KR102134980B1 - 살아있는 약독화된 바이러스를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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조지 이. 오소리오
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Abstract

백신을 포함하는 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화 및/또는 분해를 감소시키기 위한 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스 및 조성물이 개시된다. 상기 조성물은 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 고분자량 계면활성제를 포함할 수 있다.

Description

살아있는 약독화된 바이러스를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR LIVE ATTENUATED VIRUSES}
본 출원은 그 전체가 본 발명에 포함되어 있는 2007년 4월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/910,579호를 우선권 주장한다.
본 발명의 구현예는 살아있는 약독화된 바이러스를 안정화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 다른 구현예는 살아있는 약독화된 바이러스의 분해(degradation)를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또 다른 구현예는 이들 조성물을 휴대 적용(portable application) 및 방법을 위한 키트에 사용하는 것에 관한 것이다.
바이러스 감염에 대해 보호하기 위한 백신은 인간 질병의 발생을 감소시키기 위해 효과적으로 사용되어 왔다. 바이러스 백신에 대한 가장 성공적인 기술 중 하나는 동물 또는 인간을 약화된 또는 약독화된 바이러스주("살아있는 약독화된 바이러스")로 면역시키는 것이다. 면역 후 제한적으로만 복제되기 때문에, 상기 약독화주는 질병을 일으키지 않는다. 그러나, 상기 제한적인 바이러스의 복제는 바이러스 항원의 전체 레퍼토리를 발현하기에 충분하며, 상기 바이러스에 대한 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 생성한다. 따라서, 이후 상기 바이러스의 병원성 주에 노출될 때, 면역화된 개체는 질병으로부터 보호된다. 이러한 살아있는 약독화된 바이러스 백신은 공중 보건에 사용되는 가장 성공적인 백신 중 하나이다.
미국에서 판매되는 16개의 승인된 바이러스 백신 중 10개는 살아있는 약독화된 바이러스이다. 매우 성공적인 살아있는 바이러스 백신은 황열(Yellow Fever) 17D 바이러스, 사빈 폴리오바이러스 타입 1, 2 및 3, 홍역, 이하선염, 풍진, 수두 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 천연두의 발발을 조절하기 위해 백시니아 바이러스 백신을 사용함으로써 처음이자 유일하게 인간의 질병을 박멸하도록 하였다. 상기 사빈 폴리오바이러스 백신은 전세계적으로 불구 질환(crippling disease)을 방지하는데 도움을 주었으며, 소아마비를 박멸하기 위해 노력하는데 사용되고 있다. 홍역, 이하선염, 풍진 및 수두 백신으로 아이들을 백신화하면 전세계적으로 수백만명의 죽음과 병을 방지한다.
재편성(reassortment), 역유전학(reverse genetics) 및 저온 적응(cold adaptation)과 같은 최근의 기술적인 진보는 인플루엔자 및 로타바이러스에 대한 살아있는 약독화된 균주를 승인하도록 하였다. 서나일(West Nile) 질병, 뎅기열(dengue fever), 말라리아, 결핵 및 HIV를 포함한 재조합 DNA 기술을 이용하여 개발된 다수의 살아있는 바이러스 백신들이 인간에 대해 임상 시험 중이다. 이들 재조합 바이러스 백신은 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 황열 17D 또는 뎅기 바이러스, DEN-2 PDK-53과 같은 잘 특성화된 약독화된 바이러스 백신을 조작하는데 의존한다. 안전하고 약독화된 바이러스는 다른 바이러스 또는 세균 병원체에 대한 보호성 항원을 발현하도록 유전적으로 가공된다. 카나리폭스/고양이 백혈병 재조합 바이러스, 카나리폭스/개 디스템퍼(distemper) 재조합 바이러스, 카나리폭스/서나일 재조합 바이러스 및 황열/서나일 재조합 바이러스를 포함하는 몇 가지 재조합 바이러스 백신이 동물용으로 승인되어 있다. 그룹(group)으로서, 살아있는 약독화된 바이러스 백신은 항생제의 출현 이후 두번째로 인간 역사에서 가장 성공적인 의학적 개입(intervention) 중 하나이며, 전세계적으로 공중 보건의 개선을 약속한다.
살아있는 약독화된 바이러스 백신이 효과적이기 위하여, 이들은 면역화 후 복제할 수 있어야 한다. 따라서, 바이러스를 불활성화시키는 임의의 인자는 백신을 무력화시킬 수 있다. 예를 들면, 2차 세계대전 전에 천연두 백신을 널리 배포 및 사용하는 것은 제한적이었는데, 그 이유는 상기 바이러스는 주위 온도에서 단지 며칠 후에 불활성화되었기 때문이다. 1920년대에, 프랑스 과학자들은 동결건조된 백신이 장기간의 안정성을 제공한다는 것을 밝혔으며, 동결건조된 백신의 대규모 제조 기술이 1940년대에 개발되었다(예를 들면, Colliter 1955 참조). 동결건조에 더하여, 살아있는 약독화된 바이러스 백신 내의 바이러스를 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 다양한 첨가제들이 확인되었다(예를 들면, Burke, Hsu 등, 1999 참조). 이들 안정화제는 전형적으로 하나 이상의 하기 성분들을 포함한다: 2가의 양이온, 버퍼화된 염 용액, 킬레이터, 우레아, 당(예컨대, 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스), 폴리올(예컨대, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨, 폴리에틸렌 글리콜), 아미노산, 단백질 가수분해물(예컨대, 카제인 가수분해물, 락트알부민 가수분해물, 펩톤), 단백질(예컨대, 젤라틴, 인간 혈청 알부민) 또는 폴리머(예컨대, 덱스트란).
그러나, 이들 안정화제를 사용하더라도, 보통 사용되는 백신 중 상당수는 안정화를 위해 여전히 냉동을 필요로 한다. 다른 보통 사용되는 백신은 온도에 극도로 민감하다; 과량의 열이나 우연한 냉동은 백신을 불활성화시킬 수 있다. 분배시 이러한 "저온 유통체계(cold chain)"를 유지하는 것은 개발도상국에서는 특히 어렵다. 따라서, 현존하거나 새롭게 개발된 살아있는 약독화된 바이러스 백신 모두의 안정성을 개선할 필요가 있다.
플라비바이러스는 가장 불안정한(labile) 바이러스 중 하나이다. 이들은 대략 11,000 베이스의 RNA 게놈을 갖는 외피 바이러스(enveloped virus)이다. 대부분의 플라비바이러스는 절지동물 벡터, 보통 모기에 의해 전파된다. 70가지 이상의 상이한 플라비바이러스가 있으며, 혈청형에 기초하여 3가지 주된 카테고리로 그룹화된다: 뎅기 그룹, 일본 뇌염 그룹 및 황열 그룹. 알려진 플라비바이러스 중에서 40가지는 모기에 의해 전파되고, 16가지는 진드기에 의해 전파되며, 18가지 바이러스는 확인된 곤충 벡터가 없다. 따라서, 대부분의 플라비바이러스는 그 절지동물 벡터 및 그 척추동물 숙주 종(종종 새 또는 동물) 모두에서 복제하도록 진화되어 왔다. 도시화의 확장, 세계 여행 및 환경적인 변화(예컨대, 남벌(deforestation) 또는 강수 패턴)는 몇 가지 플라비바이러스가 인간의 공중 보건에 대한 위협으로 나타나도록 하였다. 이러한 바이러스는 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 서나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 및 진드기-유래 뇌염 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
강력한 모기 통제 및 백신화 노력을 통하여, 황열은 북아메리카, 중앙아메리카, 남아메리카, 캐리비안 및 유럽의 상당수에서 박멸되었다. 그러나, 최근 20년 동안 케이스(case)를 보고하는 국가의 수가 늘고 있다. 황열 바이러스는 현재 대부분의 아프리카, 남아메리카 및 일부 캐리비안의 섬에서 풍토병이다. 세계보건기구(WHO)는 매년 200,000 케이스의 황열이 발생하여 30,000명이 사망한다고 추산한다. 2차 세계대전 동안, 뎅기 플라비바이러스는 전세계적으로 열대 및 아열대 지역으로 전파되었으며, 지금은 세계 인구의 약 절반인 35억명의 사람들을 위협하고 있다. WHO는 매년 5천만-1억 케이스의 뎅기열이 발생한다고 추산한다. 이들 중 500,000명은 뎅기 출혈열로 불리는 보다 심각한 생명을 위협하는 형태의 질병으로, 매년 25,000명 이상을 사망하게 한다. 특히 독성인(virulent) 형태의 서나일 바이러스는 1999년 뉴욕에서 아마도 여행을 통해 서반구로 도입되었다. 모기-전파성 바이러스는 1차 숙주로 새를 감염시켰지만, 인간 및 말에서도 질병 및 사망을 초래하였다. 서나일 바이러스는 미국 전체 및 캐나다 및 멕시코 내로 퍼졌다. 도입된 후, 서나일 바이러스는 미국에서 20,000 케이스 이상의 서나일 질병을 초래하고, 950명이 사망하게 하였다. 일본 뇌염 바이러스는 1차적으로 동아시아 및 서아시아에서 매년 30,000 내지 50,000 케이스의 신경계 질병을 초래한다. 보고된 케이스의 25-30%는 치명적이다. 진드기-유래 뇌염 바이러스는 유럽 및 아시아의 일부에서는 풍토병이며, 일시적으로 발발하여 수천명의 개체에 영향을 미치게 된다. 보다 제한적으로 세계에 전파된 관련 바이러스는 쿤진(Kunjin) 바이러스(서나일의 가까운 친족) 및 호주 및 뉴기니에서의 무레이 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 북아메리카 및 남아메리카에서의 세인트루이스 뇌염 바이러스, 아프리카에서의 우수투(Usutu), 코우탱고(Koutango) 및 야온데(Yaonde) 바이러스 및 남아메리카의 카시파코어(Cacipacore) 바이러스를 포함한다.
