ES2228540T3 - Metodo para conservar material biologicamente activo. - Google Patents
Metodo para conservar material biologicamente activo.Info
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Abstract
Un método de conservación de material biológicamente activo, que comprende mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica, añadir al coacervado una solución acuosa estéril de trehalosa, someter la mezcla estéril de coacervado y trehalosa a secado a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura, inicialmente no superior a 37ºC, que se controla posteriormente para que no descienda hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz vítrea porosa que comprende trehalosa vítrea metaestable que contiene, en la matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.
Description
Método para conservar material biológicamente
activo.
La presente invención se refiere a la
conservación de material biológicamente activo, p.ej. virus,
bacterias y biomoléculas. En particular, se refiere a un método
ultrarrápido mediante el cual dicho material se puede conservar,
usando quitosano y el disacárido trehalosa. Mediante este método se
puede lograr una conservación a largo plazo de biomoléculas y
microorganismos y, especialmente, se pueden preparar vacunas vivas
atenuadas.
La conservación de materiales biodegradables
mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología
familiar y antigua. Cuando la tarea de conservar biomoléculas
sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante
deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural,
produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad
vital. La liofilización en nitrógeno líquido y la liofilización se
han convertido en los métodos aceptados para la conservación a largo
plazo de biomoléculas sensibles, usándose el último método
extensivamente para la conservación de vacunas atenuadas vivas.
Se ha logrado una termotolerancia mejorada de la
vacuna de la peste bovina liofilizada prolongando el ciclo de secado
secundario, a fin de reducir los niveles de humedad residual (RM)
hasta aproximadamente 1%-2%. Esto implica ciclos operativos largos y
de elevado consumo de energía, de hasta 72 horas, como lo
describieron Mariner, J.C. et al., Vet. Microbiol., 1990, 21,
195-209. Las vacunas producidas mediante este método
se conocen y distinguen de la vacuna estándar por el nombre de
"THERMOVAX".
Como se mencionó anteriormente, estos procesos
usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de
energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de
termotolerancia en el producto final, y se requiere aún
refrigeración para reducir el deterioro durante el almacenamiento.
Este es un problema particular para vacunas vivas destinadas a
usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el
desafortunado resultado de que los programas de vacunación
realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la
"cadena de frío" es difícil, pueden conducir finalmente a la
vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en
algunos casos, inservible.
Durante la selección natural evolutiva, ciertas
especies de plantas y animales adquirieron la notable y elegante
capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo
latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y
aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez
hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la "planta de la
resurrección" Selaginella lepidophyla, el camarón de mar
Artemia salina (Clegg, J. J. Comp. Biochem. Physiol., 1967,
20, 801-809), la levadura Saccharomyces
cerevisiae (Coutinho, E., Journal of Biotechnology, 1988, 7,
23-32) y el tardigrado Macrobiotus hufelandi
(Kinchin, I M., Biologist, 1995, 42, 4). Tales organismos se
denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven
se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y
plantas que presentan esta capacidad, contienen el disacárido
trehalosa
(\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido).
Su presencia, generalmente del orden de 0,2 g/g de peso celular seco
en la mayoría de los criptobiontes, les permite resistir la
deshidratación extrema, temperaturas elevadas, rayos X y también, en
algunas especies de tardigrados, presiones de hasta 600 MPa.
Colaco et al., Biotechnology, 1992, 10,
1007-1011, describen la ventaja del secado rápido de
materiales biológicos usando trehalosa. Este método se refiere sobre
todo al secado de enzimas de restricción e inmunoglobulinas sobre
matrices sólidas preformadas, como fibras de celulosa, o sobre las
superficies de placas de plástico, para fines diagnósticos como
ELISA o aplicaciones diagnósticas similares en el laboratorio. Sin
embargo, surgen problemas con estas técnicas cuando se amplían a
gran escala a aplicaciones industriales, como la producción de
vacunas comerciales a gran escala, en la que se tienen que manejar
números de unidades y volúmenes mucho mayores, usando técnicas
asépticas obligatorias en viales sellados parcialmente. Para cumplir
los requisitos operativos de la producción de vacunas a gran escala,
en la que son típicos volúmenes unitarios de 1,0 ml o superiores y
lotes de producción de 20 litros, se requiere una estrategia
diferente para eliminar el volumen de agua en un tiempo
económicamente aceptable. El secado a presión atmosférica, incluso a
las temperaturas máximas toleradas fisiológicamente, requeriría un
tiempo inaceptablemente largo para eliminar el agua lo
suficientemente rápido desde viales de vacuna parcialmente
taponados, y produciría inevitablemente desnaturalización y pérdida
de actividad.
Nishimura K. et al., VACCINE 3 Nº 5
(1985), muestran que los coacervados de quitosano tienen una elevada
afinidad por los epitelios mucosos. Se sugirió que esto podría
intensificar el transporte activo de antígeno hacia las células,
estimulando por la respuesta inmunitaria sistémica, tanto de IgA
como de IgG.
