JP6817370B2 - 弱毒生ウイルス組成物 - Google Patents

Description

（優先権）
本願は、２００７年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／９１０，５７９号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は本明細書中に参考として援用される。

（分野）
本明細書の実施形態は、弱毒生ウイルスを安定化させるための、組成物および方法に関する。その他の実施形態は、弱毒生ウイルスの分解を低減させるための、組成物および方法に関する。さらにその他の実施形態は、これらの組成物の、携帯可能な適用例および方法に向けたキットでの使用に関する。

（背景）
ウイルス感染を予防するワクチンは、ヒト疾患の発生を減少させるのに有効に使用されている。ウイルス性ワクチンに関して最も成功した技術の１つは、動物またはヒトに、弱力化または弱毒化したウイルス（「弱毒生ウイルス」）の株で免疫を与えることである。免疫化後の限られた複製が原因で、弱毒化株は疾患を引き起こさない。しかし、限られたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するのに十分であり、ウイルスにとって強力で長期間にわたる免疫応答をもたらす。このように、ウイルスの病原性株に引き続き曝すと、免疫化された個体は疾患から保護される。これらの弱毒生ウイルス性ワクチンは、公衆衛生で使用される最も成功したワクチンの１つである。

米国で販売が認可された１６種のウイルス性ワクチンのうち１０種は、弱毒生ウイルスである。非常にうまくいった生のウイルス性ワクチンには、黄熱病１７Ｄウイルス、セービンポリオウイルス１、２、および３型、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘ウイルスおよびワクシニアウイルスが含まれる。天然痘の大流行を抑制するためのワクシニアウイルスワクチンの使用は、ヒト疾患の初めての唯一の撲滅をもたらした。セービンポリオウイルスワクチンは、世界中のダメージを与える疾患を予防するのを助け、ポリオを根絶する試みで使用されている。麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、および水痘ワクチンでの小児のワクチン接種は、何百万人もの死および病気を国際的に予防する。

混ぜ合わせ、逆遺伝学、および低温適応などの最近の技術的進歩により、インフルエンザおよびロタウイルス用として弱毒生ウイルスが認可された。組換えＤＮＡ技術により開発されたいくつかの生のウイルス性ワクチンは、ウエストナイル疾患、デング熱、マラリア、結核、およびＨＩＶ用のワクチンも含めて、ヒト臨床試験中である。これらの組換えウイルス性ワクチンは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱病１７Ｄ、またはデングウイルス、ＤＥＮ−２ＰＤＫ−５３など、十分に特徴付けられた弱毒化ウイルス性ワクチンの操作に依拠する。安全な弱毒化ウイルスは、他のウイルスまたは病原菌に対して防御抗原を発現するように、遺伝子操作される。いくつかの組換えウイルス性ワクチンは、カナリア痘／ネコ白血病組換えウイルス、カナリア痘／イヌジステンパー組換えウイルス、カナリア痘／ウエストナイル組換えウイルス、および黄熱／ウエストナイル組換えウイルスも含めて、動物使用として認められている。集団として、弱毒生ウイルス性ワクチンは、抗生物質の出現に次いで２番目に、ヒトの歴史の中で最も成功した医学的介入の１つであり、世界中の公衆衛生を改善するものとして将来有望である。

弱毒生ウイルス性ワクチンを有効にするために、このワクチンは、免疫化後に複製可能でなければならない。このように、ウイルスを不活化する任意の要因は、ワクチンにダメージを与える可能性がある。例えば、第２次世界大戦前の天然痘ワクチンの世界的な流通および使用は、ウイルスがわずか数日後に周囲温度で不活化したことにより、制約を受けた。１９２０年代には、フランスの科学者が、凍結乾燥したワクチンによって長期間にわたる安定性がもたらされたことを実証し、凍結乾燥ワクチンの大規模製造のための技法が１９４０年代に開発された（例えば、Ｃｏｌｌｉｅｒ、１９５５年参照）。凍結乾燥の他に、弱毒生ウイルス性ワクチンの安定化を助けることができる様々な添加剤が明らかにされた（例えば、Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年参照）。これらの安定化剤は、典型的には、下記の成分：２価陽イオン、緩衝塩溶液、キレート剤、尿素、糖（例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース）、ポリオール（例えば、グリセロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール）、アミノ酸、タンパク質加水分解物（例えば、カゼイン加水分解物、ラクトアルブミン加水分解物、ペプトン）、タンパク質（例えば、ゼラチン、ヒト血清アルブミン）、またはポリマー（例えば、デキストラン）の１種または複数を含む。

しかし、これらの安定化剤を用いても、一般に使用されるワクチンの多くは、依然として、安定化のために冷蔵する必要がある。その他の一般に使用されるワクチンは、温度の両極端に感受性があり；過剰な熱または思いがけない凍結によって、ワクチンが不活化する可能性がある。流通中のこの「コールドチェーン」の維持は、開発途上国では特に難しい。このように、既存のおよび新たに開発された、両方の弱毒生ウイルス性ワクチンの安定性を改善することが、依然として求められている。

フラビウイルスは、最も不安定なウイルスの１つである。このウイルスは、ＲＮＡゲノムが約１１０００塩基のエンベロープを持ったウイルスである。フラビウイルスのほとんどは、節足動物ベクター、一般には蚊によって、伝染する。これらのウイルスは、３つの主なカテゴリー：デング群、日本脳炎群、および黄熱病群にグループ分けされる、７０種を超える種々のフラビウイルスがある。知られているフラビウイルスのうち、４０種は蚊によって伝染し、１６種はダニによって伝染し、１８種のウイルスは、特定された昆虫ベクターを持たない。このように、ほとんどのフラビウイルスは、それらの節足動物ベクターおよびそれらの脊椎動物宿主種（しばしば、トリまたは哺乳類）の両方において、複製するように進化している。拡大する都会化、世界的規模の旅行、および環境の変化（森林破壊や降雨パターンなど）が、ヒトの公衆衛生に対する脅威としての、いくつかのフラビウイルスをもたらしている。そのようなウイルスには、限定するものではないが黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。

徹底した蚊の抑制およびワクチン接種の努力により、黄熱病ウイルスは、北、中央、および南アメリカ、カリブ、および欧州の多くから排除された。しかし、この２０年で、症例を報告する国の数が増加した。黄熱病ウイルスは、現在、アフリカおよび南アメリカおよびいくつかのカリブの島々の多くの部分で流行している。世界保健機関（ＷＨＯ）は、黄熱病の２０００００症例が、毎年３００００名の死亡をもたらしていると推定する。第２次世界大戦以来、デングフラビウイルスは、世界全体を通して熱帯および亜熱帯地方に拡がってきており、現在、３５億人以上、即ち世界人口の約半分を脅かしている。ＷＨＯは、５千万〜１億症例のデング熱が毎年生じていると推定する。これらのうち５０００００症例は、デング出血熱と呼ばれるより重症な生命を脅かす形態の疾患であり、１年に２５０００名よりも多くの死亡をもたらす。特に毒性の強い形態のウエストナイルウイルスが、１９９９年にニューヨークで、おそらくは旅行によって、西半球に導入された。蚊媒介性ウイルスは１次宿主としてトリに感染したが、ヒトおよびウマにも疾患および大量死を引き起こした。ウエストナイルウイルスは、米国全土とカナダおよびメキシコに拡がった。その導入以来、ウエストナイルウイルスは、米国では、２００００件以上の報告されたウエストナイル疾患の症例を引き起こして９５０名の死亡をもたらした。日本脳炎ウイルスは、主に東および南アジアで、毎年３００００から５００００症例の神経疾患を引き起こした。報告された症例の２５〜３０％は致命的である。ダニ媒介性日本脳炎ウイルスは、欧州およびアジアの一部で流行し、数千人にも影響を及ぼす一時的な大流行を引き起こし続けている。より限定的な地理的蔓延に関連するウイルスには、オーストラリアおよびニューギニアのクンジンウイルス（ウエストナイルに近い類縁体）およびマレーバレー脳炎ウイルス、北および南米のセントルイス脳炎ウイルス、アフリカのウスツ、コウタンゴ、およびヤオンデウイルス、南米のカシパコールウイルスが含まれる。

弱毒生ウイルス性ワクチンは、安全で、黄熱病や日本脳炎などのフラビウイルス疾患から保護するものが、開発されている。弱毒生ウイルス性ワクチン、１７Ｄは、黄熱病を予防するのに広く使用されている。現行のフラビウイルスワクチンは、安定化剤の存在下で凍結乾燥する。それにも関わらず、ワクチンは、開発途上国および先進国内のより遠隔の地で実現することが難しい要件である、２〜８℃での貯蔵および輸送を必要とする。さらにワクチンは、再構成すると、２〜８℃で貯蔵した場合であっても効力を急速に失う。

麻疹ワクチンは、疾患を予防するために世界的に使用されている、不安定な弱毒化ウイルスの別の例である。麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科の、エンベロープを持った非分節性マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。麻疹は、ワクチン接種をしない思春期前の実質的に全ての小児に影響を及ぼす可能性がある、非常に伝染性のある季節性疾患である。開発途上国では、麻疹に感染した子供の死亡率は、２から１５％程度に高い可能性がある。確かに、世界的な免疫化を始めようとする試みにも関わらず、麻疹は依然として、毎年７０００名を超える子供の死亡を引き起こしている。麻疹ワクチンは、主にニワトリ線維芽細胞で製造される、弱毒生ウイルスである。ワクチンは、ゼラチンおよびソルビトールで安定化し、次いで凍結乾燥される。安定化した凍結乾燥済みワクチンは、２から８℃で貯蔵した場合に２年以上の貯蔵寿命を有する。しかし、凍結乾燥済みワクチンは依然として、開発途上国世界では維持するのが難しいコールドチェーンを必要とする。さらに、ワクチンは再構成すると、室温（２０から２５℃）で１時間以内にその効力の５０％を失う。