안전하고 황열 및 일본 뇌염과 같은 플라비바이러스 질병에 대해 보호할 수 있는 살아있는 약독화된 바이러스 백신이 개발되어 왔다. 상기 살아있는 약독화된 바이러스 백신인 17D는 황열을 방지하기 위해 널리 사용되고 있다. 현재의 플라비바이러스 백신은 안정화제의 존재하에 동결건조된다. 그럼에도 불구하고, 상기 백신은 2-8℃에서의 보관 및 배송을 필요로 하는데, 이러한 조건은 개발도상국 및 선진국에서 보다 먼 지역에서는 달성하기 어렵다. 아울러, 재구성시, 상기 백신은 심지어 2-8℃에 보관되더라도 신속하게 효능을 잃어버린다.
홍역 백신은 질병을 방지하기 위해 전세계적으로 사용되는 불안정한 약독화된 바이러스의 다른 예이다. 홍역 바이러스는 파라믹소바이러스 과의 외피를 갖는 세그멘트되지 않은 음성 가닥(negative strand) RNA 바이러스이다. 홍역은 전염성이 강한 계절 질병이며, 백신화가 없으면 사춘기 이전에 실질적으로 모든 어린이들을 감염시킬 수 있다. 개발도상국의 경우, 홍역에 감염된 어린이의 사망률은 2 내지 15%만큼 높을 수 있다. 실제로, 세계적인 면역화를 이루려는 노력에도 불구하고, 홍역은 여전히 매년 7,000명 이상의 어린이 사망을 초래한다. 홍역 백신은 살아있는 약독화된 바이러스로서, 원형의(primary) 닭 섬유아세포에서 제조된다. 백신은 젤라틴 및 솔비톨로 안정화된 후 동결건조된다. 상기 안정화된 동결건조 백신은 2 내지 8℃에서 보관될 경우 2년 이상의 저장 수명을 갖는다. 그러나, 동결건조된 백신은 여전히 개발도상국에서는 유지하기 어려운 저온 유통체계를 필요로 한다. 아울러, 재구성시, 상기 백신은 실온(20 내지 25℃)에서 1시간 내에 그 효능의 50%를 잃는다.
따라서, 본 기술분야에서는 개선된 백신 제형에 대한 필요성이 존재한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특별한 구현예의 어떤 측면을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 상기 구현예는 하나 이상의 이들 도면과 본 발명에서 제공된 상세한 설명을 조합해 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 조성물 내에서 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스의 안정성을 검사하기 위한 다양한 조성물을 이용한 실험의 예시적인 막대그래프(histogram)를 나타낸다.
도 2는 다양한 예시적인 조성물 내에서 37℃에서의 바이러스의 불활성화를 위한 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스의 동역학 분석의 예시적인 그래프를 나타낸다.
도 3은 37℃에서 21시간 동안 보관된 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 바이러스를 분석한 예시적인 막대그래프를 나타낸다. 수치는 투입한 역가에 대한 배양 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현된다. 제형의 백분율은 해당 부형제의 (w/v)를 나타낸다.
도 4는 상이한 조성물에서 37℃에서 23시간 동안 보관된 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 바이러스를 분석한 예시적인 막대그래프를 나타낸다. 수치는 투입한 역가에 대한 배양 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현된다.
도 5는 상이한 조성물에서 37℃에서 23시간 동안 보관된 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 바이러스를 분석한 예시적인 막대그래프를 나타낸다. 수치는 투입한 역가에 대한 배양 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현된다. 각 제형의 2개의 막대는 실험이 이중이라는 것을 나타낸다.
도 6은 상이한 제형으로 보관될 때 2번의 냉동-해동 사이클 후 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53 바이러스의 예시적인 막대그래프 분석을 나타낸다. 수치는 투입한 역가에 대한 냉동-해동 사이클 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현된다.
도 7은 수주의 시간에 걸쳐서 25℃에서 바이러스 불활성화를 위한 다양한 예시적인 조성물에서 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53/WN 재조합 플라비바이러스의 동역학 분석의 예시적인 그래프를 나타낸다.
도 8은 수주의 시간에 걸쳐서 4℃에서 바이러스 불활성화를 위한 다양한 예시적인 조성물에서 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK 53/WN 재조합 플라비바이러스의 동역학 분석의 예시적인 그래프를 나타낸다.
도 9는 다양한 예시적인 조성물에서 동결건조한 후 예시적인 바이러스인 DEN-2 PDK-53 바이러스의 예시적인 막대그래프 분석을 나타낸다. 바이러스의 불활성화는 상이한 온도에서 2주 후 전술한 바와 같이 평가되었다.
발명의 요약
본 발명의 구현예는 살아있는 약독화된 바이러스 조성물의 저하(deterioration) 또는 불활성화를 줄이거나 방지하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 개시된 어떤 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스의 저하를 감소시키는 성분들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예는 살아있는 약독화된 바이러스의 안정성을 크게 향상시키는 부형제(excipient)의 조합에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 조성물 및 방법은 저온(예컨대, 냉장 또는 냉동 보관)에 대한 필요성을 감소시키면서 수성(aqueous) 및/또는 재구성된 살아있는 약독화된 바이러스의 저장 수명을 증가시키는 것에 관한 것이다.
이들 구현예에 따르면, 어떤 살아있는 약독화된 바이러스는 플라비바이러스에 관한 것이다. 어떤 구현예는 조성물에 관한 것으로서, 하나 이상의 고분자량 계면활성제, 단백질 및 탄수화물과 조합된 하나 이상의 살아있는 약독화된 플라비바이러스와 같은 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 기재된 조성물은 살아있는 약독화된 플라비바이러스(Flavivirus), 토가바이러스(Togavirus), 코로나바이러스(Coronavirus), 라브도바이러스(Rhabdovirus), 필로바이러스(Filovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus), 분야바이러스(Bunyavirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 헤파드나바이러스(Hepadnavirus), 페스티바이러스(Pestivirus), 피코르나바이러스(Picornavirus), 칼리시바이러스(Calicivirus), 레오바이러스(Reovirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 파포바바이러스(Papovavirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 또는 폭스바이러스(Poxvirus)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 살아있는 약독화된 바이러스의 안정성을 증가시키거나 및/또는 불활성화 및/또는 분해를 감소시킬 수 있다.
