro-organismo usado: BHV Composición estabilizadora usada: NB: en estos experimentos se comprendió ya sea Espermina o Espermidina en la composición estabilizadora.
Para propósitos de referencia, se incluyó un estabilizador convencional de la técnica anterior (Makoschey eí al. , supra) como ejemplo comparativo, esto se indica como "Conv. Stab." Tabla 7 : Ti po de poliamina v efecto de concentración de poliamina (continuación) n .a. = no disponible Tabla 8: Tipo de sales de poliamina e hidratos v efecto de concentración Micro-organismo usado: BHV Composición estabilizadora usada: * En estos experimentos se comprende ya sea una poliamina o una combinación ; esto se indica en la tabla Tabla 8 : Tipo de sales de poliamina e hidratos y efecto de concentración (continuación) n .a. = no disponible Tabla 8 : Tipo de sales de poliamina e hidratos v efecto de concentración (continuación) A = Tetrahidrocloruro espermina 10 g/l, y Putrescina 5 g/l. B = Tetrahidrocloruro espermina 10 g/l y Etileno diamina 5g/l.
Tabla 9: Estabilización de diferentes virus, y efecto de poliamina Composiciones estabilizadoras usadas: "I nvención 1 " "Invención 2' Invención 3' Los ejemplos comparativos se llevaron a cabo con el estabilizador convencional de la técnica anterior (Makoschey eí al, supra), esto se indica como "Conv. Stab." Tabla 9 : Estabilización de d iferentes virus v efecto de polianmina (continuación) n.a. = no disponible Tabla 9: Estabilización de diferentes virus y efecto de poliamina (continuación) n .a. = no disponible Tabla 9: Estabilización de diferentes virus v efecto de poióamina (continuación) n.a. = no disponible Tabla 10: Estabilización de diferentes virus, que se produjeron ACF Composiciones estabilizadoras usadas: "Invención 1", "Invención 3" y estabilizador convencional "Conv. stab." (ver Tabla 9) n.a. = no disponible Tabla 11: Reemplazo de glicina por soluto compatible Composiciones estabilizadoras usadas: "Invención 3" y "Conv. Stab." (ver Tabla 9) Modificaciones de la Invención 3: Tabla 11: Reemplazo de glicina por soluto compatible (continuación) Tabla 12: Efecto de pH de regulador Micro-organismo usado: BHV Composición estabilizadora usada: "I nvención 3" y "Conv. Stab." (ver Tabla 9) Modificaciones de estabilizador de "invención 3" Las variaciones de pH se indican en la tabla: Tabla 1 3: Estabilización de bacterias E.coli Micro-organismo usado: E.coli K1 2 Composición estabilizadora usada: "invención 1 " (ver Tabla 9). Para comparación, se utilizó un estabilizador bacteriano estándar que contiene Albúmina . Esto se indica como "bac stab." Tabla 14: Estabilización de diferentes bacterias Micro-organismo usado: Diferentes bacterias Composición estabilizadora usada: "invención 1 " e "invención 3" (ver Tabla 9). Para comparación se utilizó un estabilizador bacteriano estándar que contiene Albúmina. Esto se indica como "bac stab."

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . La composición estabilizadora, que comprende al menos un amino ácido, al menos un azúcar, y al menos una poliamina, en donde todos los compuestos son químicamente definidos, así siendo libre de suero, libre de proteína, libre de compuestos animales, libre de pol ímero de cual únicamente un peso variado de moléculas o de longitud variable de dicha cadena es conocida y libre de lisado proteináceo, extracto, hidrolizado, o mezcla péptida, caracterizada porque la poliamina es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en etileno-diamina , cadaverina, putrescina, espermidina y espermina. 2. La composición estabilizadora según la reivindicación 1 , caracterizada porque el azúcar es al menos uno seleccionado a partir del grupo que consiste en glucosa, lactosa, sucrosa , maltosa, trehalosa, sorbitol y mannitol . 3. La composición estabilizadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 , caracterizada porque el amino ácido es glutamato o glicina, o en donde se comprenden ambos de estos amino ácidos. 4. La composición estabilizadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la composición es una solución acuosa regulada . 5. La composición estabilízadora según la reivindicación 4, caracterizada porque el regulador es a base de fosfato. 6. La composición de vacuna que comprende una composición estabilizadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y al menos una molécula biológica o al menos un microorganismo o una combinación de los mismos. 7. La composición de vacuna según la reivindicación 6, caracterizada porque el micro-organismo es un virus o una bacteria , o en donde se comprenden ambos, un virus y una bacteria. 8. La composición de vacuna según la reivindicación 7, caracterizada porque el virus es al menos una especie viral seleccionada a partir del grupo que consiste en herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, bírna-, corona-, pneumo- y poxvirus. 9. La composición de vacuna según la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula biológica es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un l ípido y un ácido nucleico. 1 0. La composición de vacuna según la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona y una enzima. 1 1 . La composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 0, caracterizada porque la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componentes animales. 1 2. La composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 1 , caracterizada porque adicionalmente comprende un adyuvante . 1 3. La composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 2, caracterizada porque la composición de vacuna se encuentra en forma liofilizada. 14. La solución de vacuna obtenible mediante reconstitución de una composición de vacuna liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1 3 en un veh ículo farmacéuticamente aceptable. 1 5. Método para la preparación de una composición farmacéutica , que comprende la mezcla de una composición estabilizadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con una composición que comprende al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo, o una combinación de los mismos. 16. El método según la reivindicación 1 5, caracterizado porque el micro-organismo es un virus o una bacteria , o en donde se comprenden ambos , un virus y una bacteria. 1 7. El método según la reivindicación 1 6, caracterizado porque el virus es al menos una especie viral seleccionada a partir del grupo que consiste en herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-, pneumo- y poxvirus. 1 8. El método según la reivindicación 1 5, caracterizado porque la molécula biológica es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un l ípido y un ácido nucleico. 1 9. El método según la reivindicación 1 8, caracterizado porque la proteína es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona, y una enzima. 20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 5 a 1 9, caracterizado porque la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componente animal . 21 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 5 a 20, caracterizado porque la composición farmacéutica resultante se sujeta a liofilización . 22. La composición farmacéutica obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 5 a 21 , en donde la composición es una composición de vacuna . 23. Método para la preparación de una solución de vacuna mediante reconstitución de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 , en un vehículo farmacéuticamente aceptable. 24. El uso de una composición estabilizadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para estabilización de la calidad y/o la cantidad de al menos una molécula biológica o al menos un micro-organismo, o una combinación de los mismos, en una composición . 25. El uso según la reivindicación 24, caracterizado porque el micro-organismo es un virus o una bacteria, o en donde se comprenden ambos, un virus y una bacteria. 26. El uso según la reivindicación 25, caracterizado porque el virus es al menos una especie viral seleccionada a partir del grupo que consiste en herpes-, paramixo-, ortomixo-, adeno-, rabdo-, birna-, corona-, pneumo- y poxvirus. 27. El uso según la reivindicación 24, caracterizado porque la molécula biológica es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un lípido y un ácido nucleico. 28. El uso según la reivindicación 27, caracterizado porque la proteína es al menos una seleccionada a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, una hormona y una enzima. 29. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 , caracterizado porque la molécula biológica o el micro-organismo, o ambos, se produjeron libres de componentes animales. 30. El uso de una composición de vacuna según la reivindicación 1 4, o una solución de vacuna obtenible mediante el método según la reivindicación 23, para inmunización de un humano o animal objetivo.
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