したがって、当技術分野では、改善されたワクチン製剤の必要性が存在する。

（要旨）
本明細書の実施形態は、弱毒生ウイルス組成物の劣化または不活化を低減しまたは防止する、方法および組成物に関する。開示されるある組成物は、弱毒生ウイルスの劣化を低減する成分の組合せを含むことができる。本明細書のその他の実施形態は、弱毒生ウイルスの安定性を大幅に高める賦形剤の組合せに関する。本明細書のさらにその他の組成物および方法は、水性および／または再構成された弱毒生ウイルスの貯蔵寿命を延ばしながら、より低い温度（例えば、冷蔵または冷凍貯蔵）の必要性を低減させることを対象とする。

本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
１種または複数の弱毒生ウイルス；
１種または複数の高分子量界面活性剤；
１種または複数のタンパク質物質；および
１種または複数の炭水化物物質
を含む、弱毒生ウイルス組成物であって、前記弱毒生ウイルスの不活化を低減させることが可能なウイルス組成物。
（項目２）
前記弱毒生ウイルスが、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目３）
前記弱毒生ウイルスがフラビウイルスである、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目４）
水性形態にある、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目５）
部分的にまたは全体的に脱水されている、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目６）
前記界面活性剤物質が、１５００以上の分子量を有する、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目７）
前記界面活性剤物質が、１種または複数のコポリマーをさらに含み、該界面活性剤物質の分子量が３０００以上である、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目８）
前記界面活性剤物質が、１つまたは複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーからなる、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目９）
前記タンパク質物質が、脊椎動物種由来のラクトアルブミン、血清アルブミン、α−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アファミン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１０）
前記タンパク質物質が、脊椎動物種由来の血清アルブミンである、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１１）
前記炭水化物物質が、糖、ポリオール、またはこれらの組合せのうちの少なくとも１種である、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１２）
前記炭水化物物質のうちの１種または複数が、トレハロース、スクロース、キトサン、ソルビトール、マンニトール、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１３）
前記炭水化物物質がトレハロースである、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１４）
少なくとも１種の界面活性剤物質がＥＯ−ＰＯブロックコポリマーＰｌｕｏｎｉｃ Ｆ１２７であり、少なくとも１種のタンパク質物質が血清アルブミンであり、少なくとも１種の炭水化物物質がトレハロースである、項目１に記載のウイルス組成物。
（項目１５）
前記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７の濃度が０．１〜４％（ｗ／ｖ）であり、前記血清アルブミンの濃度が０．００１〜３％（ｗ／ｖ）であり、前記トレハロースの濃度が５〜５０％（ｗ／ｖ）である、項目１４に記載のウイルス組成物。
（項目１６）
１種または複数の弱毒生ウイルスと、１種または複数の高分子量界面活性剤、１種または複数のタンパク質物質、および１種または複数の炭水化物を含む組成物とを組み合わせるステップを含む、弱毒生ウイルス組成物の不活化を低減させるための方法であって、ここで該組成物は、該弱毒生ウイルスの不活化を低減させることが可能である、方法。
（項目１７）
前記弱毒生ウイルスが、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記組合せを部分的にまたは全体的に脱水するステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
投与前に前記組成物を部分的にまたは全体的に再水和するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が、水性ウイルス組成物の貯蔵寿命を延ばす、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が、水性の弱毒生ウイルスの不活化を２４時間以上にわたり低減させる、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、水性の弱毒生ウイルスの不活化を、１つまたは複数の凍結解凍サイクルの間に低減させる、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
少なくとも１種の高分子量界面活性剤がＥＯ−ＰＯブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７であり、前記タンパク質物質の少なくとも１種が血清アルブミンであり、前記炭水化物物質の少なくとも１種がトレハロースである、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
前記ウイルス組成物が、健康状態の発症を低減させるかまたは健康状態を予防するために被験者に投与される、項目１６に記載の方法。
（項目２５）
前記健康状態が、ウエストナイル感染、デング熱、日本脳炎、キャサヌール森林病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介性脳炎、黄熱病、およびＣ型肝炎ウイルス感染からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
少なくとも１個の容器と；
１種または複数のタンパク質物質、１種または複数の炭水化物物質、および１種または複数の高分子量界面活性剤を含む組成物とを含む、弱毒生ウイルス組成物の不活化を低減させるためのキットであって、該組成物は、弱毒生ウイルスの不活化を低減させる、キット。
（項目２７）
少なくとも１種の界面活性剤物質がＥＯ−ＰＯブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７であり、少なくとも１種のタンパク質物質が血清アルブミンであり、少なくとも１種の炭水化物物質がトレハロースである、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
前記トレハロースの濃度が５〜５０％（ｗ／ｖ）である、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
前記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７の濃度が０．１〜４％（ｗ／ｖ）である、項目２７に記載のキット。
（項目３０）
前記血清アルブミンの濃度が０．００１〜３％（ｗ／ｖ）である、項目２７に記載のキット。
（項目３１）
前記組成物が、１種または複数の弱毒生ウイルスをさらに含む、項目２６に記載のキット。
（項目３２）
前記弱毒生ウイルスが、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３１に記載のキット。

これらの実施形態によれば、ある弱毒生ウイルスは、フラビウイルスを対象とする。組成物を対象とするいくつかの実施形態は、限定するものではないが、１種または複数の高分子量界面活性剤、タンパク質、および炭水化物と組み合わせた１種または複数の生の弱毒化フラビウイルスなど、１種または複数の弱毒生ウイルスを含むことができる。

本明細書で企図される組成物は、生の弱毒化フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスを含むがこれらに限定するものではない、弱毒生ウイルスの安定化を増大させ、かつ／または不活化および／または劣化を低減させることができる。

その他の実施形態は、本明細書で企図されるウイルスの１種または複数によって引き起こされる病状の発症を、低減させまたは予防することが可能なワクチン組成物を対象とした、弱毒生ウイルス組成物および方法に関する。これらの実施形態によれば、病状には、限定するものではないがウエストナイル感染、デング熱、日本脳炎、キャサヌール森林病、マレーバレー脳炎、アルクフルマ出血熱、セントルイス脳炎、ダニ媒介性脳炎、黄熱病、およびＣ型肝炎ウイルス感染を含めることができる。

ある実施形態では、本明細書で企図される組成物は、部分的にまたは完全に脱水しまたは水和することができる。その他の実施形態では、本明細書の組成物での使用が企図されるタンパク質物質には、限定するものではないがラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、その他の血清アルブミン、またはアルブミン遺伝子ファミリーメンバーを含めることができる。糖またはポリオール物質には、限定するものではないが単糖、二糖、糖アルコール、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セリビオース、ゲンチオビオース、ラミナリボース、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、キシリトール、エリスリトール、ラフィノース、アミロース、シクロデキストリン、キトサン、またはセルロースを含めることができる。ある実施形態では、界面活性剤物質には、限定するものではないがアルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とのコポリマー（ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー）、ポリ（ビニルピロリドン）、アルキルポリグルコシド（モノステアリン酸スクロース、ラウリルジグルコシド、またはソルビタンモノラウレート、オクチルグルコシド、およびデシルマルトシドなど）、脂肪アルコール（セチルアルコールまたはオレイルアルコール）、またはコカミド（コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＴＥＡ）などの非イオン性界面活性剤を含めることができる。

その他の実施形態では、界面活性剤には、限定するものではないが、コポリマー ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標））、コポリマー ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（登録商標））、コポリマー ポロキサマー４０３（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（登録商標））、または３０００〜４０００ＭＷよりも大きいその他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーを含めることができる。

いくつかの実施形態では、ワクチン組成物には、限定するものではないが血清アルブミンである１種または複数のタンパク質物質；トレハロースである１種または複数の糖物質；およびＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、コポリマー ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標））である１種または複数の界面活性剤ポリマー物質を含めることができる。

本明細書のいくつかの実施形態は、部分的にまたは全体が脱水した弱毒生ウイルス組成物に関する。これらの実施形態によれば、組成物は、２０％以上；３０％以上；４０％以上；５０％以上；６０％以上；７０％以上；８０％以上；または９０％以上が脱水されていてもよい。

その他の実施形態は、１種または複数の弱毒生ウイルスと、１種または複数のタンパク質物質；１種または複数の糖またはポリオール物質；および１種または複数の高分子量界面活性剤を含むがこれらに限定するものではない弱毒生ウイルスの不活化を低減させることが可能な組成物とを組み合わせるステップを含むがこれらに限定するものではない、弱毒生ウイルスの不活化を低減させるための方法であって、この組成物が、弱毒生ウイルスの不活化を低減させる方法に関する。これらの実施形態によれば、弱毒生ウイルスには、限定するものではないがフラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスを含めることができる。さらに、本明細書に開示される方法および組成物は、組合せ用の凍結乾燥またはその他の水和方法を含むことができる。これらの方法および組成物によれば、この方法および組成物は、凍結乾燥しまたは部分的にもしくは全体が脱水された弱毒生ウイルスの、不活化を低減させる。その他の方法では、弱毒生ウイルスの不活化を低減させるための組成物は、水性組成物を含んでもよく、または脱水後に再水和した組成物を含んでもよい。本明細書に記述される組成物は、水性のまたは再水和した弱毒生ウイルスの貯蔵寿命を、延ばすことが可能である。

ある特定の実施形態では、本明細書で企図されるワクチン組成物に使用される弱毒生ウイルスには、限定するものではないが弱毒化黄熱病ウイルス（１７Ｄなど）、弱毒化日本脳炎ウイルス（ＳＡ １４−１４−２など）、弱毒化デングウイルス（ＤＥＮ−２／ＰＤＫ−５３またはＤＥＮ−４Δ３０など）、または組換えキメラフラビウイルスを含む、限定するものではないが１種または複数の生の弱毒化フラビウイルスワクチンを含めてもよい。