다른 구현예는 본 발명에 기재된 하나 이상의 바이러스에 의해 초래되는 의학적 증상의 개시를 줄이거나 방지할 수 있는 백신 조성물에 관한 살아있는 약독화된 바이러스 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 의학적 증상은 서나일 감염, 뎅기열, 일본 뇌염, 키아사누르 삼림병(Kyasanur forest disease), 무레이 밸리 뇌염, 알크후르마(Alkhurma) 출혈열, 세인트루이스 뇌염, 진드기-유래 뇌염, 황열 및 C형 간염 바이러스 감염을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예에서, 본 발명에 기재된 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수 또는 수화될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 사용되도록 개시된 단백질 제제는 락트알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA), 소 혈청 알부민(BSA), 다른 혈청 알부민 또는 알부민 유전자 패밀리의 일원을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사카라이드 또는 폴리올 제제는 모노사카라이드, 디사카라이드, 당 알코올, 트레할로오스, 수크로오스, 말토오스, 이소말토오스, 셀리바이오스, 젠티오바이오스, 라미나리보오스, 자일로바이오스, 만노바이오스, 락토오스, 프룩토오스, 솔비톨, 만니톨, 락티톨, 자일리톨, 에리트리톨, 라피노오스, 아밀세, 사이클로덱스트린, 키토산 또는 셀룰로오스를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 어떤 구현예에서, 계면활성제는 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드)와 폴리(프로필렌 옥사이드)의 코폴리머(EO-PO 블록 코폴리머), 폴리(비닐 피롤로이돈), 알킬 폴리글루코시드(예컨대, 수크로오스 모노스테아레이트, 라우릴 디글루코시드, 또는 솔비탄 모노라우레이트, 옥틸 글루코시드 및 데실 말토시드), 지방산 알코올(세틸 알코올 또는 올레일 알코올) 또는 코카미드(cocamide)(코카미드 MEA, 코카미드 DEA 및 코카미드 TEA)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 상기 계면활성제는 플루로닉 F127, 플루로닉 F68, 플루로닉 P123 또는 다른 3,000-4,000 MW 이상의 EO-PO 블록 코폴리머를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예에서, 백신 조성물은 혈청 알부민인 하나 이상의 단백질 제제; 트레할로오스인 하나 이상의 사카라이드 제제; 및 EO-PO 블록 코폴리머 플루로닉 F127인 하나 이상의 계면활성제 폴리머 제제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 어떤 구현예는 부분적으로 또는 전체적으로 탈수된 살아있는 약독화된 바이러스 조성물에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 조성물은 20% 이상; 30% 이상; 40% 이상; 50% 이상; 60% 이상; 70% 이상; 80% 이상; 또는 90% 이상 탈수될 수 있다.
다른 구현예는 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스를, 하나 이상의 단백질 제제; 하나 이상의 사카라이드 또는 폴리올 제제; 및 하나 이상의 고분자량 계면활성제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 감소시킬 수 있는 조성물과 조합하는 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 줄이기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 줄여준다. 이들 구현예에 따르면, 상기 살아있는 약독화된 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 페스티바이러스, 피코르나바이러스, 칼리시바이러스, 레오바이러스, 파르보바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 폭스바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적으로, 본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 조합을 위하여 동결건조 또는 다른 탈수 방법을 포함할 수 있다. 이들 방법 및 조성물에 따르면, 상기 방법 및 조성물은 동결건조되거나 부분적으로 또는 전체적으로 탈수된 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 줄여준다. 다른 방법으로는, 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 줄이기 위한 본 발명의 조성물은 수성 조성물을 포함할 수 있거나, 또는 탈수 후 재수화된 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 수성 또는 재수화된 살아있는 약독화된 바이러스의 저장 수명을 증가시킬 수 있다.
어떤 특별한 구현예에서, 본 발명에 기재된 백신 조성물에 사용되기 위한 살아있는 약독화된 바이러스는 약독화된 황열 바이러스(예컨대, 17D), 약독화된 일본 뇌염 바이러스(예컨대, SA 14-14-2), 약독화된 뎅기 바이러스(예컨대, DEN-2/PDK-53 또는 DEN-4Δ30) 또는 재조합 키메라 플라비바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 살아있는 약독화된 플라비바이러스 백신을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구현예에서, 본 발명에 기재된 조성물은 실온(예컨대, 약 20 내지 약 25℃) 또는 냉장 온도(예컨대, 약 0 내지 약 10℃)에서 24시간 이상 수화된 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화 및/또는 분해를 줄일 수 있다. 보다 특별한 구현예에서, 조합 조성물은 약 100%의 살아있는 약독화된 바이러스를 24시간 이상 유지할 수 있다. 또한, 본 발명에 기재된 조합 조성물은 적어도 2번의 냉동 및 해동 사이클 동안에 수화된 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 감소시킬 수 있다. 다른 방법은 냉장 온도(예컨대, 약 0 내지 약 10℃)에서 약 24시간 내지 약 50일 동안 수화된 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 감소시킬 수 있는 조합 조성물에 관한 것이다. 상기 방법에서 기재된 조성물은 하나 이상의 혈청 알부민 단백질 제제; 하나 이상의 트레할로오스 사카라이드 제제; 및 하나 이상의 플루로닉 F127의 EO-PO 블록 코폴리머 제제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 어떤 구현예에서, 상기 살아있는 약독화된 바이러스 조성물은 대략 21℃에서 7일 후 약 100%의 바이러스 역가 및 4℃ 부근의 냉장 온도에서 50일 후 약 100%의 바이러스 역가를 갖고 있다. 본 발명의 다른 구현예는 대략 21℃에서 7일 후 약 90% 또는 약 80%의 바이러스 역가 및 4℃ 부근의 냉장 온도에서 50일 후 약 90% 또는 약 80%의 바이러스 역가를 갖는 살아있는 약독화된 바이러스 조성물을 포함할 수 있다. 기재된 다른 구현예는 본 기술분야에 알려진 다른 조성물과 비교하여 대략 37℃에서 수 시간(예컨대, 20시간) 후 약 3x 내지 약 10x의 바이러스 역가 농도를 갖는 살아있는 약독화된 바이러스 조성물을 포함한다(예를 들면, 도 4 및 도 5 참조). 본 발명에 개시된 조성물은 상기 조성물이 대략 37℃에서 보관될 때 살아있는 약독화된 바이러스의 분해를 감소시킨다.
다른 구현예는 용기; 및 하나 이상의 단백질 제제, 하나 이상의 사카라이드 또는 폴리올 제제 및 하나 이상의 EO-PO 블록 코폴리머 제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 조성물로서 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화 및/또는 분해를 줄여주는 조성물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 살아있는 약독화된 바이러스 조성물의 불활성화를 줄이기 위한 키트에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 키트 조성물은 하나 이상의 혈청 알부민의 단백질 제제; 하나 이상의 트레할로오스의 사카라이드 제제; 및 하나 이상의 EO-PO 블록 코폴리머 제제를 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명에 기재된 키트는 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 페스티바이러스, 피코르나바이러스, 칼리시바이러스, 레오바이러스, 파르보바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 폭스바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 사카라이드 제제로 트레할로오스를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 트레할로오스 농도는 5%(w/v) 또는 그 이상일 수 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 EO-PO 블록 코폴리머 제제로 폴리머 F127을 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 폴리머 F127 농도는 약 0.1 내지 약 4%(w/v)일 수 있다.
본 발명에 기재된 다른 구현예, 조성물은 미량의 2가 양이온을 함유하거나, 함유하지 않을 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 기재된 조성물은 미량의 칼슘/마그네슘(Ca+2/Mg+2)을 갖거나, 갖지 않을 수 있다.
예시적인 구현예의 설명
정의
본 발명에서 사용된 바와 같이, "한" 또는 "하나"는 한 아이템의 하나 이상을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "약"은 ±5% 까지를 포함할 수 있으며, 예를 들면 약 100은 95 및 105까지를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "사카라이드" 제제는 하나 이상의 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 갈락토오스, 리보오스, 만노오스, 람노오스, 탈로오스, 자일로오스 또는 알로오스 아라비노오스), 하나 이상의 디사카라이드(예컨대, 트레할로오스, 수크로오스, 말토오스, 이소말토오스, 셀리바이오스, 젠티오바이오스, 라미나리보오스, 자일로바이오스, 만노바이오스, 락토오스 또는 프룩토오스), 트리사카라이드(예컨대, 아카르보오스, 라피노오스, 멜리지토오스, 판노오스 또는 셀로트리오스) 또는 당 폴리머(예컨대, 덱스트란, 잔탄, 풀루란, 시클로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 전분, 셀로올리고사카라이드, 셀룰로오스, 말토올리고사카라이드, 글리코겐, 키토산 또는 키틴)를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "폴리올" 제제는 임의의 당 알코올(예컨대, 만니톨, 솔비톨, 아라비톨, 에리트리톨, 말티톨, 자일리톨, 글리시톨, 글리콜, 폴리글리시톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 글리세롤)을 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "고분자량 계면활성제"는 1,500 분자량 이상인 표면 활성형 양친성(amphiphilic) 분자를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "EO-PO 블록 코폴리머"는 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 블록으로 이루어진 코폴리머를 의미할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용된 바와 같이, "플루로닉"은 EOx-POy-EOx 형태의 EO-PO 블록 코폴리머를 의미할 수 있다. 이러한 구조의 EO-PO 블록 코폴리머는 또한 "폴록사머" 또는 "신페로닉"으로 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "약독화된 바이러스"는 동물에 투여되었을 때 질병의 임상적 증상이 없거나 감소되었음을 보여주는 바이러스를 의미할 수 있다.