La presente invención se refiere principalmente a
un método de conservación de material biológicamente activo, usando
quitosano y trehalosa en condiciones que producen la eliminación del
agua, permitiendo, al mismo tiempo, mantener la integridad biológica
del material.
Consecuentemente, la invención proporciona un
método para conservar material biológicamente activo, que comprende
mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con
una solución acuosa estéril de quitosano o su sal atóxica, para
formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano
o su sal atóxica, añadir al coacervado una solución acuosa estéril
de trehalosa, someter la mezcla acuosa estéril de coacervado y
trehalosa a secado a una presión inferior a la atmosférica y a una
temperatura, inicialmente no superior a 37ºC, que se controla para
que no disminuya hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz porosa
vítrea que comprende trehalosa vítrea metaestable, que contiene, en
la matriz, quitosano o su sal atóxica y material biológicamente
activo desecado.
Según una realización preferida, el método de
conservación de un material biológicamente activo comprende las
siguientes etapas:
- (i)
- mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica;
- (ii)
- mezclar el coacervado producido en la etapa (i), con una solución acuosa estéril de trehalosa;
- (iii)
- someter la mezcla a secado primario, durante 30 a 60 minutos, a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura inicialmente no superior a 37ºC, y que se controla para que no descienda hasta 0ºC o inferior y que finalmente no es superior a 40ºC, para formar una matriz porosa vítrea que comprende trehalosa vítrea con un contenido de humedad residual no superior a 10%, y que contiene en la matriz quitosano o su sal atóxica y material biológicamente activo desecado; y
- (iv)
- someter la matriz porosa vítrea de la etapa (iii) a secado secundario durante 10 a 30 horas a una presión no superior a 0,1 mbares y a una temperatura que finalmente está en el intervalo de 40 a 45ºC, para formar una matriz de trehalosa que tiene un contenido de humedad residual no superior a 2%, que contiene en la matriz, quitosano o su sal atóxica y material biológicamente activo desecado.
Usando el método de la invención es posible
producir una vacuna viva con características biológicas mejoradas y
ventajas comerciales distintas, comparada con los métodos del estado
de la técnica previo. Las vacunas preparadas usando el método de la
invención se secan mucho más rápidamente que aquéllas que usan los
procedimientos de liofilización convencionales. Por ejemplo, el
método de la invención se puede usar para preparar mezclas de
trehalosa/quitosano/material biológicamente activo hasta un
contenido de humedad residual de aproximadamente 10%, en menos de
una hora. Se puede lograr una deshidratación posterior hasta un
contenido de humedad residual de aproximadamente
1-2% en menos de 30 horas, por ejemplo
aproximadamente 20 horas, comparado con un período de 50 horas
mediante procedimientos de liofilización convencionales. Además, el
daño producido por concentración de soluto se minimiza según la
presente invención y, particularmente, se evita la cristalización
dañina del hielo. La termoestabilidad del material biológicamente
activo conservado en la matriz vítrea de trehalosa es superior a la
de los materiales conservados mediante métodos del estado de la
técnica previo y, por tanto, se minimiza la necesidad de la
"cadena de frío", que es un condicionante grave con la vacuna
liofilizada convencional. El producto de la presente invención se
puede exponer a temperaturas ambientales elevadas, p.ej., hasta
aproximadamente 45ºC, durante períodos prolongados de tiempo, sin
pérdida grave de actividad biológica. Además de éstas y otras
ventajas de la presente invención, el producto del método presenta
una "solubilidad instantánea" una vez rehidratado
El método de la presente invención es adecuado
para lograr la conservación a largo plazo de materiales
biológicamente activos, por ejemplo, microorganismos, proteínas,
biomoléculas vivas y ácidos nucleicos. En particular, se puede usar
para conservar componentes víricos atenuados vivos, altamente
lábiles y componentes de micoplasma que se pueden rehidratar para
formar vacunas. Ejemplos de tales materiales biológicamente activos
que se pueden conservar según el método de la invención
incluyen:
- Familia: Paramixoviridae
- Subfamilia: Paramixovirinae
- Géneros: grupo de virus de la Parainfluenza, sarampión, peste bovina, moquillo, peste de pequeños rumiantes
- Paramixovirus: virus de la parotiditis infecciosa (paperas)
- Género: Rubivirus, rubeola (sarampión alemán)
- Género: Flavivirus, virus de la fiebre amarilla (fiebre amarilla)
- Género: Rhabdovirus, Lyssaviridae (virus de la rabia)
- Picornavirus (virus de la polio)
- Virus de la enfermedad de Newcastle
- Micoplasma: Mycoplasma mycoides (pleuroneumonía bovina contagiosa)
- Brucella abortus: vacuna de la cepa 19
Según el método de la presente invención, el
material biológicamente activo a conservar se prepara en forma de
suspensión en un medio acuoso apropiado. Puede darse el caso de que
se necesite cultivar un virus o cepa bacteriana, por ejemplo en
células Vero, en un medio de cultivo apropiado y luego recogerlas
antes de ponerlas en suspensión, a fin de proporcionar una
concentración de material útil. Típicamente, se ajustará el pH de la
suspensión acuosa de material biológicamente activo, por ejemplo
mediante la adición de un álcali, hasta un pH en el intervalo de 7,0
a 7,8, especialmente aproximadamente 7,4.