ある実施形態では、本明細書で企図される組成物は、室温（例えば、約２０°から約２５℃）または冷蔵温度（例えば、約０°から約１０℃）で２４時間超にわたり、水和した弱毒生ウイルスの不活化および／または劣化を低減させることが可能である。より特定の実施形態では、組合せ組成物は、２４時間超にわたり、弱毒生ウイルスの約１００％を維持することが可能である。さらに、本明細書で企図される組合せ組成物は、少なくとも２サイクルの凍結および解凍中に、水和した弱毒生ウイルスの不活化を低減させることが可能である。その他の方法は、冷蔵温度（例えば、約０°から約１０℃）で約２４時間から約５０日にわたり、水和した弱毒生ウイルスの不活化を低減させることが可能な、組合せ組成物に関する。これらの方法で企図される組成物には、限定するものではないが血清アルブミンの１種または複数のタンパク質物質；トレハロースの１種または複数の糖物質；および、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）の１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー物質を含めることができる。ある実施形態では、弱毒生ウイルス組成物は、約２１℃で７日後に約１００％のウイルス力価のままであり、約４℃程度の冷蔵温度で５０日後に約１００％のウイルス力価のままである。本明細書のその他の実施形態は、約２１℃で７日後に約９０％または約８０％のウイルス力価であり続け、約４℃の冷蔵温度で５０日後に約９０％または約８０％のウイルス力価であり続ける、弱毒生ウイルス組成物を含んでもよい。企図されるその他の実施形態には、当技術分野で知られているその他の組成物に比べ（例えば、図４および５参照）、約３７℃で数時間（例えば２０時間）後に約３倍から約１０倍濃度のウイルス力価を保持する弱毒生ウイルス組成物が含まれる。本明細書に開示される組成物は、この組成物を約３７℃で貯蔵したときに、弱毒生ウイルスの劣化を低減する。

その他の実施形態は、限定するものではないが容器と；限定するものではないが１種または複数のタンパク質物質、１種または複数の糖またはポリオール物質、および１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー物質を含む組成物とを含む、弱毒生ウイルス組成物の不活化を低減させるためのキットであって、この組成物が弱毒生ウイルスの不活化および／または劣化を低下させるキットに関する。これらの実施形態によれば、キット組成物は、血清アルブミンの、１種または複数のあるタンパク質物質；トレハロースの１種または複数の糖物質；および１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー物質を含んでいてもよい。加えて本明細書で企図されるキットは、さらに、限定するものではないがフラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスを含めた１種または複数の弱毒生ウイルスを含んでいてもよい。ある実施形態では、本明細書の組成物は、糖物質としてトレハロースを含むことができる。これらの実施形態によれば、トレハロース濃度は、５％（ｗ／ｖ）に等しくまたはそれ以上であってもよい。ある実施形態では、本明細書の組成物は、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー物質としてコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）を含むことができる。これらの実施形態によれば、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）濃度は、約０．１から約４％（ｗ／ｖ）であってもよい。

その他の実施形態では、本明細書で企図される組成物は、微量の２価の陽イオンを含有してもよく、また全く含有しなくてもよい。例えば、本明細書で企図される組成物は、微量のカルシウム／マグネシウム（Ｃａ^＋２／Ｍｇ^＋２）を有してもよく、または全く有していなくてもよい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書の特定の実施形態のある態様をさらに示すために含める。実施形態は、本明細書に示される詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによって、より良く理解することができる。

組成物中での例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスの安定性を試験するために、様々な組成物を使用した実験の、例示的なヒストグラムである。 様々な例示的な組成物中の、３７℃でのウイルス不活化に関する、例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスの動態分析の例示的なグラフである。 ３７℃で２１時間貯蔵された例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの分析の、例示的なヒストグラムである。値は、入力価に対して、インキュベーション後に保たれるウイルス力価のパーセンテージとして表す。配合物パーセンテージは、それぞれの賦形剤の（ｗ／ｖ）を指す。 種々の組成物中で、３７℃で２３時間貯蔵された例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの分析の、例示的なヒストグラムである。値は、入力価に対して、インキュベーション後に保たれるウイルス力価のパーセンテージとして表す。 種々の組成物中で、３７℃で２３時間貯蔵された例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの分析の、例示的なヒストグラムである。値は、入力価に対して、インキュベーション後に保たれるウイルス力価のパーセンテージとして表す。各配合物ごとの２つの棒は、実験を２回行ったことを示す。 種々の製剤中で貯蔵したときの、２サイクルの凍結解凍後の、例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの例示的なヒストグラム分析を示す図である。値は、入力価に対して、凍結解凍サイクル後に保たれるウイルス力価のパーセンテージとして表す。 数週間にわたる２５℃でのウイルス不活化に関する、様々な例示的な組成物における例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３／ＷＮ組換えフラビウイルスの、動的分析の例示的なグラフである。 数週間にわたる４℃でのウイルス不活化に関する、様々な例示的な組成物における例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３／ＷＮ組換えフラビウイルスの、動的分析の例示的なグラフである。 様々な例示的な組成物における凍結乾燥後の例示的なウイルス、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの、例示的なヒストグラム分析を示す図である。異なる温度で２週間後、ウイルス不活性化を上記のように評価した。

（定義）
本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数の項目を意味してもよい。

本明細書で使用される「約」は、±５％を含む値までを意味してもよく、例えば、約１００は９５から１０５までを含むことを意味してもよい。
本明細書で使用される「糖」物質は、１種または複数の単糖（例えばグルコース、ガラクトース、リボース、マンノース、ラムノース、タロース、キシロース、またはアロースアラビノース）、１種または複数の二糖（例えばトレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セリビオース、ゲンチオビオース、ラミナリボース、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、またはフルクトース）、三糖（例えばアカルボース、ラフィノース、メリジトース、パノース、またはセロトリオース）、または糖ポリマー（例えばデキストラン、キサンタン、プルラン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、セロオリゴ糖、セルロース、マルトオリゴ糖、グリコーゲン、キトサン、またはキチン）を意味することができる。

本明細書で使用される「ポリオール」物質は、任意の糖アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール、アラビトール、エリスリトール、マルチトール、キシリトール、グリシトール、グリコール、ポリグリシトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはグリセロール）を意味することができる。本明細書で使用される「高分子量界面活性剤」は、分子量が１５００よりも大きい、表面活性な両親媒性の分子を意味することができる。

本明細書で使用される「ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー」は、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）とのブロックからなるコポリマーを意味することができる。さらに、本明細書で使用される「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」は、ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘ中のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーを意味することができる。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーのこの構成は、「Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ」または「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ」とも称される。

本明細書で使用される「弱毒化ウイルス」は、動物に投与したときの疾患の臨床的徴候が低減しまたは全くないことを示すウイルスを、意味することができる。
（詳細な説明）
以下のセクションにおいて、様々な例示的な組成物および方法は、様々な実施形態を詳述するために記述する。様々な実施形態の実施は、本明細書に記述される特定の詳細の全てまたは一部でさえ用いることを必要とせず、むしろ、濃度、時間、およびその他の特定の詳細は、通常の実験を通して変更してもよいことが、当業者に明らかにされよう。ある場合には、周知の方法または構成成分が、記述中に含まれていない。

フラビウイルスワクチンの安定性は、既存の黄熱病および日本脳炎の両方の弱毒生ウイルスに関して、評価されている。１９８７年に試験をしたとき、当時製造された１２種の黄熱病ワクチンのうち５種のみが、安定性の最小限の基準を満たした。その後、糖、アミノ酸、および２価陽イオンの混合物を添加することにより、凍結乾燥ワクチンが安定化することが実証され、したがってそのワクチンは、３７℃で１４日間インキュベートした後に１ログ未満の力価を失った。黄熱病ワクチン用の凍結乾燥製剤の安定化については、記述されている（例えば、米国特許第４，５００，５１２号参照）。米国特許第４，５００，５１２号は、ラクトース、ソルビトール、２価陽イオン、カルシウムおよびマグネシウムと、少なくとも１種のアミノ酸の組合せについて述べている。この製剤は、凍結乾燥ワクチンの安定化を助けることができるが、水性形態のワクチンに安定性を与えることができない。別の研究では、上述の組成物を含めたいくつかの異なる製剤の能力と、スクロース、トレハロース、およびラクトアルブミンが凍結乾燥済み黄熱病ワクチンの安定性に及ぼす影響について、試験をした。１０％スクロースのみ、２％ソルビトールおよび４％イノシトール、または１０％スクロースおよび５％ラクトアルブミン、０．１ｇ／ｌ ＣａＣｌ２および０．０７６ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４からなる製剤は、最良の安定性をもたらすことが分かった（例えば、Ａｄｅｂａｙｏ、Ｓｉｍ−Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇら、１９９８年参照）。しかし、再懸濁後の全ての場合において、黄熱病ワクチンは依然として非常に不安定であり、わずか約１時間後に廃棄しなければならない（例えば、Ｍｏｎａｔｈ、１９９６年；Ａｄｅｂａｙｏ、Ｓｉｍ−Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇら、１９９８年参照）。これは、不安定なワクチンが使用される場合には、ワクチンの浪費と、現場の条件下で効力のないワクチン投与を引き起こす可能性につながる。