상세한 설명
하기 섹션에서는 다양한 구현예를 상술하기 위하여 다양한 예시적인 조성물 및 방법이 개시된다. 본 기술분야의 당업자에게는 상기 다양한 구현예를 실행할 때 본 발명에서 약술한 특정한 세부항목(detail)의 전부 또는 심지어 일부조차도 도입할 필요가 없으며, 농도, 시간 및 다른 특정한 세부항목은 일상적인 실험을 통해 변경될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 어떤 경우, 잘 알려진 방법 또는 조성물은 상기 설명에 포함되어 있지 않다.
플라비바이러스 백신의 안정성은 남아있는 살아있는 약독화된 황열 및 일본 뇌염 바이러스 모두에 대해 평가되어 왔다. 1987년에 검사되었을 때, 이때 제조된 12개의 황열 백신 중 단지 5개만이 최소 안정성 기준을 충족시켰다. 순차적으로, 당, 아미노산 및 2가 양이온 혼합물을 첨가하면 동결건조된 백신이 안정화되어서, 상기 백신은 37℃에서 14일 동안 배양한 후 효능의 1 log 이하가 상실된다는 것이 밝혀졌다. 황열 백신에 대한 동결건조된 제형의 안정화가 개시된 바 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,500,512호 참조). 미국 특허 제4,500,512호는 락토오스, 솔비톨, 2가 양이온인 칼슘 및 마그네슘 및 적어도 하나의 아미노산의 조합을 개시하고 있다. 상기 제형은 동결건조된 백신을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있지만, 수성 형태에서 백신을 안정화시키지는 못한다. 다른 연구에서는 상기 동결건조된 황열 백신의 안정성에 대한 전술한 조성물을 포함하는 몇 가지 상이한 제형의 능력과 수크로오스, 트레할로오스 및 락트알부민의 효과에 대해 조사하였다. 10% 수크로오스 단독, 4% 이노시톨을 갖는 2% 솔비톨, 또는 5% 락트알부민을 갖는 10% 수크로오스, 0.1 g/ℓ CaCl2 및 0.076 g/ℓ MgSO4로 이루어진 제형은 최고의 안정성을 제공하는 것으로 나타났다(예를 들면, Adebayo, Sim-Brandenburg 등, 1998 참조). 그러나, 모든 경우에 있어서, 재현탁 후에는 황열 백신이 여전히 매우 불안정하며, 단지 약 1시간 후에는 버려야만 한다(예를 들면, Monath 1996; Adebayto, Sim-Brandenburg 등, 1998 참조). 만일 불안정한 백신이 사용된다면, 이는 백신의 손실과, 현장 조건(field condition) 하에서 효과가 없는 백신을 투여할 가능성을 갖게 한다.
일본 뇌염에 대해 보호하기 위한 다른 살아있는 약독화된 플라비바이러스 백신이 승인되었고, 중국에서 널리 사용되고 있다(예를 들면, Halstead 및 Tsai, 2004 참조). 상기 일본 뇌염 백신 주인 SA 14-14-2는 원형의 햄스터 신장 세포에서 자라며, 세포의 상등액(supernatant)을 수확하여 대충(coarsely) 여과한다. 이전의 한 조성물은 1% 젤라틴과 5% 솔비톨을 안정화제로 포함하였다. 상기 안정화제를 사용하여 백신을 동결건조한 후, 2 내지 8℃에서는 적어도 1.5년 동안 안정하지만, 실온에서는 단지 4개월, 37℃에서는 10일 동안만 안정하다. 상기 황열 백신의 경우, 재구성된 백신은 매우 불안정하며, 실온에서는 단지 2시간 동안만 안정하다(예를 들면, Wanf, Yang 등, 1990 참조). 본 발명의 어떤 구현예에서, 일본 뇌염의 분해를 안정화 또는 감소시키기 위한 살아있는 약독화된 플라비바이러스 조성물이 기재된다.
살아있는 약독화된 플라비바이러스 백신에 대하여, 2-8℃ 이상의 온도에서 동결건조된 제형의 장기간의 안정성을 제공하는 제형은 알려져 있지 않다. 또한, 수시간 이상 동안 수성 백신의 역가 손실을 방지하고, 분해를 안정화 또는 감소시키는 제형은 개시되어 있지 않다.
다른 살아있는 약독화된 바이러스에 대한 제형 또한 개시되어 있다(예를 들면, Burke, Hsu 등, 1999 참조). SPGA로 불리는 보통의 한 안정화제는 2 내지 10% 수크로오스, 포스페이트, 칼륨 글루타메이트 및 0.5 내지 2% 혈청 알부민의 혼합물이다(예를 들면, Bovarnick, Miller 등, 1950 참조). 상이한 양이온을 갖고, 수크로오스 대신 전분 가수분해물 또는 덱스트란으로 치환하고, 혈청 알부민 대신 카세인 가수분해물 또는 폴리비닐 피롤리돈으로 치환한 상기 기본적 제형의 다양한 변형물이 알려져 있다. 다른 제형은 단백질 공급원(source)으로 혈청 알부민 대신 가수분해된 젤라틴을 사용한다(Burke, Hsu 등, 1999). 그러나, 젤라틴은 면역화된 어린이에서 알레르기 반응을 초래할 수 있고, 백신 관련 부작용의 원인이 될 수 있다. 미국 특허 제6,210,683호는 백신 제형에서 인간 혈청으로부터 정제된 알부민 대신 재조합 인간 혈청 알부민으로 치환한 것을 개시하고 있다.
본 발명의 구현예는 종래 기술과 비교하여 살아있는 약독화된 바이러스 백신의 안정성을 향상시키거나 및/또는 분해를 감소시키는 조성물을 개시한다. 본 발명에서 개시된 어떤 조성물은 약 37℃에서 2시간까지; 3시간까지; 4시간까지 또는 4시간 이상 수성 바이러스의 안정성을 제공한다. 본 발명에서 개시된 어떤 조성물은 약 실온(예컨대, 25℃)에서 1일 내지 약 1주 이상까지 수성 바이러스의 안정성을 제공한다. 본 명세서에 기재된 구현예는 예를 들면 냉동 및/또는 해동된 및/또는 상승 온도의 살아있는 약독화된 바이러스의 증가된 보호를 제공한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 실온 조건(예컨대, 약 25℃)에서 탈수된 살아있는 약독화된 바이러스 제품을 안정화시키거나, 분해를 감소시키거나 및/또는 불활성화를 방지할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 기재된 조성물은 약 25℃ 또는 약 37℃까지에서 수성의 살아있는 약독화된 바이러스 제품을 안정화시키거나, 분해를 감소시키거나 및/또는 불활성화를 방지할 수 있다. 본 발명에서 개시된 조성물 및 방법은 선진국 및 후진국 지역에서 바이러스 백신의 보관, 분배, 운반 및 투여를 촉진시킬 수 있다.