La suspensión de material biológicamente activo
se mezclará a continuación con una solución acuosa estéril de
quitosano o una de sus sales atóxicas. Quitosano es el nombre
general dado a una clase de polisacáridos catiónicos preparados
mediante la desacetilación de quitina
(poli(N-acetil-glucosamina) a
(poli(1,4-beta-D-glucopiranosamina).
La quitina es un biopolímero natural que se encuentra abundantemente
en los exoesqueletos de los crustáceos. Las cutículas de los
tardigrados en el estado resistente de latencia están compuestas por
quitina. El quitosano es un polieletrólito catiónico lineal que es
atóxico, biodegradable y biocompatible, y es un sólido translúcido
amorfo blanco o crema, que es soluble en ácidos orgánicos diluidos.
El uso del quitosano en la presente invención está basado en el
descubrimiento de que actúa como una cubierta biopolímera protectora
alrededor del material biológicamente activo que se está
conservando. Por tanto, el uso de quitosano en combinación con el
método de desecación controlado descrito aquí, mejora la tolerancia
térmica del material desecado. Típicamente, la concentración del
quitosano en la solución acuosa estéril usada para mezcladura con la
suspensión de material biológicamente activo estará en el intervalo
de 0,001% a 0,02% p/v. Se han obtenido resultados excelentes usando
una solución que contenía 0,01% p/v de quitosano. El quitosano se
usa preferiblemente en forma de una sal de adición atóxica, p.ej.,
HCl de quitosano, que es más soluble que el quitosano.
La solución de quitosano y la suspensión de
material biológicamente activo se mezclan típicamente en una
relación de volumen de aproximadamente 1:1, a un pH de 7,4, a una
temperatura de superior a 0ºC hasta 37ºC, preferiblemente menos de
20ºC y con la máxima preferencia aproximadamente 4ºC. El quitosano y
el material biológicamente activo se someten preferiblemente a
agitación vigorosa, p.ej., mediante agitación vorticial durante
hasta 60 segundos, a una temperatura en el intervalo de 2 a 6ºC,
preferiblemente aproximadamente 4ºC, para producir una mezcla
homogénea. La mezcla, típicamente, se dejará reposar manteniendo la
temperatura permitiendo que se forme el coacervado, es decir, un
complejo de absorción del quitosano y el material biológicamente
activo, en el que el material biológicamente activo queda recubierto
por el quitosano. El coacervado así formado se recoge a
continuación, típicamente por centrifugación. Esta precipitación del
coacervado de quitosano es útil para concentrar grupos de vacunas de
baja concentración y/o para reducir los volúmenes de tratamiento
para secado. Preferiblemente, la etapa de centrifugación se realiza
no más de una hora después de la mezcladura de la solución de
quitosano y la suspensión de material biológicamente activo. Si la
mezcla se almacena durante un período más largo, las partículas del
precipitado de coacervado, más que ser ligeras y homogéneas, tienden
a aglutinarse entre sí. La centrifugación se lleva a cabo
preferiblemente en una centrífuga refrigerada, mantenida típicamente
a aproximadamente 4ºC, a una velocidad típica de aproximadamente
10.000 rpm durante varios minutos. A continuación de la recogida, el
coacervado preferiblemente se vuelve a poner en suspensión en un
medio apropiado, p.ej. solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) o
extracto de levadura y lactalbúmina de Hanks (LYE de Hanks), antes
de mezclarlo con una solución estéril de trehalosa. El coacervado se
volverá a poner en suspensión, en general, en un volumen de medio
apropiado que es igual al volumen del líquido antes de la
centrifugación, de forma que la concentración de material
biológicamente activo en la suspensión de coacervado es la misma que
en el líquido antes de la centrifugación. Sin embargo, el material
biológicamente activo se puede concentrar, si se desea, volviendo a
poner en suspensión el coacervado en un volumen de medio apropiado
que es menor que el volumen del líquido antes de la centrifugación.
Concentrando el material biológicamente activo de esta forma, el
volumen de agua que se tiene que eliminar durante la etapa de
desecación al vacío, se reduce de forma efectiva, reduciendo por
tanto la cantidad de energía requerida durante la desecación
evaporativa y reduciendo el período de tiempo requerido para secar
el material, según el método de la invención. En el caso de que el
material biológicamente activo sea un virus, puede ser a menudo
beneficioso concentrar el virus, es decir, incrementar la
concentración, de esta forma.