日本脳炎を予防するための、別の生の弱毒化フラビウイルスワクチンが認可されており、中国で広く使用されている（例えば、ＨａｌｓｔｅａｄおよびＴｓａｉ、２００４年参照）。日本脳炎ワクチン株、ＳＡ １４−１４−２は、主にハムスター腎細胞で成長させ、細胞の上澄みを収集し、粗く濾過する。ある直前の組成物は、１％のゼラチンを含んでおり、５％のソルビトールを安定化剤として添加した。これらの安定化剤を使用して、ワクチンを凍結乾燥し、次いで２から８℃で少なくとも１年半安定であるが、室温ではわずか４カ月、また３７℃では１０日間しか安定ではない。黄熱病ワクチンの場合のように、再構成済みワクチンは非常に不安定で、室温では２時間しか安定ではない（例えば、Ｗａｎｆ， Ｙａｎｇら、１９９０年参照）。本明細書のある実施形態では、日本脳炎の変質を安定化させまたは低減するための、生の弱毒化フラビウイルス組成物が、企図される。

２〜８℃よりも高い温度で凍結乾燥製剤の長期にわたる安定性をもたらす、生の弱毒化フラビウイルスワクチン用製剤は、明らかにされていない。さらに、力価の損失を防止し、数時間超にわたって水性ワクチンの変質を安定化させまたは低減させる製剤についても、記述されていない。

その他の弱毒生ウイルス用製剤も、記述されている（例えば、Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年参照）。ＳＰＧＡと呼ばれるある一般的な安定化剤は、２から１０％のスクロース、ホスフェート、グルタミン酸カリウム、および０．５から２％の血清アルブミンの混合物である（例えば、Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ、Ｍｉｌｌｅｒら、１９５０年参照）。この塩基性製剤の様々な変更は、種々の陽イオン、スクロースの代わりにデンプン加水分解物またはデキストランを用いること、および血清アルブミンの代わりにカゼイン加水分解物またはポリビニルピロリドンを用いることによって明らかにされている。その他の製剤は、タンパク質源として血清アルブミンの代わりに加水分解したゼラチンを使用する（Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年）。しかし、ゼラチンは、免疫化された子供にアレルギー反応を引き起こす可能性があり、ワクチン関連の有害事象の原因となり得る。米国特許第６，２１０，６８３号は、ワクチン製剤でヒト血清から精製されたアルブミンの代わりに組換えヒト血清アルブミンを用いることについて記述している。

本明細書の実施形態は、従来技術の場合に比べて、弱毒生ウイルスワクチンの安定性を高めかつ／または変質を低減させる、組成物を開示する。本明細書に開示されるある組成物は、３７℃でまたは約３７℃で、２時間まで；３時間まで；４時間まで；および４時間超の水性ウイルスの安定性をもたらす。本明細書に開示されるある組成物は、室温（例えば、２５℃）でまたはほぼ室温で、最長で１日から約１週間またはそれ以上、水性ウイルスの安定性を提供する。本明細書で企図される実施形態は、例えば凍結および／または解凍、および／または高温からの、弱毒生ウイルスの保護を増大させる。ある実施形態では、本明細書の組成物は、室温条件で（例えば、約２５℃）、脱水した弱毒生ウイルス生成物を安定化させ、変質を低減させ、かつ／または不活化を防止することができる。その他の実施形態では、本明細書に企図される組成物は、約２５℃でまたは最高３７℃でまたは約３７℃で、水性の弱毒生ウイルス生成物を安定化させ、変質を低減させ、かつ／または不活化を防止することができる。本明細書に開示される組成物および方法は、先進および開発途上地域での、ウイルスワクチンの貯蔵、流通、配達、および投与を容易にすることができる。

その他の実施形態は、限定するものではないがピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス）、カリシウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス、およびネコ伝染性腹膜炎ウイルス）、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス、ウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、ルベラウイルス、ロスリバーウイルス、ウシ下痢ウイルス、ブタコレラウイルス）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ヒトコロナウイルス（風邪）、ブタ胃腸炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス）、フィロウイルス（例えば、マールブルグウイルス、エボラウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器号胞体ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛疫ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス、ラクロスウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサウイルス、マクポウイルス）、レオウイルス（例えば、ヒトレオウイルス、ヒトロタウイルス）、ビルナウイルス（例えば、感染性ファブリキウス嚢ウイルス、魚膵臓壊死ウイルス）、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ウシ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス（例えば、ヒトパルボウイルスＢ、イヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス）パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス）、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ウシアデノウイルス、ブタアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、スカンクポックスウイルス、サルポックスウイルス、ウシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス）を含めた、弱毒生ウイルスワクチン用組成物を含むことができる。

当業者なら、本明細書の組成物または製剤は、限定するものではないが細胞培養継代、再集合、感染性クローンへの変異の組込み、逆遺伝学、その他の組換えＤＮＡまたはＲＮＡ操作を含めた任意の手段によって弱毒化されたウイルスに関連することを理解するであろう。さらに、当業者なら、その他の実施形態は、限定するものではないが組換えフラビウイルス、組換えアデノウイルス、組換えポックスウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、および組換えヘルペスウイルスを含めた任意のその他のタンパク質またはＲＮＡを発現するように、遺伝子操作されたウイルスに関連することを理解するであろう。そのようなウイルスは、感染性疾患のワクチン、腫瘍学的状態を治療するワクチン、または障害を治療する発現タンパク質またはＲＮＡを導入する（例えば、遺伝子療法、アンチセンス療法、リボザイム療法、または低阻害性ＲＮＡ療法）ウイルスとして使用してもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ペルペスウイルス科、またはポックスウイルス科の膜エンベロープを有する１種または複数のウイルス（例えばエンベロープ付きウイルス）を含有することができる。ある実施形態では、組成物は、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、またはレトロウイルス科の１種または複数のエンベロープ付きＲＮＡウイルスを含有する。その他の実施形態では、本明細書の組成物は、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、またはレトロウイルス科の、１種または複数のエンベロープ付きプラス鎖ＲＮＡウイルスを含有することができる。ある実施形態では、組成物は、１種または複数の生の弱毒化フラビウイルス（例えば、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、または日本脳炎ウイルス）を含有することができる。

本明細書のいくつかの実施形態は、水性または凍結乾燥形態の、弱毒生ウイルス用組成物に関する。当業者なら、熱ウイルス安定性を改善しかつ凍結解凍不活化を防止する製剤が、液体、粉末化、フリーズドライ、または凍結乾燥されかつ当技術分野で知られている方法によって調製された生成物を改善することが理解されよう。再構成後、そのような安定化ワクチンは、限定するものではないが皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻内投与、経肺投与、または経口投与を含めた様々な経路によって、投与することができる。限定するものではないが、シリンジおよび針注射、二股になった針による投与、皮内パッチまたはポンプによる投与、無針ジェット送達、皮内粒子送達、またはエアロゾル粉末送達を含めた、ワクチンを送達するための様々な装置が当技術分野で知られている。

実施形態は、１種または複数の弱毒生ウイルス（上述の）と、１種または複数の高分子量界面活性剤および１種または複数のタンパク質の混合物を、生理学的に許容される緩衝液に溶かしたものからなる組成物を含むことができる。ある実施形態では、組成物は、限定するものではないが１種または複数の弱毒生ウイルス、１種または複数の高分子量界面活性剤、１種または複数のタンパク質、および１種または複数の炭水化物を、生理学的に許容される緩衝液に加えたものを含む。

その他の実施形態では、組成物は、弱毒生ウイルスの熱安定性を増大させる、１種または複数の高分子量界面活性剤を含有することができる。界面活性剤は、ガラスバイアルなどの表面からの材料損失を防止するために、ワクチン製剤に組み込まれている（例えば、Ｂｕｒｋｅ、Ｈｓｕら、１９９９年参照）。しかし、本明細書のある実施形態は、本明細書に開示される組成物および方法にとっていくらか珍しい有益な生化学的性質を有する、高分子量界面活性剤を含む。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−、ＥＯと示す）およびポリプロピレンオキシド（−ＣＨ_２ＣＨＣＨ_３Ｏ−、ＰＯと示す）のブロックを含むことができる。ＰＯブロックは、ＥＯ_ｘ−ＰＯ_ｙ−ＥＯ_ｘの配置構成になるように２個のＥＯブロックで挟むことができる。ＰＯ成分は親水性であり、ＥＯ成分は疎水性であるので、全体的な親水性、分子量、および界面活性剤特性は、ＥＯ_ｘ−ＰＯ_ｙ−ＥＯ_ｘブロック構造中のｘおよびｙを変化させることによって、調節することができる。水溶液では、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ＰＯコアおよび親水性ＥＯ基のコロナを有するミセルに自己組織化することになる。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー製剤は、様々な疎水性薬物、およびタンパク質、ＤＮＡ、または不活化ワクチン用の、可能性ある薬物送達物質として確認されている（例えば、Ｔｏｄｄ、Ｌｅｅら、１９９８年；Ｋａｂａｎｏｖ、Ｌｅｍｉｅｕｘら、２００２年）。高濃度（例えば、＞１０％超）では、より高い分子量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーの一部が、逆ゲル化し、温度が上昇するにつれてゲルを形成することになる。体温でのゲル形成では、薬物およびワクチン送達適用例でデポーとして作用するように、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーゲルの使用が可能になる（例えば、Ｃｏｅｓｈｏｔｔ、Ｓｍｉｔｈｓｏｎら、２００４年参照）。さらに、これらのポリマーはその界面活性剤特性により、アジュバント製剤中で、また局所的に施用されたクリームおよびゲル中の乳化剤として、使用されている。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、放射線またはエレクトロポレーションで媒介された損傷の後、創傷および火傷の治癒を加速させ、細胞膜を封止することも示されている。

その他の実施形態では、ワクチン組成物は、分子量が１５００以上の１種または複数の界面活性剤を含むことができる。ある実施形態では、界面活性剤は、非イオン性の親水性ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（またはＥＯ−ＰＯブロックコポリマー）である。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーを、不活化ワクチン、タンパク質ワクチン、またはＤＮＡワクチンのアジュバントおよび送達ビヒクルとして使用してきたが、これらを、生のウイルスの不活化を防ぐために使用することは、当技術分野では予想されていない。特定の実施形態では、製剤は、分子量が３０００以上の１種または複数のＥＯ−ＰＯポリマーを含有することができる。他の実施形態では、組成物は、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）またはコポリマー ポロキサマー４０３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（登録商標）を部分的に含むことができる。当業者なら、界面活性剤の改質を化学的に行うことができることが理解されよう。本明細書では、任意の本質的に均等な界面活性剤ポリマーが考えられると企図される。