다른 구현예는 피코르나바이러스(예컨대, 폴리오 바이러스, 수족구 질병 바이러스), 칼리시바이러스(예컨대, SARS 바이러스 및 고양이 감염성 복막염 바이러스), 토가바이러스(예컨대, 신드비스(sindbis) 바이러스, 말 뇌염 바이러스, 치쿤군야(chikungunya) 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 소 설사 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스), 플라비바이러스(예컨대, 뎅기 바이러스, 서나일 바이러스, 황열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 진드기 유래 뇌염 바이러스), 코로나바이러스(예컨대, 인간 코로나바이러스(보통의 감기), 돼지 위장염 바이러스), 라브도바이러스(예컨대, 공수병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스), 필로바이러스(예컨대, 말버그(Marburg) 바이러스, 에볼라 바이러스), 파라믹소바이러스(예컨대, 홍역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합(syncytial) 바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스, 우역(rinderpest) 바이러스), 오르토믹소바이러스(예컨대, 인간 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스), 분야바이러스(예컨대, 한타바이러스, 라크로쎄(LaCrosse) 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스), 아레나바이러스(예컨대, 라싸(Lassa) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스), 레오바이러스(예컨대, 인간 레오바이러스, 인간 로타바이러스), 비르나바이러스(예컨대, 감염성 부르살(Bursal) 바이러스, 물고기 췌장 괴사 바이러스), 레트로바이러스(예컨대, HIV 1, HIV 2, HTLV-1, HTLV-2, 소 백혈병 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 마우스 유방암 바이러스), 헤파드나바이러스(예컨대, B형 간염 바이러스), 파르보바이러스(예컨대, 인간 파르보바이러스 B, 개 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증(panleukopenia) 바이러스), 파포바바이러스(예컨대, 인간 파필로마바이러스, SV40, 소 파필로마바이러스), 아데노바이러스(예컨대, 인간 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 소 아데노바이러스, 돼지 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스(예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 감염성 소 비기관염(rhinotracheitis) 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 6) 및 폭스바이러스(예컨대, 백시니아, 파울폭스바이러스, 미국너구리(raccoon) 폭스바이러스, 스컹크폭스바이러스, 원숭이폭스바이러스, 카우폭스바이러스, 전염성 연속종(musculum contagiosum) 바이러스)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 살아있는 약독화된 바이러스 백신용 조성물을 포함할 수 있다.
본 기술분야의 당업자는 본 발명의 조성물 또는 제형이 세포 계대 배양, 재편성, 감염성 클론에서의 돌연변이 도입, 역유전학, 다른 재조합 DNA 또는 RNA 조작을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 수단에 의해 약독화된 바이러스에 관한 것임을 인식할 것이다. 또한, 본 기술분야의 당업자는 다른 구현예는 재조합 플라비바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 폭스바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노-연관 바이러스 및 재조합 헤르페스 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 다른 단백질 또는 RNA를 발현하도록 가공된 바이러스에 관한 것임을 인식할 것이다. 이러한 바이러스는 감염성 질병에 대한 백신, 종양 증상을 치료하기 위한 백신, 또는 질병을 치료하기 위해 단백질 또는 RNA의 발현을 도입하기 위한 바이러스(예컨대, 유전자 치료, 안티센스 치료, 리보자임 치료 또는 작은 억제성(small inhibitory) RNA 치료)로 사용될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 토가바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레트로바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스 또는 폭스바이러스 과의 막 외피를 갖는 하나 이상의 바이러스(예컨대, 외피 바이러스)를 함유할 수 있다. 어떤 구현예에서, 조성물은 토가바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스 또는 레트로바이러스 과의 하나 이상의 외피 RNA 바이러스를 함유한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 토가바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스 또는 레트로바이러스 과의 하나 이상의 외피성 양성 가닥 RNA 바이러스를 함유할 수 있다. 어떤 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 살아있는 약독화된 플라비바이러스(예컨대, 뎅기 바이러스, 서나일 바이러스, 황열 바이러스 또는 일본 뇌염 바이러스)를 함유할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예는 수성 또는 동결건조된 형태의 살아있는 약독화된 바이러스용 조성물에 관한 것이다. 본 기술분야의 당업자는 바이러스의 열안정성을 개선하고 냉동-해동 불활성화를 방지하는 제형은 액상, 분말상, 냉동건조 또는 동결건조된 제품 및 기술분야에 알려진 방법에 의해 제조된 제품을 개선할 것임을 인식할 것이다. 재구성 후, 이러한 안정화된 백신은 진피내 투여, 표피 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 폐 투여 또는 경구 투여를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 바늘 및 주사기 주입, 양갈래(bifurcated) 바늘 투여, 진피내 패치 또는 펌프에 의한 투여, 바늘-없는 제트 운반, 진피내 입자 운반 또는 에어로졸 분말 운반을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 상기 백신을 운반하기 위한 다양한 장치가 본 기술분야에 알려져 있다.
구현예는 생리적으로 허용가능한 버퍼 내에 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스(전술한 바와 같음) 및 하나 이상의 고분자량 계면활성제 및 하나 이상의 단백질의 혼합물로 이루어진 조성물을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 조성물은 생리학적으로 허용가능한 버퍼 내에 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스, 하나 이상의 고분자량 계면활성제, 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 탄수화물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스의 열안정성을 증가시키는 하나 이상의 고분자량의 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제는 유리 바이알과 같은 표면에 대한 물질의 손실을 방지하기 위해 백신 제형 내에 포함되어 왔다(예를 들면, Burke, Hsu 등, 1999 참조). 그러나, 본 발명의 어떤 구현예는 본 발명에 개시된 조성물 및 방법을 위한 어떤 특이한 생화학적 이용 특성을 갖는 고분자량의 계면활성제를 포함한다. 상기 EO-PO 블록 코폴리머는 폴리에틸렌 옥사이드(-CH2CH2O-, 'EO'로 나타냄) 및 폴리프로필렌 옥사이드(-CH2CHCH3O-, 'PO'로 나타냄)의 블록을 포함할 수 있다. 상기 PO 블록은 EOx-POy-EOx 배열에서 2개의 EO 블록과 인접할 수 있다. 상기 PO 성분은 친수성이고 상기 EO 성분은 소수성이기 때문에, 총 친수성도, 분자량 및 계면활성제 특성은 상기 EOx-POy-EOx 블록 구조에서의 x 및 y를 변화시킴으로써 조정될 수 있다. 수용액에서, 상기 EO-PO 블록 코폴리머는 PO 코어(core)와 친수성 EO 그룹의 코로나(corona)를 갖는 미셀로 자가조립(self-assembly)될 것이다. EO-PO 블록 코폴리머 제형은 다양한 소수성 약물 및 단백질, DNA 또는 불활성화된 백신을 위한 잠재적인 약물 운반 제제로 연구되어 왔다(예컨대, Todd, Lee 등, 1998; Kabanov, Lemieux 등, 2002). 고농도(예를 들면, 10% 이상)에서, 어떤 고분자량의 EO-PO 블록 코폴리머는 역 겔화(reverse gelation)가 일어나서, 온도가 증가할 때 겔을 형성할 것이다. 체온에서의 겔 형성은 상기 EO-PO 블록 코폴리머 겔이 약물 및 백신 운반 적용분야에서 저장소(depot)로 작용하기 위해 사용되도록 한다(예를 들면, Coeshott, Smithson 등, 2004 참조). 또한, 그 계면활성제 특성으로 인하여, 이들 폴리머는 어주번트(adjuvant) 제형, 및 유화제로서 국소 도포된 크림 및 겔에 사용되어 왔다. 상기 EO-PO 블록 코폴리머는 또한 상처 및 화상의 치료를 가속화시키고, 조사(radiation) 또는 전기천공-매개성 손상 후에 세포막을 봉합시키는 것으로 나타나 있다.
다른 구현예에서, 백신 조성물은 1,500 이상의 분자량을 갖는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 계면활성제는 비이온성, 친수성의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머(또는 EO-PO 블록 코폴리머)이다. EO-PO 블록 코폴리머가 어주번트 및 불활성화된 백신, 단백질 백신 또는 DNA 백신용 운반 비히클로 사용되어 왔지만, 이들을 살아있는 바이러스의 불활성화를 방지하는데 사용하는 것은 본 기술분야에서 예측되지 않는다. 특별한 구현예에서, 제형은 3,000 이상의 분자량을 갖는 하나 이상의 EO-PO 폴리머를 함유할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물은 EO-PO 블록 코폴리머 플루로닉 F127 또는 플루로닉 P123을 일부 포함할 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 상기 계면활성제의 변형이 화학적으로 일어날 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명에서는 임의의 본질적으로 동등한 계면활성제 폴리머가 고려될 수 있음이 기재된다.