La trehalosa es uno de los disacáridos más
estables y químicamente no reactivos. Tiene una energía de unión
extremadamente baja, de menos de 1 Kcal/mol, haciendo la estructura
del dímero muy estable. No sufre caramelización a menos que se
caliente intensamente, ni sufre la reacción de Maillard con
proteínas o péptidos. La estructura natural dihidratada, que
contiene dos moléculas de agua, permite una flexibilidad inusual en
trono a la unión disacárida, lo cual posiblemente permite una
asociación más próxima con biomoléculas de estructura terciaria. No
es higrocópica, aunque presenta una "solubilidad instantánea"
una vez hidratada, una propiedad particularmente útil para vacunas
desecadas.
La solución acuosa estéril de trehalosa usada en
el método de la presente invención, tendrá típicamente una
concentración de trehalosa de 0,20% a 10% p/v, aunque es posible
usar soluciones de concentración superior (p.ej., 50% p/v) de
trehalosa, para proporcionar la concentración final requerida de
trehalosa en la mezcla que se somete a desecación. Preferiblemente,
la concentración de trehalosa será de 2 a 10%, y más preferiblemente
de 2,5 a 8% p/v. Dentro del intervalo de concentraciones de
trehalosa, la concentración real usada dependerá, en general, del
tamaño de unidad del material biológicamente activo. Se requiere
menos trehalosa para partículas de virus pequeñas que para células
grandes.
La mezcla de la solución estéril de trehalosa y
del coacervado puesto de nuevo en suspensión, cuando se prepara, se
somete a desecación al vacío. Preferiblemente, se usa un aparato de
liofilización convencional (p.ej., como el fabricado por EDWARDS,
CHRIST, USIFROID o SAVANT) para el procedimiento de desecación, a
fin de proporcionar un medio controlado para las etapas críticas en
el método. Se enfatiza, sin embargo, que si se usa tal aparato, no
se emplean condiciones de liofilización y el material no se somete a
liofilización. La temperatura inicial del aparato secador es tal que
asegure que la temperatura de la mezcla de trehalosa/coacervado no
será superior a 37ºC y será preferiblemente 37ºC, a fin de evitar
cualquier pérdida de actividad biológica en esta etapa del método. A
medida que se elimina agua por evaporación desde la mezcla, la
temperatura de la mezcla disminuye. No obstante, la desecación se
lleva a cabo para asegurar que no se produzca congelación o
sublimación a partir del hielo, como ocurre normalmente en
procedimientos de liofilización convencionales, es decir, la
temperatura del producto durante esta etapa del proceso de secado se
controla para que no disminuya hasta 0ºC o por debajo, y se controla
típicamente para que no disminuya por debajo de 4ºC. La presión se
reduce por debajo de la presión atmosférica, preferiblemente hasta
un valor de 800 a 300 mbares.
La etapa de desecación se continúa durante un
período de tiempo, típicamente entre 30 y 60 minutos, durante el
cual la temperatura de la mezcla de trehalosa/coacervado se reduce
inicialmente a medida que el agua se elimina por evaporación, y
luego aumenta. Cuando se alcanza una temperatura (bajo la presión
reducida empleada) de aproximadamente 25ºC, la trehalosa forma una
matriz vítrea. El contenido de humedad de la matriz vítrea es
aproximadamente 10%. La temperatura del material al final de este
procedimiento de desecación se debería de controlar de forma que no
exceda los 40ºC, ya que el material biológicamente activo sufrirá
daño si la temperatura se deja aumentar por encima de ésta.
Se prefiere que el método de la invención utilice
un procedimiento de desecación que comprenda dos etapas de
desecación, una etapa de desecación primaria (como se describió
anteriormente), en la que el contenido de humedad residual del
material se reduce a un valor no superior a 10%, y una etapa de
desecación secundaria, en la que el contenido de humedad residual
del material se reduce más, hasta un valor que no exceda el 2%. La
etapa de desecación secundaria, si se usa, se realiza a continuación
de una etapa de desecación primaria como se describió anteriormente,
preferiblemente sin eliminación del material del aparato de
desecación usado para la etapa de desecación primaria. En una etapa
de desecación secundaria, la matriz vítrea obtenida al final de la
etapa de desecación primaria se deshidrata más a presión reducida
que no exceda 0,1 mbares. Los aparatos especializados disponibles
actualmente tienen la capacidad de funcionar a presiones
extremadamente bajas, por ejemplo por debajo de 0,001 mbares. Sin
embargo, se han obtenido resultados muy buenos según la presente
invención usando presiones reducidas para la etapa de desecación
secundaria, en el intervalo de 0,001 a 0,1 mbares, típicamente de
0,01 a 0,1 mbares. La etapa de desecación secundaria se continúa
durante un período de tiempo total en el intervalo de 10 a 30 horas,
preferiblemente de 20 a 30 horas.