本明細書の実施形態は、１種または複数の弱毒生ウイルス、１種または複数の界面活性剤、および１種または複数のタンパク質の組成物を含むことができる。ある実施形態では、タンパク質をアルブミンにすることができる。血清アルブミンは、脊椎動物の血液中で最も一般的なタンパク質の１種であり、多数の機能を有している。タンパク質は、分子量が６６５００の５８５アミノ酸である。ヒト血清アルブミンは、グリコシル化されておらず、無数の結合活性のいくつかに関わる単一の遊離チオール基を有している。血清アルブミンは、その大部分が、個々が２つのサブドメインに細分化されている３つの構造ドメインを有するα−ヘリックスである。アルブミンは、アスピリン、イブプロフェン、ハロタン、プロポフォール、およびワーファリンなどの薬物、ならびに脂肪酸、アミノ酸、ステロイド、グルタチオン、金属、ビリルビン、リソレシチン、ヘマチン、およびプロスタグランジンを含めた様々な分子と特に結合することが知られている。種々の構造ドメインは、薬物の結合に関与し；ほとんどの小分子薬物およびホルモンは、サブドメインＩＩＡおよびＩＩＩＡに位置している２つの主な部位の１つに、結合する。その免疫原性の欠如により、アルブミンが、生物学的製品の担体タンパク質として一般に使用される。弱毒生ウイルスワクチンに含有されるタンパク質用量は、マイクログラムの何分の１かにすることができるので（１０^３から１０^５のウイルス粒子から得られる）、不活性担体タンパク質が、ガラス、プラスチック、またはその他の表面への吸収および非特異的結合に起因した損失を防止するのに使用される。しかし、本明細書で実証されるように、安定性の予期せぬ改善が観察され、アルブミンとＥＯ−ＰＯブロックコポリマーとの組合せは、これらの２つの成分間および／またはこれらの成分とウイルス粒子との間に相互作用があることを示唆している。さらに、アルブミンの存在下でのウイルスの高度な安定化は、一般的な担体タンパク質としての機能によるものではないようであり；ゼラチンやラクトフェリンなどのその他のタンパク質は、ウイルスの安定性を改善することができない。

ある実施形態では、血清アルブミンは、ヒトまたはその他の哺乳類源からのものでよい。ヒトでの使用を目的としたワクチンの場合、特定の実施形態は、有害な免疫応答を低減させまたはなくすために、必要に応じてヒトアルブミンまたはその他のヒト生成物を含むことができる。当業者なら、各種に特異的なアルブミンは、動物ワクチンに使用してもよいことが理解されよう（例えば、イヌ生成物にはイヌアルブミン、ウシ生成物にはウシアルブミン）。他の実施形態では、タンパク質が組換えヒトアルブミンである。細菌、酵母、藻、植物、哺乳類細胞、またはトランスジェニック動物系を含む様々な発現系で、組換えヒトアルブミンまたはその一部を発現するための、標準的な方法が存在する。さらに、血清アルブミンまたはその一部は、無細胞系で生成され、または化学的に合成することができる。これらまたは任意の同様の系で生成された組換えヒトアルブミンは、本明細書に組み込まれている。当業者なら、アルブミンの代わりのその他のタンパク質を用いることができることを、理解するであろう。例えばアルブミンは、多重遺伝子ファミリーのメンバーである。その構造および配列の類似性により、本明細書に企図される組成物および方法では、そのファミリーのその他のメンバー（例えば、α−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、またはアファミン）をアルブミンの代わりに用いてもよい。当業者なら、当技術分野で知られている任意の手段によって、例えば組換えＤＮＡ技術によって、翻訳後修飾によって、タンパク質分解切断によって、および／または化学的手段によって、アルブミンに変更を加えることができることも理解されよう。置換および変更なしに、血清アルブミンに対して本質的に均等な安定化機能をもたらすアルブミンのこれらの置換および変更が、本明細書では企図される。

ある実施形態では、医薬品として許容される緩衝液中に高分子量の界面活性剤、タンパク質、および炭水化物を有する組成物が、記述される。いくつかの実施形態では、炭水化物が糖またはポリオールである。糖には、限定するものではないが単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、マンノース、ラムノース、タロース、キシロース、またはアロースアラビノース）、二糖（例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セリビオース、ゲンチオビオース、ラミナリボース、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、またはフルクトース）、三糖（例えば、アカルボース、ラフィノース、メリジトース、パノース、またはセロトリオース）、または糖ポリマー（例えば、デキストラン、キサンタン、プルラン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、セロオリゴ糖、セルロース、マルトオリゴ糖、グリコーゲン、キトサン、またはキチン）を含めることができる。ポリオールには、限定するものではないがマンニトール、ソルビトール、アラビトール、エリスリトール、マルチトール、キシリトール、グリシトール、グリコール、ポリグリシトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびグリセロールを含めることができる。

特定の実施形態では、製剤は、１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、１種または複数のタンパク質、およびトレハロースの組合せを、薬理学的に許容される緩衝液に加えたものを含有することができる。ある実施形態では、トレハロースを５から５０％（ｗ／ｖ）に及ぶ濃度で存在させることができる。トレハロースは、タンパク質製剤の安定性を高めるのに使用されている。これは、低温保存剤として当技術分野で広く知られており、事実上、生物をストレスから保護するのに使用される。低水位条件に耐えることができる無水性生物は、大量のトレハロースを含有する。トレハロースは、乾燥中に膜の不安定化を引き起こす可能性がある膜融合事象および相転移の両方を防止することが、示された。構造分析は、トレハロースが、脂質二重層内で極性頭部基同士の間にうまく適合することを示唆している。トレハロースは、乾燥中の不安定なタンパク質の変性も防止する。トレハロースは、極性タンパク質残基との水素結合によって、タンパク質を安定化すると考えられる。トレハロースは、１：１結合の２個のグルコース分子からなる二糖である。１：１結合により、トレハロースは還元力がほとんどまたは全くなく、したがって本質的に、アミノ酸およびタンパク質とは反応しない。この還元活性の欠如により、タンパク質に対するトレハロースの安定化作用を改善することができる。ある実施形態では、トレハロースは、弱毒生ウイルスに安定性をもたらす。トレハロースのこの活性は、ウイルスの膜および被覆タンパク質の両方を安定化させる能力に起因すると考えられる。

他の実施形態では、組成物は、１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、１種または複数のタンパク質、およびその１つがキトサンである１種または複数の炭水化物を、生理学的に許容される緩衝液中に含み、それによって、弱毒生ウイルスに、改善された安定性をもたらすことができる。ある実施形態では、組成物は、０．００１から２％の範囲の濃度で（例えば、約６．８のｐＨで）キトサンを含むことができる。キトサンは、甲殻類の外骨格の構造的ポリマーであるキチンの脱アセチル化によって得られる、陽イオン多糖である。これは、Ｎ−アセチル−グルコサミンおよびグルコサミンのポリマーであり；２種の炭水化物の含量は、脱アセチル化の程度に左右される。キトサンの正電荷は、負に帯電している表面および分子との結合を可能にする。このようにキトサンは、粘膜面と結合し、粘膜吸収を促進すると考えられる。キトサンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその他のオリゴヌクレオチドと結合しナノ粒子を形成することができ、非ウイルス遺伝子送達で使用されている。本明細書のある実施形態は、キトサンが、弱毒生ウイルスの安定性を増大させることを実証している。

ある実施形態では、典型的には生理学的に許容される緩衝液を含む組成物について、記述することができる。当業者なら、限定するものではないがホスフェート、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、重炭酸塩を含有する緩衝液、当技術分野で知られているその他の緩衝液、および緩衝液の組合せを含めた、様々な生理学的に許容される緩衝液が存在することが分かる。さらに、当業者なら、塩濃度を生理学的レベル近く（例えば、生理食塩液または塩全体が０．１５Ｍ）に調節することは、注射部位の細胞損傷および／または痛みを予防するための組成物の非経口投与において、最適であり得ることが分かる。当業者なら、炭水化物濃度が増加するにつれて、製剤と均等な浸透圧を維持するために塩濃度を低下させてもよいことも理解されよう。ある実施形態では、ｐＨが６．８より高い緩衝媒体が企図され；一部の弱毒生ウイルス（例えば、フラビウイルス）は、低ｐＨで不安定である。別の実施形態では、生理学的に許容される緩衝液を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にすることができる。

本明細書の一部の弱毒生ウイルスワクチン組成物は、少ない免疫原性を有することに加え、弱毒生ウイルスの安定性を増加させかつ／または変質を低減させ、または非免疫原性である組成物に関する。これらの実施形態によれば、組成物は、１種または複数のタンパク質物質；１種または複数の糖またはポリオール物質；および１種または複数の高分子量界面活性剤を含むことができ、この組成物は、弱毒生ウイルスの不活化を低下させる。したがって、本明細書に企図されるある組成物は、被験者に投与したときに、少ない副作用を有する。いくつかの例示的な組成物では、（１種または複数の）界面活性剤は、１種または複数のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーからなり；（１種または複数の）タンパク質物質は、脊椎動物種から得たラクトアルブミン、血清アルブミン、α−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アファミンからなる群から選択され；（１種または複数の）炭水化物物質は、糖および／またはポリオールの１種または複数である。ある実施形態では、組成物は、トレハロース、スクロース、キトサン、ソルビトール、およびマンニトールからなる群から選択された（１種または複数の）炭水化物物質の１種または複数を含むことができる。あるより特定の実施形態では、ワクチンに対する免疫応答を低減させるため、血清アルブミンを、脊椎動物種から、またはその他の実施形態では被験者（例えば、ヒト）と同じ供給源から得ることができる。その他の実施形態では、炭水化物物質がトレハロースである。ある実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤が、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）である。いくつかの弱毒生ウイルスワクチン組成物では、少なくとも１種の炭水化物物質がトレハロースである。ある実施形態では、弱毒生ウイルスワクチン組成物は、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）を、０．１から４％（ｗ／ｖ）の濃度で含み；かつ／または血清アルブミン濃度は０．００１から３％（ｗ／ｖ）であり、かつ／またはトレハロース濃度は５から５０％（ｗ／ｖ）にすることができる。