본 발명의 구현예는 하나 이상의 살아있는 약독화된 바이러스, 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 단백질의 조성물을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 단백질은 알부민일 수 있다. 혈청 알부민은 척추동물 혈액 내의 가장 흔한 단백질 중 하나이며, 여러가지 기능을 갖고 있다. 상기 단백질은 585개 아미노산이며, 66,500의 분자량을 갖는다. 인간 혈청 알부민은 글리코실화되어 있지 않으며, 그 무수한 결합 활성의 일부와 관련된 하나의 자유 티올기를 갖고 있다. 혈청 알부민은 주로 각각 2개의 서브도메인으로 세분되는 3개의 구조 도메인을 갖는 α-헬릭스이다. 알부민은 아스피린, 아부프로펜, 할로탄(halothane), 프로포폴(propofol) 및 워파린(warfarin)과 같은 약물뿐만 아니라 지방산, 아미노산, 스테로이드, 글루타치온, 금속, 빌리루빈, 리소레시틴, 헤마틴 및 프로스타글란딘을 포함하는 다양한 분자에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 그 상이한 구조 도메인은 약물의 결합과 관련된다; 대부분의 소분자 약물 및 호르몬은 서브도메인 ⅡA 및 ⅢA 내에 위치한 2개의 1차 부위 중 하나에 결합한다. 면역원성이 없기 때문에, 알부민은 보통 생물학적 제품에서 담체 단백질로 사용된다. 살아있는 약독화된 바이러스 백신 내에 함유된 단백질 도스(dose)는 마이크로그램(103 내지 105 바이러스 입자로부터 유래됨) 정도일 수 있으므로, 유리, 플라스틱 또는 다른 표면에 흡수 및 비특이적으로 결합하여 손실되는 것을 방지하기 위해 불활성 담체 단백질이 사용된다. 그러나, 본 발명에서 설명한 바와 같이, 알부민과 EO-PO 블록 포콜리머의 조합을 이용하면 안정성의 현저한 개선이 관찰되었는데, 이는 상기 2가지 성분 및/또는 상기 성분들과 바이러스 입자가 상호작용함을 제시한다. 또한, 알부민 존재시 바이러스의 안정성이 개선되는 것은 일반적인 담체 단백질의 기능으로 인한 것 같지는 않다: 젤라틴 및 락토페린과 같은 다른 단백질은 바이러스의 안정성을 개선하지 않는다.
어떤 구현예에서, 혈청 알부민은 인간 또는 다른 포유동물 공급원 유래일 수 있다. 인간을 위해 사용될 의도인 백신의 경우, 특별한 구현예는 면역 부작용을 감소 또는 제거하기 위하여 필요시 인간 알부민 또는 다른 인간 제품을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 각 종에 대해 특이적인 알부민이 동물 백신에 사용될 수 있음을(예컨대, 개 제품에 대해서는 개 알부민, 소 제품에 대해서는 소 알부민) 인식할 것이다. 추가 구현예에서, 상기 단백질은 재조합 인간 알부민이다. 세균, 효모, 조류, 식물, 포유동물 세포 또는 형질전환 동물 시스템을 포함하는 다양한 발현 시스템에서 재조합 인간 알부민 또는 그의 일부를 발현하기 위한 표준 방법이 존재한다. 또한, 혈청 알부민 또는 그의 일부는 세포 부재(cell-free) 시스템에서 제조되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 또는 임의의 유사한 시스템에서 제조된 재조합 인간 알부민은 본 발명에 포함된다. 본 기술분야의 당업자는 다른 단백질이 알부민 대신 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 알부민은 다중-유전자(multi-gene) 패밀리의 일원이다. 그 구조 및 서열의 유사성으로 인하여, 상기 패밀리의 다른 일원(예컨대, α-페토프로틴(fetoprotein), 비타민 D 결합 단백질 또는 아파민(afamin))을 본 발명에 기재된 방법 및 조성물 내의 알부민 대신에 치환할 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 또한 본 기술분야에 공지된 임의의 수단, 예를 들면 재조합 DNA 기술, 번역 후(post-translational) 변형, 단백질분해성 분할(proteolytic cleavage) 및/또는 화학적 수단에 의해 알부민을 변형할 수 있음을 인식할 것이다. 치환 및 변경없는 혈청 알부민과 본질적으로 동등한 안정화 기능을 제공하는 알부민에 대한 이러한 치환 및 변경은 본 발명에 기재된다.
어떤 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 버퍼 내에 고분자량의 계면활성제, 단백질 및 탄수화물을 갖는 조성물이 개시된다. 어떤 구현예에서, 상기 탄수화물은 당 또는 폴리올이다. 당은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 갈락토오스, 리보오스, 만노오스, 람노오스, 탈로오스, 자일로오스 또는 알로오스 아라비노오스), 디사카라이드(예컨대, 트레할로오스, 수크로오스, 말토오스, 이소말토오스, 셀리바이오스, 젠티오바이오스, 라미나리보오스, 자일로바이오스, 만노바이오스, 락토오스 또는 프룩토오스), 트리사카라이드(예컨대, 아카르보오스, 라피노오스, 멜리지토오스, 판노오스 또는 셀로트리오스) 또는 당 폴리머(예컨대, 덱스트란, 잔탄, 풀루란, 시클로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 전분, 셀로올리고사카라이드, 셀룰로오스, 말토올리고사카라이드, 글리코겐, 키토산 또는 키틴)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 폴리올은 만니톨, 솔비톨, 아라비톨, 에리트리톨, 말티톨, 자일리톨, 글리시톨, 글리콜, 폴리글리시톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 글리세롤을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특별한 구현예에서, 제형은 약동학적으로 허용가능한 버퍼 내에 하나 이상의 EO-PO 블록 코폴리머, 하나 이상의 단백질 및 트레할로오스를 함유할 수 있다. 어떤 구현예에서, 트레할로오스는 5 내지 50%(w/v) 범위의 농도로 존재할 수 있다. 트레할로오스는 단백질 제형의 안정성을 향상시키기 위해 사용되어 왔다. 이는 본 기술분야에서 동결보존제(cryopreservative)로 널리 알려져 있으며, 자연에서는 스트레스로부터 생물을 보호하기 위해 사용된다. 낮은 수분 조건을 견딜 수 있는 무수생물태성(anhydrobiotic) 생물은 많은 양의 트레할로오스를 함유한다. 트레할로오스는 건조 과정에서 막의 불안정성을 초래할 수 있는 막 융합 사건과 상전이(phase transition) 모두를 방지하는 것으로 밝혀져 있다. 구조 분석으로부터 트레할로오스는 지질 이중층 내의 극성 헤드 그룹 사이에 잘 맞고 있음을 제시한다. 트레할로오스는 또한 건조 과정에서 불안정한 단백질의 변성(denaturation)을 방지한다. 트레할로오스는 극성 단백질 잔기와의 수소 결합에 의해 단백질을 안정화시키는 것으로 생각된다. 트레할로오스는 2개의 글루코오스 분자의 1:1 결합으로 이루어진 디사카라이드이다. 상기 1:1 결합으로 인하여, 트레할로오스는 환원력이 거의 없거나 전혀 없으며, 따라서 본질적으로 아미노산 및 단백질과 반응하지 않는다. 이러한 환원력의 부재는 단백질에 대한 트레할로오스의 안정화 효과를 개선할 수 있다. 어떤 구현예에서, 트레할로오스는 살아있는 약독화된 바이러스에 대한 안정성을 제공한다. 트레할로오스의 이러한 활성은 바이러스의 막 및 코트 단백질 모두를 안정화시키는 그의 능력 때문일 수 있다.
추가 구현예에서, 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스에 대한 개선된 안정성을 제공하기 위하여 생리학적으로 허용가능한 버퍼 내에 하나 이상의 EO-PO 블록 코폴리머, 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있으며, 상기 탄수화물 중 하나는 키토산이다. 어떤 구현예에서, 조성물은 0.001 내지 2%(예컨대, 약 6.8의 pH에서) 범위의 농도로 키토산을 포함할 수 있다. 키토산은 갑각류 외골격의 구조 폴리머인 키틴의 탈아세틸화에 의해 유래되는 양이온성 폴리사카라이드이다. 이는 N-아세틸-글루코사민 및 글로코사민의 폴리머이며; 상기 2가지 탄수화물의 함량은 탈아세틸화 정도에 의존한다. 키토산의 양전하는 키토산이 음으로 대전된 표면 및 분자와 결합하도록 한다. 따라서, 키토산은 점막 표면에 결합하며, 점막 흡수를 촉진하는 것으로 생각된다. 키토산은 또한 DNA, RNA 및 다른 올리고뉴클레오티드와 결합하고 나노입자를 형성할 수 있으며, 비-바이러스성 유전자 운반에 사용되어 왔다. 본 발명의 어떤 구현예는 키토산이 살아있는 약독화된 바이러스의 안정성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
어떤 구현예에서, 조성물은 전형적으로 생리학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 것으로 개시될 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 포스페이트, TRIS, MOPS, HEPES, 중탄산염, 본 기술분야에 알려진 다른 버퍼를 함유하는 버퍼 및 이들 버퍼의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 생리학적으로 허용가능한 버퍼가 존재할 수 있음을 인식하고 있다. 또한, 본 기술분야의 당업자는 주사 부위에서의 세포 손상 및/또는 통증을 방지하기 위하여 염의 농도를 거의 생리학적 레벨(예컨대, 생리식염수 또는 0.15 M 총 염)로 조정하는 것이 조성물의 비경구 투여용으로 최적일 수 있음을 인식하고 있다. 본 기술분야의 당업자는 또한 제형에 동등한 삼투압을 유지하기 위하여, 탄수화물의 농도가 증가하면 염 농도는 줄어들 수 있음을 인식할 것이다. 어떤 구현예에서, 6.8 이상의 pH를 갖는 버퍼 배지가 기재된다; 일부 살아있는 약독화된 바이러스(예컨대, 플라비바이러스)는 낮은 pH에서 불안정하다. 다른 구현예에서, 생리학적으로 허용가능한 버퍼는 포스페이트-버퍼된 식염수(PBS)일 수 있다.