Como se mencionó anteriormente, la temperatura de
la matriz vítrea al final de la etapa de desecación primaria, no
debería exceder los 40ºC. Durante la etapa de desecación secundaria,
la temperatura de la matriz puede aumentar ligeramente hasta una
temperatura final, al final del procedimiento de desecación, de 40ºC
a 45ºC. La matriz de trehalosa, al final de la etapa de desecación
secundaria, tendrá un contenido residual de humedad de 2% o menos,
preferiblemente 1% o menos, a fin de asegurar un grado muy alto de
termoestabilidad en el producto. A dichos contenidos de humedad
residuales, la temperatura final en el procedimiento de desecación
no debería ser superior a 45ºC, ya que el material biológicamente
activo desecado en la matriz puede sufrir algún grado de destrucción
por encima de 45ºC. Preferiblemente, la temperatura del producto al
final de la etapa de desecación secundaria no excederá los 44ºC.
Se ha encontrado, a través de experimentación,
que existe alguna ventaja en controlar la temperatura de la matriz
durante la etapa de desecación secundaria, de forma que se mantenga
a aproximadamente 37ºC, durante un período de 15 a 17 horas, y luego
aumentarla gradualmente (por ejemplo alrededor de 0,5 a 1ºC por
hora), durante el tiempo de desecación secundario restante, hasta
una temperatura final en el intervalo de 40ºC a 45ºC.
La matriz de trehalosa vítrea producida según el
método se puede almacenar durante largos períodos de tiempo, p.ej.
varias semanas, sin ninguna pérdida sustancial de actividad, y sin
necesidad de refrigeración, y se puede rehidratar muy rápidamente en
un medio acuoso apropiado, típicamente agua destilada estéril, para
producir una vacuna destinada a usarse en un período de tiempo muy
corto.
La preparación de una vacuna y el procedimiento
de funcionamiento usando un liofilizador para la desecación de
material biológicamente activo, como los virus de la peste bovina,
de la peste de los pequeños rumiantes y el micoplasma, sin una etapa
de liofilización que implique la sublimación a partir del hielo,
explota la propiedad excepcional del disacárido trehalosa para
proteger las macromoléculas terciarias durante la desecación.
Comparado con procedimientos de liofilización
convencionales, el método de la invención ofrece las siguientes
ventajas:
- -
- Proporciona un nivel elevado de protección para el material biológicamente activo, empleando un procedimiento sencillo, relativamente corto. Se proporciona incluso un nivel mayor de protección usando el procedimiento de desecación en dos etapas, que puede emplear un ciclo de 25 horas.
- -
- El tiempo del ciclo de producción y los costes energéticos se reducen, por tanto, comparados con procedimientos de liofilización típicos.
- -
- Todo lo que se necesita es un equipamiento de desecación básico, aunque se pueden usar también liofilizadores sofisticados, controlados por microprocesador, pero no son estrictamente esenciales.
- -
- El método tolera la interrupción de la corriente, a diferencia de la liofilización, en la que incluso un corte de corriente corto puede producir la fusión del producto, conduciendo a una pérdida de virus inaceptable.
La vacunación oral con algunas cepas atenuadas de
virus ha sido difícil de lograr en el pasado, debido a la pérdida de
epiteliotropismo. Tanto la vacunación oral como la intranasal serían
útiles y apropiadas para muchas aplicaciones porque mimetizan la vía
natural de infección por gotitas, produciendo una cascada de
inmunidad mucosa protectora, con una respuesta de IgA, de IgG2a
humoral y de células T cooperadoras de tipo 1. Sería fácil
administrar tales vías de vacunación y éstas serían aplicables en el
caso de que se prepare una vacuna adecuada. El quitosano aumenta el
transporte transcelular y paracelular a través del epitelio mucoso,
y se cree que incrementa o restablece el epiteliotropismo
disminuido, asociado normalmente con cepas de vacuna atenuadas
(p.ej. virus de la peste bovina RBOK atenuado y micoplasma CBPP
S1/44). Esto puede ser particularmente importante en CBPP y otras
infecciones por micoplasma, en las que los mecanismos de protección
son aún desconocidos, particularmente la inmunidad posvacunación
tras la vacunación subcutánea. Un procedimiento de vacunación con
cepas vivas atenuadas que mimetizan la vía natural de infección,
induce una inmunidad celular y seromucosa más completa. Según un
aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de
fabricación de una vacuna para uso oral e intranasal, que comprende
preparar una matriz vítrea de trehalosa que contenga virus desecados
según el método descrito anteriormente, y rehidratar la matriz
vítrea con una composición acuosa apropiada. Según una realización
preferida de este aspecto de la invención, la vacuna para vacunación
oral o intranasal es una vacuna NMR. Debido a que la vacuna NMR
pediátrica actual se prepara mediante tecnología de liofilización
convencional y se inyecta en el paciente subcutáneamente, una vacuna
oral o intranasal proporcionaría grandes ventajas.
Se cultivó la cepa RBOK del virus de la peste
bovina en células Vero en medio LYE (hidrolizado de lactalbúmina y
extracto de levadura) de Hanks, que contenía 0,1% de trehalosa en
vez de glucosa. Se cultivaron Mycoplasma mycoides subs. mycoides
S1/44 (SC) T_{1}-SR y virus de la pleuroneumonía
contagiosa bovina (CBPP), en medio de Gourlay. A continuación se
recogieron el grupo de virus y el grupo de CBPP. El pH de los grupos
de virus y de CBPP se ajustaron con NaOH 0,1 M hasta pH 7,4.