（医薬品組成物）
本明細書の実施形態は、生体内医薬品投与に適切な、生物学的に適合性ある形での、被験者への組成物の投与を提供する。「生体内投与に適切な、生物学的に適合性ある形」とは、投与される活性物質（例えば、実施形態の弱毒生ウイルス組成物）の形であって、活性物質の治療効果があらゆる毒作用を上回る形を意味する。治療組成物の、治療上活性な量の投与は、所望の結果を実現するのに必要な投与量および期間で有効な量と定義される。例えば、化合物の治療上活性な量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子と、個人での所望の応答を引き出す製剤の能力に応じて、変化させてもよい。投薬計画は、最適な治療応答が得られるように調節することができる。

いくつかの実施形態では、組成物（例えば、実施形態の医薬品化学物質、タンパク質、ペプチド）を、皮下、静脈内、経口投与、吸入、経皮施用、膣内施用、局所施用、鼻内、または直腸投与などの都合のよい手法で投与してもよい。より特別な実施形態では、化合物を、経口的にまたは皮下から投与してもよい。別の実施形態では、化合物を静脈内から投与してもよい。一実施形態では、化合物を、吸入など鼻内から投与してもよい。

化合物は、組成物と同時投与される適切な担体または希釈剤に混合して、被験者に投与してもよい。本明細書で使用される「医薬品として許容される担体」は、生理食塩液および水性緩衝溶液などの希釈剤を含むものとする。活性物質は、非経口的にまたは腹腔内から投与してもよい。分散体も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物に加えて、また油に加えて、調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有してもよい。

注射用途に適した医薬品組成物は、当技術分野で知られている手段によって投与してもよい。例えば、滅菌注射液または分散液の即時調製のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を、使用してもよい。全ての場合において、組成物は、滅菌することができ、容易に注射針通過が可能な程度まで流体にすることができる。組成物は、さらに、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護することができる。医薬品として許容される担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体にすることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤の使用によって、維持することができる。

滅菌注射液は、必要に応じて、適切な溶媒または上述の成分の１種もしくは組合せにある量の活性化合物を組み込み、その後、滅菌することによって、調製することができる。
配合したら、溶液を、剤形に適合する手法で、また治療上有効になるような量で、投与することができる。製剤は、上述の注射液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与される。低速放出カプセルおよび持続放出微粒子なども、本明細書の組成物を投与するのに用いることができると考えられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。

活性治療薬は、混合物に配合してもよく、用量当たり約０．０００１から１．０ｍｇ、または約０．００１から０．１ｍｇ、または約０．１から１．０、またはさらに約１から１０ｇ含むことができる。単回用量または多回用量も、所定の状態に合わせて適切なスケジュールで投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、本明細書で企図されるウイルスに曝す前、間、および／または後に投与することができる。

別の実施形態では、点鼻液もしくはスプレー、エアロゾル、または吸入薬を、関心ある化合物を送達するのに使用してもよい。その他の投与態様に適した追加の製剤には、坐薬およびペッサリーが含まれる。直腸に入れるペッサリーまたは坐薬を使用してもよい。一般に、坐薬の場合、伝統的な結合剤および担体には、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含めてもよく；そのような坐薬は、活性成分を０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲で含有する混合物から形成してもよい。

経口製剤は、例えば、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤を含む。ある実施形態では、経口医薬品組成物は、不活性希釈剤もしくは同化性食用担体を含むことができ、または硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセルに閉じ込めてもよく、または錠剤に圧縮してもよく、または食事のときの食物と共に直接取り込んでもよい。経口治療投与の場合、活性化合物は、賦形剤に組み込んでもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、およびオブラートなどの形で使用してもよい。そのような組成物および調製物は、活性化合物を少なくとも０．１％含有すべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、当然ながら変えてもよく、単位の重量の約２から約７５％の間が都合よく、または好ましくは２５から６０％の間である。そのような、治療上有用な組成物の活性化合物の量は、適切な投与量を得ることができる量である。

（キット）
他の実施形態は、本明細書に記述される方法および組成物と共に使用されるキットに関する。組成物および生のウイルス製剤は、キットに入れて提供してもよい。キットは、適切な容器、本明細書に詳述される弱毒生ウイルス組成物、およびその他の抗ウイルス薬、抗真菌または抗菌薬などの、任意選択の１種または複数の追加の薬剤を含むこともできる。

キットはさらに、その必要がある被験者に使用される、適切に一定分量が分取された組成物を含んでもよい。さらに、本明細書の組成物は、部分的にまたは全体的に脱水されても水性であってもよい。本明細書で企図されるキットは、特定の製剤に応じて、本明細書に開示されるように室温でまたは冷蔵温度で貯蔵してもよい。

キットの容器手段は、一般に、組成物を入れることができる、好ましくは適切に一定分量を分取することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他の容器手段を含むことになる。追加の成分を提供する場合、このキットは一般に、この薬剤または成分を入れることができる１種または複数の追加の容器も含有することになる。本明細書のキットは、典型的には、市販用に厳重に封じ込められた、薬剤、組成物、および任意のその他の試薬容器を収容するための手段も含むことになる。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成型プラスチック容器を含めてもよい。

以下の実施例は、本明細書に提示されるある実施形態を実証するために含める。当業者なら、以下に続く実施例に開示される技法は、本明細書に開示される手法でうまく機能するように発見された技法であり、したがってその実施に好ましい態様を構成すると見なすことができると理解すべきである。しかし、当業者なら、本発明の開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、本明細書の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを、理解すべきである。

（実施例１）
液相におけるＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスの塩基安定性
ある例示的な方法では、液相でのフラビウイルスの熱安定性が調査された。この方法によれば、種々の温度でリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に貯蔵されたＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３親ワクチンベクターの塩基安定性が、決定された（表１）。一実施例では、４℃、室温（約２１℃）、または３７℃の２ｍｌのスクリューキャップ付きバイアルで、１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスを全体積０．５ｍｌのＰＢＳ中でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、ウイルス力価および活性を、ベロ細胞でのニュートラルレッドアガロースオーバーレイプラーク滴定アッセイによって決定した。表１に示されるように、４℃のＰＢＳ中でのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３のインキュベーションは、ウイルス力価に平均して４倍の低下をもたらし、３７℃で同じ期間インキュベートしたときには、ウイルス活性の完全な損失をもたらした。これらの結果は、安定化賦形剤が存在しない状態では、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスが比較的乏しい安定性であることを示している。

表１ 種々の温度で２４時間貯蔵されたＤｅｎ−２ ＰＤＫ５３ウイルスの安定性

（実施例２）
組成物の安定化作用
ある例示的な組成物で、生のウイルスワクチンの熱安定性を助ける本明細書で企図される医薬品として許容される賦形剤は、当技術分野で知られている。１つの例示的な方法では、ＰＢＳを塩基組成物として使用して、種々の賦形剤の安定化作用について評価した。これらの実施例では、各賦形剤のストック溶液をＰＢＳ中に作製し、ストック溶液のｐＨが約６．８に調節されたキトサン以外はｐＨをＮａＯＨで約７．１に調節した。賦形剤をＰＢＳ中に希釈して、示される最終濃度（ｗ／ｖ）にした（表２）。この方法によれば、１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスを無血清培地に加えたものを、各組成物０．５ｍｌに添加し、３７℃で２４時間貯蔵した。インキュベーション後、ウイルス活性および力価を、上述のようにベロ細胞でのプラーク滴定によって決定した。表２に示されるように、先の実験例と同等の様々な濃度で単一の賦形剤を含む組成物の安定化作用は、最小限であった。しかし、いくつかの賦形剤、例えばトレハロースおよび組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、３７℃でＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスを安定化させるとき、他よりも効果的であった。表２に示される研究の結果は、ｒＨＳＡおよびトレハロースを含めたいくつかの賦形剤の高い安定化作用も明らかにし、この作用は、これら賦形剤のある濃度範囲内で得ることができる。この特定の実施例で、トレハロースは、１５％（ｗ／ｖ）よりも高い濃度でより有効であり、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）は、０．５から３％の間の濃度で有効であった。