본 발명의 어떤 살아있는 약독화된 바이러스 백신 조성물은 감소된 면역원성을 갖거나 비면역원성인 것에 더하여 살아있는 약독화된 바이러스의 안정성을 증가시키거나 및/또는 저하(deterioration)를 감소시키는 조성물에 관한 것이다. 이들 구현예에 따르면, 조성물은 하나 이상의 단백질 제제; 하나 이상의 사카라이드 또는 폴리올 제제; 및 하나 이상의 고분자량 계면활성제를 포함할 수 있으며, 상기 조성물은 살아있는 약독화된 바이러스의 불활성화를 줄여준다. 따라서, 본 발명에 기재된 어떤 조성물은 대상에 투여되었을 때 부작용이 감소한다. 어떤 예시적인 조성물에서, 상기 계면활성제(들)는 하나 이상의 EO-PO 블록 코폴리머로 이루어지고; 상기 단백질 제제(들)는 락트알부민, 혈청 알부민, α-페토프로틴, 비타민 D 결합 단백질, 척추동물 종으로부터 유래된 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 상기 탄수화물 제제(들)는 하나 이상의 사카라이드 및/또는 폴리올이다. 어떤 구현예에서, 조성물은 트레할로오스, 수크로오스, 키토산, 솔비톨 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탄수화물 제제(들)를 포함할 수 있다. 어떤 보다 특별한 구현예에서, 백신에 대한 면역 반응을 감소시키기 위하여, 상기 혈청 알부민은 척추동물 종으로부터 유래되거나, 다른 구현예에서는 상기 대상(예컨대, 인간)과 동일한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 탄수화물 제제는 트레할로오스이다. 어떤 구현예에서, 적어도 하나의 계면활성제는 EO-PO 블록 코폴리머인 플루오닉 F127이다. 어떤 살아있는 약독화된 바이러스 백신 조성물에서, 적어도 하나의 탄수화물 제제는 트레할로오스이다. 어떤 살아있는 약독화된 바이러스 백신에서, 조성물은 그 농도가 0.1 내지 4%(w/v)인 EO-PO 블록 코폴리머 플루로닉 F127; 및/또는 0.001 내지 3%(w/v) 농도의 혈청 알부민을 포함하며, 및/또는 상기 트레할로오스의 농도는 5 내지 50%(w/v)일 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 구현예는 생체내에서 약학적 투여용으로 적합한 생물학적 상용 형태로 대상에게 조성물을 투여하는 것을 제공한다. "생체내 투여용으로 적합한 생물학적 상용 형태"란 투여되는 활성 제제(예컨대, 상기 구현예의 살아있는 약독화된 바이러스 조성물)의 형태로서, 상기 활성 제제의 치료 효과가 임의의 독성 효과를 능가하는 것을 의미한다. 치료 조성물의 치료학적 활성양의 투여는 원하는 결과를 얻기 위해 필요한 도스 및 기간 동안의 유효량으로 정의된다. 예를 들면, 화합물의 치료학적 활성양은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 상기 개체에서 원하는 반응을 일으키기 위한 제형의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 도스 처방계획은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
어떤 구현예에서, 조성물(예컨대, 구현예의 약학적 화학물질, 단백질, 펩티드)은 피하, 정맥내, 경구 투여, 흡입, 경피 적용, 질내 적용, 국소 적용, 비강내 또는 직장 투여와 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 보다 특별한 구현예에서, 상기 화합물은 경구 또는 피하 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 정맥내 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 화합물은 흡입과 같이 비강내 투여될 수 있다.
화합물은 상기 조성물과 함께 투여되는 적합한 담체 또는 희석제 내에서 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"란 용어는 식염수 및 수성 버퍼 용액과 같은 희석제를 포함하기 위한 의도이다. 상기 활성 제제는 또한 비경구 또는 복강내로 투여될 수 있다. 또한, 분산액이 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 내 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건 하에, 이들 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유할 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 조성물은 본 기술분야에 알려진 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 멸균된 주사 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 분말이 사용될 수 있다. 모든 경우, 상기 조성물은 멸균될 수 있고, 주사가능성(syringability)이 용이하게 되는 정도로 액체일 수 있다. 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 활동에 대해 추가로 보존될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성(fluidity)은, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅을 이용하거나, 분산액의 경우에는 원하는 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
멸균 주사 용액은 일정량의 활성 화합물을 필요시 적합한 용매 또는 상기에 나열한 성분 중 하나 또는 조합에 포함시킨 후 멸균함으로써 제조될 수 있다.
제형화시, 용액은 도스 제형과 상용인 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 제형은 전술한 주사 용액 타입과 같은 다양한 도스 형태로 용이하게 투여될 수 있다. 또한, 서방형 캡슐, 시간-방출 미세입자 등이 본 발명의 투여 조성물용으로 도입될 수 있음이 기재된다. 이들 특별한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다.
상기 활성 치료제는 혼합물 내에 제형화될 수 있으며, 도스 당 약 0.0001 내지 1.0 ㎎, 약 0.001 내지 0.1 ㎎, 또는 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 1 내지 10 g을 포함할 수 있다. 또한, 단일 도스 또는 다중 도스가 소정의 상황을 위한 적합한 스케줄로 투여될 수 있다. 어떤 구현예에서, 도스는 본 발명에 기재된 바이러스에 노출되기 전, 중 및/또는 후에 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 관심 화합물을 운반하기 위하여 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제가 사용될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제형은 좌약 및 페서리(pessary)를 포함한다. 또한, 직장 페서리 또는 좌약이 사용될 수 있다. 좌약의 경우, 일반적으로 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드와 같은 전통적인 결합제 및 담체가 포함될 수 있다; 이러한 좌약은 상기 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
경구용 제형은 예를 들면 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 보통 도입되는 부형제를 포함한다. 어떤 구현예에서, 경구용 약학적 조성물은 불활성 희석제 또는 동화형 식용 담체를 포함할 수 있거나, 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 캡슐 내에 동봉될 수 있거나, 정제로 압착될 수 있거나, 식이용 음식에 직접 포함될 수 있다. 경구용 치료용 투여의 경우, 상기 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고, 섭취용 정제, 구강용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제물은 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 상기 조성물 및 제제물의 백분율은 물론 다양할 수 있으며, 편리하게는 단위 중량의 약 2 내지 약 75% 사이, 또는 바람직하게는 25-60% 사이일 수 있다. 이러한 약학적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물의 양은 적합한 도스가 얻어질 수 있는 양이다.
키트
추가 구현예는 본 발명에 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 조성물과 살아있는 바이러스 제형은 상기 키트 내에 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 적합한 용기, 본 발명에서 상술한 살아있는 약독화된 바이러스 조성물, 및 선택적으로는 다른 항바이러스제, 항진균제 또는 항균제와 같은 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있다.
상기 키트는 필요로 하는 대상에게 사용하기 위해 적합하게 나누어진 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수되거나 수성일 수 있다. 본 발명에 기재된 키트는 개별 제형에 따라 본 발명에서 개시된 것과 같은 실온 또는 냉장 온도에서 보관될 수 있다.