Se preparó una solución de reserva de quitosano
al 2% p/v, como sigue:
HCl de quitosano (suministrado por Pronova Seacure) | 20g |
Agua destilada | 1000 ml |
Sometido a autoclave a 121ºC durante 30
minutos.
Se preparó una solución de reserva de dihidrato
de trehalosa al 50% p/v en una solución salina equilibrada de Hanks
(HBSS), ajustándose el pH mediante la adición de NaOH 0,1 M hasta
7,4. La solución se esterilizó mediante tratamiento en autoclave a
121ºC durante 20 minutos.
Se preparó un volumen adecuado de resistencia de
trabajo al 0,02% p/v de quitosano, añadiendo 1 ml de quitosano de
reserva al 2% p/v a 99 ml de agua destilada estéril.
Se añadió un volumen de solución de quitosano al
0,02% p/v, a un volumen de fluido de virus a 4ºC, y el pH se ajustó
hasta 7,4 con NaOH 0,1 M. Esta etapa se repitió separadamente para
el grupo de cultivo de CBPP y el complejo de coacervación resultante
de cada uno se completó mediante agitación vorticial rápida durante
30 segundos y posteriormente se almacenó a 4ºC durante 1 hora. El
precipitado resultante de cada uno se recogió mediante
centrifugación a 10.000 rpm en una centrífuga refrigerada, el
sobrenadante se desechó y el coacervado se volvió a poner en
suspensión en un volumen de solución salina equilibrada de Hanks
(HBSS). Se añadió un volumen de solución de trehalosa estéril en
solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) al 50% p/v, a la
suspensión de coacervado, para proporcionar una concentración de
trehalosa final de 5% p/v (la actividad se controla mediante los
procedimientos funcionamiento estándar de control de calidad para
estos organismos)
La vacuna se secó rellenando alícuotas de 1,0 ml
en viales de vacuna de 5 ml taponados parcialmente con tapones de
caucho de butilo secos. Los estantes del liofilizador convencional
(EDWARDS MODULYO) se calentaron hasta 37ºC y se dejó que el
condensador alcanzase 40ºC bajo cero. Los viales de vacuna se
colocaron en el liofilizador y la presión en la cámara de secado se
ajustó hasta 800 mbares y comenzó el secado durante 30 minutos hasta
que se hubo evaporado aproximadamente 75% del agua, teniendo cuidado
de no permitir que la temperatura del producto descendiera por
debajo de 0ºC. La presión se redujo a continuación hasta 500 mbares
y el secado continuó hasta que se alcanzó la temperatura de
transición vítrea de la trehalosa, a aproximadamente 25ºC, se formó
una matriz porosa vítrea y la temperatura del producto se dejó
aumentar hasta alcanzar la temperatura de partida inicial, próxima a
la de los estantes. En esta etapa, la humedad residual (RM) era
aproximadamente 10%. Un secado posterior a 0,01 mbares y 45ºC
durante 17 horas, redujo ésta hasta 1-2% RM,
asegurando una termoestabilidad elevada en el producto.
La presión se mantuvo a 0,01 mbares y los viales
se cerraron herméticamente al vacío o a presión atmosférica, en
nitrógeno seco.
La efectividad de la presente invención se
demostró midiendo las concentraciones de virus de la peste bovina y
de micoplasma CBPP en sus líquidos originales respectivos, y luego
en vacunas preparadas a partir del producto deshidratado obtenido
según el ejemplo anterior.
- 1.
- Concentración de virus del líquido original antes del secado: 5,40 Log 10 DICT 50/ml.
- 2.
- Concentración de virus en el producto del Ejemplo (secado con trehalosa al 2,5%): 5,45 Log 10 DICT 50/ml.
- en la que DICT 50/ml = dosis capaz de infectar al 50% de los tejidos, por ml.
- 1.
- Concentración de micoplasma vivo del líquido original antes del secado: 9,90 Log 10 organismos/ml.
- 2.
- Concentración del producto del Ejemplo (tras secado con trehalosa al 5%): 8,05 Log 10 organismos/ml.
Se cultivó inicialmente una cepa de peste de los
pequeños rumiantes (PPRV 75/1), usando células Vero en medio de
Eagles con modificación de Glasgow (GMEM), suplementado con caldo de
fosfato de triptosa al 10% (TPB, Difco) y suero de ternera fetal al
10% (FCS) como sigue:
Se sembraron células Vero en matraces de plástico
de 5 x 150 cm^{2} a una concentración celular de 287.000
células/ml, 60 ml por matraz. Se inocularon dos matraces con 0,5 ml
de suspensión de virus PPR, a una multiplicidad de infección de 0,03
partículas virales/célula. Un matraz permaneció sin inocular como
testigo.