表２．３７℃で２４時間貯蔵したときのＤＥＮ−２ ＰＤＨ５３安定性に対する種々の賦形剤の作用

（実施例３）
賦形剤の特定の組合せを含む組成物の安定化作用
下記の例示的な手順では、種々の組合せおよび濃度の多数の賦形剤を含む組成物を、親ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスワクチンに対する安定化作用について試験した。賦形剤を、実施例２で記述されたストック溶液から、ＰＢＳ中で、示される最終濃度まで希釈した。１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンウイルスを、各組成物０．５ｍｌ中、３７℃で２１時間（図１）、または４８時間にわたって（図２）インキュベートした。特定の時間間隔で、ウイルス力価および活性を、実施例１で述べたようにプラーク滴定アッセイにより決定した。図１は、これを実証する例示的な結果を、入力に対するインキュベーション後に残るウイルス力価％として表し、図２では、ｌｏｇ_１０力価損失として表す。この特定の例示では、賦形剤の種々の組合せの分析によって、糖、プルロニックコポリマー非イオン性界面活性剤、およびタンパク質からなる製剤が、３７℃でＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３安定性を改善するのに最適であることが明らかにされた。トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む製剤は、最大の安定化作用を発揮した。予期せぬことに、これら３種の賦形剤を組み合わせた安定化作用は、個々の成分それぞれで観察されたものの合計よりも非常に大きく、成分間の相乗作用があることを示唆している。ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３フラビウイルスの、改善された熱安定性は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡの組合せの相乗活性を通して得られ、これは従来技術の例を基に予測することができなかった。図１および２は、トレハロース／コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）／ｒＨＳＡ混合物の安定化作用が、０．０５％のキトサンを添加することによってさらに高まったことも示す。図２は、３７℃で４８時間にわたり貯蔵したときのウイルス不活化速度が、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含有する組成物によって、著しく低下することを示す。当技術分野の実施例は、フラビウイルスの安定性は、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋の２価陽イオンを含有する製剤によって高めることができることを示唆する。しかし、図１および２に示されるように、製剤へのＣａ^２＋（０．０００９Ｍ）およびＭｇ^２＋（０．０００５Ｍ）の添加は、追加の安定化の利益をもたらさない。図２の結果は、特定の実施形態において、２価陽イオンの添加が、長期にわたる液相ウイルス安定性に悪影響を及ぼす可能性があることを示唆している。

１つの例示的な方法では、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む組成物を、その安定化特性について、多数のフラビウイルスを用いて評価した。ウエストナイル（ＤＥＮ−２／ＷＮ）、デング１（ＤＥＮ−２／Ｄ１）、デング３（ＤＥＮ−２／Ｄ３）、またはデング４（ＤＥＮ−２／Ｄ４）ウイルスから膜およびエンベロープタンパク質を発現するキメラＤＥＮ−２フラビウイルスの安定性を、実施例１の場合と同様に決定した。表３の例示的な結果は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む組成物中で貯蔵したときに、全てのキメラフラビウイルスの液相安定性が大幅に改善したことを明らかにしている。異なるキメラは、５種の血清学的に全く異なるフラビウイルスから、異なるエンベロープおよび膜タンパク質を発現する。さらに、ウエストナイルウイルスおよびデングウイルスは、著しく多岐にわたる。この結果は、本明細書の組成物が、Ｆｌａｖｉｖｉｒａｄａｅ科ならびにその他のウイルス科の多様なメンバーの液相安定化に、有用になり得ることを示唆している。室温（約２１℃）および４℃でフラビウイルスを安定化させる能力は、実施例１で概説された代表的な手順によって試験をした。表４に示される例示的な結果は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む組成物が、ウイルス活性を２１℃で７日間および４℃で４８時間、有効に保持することを明らかにしている。

表３．ＰＢＳ中、または１５％トレハロース、２％コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、および１％ｒＨＳＡを含む組成物（Ｆ１）中に、３７℃で２１時間貯蔵された、種々のキメラフラビウイルスの安定性

表４．ＰＢＳ中、または１５％トレハロース、２％コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、および１％ｒＨＳＡを含む組成物（Ｆ１）中に、種々の温度で７または４８日間貯蔵された、フラビウイルスの安定性

（実施例４）
代替成分の使用
別の例示的な方法を使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびゼラチンの安定化作用と、ｒＨＳＡおよび種々のプルロニックコポリマーの安定化作用とを比較した。ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルス安定性アッセイは、実施例１および２に関して先に概説したように実施した。先の実施例は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む製剤は、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３親ワクチンウイルスの熱安定性を最適に改善したことを示唆した。図３の例によって示されるように、ウシ胎児血清アルブミンの安定化作用は、ｒＨＳＡ単独またはトレハロースおよびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）と組み合わせた場合に匹敵する。図３は、単独の賦形剤、ゼラチンが、３７℃でＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３を安定化する際のｒＨＳＡに匹敵することも示す。しかしこの例示的な方法では、ＢＳＡとは異なって、ゼラチンは、やはりトレハロースおよびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）も含有する組成物中でｒＨＳＡの代わりをする有効なものになるようには見えない。このように、ｒＨＳＡ以外のタンパク質は、フラビウイルスワクチンの安定化を助けるためにトレハロースおよびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）と組み合わせて使用してもよいが、血清アルブミンまたは密接に関係するタンパク質の使用は、この例示的な方法によってより適切である。さらに図３は、単独の賦形剤として、コポリマー ポロキサマー４０３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（登録商標）のＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３ウイルス安定化能力がコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）に匹敵することを示す。しかし、この例示的な方法では、コポリマー ポロキサマー４０３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（登録商標）は、やはりトレハロースおよび血清アルブミンを含有する組成物中で、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）の代わりをする有効なものになるようには見えない。図４に例示されるように、トレハロース、ｒＨＳＡ、およびプルロニックコポリマーに代わるＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）などのその他の一般に使用される医薬品界面活性剤を含有する組成物は、プルロニックコポリマーを含有する製剤よりもＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３の安定化が有効ではない。これらの例示的な方法は、異なる高分子量プルロニックコポリマー界面活性剤を含有する製剤の、より良好な安定化効率を示唆している。

例示的なデータを、図４にさらに示す。図４は、種々の界面活性剤を含有する組成物中の、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスの安定性を表す。ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３は、各製剤中に、３７℃で２３時間貯蔵した。この実施例で評価された界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−ＯＧ）、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（Ｐ ２０）、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（Ｐ ８０）、およびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）（Ｆ）を含む。その他の製剤成分には、トレハロース（Ｔ）およびｒＨＳＡ（Ａ）が含まれる。値は、入力した力価に対する、インキュベーション後に残存するウイルス力価の％として表す。

（実施例５）
種々の組成物の安定化作用の比較
ある例示的な組成物の安定化特性を、当技術分野で知られている組成物の特性と比較した。当技術分野で開示されている（米国特許第４，５００，５１２号）生のフラビウイルスワクチン用安定化組成物は、ＰＢＳ中に４％のラクトース、２％のソルビトール、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、０．０７６ ＭｇＳＯ_４、および０．０００５Ｍから０．０５Ｍ程度のアミノ酸を含む。Ａｄｅｂａｙｏら（１９９８年）により報告された別の組成物は、１０％のスクロース、５％のラクトアルブミン、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、および０．０７６ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４からなる。１つの例示的な方法では、これら製剤の安定化特性を、本明細書の特定の実施形態と比較した。一例の組成物、Ｆ１では、この組成物は、１５％のトレハロース、２％のコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、および１％の組換えＨＳＡを含む。Ｆ２は、アミノ酸を含まない米国特許第４，５００，５１２号の製剤であり、Ｆ３は、アミノ酸ヒスチジンおよびアラニンを含む同じ製剤である。Ｆ４は、Ａｄｅｂａｙｏらの組成物である。１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンウイルスを、各組成物０．５ｍｌ中３７℃で２３時間インキュベートし、その後、ウイルス活性および力価について、実施例１で述べたようにアッセイを行った。図５に例示されるように、いくつかの実施形態、例えば製剤Ｆ１は、これら前述の組成物に優る著しい改善を示す。示される実施例では、ウイルス活性は、当技術分野で知られている製剤（製剤Ｆ３およびＦ４）中に貯蔵された後、事実上回復しなかったが、これに対して、本明細書に開示された組成物中に貯蔵した後は、初期ウイルス力価の最大５０％が回復した。これらの結果は、先の製剤が、液相貯蔵中の生のウイルスワクチン安定性を促進させる際、効果的ではないことを明らかにしている。

（実施例６）
複数回の凍結解凍後のウイルス活性の保存
１つの例示的な方法では、選択組成物が凍結解凍サイクル後にウイルス活性を保存する能力が、実証された。１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンウイルスを、スクリューキャップバイアル中で、各組成物０．５ｍｌに懸濁した。最初の凍結解凍サイクルでは、バイアルを−８０℃で２４時間凍結させ、３７℃で急速に解凍した。この直後に、２回目の凍結解凍サイクルを行い、バイアルを−８０℃で１時間凍結し、３７℃で急速に解凍した。次いでウイルス力価および活性を、実施例１に記述されるプラーク滴定アッセイにより評価した。図６に示されるように、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む特定の組成物は、２回の凍結解凍サイクルを通して全ウイルス活性を効果的に保存した。さらに、これら３種の賦形剤を含む組成物は、単一の賦形剤のみ含有するものよりも効果的であった。この特定の例示的な実験の結果は、本明細書に開示される組成物および方法が、フラビウイルスワクチンの有効な凍結保護物質であり、凍結乾燥、噴霧乾燥、またはその他の脱水技法中にウイルス保存を容易にできることを示唆している。

（実施例７）
その他の弱毒生ウイルスの安定化
先に例示された実施例は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む組成物中での、いくつかの生の弱毒化フラビウイルスの、有効な液相安定化について明らかにする。本明細書に開示される実施形態も、その他の弱毒生ウイルスを安定化させるのに有効になり得ることが予測される。例えば、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む製剤は、生の弱毒化麻疹ウイルス、弱毒化シンドビスウイルス、弱毒化インフルエンザウイルス、組換え弱毒化アデノウイルス、または組換え弱毒化ワクシニアウイルスの安定化に使用してもよい。１つの例示的な方法では、これらの非フラビウイルス性ウイルスを、細胞培養から収集した直後に、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む組成物中に液相で懸濁し維持することができる。別の例示的な方法では、非フラビウイルス性ウイルスを、凍結もしくは噴霧乾燥の前にまたは後に、組成物中に懸濁することができる。統計的に改善されたウイルス安定性は、この実施形態の製剤が、フラビウイルス科以外のその他の弱毒化ウイルスワクチンに適用可能であることを実証することができる。当業者なら、後に本出願をその他の弱毒生ウイルスにまで拡げることができることが分かる。