Los matraces se incubaron a 37ºC en CO_{2} al
5%, y las células se examinaron diariamente para el desarrollo de
efectos citopáticos (cpe). En el día 4, el medio GMEM se reemplazó
por extracto de levadura y lactalbúmina de Hanks (LYE de Hanks), que
contenía FCS al 2% y dihidrato de trehalosa al 0,1%. En el día 6,
los cpe eran aproximadamente 80% y las cosechas de virus se
reunieron, congelaron y almacenaron a -20ºC. El matraz testigo
permaneció en la incubadora durante 10 días, y se comprobó que
estaba exento de contaminación o degradación celular, sin señales
obvias de agentes espontáneos.
Se preparó una solución acuosa de reserva de
quitosano (Seacure Cl 310) al 2% p/v en agua destilada y se
esterilizó en un autoclave a una temperatura de 121ºC durante 30
minutos. La solución de reserva se diluyó usando agua destilada
estéril, para proporcionar una solución que contenía quitosano al
0,02% p/v.
El pH del fluido de virus se ajustó hasta 7,4,
usando NaOH 0,1 M. A una parte del fluido de virus de pH ajustado se
le añadió una parte de la solución de quitosano diluida al 0,02%
p/v, y la mezcla se agitó vorticialmente durante 30 segundos. La
mezcla agitada se dejó reposar durante 1 hora a 4ºC, para permitir
la formación completa del complejo de coacervado.
Inmediatamente, al final del período de reposo de
1 hora, la mezcla de coacervado se centrifugó a 10.000 rpm en una
centrífuga refrigerada durante 20 minutos. El sobrenadante
resultante se desechó, y el complejo precipitado se recogió y se
puso en suspensión en medio LYH de Hanks + FBS al 2%, a un pH de
7,4. El volumen total del medio de nueva suspensión era igual al
volumen total del líquido sometido a centrifugación.
Una parte del complejo puesto nuevamente en
suspensión se mezcló con una parte de una solución acuosa estéril al
5% p/v de dihidrato de trehalosa, proporcionando así una
concentración de fluido de trehalosa de 2,5% p/v de trehalosa en la
mezcla.
Se distribuyeron volúmenes de un ml en sendos
viales de vacuna de 5 ml, y se sellaron parcialmente con insertos de
caucho de butilo ventilados en seco. Esta aplicación se llevó a cabo
a temperatura ambiente, en una cabina de flujo de aire laminar y
tomando precauciones asépticas estrictas.
El procedimiento de deshidratación se llevó a
cabo usando un liofilizador Supermodulyo de Edwards con un control
preciso sobre la cámara de presión, presión del condensador,
temperaturas de almacenamiento y de producto. El liofilizador se
preparó previamente, antes de cargar la cámara de almacenamiento con
los viales que contenían el producto. La temperatura de
almacenamiento se incrementó hasta 40ºC y la temperatura del
condensador se dejó alcanzar el límite de funcionamiento de -40ºC.
Los viales se colocaron después en los estantes y los contenidos se
dejaron alcanzar 35ºC. La puerta de la cámara se cerró con las
válvulas de admisión de aire macroscópico y microscópico totalmente
abiertas, y la bomba de vacío se encendió con la válvula de lastre a
tope. La presión en la cámara se ajustó hasta 800 mbares cerrando
cuidadosamente la válvula de admisión de aire macroscópico. La
presión en el condensador se mantuvo a 500 mbares, a fin de producir
un gradiente de presión entre la cámara y el condensador, y esto
proporcionó la fuerza impulsora para inducir al vapor de agua a
fluir desde la superficie del producto hasta el condensador. El
cierre parcial de los viales con los tapones tenía también el efecto
beneficioso de estrangular la apertura, incrementando por tanto la
presión aún más en la superficie del producto. Se percibió que los
viales cerrados parcialmente se secaban más rápidamente que los
totalmente abiertos, que contenían termopares de registro de
temperatura.
La temperatura del producto se controló
principalmente cerrando cuidadosamente la válvula de admisión de
aire macroscópico durante los primeros 15 minutos y, a continuación,
mediante manipulación de la válvula de admisión de aire
microscópico, asegurándose de no permitir que el producto se
congelase. El mantenimiento de la temperatura alrededor de
1-2ºC producido mediante enfriamiento evaporativo,
incrementó la velocidad de evaporación, de forma que 90% del agua se
había evaporado en una hora y la temperatura del producto comenzó a
aumentar para igualar la temperatura de almacenamiento. A medida que
transcurría la deshidratación, se alcanzó un punto crítico después
de 40 minutos, en que se producía un aumento repentino rápido hasta
25ºC, seguido en segundos por un descenso repentino de la
temperatura del producto hasta 15ºC. Éste estaba acompañado por un
burbujeo considerable del producto.
El lote se sometió luego a un período de secado
secundario, en el que la temperatura se incrementó durante un
período de 17 horas adicionales, hasta una temperatura final del
producto de 42,4ºC y una presión de 0,06 mbares, con la válvula de
lastre totalmente cerrada. Esto producía el efecto de reducir el
contenido de humedad residual del material hasta aproximadamente
0,72%.
Claims (26)
1. Un método de conservación de material
biológicamente activo, que comprende mezclar una suspensión acuosa
del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril
de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado
del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica,
añadir al coacervado una solución acuosa estéril de trehalosa,
someter la mezcla estéril de coacervado y trehalosa a secado a una
presión inferior a la atmosférica y una temperatura, inicialmente no
superior a 37ºC, que se controla posteriormente para que no
descienda hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz vítrea porosa
que comprende trehalosa vítrea metaestable que contiene, en la
matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal
atóxica.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
el material biológicamente activo se selecciona de virus, bacterias,
proteína biológicamente activa con estructura terciaria y ácido
nucleico.
3. Un método según la reivindicación 2, en el que
el material biológicamente activo es al menos un virus seleccionado
de virus de la peste bovina, virus de la peste de los pequeños
rumiantes, sarampión, paperas, rubeola, fiebre amarilla, polio y
virus de la enfermedad de Newcastle.
4. Un método según al reivindicación 2, en el que
el material biológicamente activo es el micoplasma de la
pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP).
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la solución acuosa estéril de
quitosano o su sal atóxica tiene una concentración de quitosano de
0,01% p/v.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que
la solución acuosa estéril de quitosano y la suspensión acuosa de
material biológicamente activo se mezclan en una relación de volumen
de 1:1 a pH 7,4.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el coacervado de material
biológicamente activo y quitosano se somete a mezcladura
vorticial.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el coacervado de material
biológicamente activo y quitosano se mezcla con una solución acuosa
estéril de trehalosa, que tiene una concentración de trehalosa en el
intervalo de 0,20 a 20% p/v.
9. Un método según la reivindicación 8, en el que
la solución acuosa estéril de trehalosa tiene una concentración de
trehalosa en el intervalo de 2,5 a 8% p/v.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que la solución acuosa estéril de trehalosa tiene una concentración
de trehalosa de aproximadamente 5% p/v.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la mezcla de coacervado y
trehalosa se somete a secado durante 30 a 60 minutos, a una presión
inferior a la atmosférica y una temperatura inicialmente no superior
a 37ºC, y que se controla para que no descienda hasta 0ºC o
inferior, y que, finalmente, no es superior a 40ºC, para formar una
matriz vítrea porosa que comprende trehalosa vítrea con un contenido
de humedad residual no superior a 10% y que contiene, en la matriz.
material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal
atóxica.
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa de secado se lleva a
cabo a una presión no superior a 800 mbares.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la matriz de trehalosa resultante
que contiene material biológicamente activo desecado y quitosano o
su sal atóxica, se somete a un procedimiento de secado secundario
durante 10 a 30 horas a presión no superior a 0,1 mbares y a una
temperatura que está finalmente en el intervalo de 40 a 45ºC, para
formar una matriz de trehalosa que tiene un contenido de humedad
residual no superior a 2%, que contiene en la matriz material
biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.
14. Un método según la reivindicación 12, en el
que el secado secundario se lleva a cabo durante 20 a 30 horas.
15. Un método según la reivindicación 13, en el
que el secado secundario se realiza durante 15 a 17 horas, a una
temperatura de aproximadamente 37ºC y la temperatura se incrementa a
continuación gradualmente durante el tiempo de secado secundario
restante, hasta una temperatura final en el intervalo de 40 a
45ºC.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que el contenido residual de humedad
al final de la etapa de secado secundario es 1,0% o inferior.
17. Un método de fabricación de una vacuna que
comprende conservar un material biológicamente activo según el
método de las reivindicaciones 1 a 15, y rehidratar el producto
vítreo así obtenido, en un medio acuoso apropiado.
18. Un método según la reivindicación 17, en el
que la vacuna es para uso oral o intranasal.
19. Un método según la reivindicación 17, en el
que la vacuna es una vacuna del sarampión, las paperas o la rubeola
(NMR).
20. Una composición rehidratable que comprende
trehalosa en forma de una matriz vítrea metaestable que contiene, en
la matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o una
de sus sales atóxicas.
21. Una composición rehidratable según la
reivindicación 20, que tiene un contenido residual de humedad no
superior a 2%.
22. Una composición rehidratable según la
reivindicación 21, que tiene un contenido residual de humedad no
superior a 1%.
23. Una composición rehidratable según una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, útil para fabricar una
vacuna, una vez rehidratada.
24. Una composición rehidratable según una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en la que el material
biológicamente activo se selecciona de virus, bacterias, proteínas
biológicamente activas con estructura terciaria y ácidos
nucleicos.
25. Una composición rehidratable según la
reivindicación 24, en la que el material biológicamente activo es al
menos un virus seleccionado de virus de la peste bovina, virus de la
peste de los pequeños rumiantes, sarampión, paperas, rubeola, fiebre
amarilla, poliomielitis y virus de la enfermedad de Newcastle.
26. Una composición rehidratable según la
reivindicación 24, en la que el material biológicamente activo es el
micoplasma de la pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP).
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