（実施例８）
安全性および生体内免疫原性
賦形剤と分子または細胞成分との分子相互作用は、ウイルス性ワクチンの安定性を高めるだけではなく、生体内の細胞または組織損傷の増大も引き起こす働きをする可能性がある。製剤は、生きている動物で、これらウイルス性ワクチンの免疫原性を低下させる可能性がある。この実施例では、例示的な組成物が、皮下注射後に安全であり、本質的に免疫学的に不活性であることが実証される。４種の異なる例示的な組成物を、下記の通り、マウスでの試験のために選択した。
製剤１：１５％トレハロース、２％Ｆ−１２７、１％ｒＨＳＡ
製剤２：１５％トレハロース、２％Ｆ−１２７、１％ｒＨＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２／０．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４
製剤３：１５％トレハロース、２％Ｆ−１２７、１％ｒＨＳＡ、０．５％キトサン
製剤４：２２．５％トレハロース、３％Ｆ−１２７、１．５％ｒＨＳＡ
製剤５：ＰＢＳ
本明細書に記述されるある方法では、８または９匹のＮＩＨスイスマウスの群を、第０日（ｄ０）に１×１０^５ｐｆｕの配合済みＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３／ＷＮ組換えフラビウイルスワクチンの皮下注射により免疫化し、ｄ２９に同じ配合済みワクチンで追加免疫し、次いでｄ４５に、病原性ウエストナイル株（ＮＹ９９）１０^３ｐｆｕでチャレンジした。対照マウス（８匹の４群）に、ウイルスを含まない製剤１〜４を単独で与えた。免疫化したどのマウスにも、投与後に有害事象は観察されなかった。したがって、この実施例では、ワクチンウイルスを含みまたは含まない例示的な製剤によって、明らかな有害事象は引き起こされなかった。血清を、ｄ０の免疫化前、ｄ２８の追加免疫前、ｄ４４のチャレンジ前、およびｄ７５のチャレンジ後に収集した。血清中のウエストナイル中和抗体力価を、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により決定した。研究の結果を表５に示す。

表５： 配合済みＤＥＮ２／ＷＮワクチンによって誘発される中和抗体および保護

^１ ＧＭＴ＝幾何平均力価；力価＜１０は、値１が任意に割り当てられた。
^２ ％ＳＣ＝ＰＲＮＴ力価＞１０により血清変換された動物の％。
製剤（製剤５）または例示的な製剤（製剤１〜４）の１種を使用したか否かに関わらず、ＤＥＮ−２／ＷＮワクチンを受けた大多数の動物は、初回用量後に血清変換した。さらに、ワクチン接種された動物の全ては、追加免疫投与後に血清変換した。幾何平均ＰＲＮＴ力価（ＧＭＴ）は、ワクチン群同士の差がほとんどないことを実証する。力価は、１次免疫化後に低く、追加免疫後に３〜１０倍増大し、次いでチャレンジによる劇的な既往応答を示した。ワクチン接種した動物の１００％が、やはりワクチン製剤とは無関係にチャレンジを乗り切った。対照動物は２２％しか生存せず、生存した対照動物は、チャレンジ後の強力な中和抗体応答の証拠を示した。１つの利点とは、この実施例は、例示的な製剤が、例示的な組換えＤＥＮ−２／ＷＮワクチンがマウスのウエストナイル疾患を予防する能力を低下させないことを示すことである。

（実施例９）
別の実施例では、２５℃または４℃で様々な期間にわたり貯蔵されたウエストナイルキメラフラビウイルスを安定化させるのに、トレハロース、ｒＨＳＡ、およびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）を含有する液体組成物を使用した。１×１０^４ｐｆｕのキメラＤＥＮ−２／ＷＮワクチンウイルスを、各温度でインキュベートし、ウイルス活性を、実施例１に記述されるように１または２週間の間隔で評価した。図７および８に例示されるように、トレハロース、ｒＨＳＡ、およびコポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）を含有する製剤は、２５℃および４℃でそれぞれ貯蔵中に、ＤＥＮ−２／ＷＮワクチンウイルスの熱安定性を著しく改善した。２５℃で、ウイルス活性の損失は、７日間にわたり１ ｌｏｇ未満であった。４℃では、ウイルス不活化は、トレハロース、コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、およびｒＨＳＡを含む例示的な製剤中に貯蔵した場合、最長１２週間にわたって無視できた。

（実施例１０）
別の例示的な方法では、トレハロース、ｒＨＳＡ、および脱水ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンとのプルロニックコポリマーを含む組成物の安定化作用が実証された。１×１０^４ｐｆｕのＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンウイルスは、本明細書に開示される手順に従って配合された。配合されたワクチンを血清バイアルに入れ、従来の凍結乾燥手順にかけた。乾燥ワクチンに真空中でストッパーをかけ、３７℃または４℃で１４日間貯蔵し、その後、滅菌水を添加することにより、ワクチンをその当初の液体体積にまで再構成した。再構成されたワクチンのウイルス活性を、先に概説したように評価した。３７℃で、リン酸緩衝生理食塩液中に配合されたトレハロース、ｒＨＳＡ、およびプルロニックコポリマーを含有する組成物の存在下、１ ｌｏｇの平均ウイルス力価損失が観察された（図９）。４℃で１４日間貯蔵された配合済み脱水ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ウイルスワクチンに関し、ウイルス活性の損失は観察されなかった。これらの結果は、本明細書に開示される組成物を利用して、脱水ウイルスワクチンが有効に保存されることを実証する。

図９は、種々の温度での、凍結乾燥したＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３の安定性を示す。配合済み凍結乾燥ＤＥＮ−２ ＰＤＫ ５３ワクチンウイルスのログ力価損失は、示されるように、３７℃または４℃で２週間にわたりインキュベートした後であった。製剤Ｆ１（１５％トレハロース、２％コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、１％ｒＨＳＡ）およびＦ２（１５％トレハロース、２％コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、０．０１％ｒＨＳＡ）を、リン酸緩衝生理食塩水中に配合した。製剤Ｆ３（１５％トレハロース、２％コポリマー ポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（登録商標）、０．０１％ｒＨＳＡ）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基中に配合した。

本明細書に開示され請求されている組成物および方法の全ては、本発明の開示に照らして、過度な実験をすることなく作製および実行することができる。組成物および方法を、好ましい実施形態に関して記述してきたが、当業者なら、本明細書の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される組成物および方法と、この方法のステップまたは一連のステップに変更を加えることができることが、明らかである。より具体的には、同じまたは類似する結果が実現される限り、化学的にかつ生理学的に関連するある物質を、本明細書に記述される物質の代わりに用いてもよい。当業者に明らかなそのような類似する代替例および変更例の全ては、添付される特許請求の範囲によって定義される精神、範囲、および概念に含まれると見なされる。

限定するものではないが特許、特許出願、論文、図書、および専門文書を含めた、本出願に引用される全ての文書または文書の一部は、その全体を参照によい本明細書に明らかに組み込む。

Claims (16)

1. 弱毒生フラビウイルス組成物であって、
   １種または複数の弱毒生フラビウイルス；
   ０．０１〜３．０％（ｗ／ｖ）の濃度の血清アルブミン；および
   ５〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロース
   を含み、（ｉ）血清アルブミンと（ｉｉ）トレハロースとの組合せが前記弱毒生フラビウイルスの不活化を低減させる有効成分である、前記弱毒生フラビウイルスの不活化を低減させることが可能なフラビウイルス組成物において、
   前記弱毒生フラビウイルスはデングウイルスであり、前記フラビウイルス組成物は水性の液体の形態にある、フラビウイルス組成物。
2. 前記血清アルブミンが、脊椎動物種由来である、請求項１に記載のフラビウイルス組成物。
3. トレハロースの濃度が少なくとも１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載のフラビウイルス組成物。
4. トレハロースの濃度が少なくとも１５％（ｗ／ｖ）である、請求項３に記載のフラビウイルス組成物。
5. トレハロースの濃度が１０％〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載のフラビウイルス組成物。
6. 血清アルブミンの濃度が０．１％〜３．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載のフラビウイルス組成物。
7. 弱毒生フラビウイルス組成物の不活化を低減させるための方法であって、１種または複数の弱毒生フラビウイルスを、０．０１〜３．０％（ｗ／ｖ）の濃度の血清アルブミン、および５〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースを含む組成物Ａと組み合わせてフラビウイルス組成物を形成するステップを含み、ここで前記組成物Ａは、前記弱毒生フラビウイルスの不活化を低減させることが可能であり、（ｉ）血清アルブミンと（ｉｉ）トレハロースとの組合せが前記弱毒生フラビウイルスの不活化を低減させる有効成分であり、前記弱毒生フラビウイルスはデングウイルスであり、前記フラビウイルス組成物は水性の液体の形態にある、方法。
8. 前記組成物Ａが、水性フラビウイルス組成物の貯蔵寿命を延ばす、請求項７に記載の方法。
9. 前記組成物Ａが、水性の弱毒生フラビウイルスの不活化を２４時間以上にわたり低減させる、請求項７に記載の方法。
10. 前記組成物Ａが、水性の弱毒生フラビウイルスの不活化を、複数の凍結解凍サイクルの間に低減させる、請求項７に記載の方法。
11. 前記フラビウイルス組成物が、デングウイルスへの曝露に起因する健康状態の発症を低減させるかまたは前記健康状態を予防するために被験者に投与されるためのものである、請求項７に記載の方法。
12. 前記健康状態がデング熱である、請求項１１に記載の方法。
13. トレハロースの濃度が少なくとも１０％（ｗ／ｖ）である、請求項７に記載の方法。
14. トレハロースの濃度が少なくとも１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１３に記載の方法。
15. トレハロースの濃度が１０％〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項７に記載の方法。
16. 血清アルブミンの濃度が０．１％〜３．０％（ｗ／ｖ）である、請求項７に記載の方法。