상기 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 그 내로 조성물이 위치되고, 바람직하게는 적합하게 나누어진다. 추가 성분이 제공된다면, 상기 키트는 또한 일반적으로 그 내로 상기 제제 또는 성분이 놓여질 수 있는 하나 이상의 용기를 추가로 함유할 것이다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 판매를 위하여 가깝게 위치시킨 상기 제제, 조성물 및 임의의 다른 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 그 내로 원하는 바이알이 놓여지는 주사 또는 취입성형된(blow-molded) 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
[ 실시예 ]
하기 실시예는 본 발명에서 제공된 어떤 구현예를 설명하기 위하여 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술들은 본 발명에 개시된 수행방법(practice)이 잘 기능하는 것으로 밝혀진 기술들을 나타낸 것이며, 따라서 그 실행방법에 대한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 본 기술분야의 당업자에 의해 인식될 것이다. 그러나, 본 기술분야의 당업자는, 본 발명의 견지에서, 개시된 특정한 구현예에 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 점을 인식하여야 한다.
액상에서 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스의 기본 안정성(base stability)
한 예시적인 방법에서, 액상에서 플라비바이러스의 열안정성을 조사하였다. 상기 방법에 따르면, 포스페이트-버퍼된 식염수(PBS) 내에 보관된 DEN-2 PDK 53 양친 백신 벡터의 기본 안정성을 상이한 온도에서 측정하였다(표 1). 한 예에서, 총 부피 0.5 ㎖의 PBS에 있는 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 바이러스를 2 ㎖의 스크루 뚜껑 바이알 내에서 4℃, 실온(∼21℃) 또는 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양한 후, 베로 세포(Vero cell)에서 뉴트럴 레드(Neutral Red) 아가로즈 오버레이 플라크 적정 분석에 의해 바이러스의 역가 및 활성을 측정하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 4℃에서 PBS에서 배양된 DEN-2 PDK 53은 바이러스 역가가 평균 4배 감소되었으며, 동일한 기간 동안 37℃에서 배양되었을 때에는 바이러스 활성이 완전히 손실되었다. 상기 결과는 안정화시키는 부형제의 부재시에는 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스의 안정성이 상대적으로 취약하다는 것을 보여준다.
상이한 온도에서 24시간 동안 보관된 DEN-2 PDK 53 바이러스의 안정성
온도 제형 바이러스 역가 손실 백분율
4℃ PBS 75
∼21℃ PBS 78
37℃ PBS 100
조성물의 안정화 효과
어떤 예시적인 조성물에서, 살아있는 바이러스 백신의 열안정성을 도와주는 본 발명에 기재된 약학적으로 허용가능한 부형제는 본 기술분야에 알려져 있다. 한 예시적인 방법에서, 상이한 부형제의 안정화 효과를 평가하기 위한 기본 조성물로 PBS를 사용하였다. 상기 예에서, 각 부형제의 스톡(stock) 용액을 PBS 내에 만들었으며, 스톡 용액의 pH를 대략 6.8로 조정한 키토산을 제외하고는 NaOH를 이용하여 pH를 대략 7.1로 조정하였다. 표시된 최종 농도(w/v)(표 2)로 PBS 내에서 부형제를 희석하였다. 상기 방법에 따르면, 무혈청(serum-free) 배지 내의 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 바이러스에 0.5 ㎖의 각각의 조성물을 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 보관하였다. 배양 후, 전술한 바와 같이 베로 세포에서의 플라크 적정에 의해 바이러스 활성 및 역가를 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 이전의 실험 예에 필적하는 다양한 농도에서 단일 부형제를 포함하는 조성물의 안정화 효과는 최소였다. 그러나, 예를 들면 트레할로오스 및 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)과 같은 일부 부형제는 37℃에서 DEN-2 PDK 53 바이러스를 안정화시키는데 다른 것들보다 보다 효과적이었다. 또한, 표 2에 나타낸 연구 결과는 rHSA 및 트레할로오스를 포함하는 몇 가지 부형제의 증가된 안정화 효과가 이들 부형제의 특정 농도 범위 내에서 얻어질 수 있음을 보여주었다. 상기 특별한 예에서, 트레할로오스는 15%(w/v) 이상의 농도에서, F127은 0.5 및 3% 사이의 농도에서 보다 효과적이었다.
37℃에서 24시간 보관될 때, DEN-2 PDK 53의 안정성에 대한 상이한 부형제의 효과
제형 바이러스 역가 손실 백분율
PBS 100.0
10% 수크로오스 99.9
15% 수크로오스 98.3
20% 수크로오스 96.4
25% 수크로오스 93.4
2% 트레할로오스 98.3
5% 트레할로오스 97.0
10% 트레할로오스 93.3
15% 트레할로오스 83.3
2% 만니톨 100.0
5% 만니톨 100.0
10% 만니톨 99.8
15% 만니톨 86.7
5% 솔비톨 100
10% 솔비톨 99.9
15% 솔비톨 99.9
1% 폴리비닐 피롤리돈 100.0
5% 폴리비닐 피롤리돈 100.0
10% 폴리비닐 피롤리돈 100.0
0.2% F127 99.6
0.5% F127 99.6
1% F127 99.5
2% F127 99.5
10% F127 99.9
0.1% rHSA 91.2
0.5% rHSA 95.0
1.0% rHSA 89.0
3.0% rHSA 89.0
5.0% rHSA 97.5
0.05% 키토산 99.0
0.1% 키토산 99.0
특정한 조합의 부형제를 포함하는 조성물의 안정화 효과
하기 예시적인 절차에서, 양친 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스 백신에 대한 안정화 효과를 확인하기 위하여, 상이한 조합 및 농도로 다중의 부형제를 포함하는 조성물을 검사하였다. 실시예 2에 개시된 바와 같이 표시된 최종 농도로 PBS 내에서 스톡 용액으로부터 부형제를 희석하였다. 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 백신 바이러스를 0.5 ㎖의 각각의 조성물에서 37℃에서 21시간(도 1) 또는 48시간 이상(도 2)의 기간 동안 배양하였다. 상기 특정한 시간 간격에서, 실시예 1에 개시된 것과 같은 플라크 적정 분석에 의해 바이러스 역가 및 활성을 측정하였다. 도 1은 이러한 설명의 예시적인 결과를 나타낸 것으로서, 투입된 것에 대한 배양 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현되며, 도 2에서는 log10 역가 손실로 표현된다. 상이한 조합의 부형제 분석 결과, 본 특별한 예시에서는 사카라이드, 플루로닉 코폴리머, 비이온성 계면활성제 및 단백질로 이루어진 제형은 37℃에서 최적으로 DEN-2 PDK 53의 안정성을 개선하는 것으로 나타났다. 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 제형은 최고의 안정화 효과를 가졌다. 예상 밖에도, 상기 2가지 부형제의 조합된 안정화 효과는 각각의 개별 성분에서 관찰된 합보다 훨씬 더 컸는데, 이는 이들 성분 사이에 상승작용이 있음을 제시한다. 트레할로오스, F127 및 rHSA 조합의 상승작용 활성을 통해 얻어진 DEN-2 PDK 53 플라비바이러스의 개선된 열안정성은 종래기술의 예에 기초해서는 예측되지 않았다. 도 1 및 도 2는 또한 트레할로오스/F127/rHSA 혼합물의 안정화 효과가 0.05% 키토산을 첨가함으로써 추가로 향상된다는 것을 나타낸다. 도 2는 37℃에서 48시간 이상의 기간 동안 보관될 때, 바이러스 불활성화 속도가 트레할로오스, F127 및 rHSA를 함유하는 조성물에 의해 현저하게 감소된다는 것을 보여준다. 본 기술분야의 예에서는 플라비바이러스의 안정성이 Ca2 + 및 Mg2 + 2가 양이온을 함유하는 제형에 의해 향상될 수 있음을 제시한다. 그러나, 도 1 및 도2에 나타난 바와 같이, 제형에 Ca2 +(0.0009 M) 및 Mg2+(0.0005M)를 첨가하는 것은 추가적인 안정화 효과를 주지 않는다. 도 2의 결과는 2가 양이온의 추가하면 특별한 구현예의 문맥(context)에서 장기간의 액상 바이러스의 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 제시한다.
한 예시적인 방법에서, 다중 플라비바이러스를 이용한 안정화 특성에 대해 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 조성물을 평가하였다. 서나일(DEN-2/WN), 뎅기 1(DEN-2/D1), 뎅기 3(DEN-2/D3) 또는 뎅기 4(DEN-2/D4) 바이러스 중 어느 하나 유래의 막 및 외피 단백질을 발현하는 키메라 DEN-2 플라비바이러스의 안정성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 표 3에 예시된 결과는 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 조성물 내에 보관될 때 모든 키메라 플라비바이러스의 액상 안정성이 크게 개선되었음을 보여준다. 상이한 키메라는 3가지 혈청적으로 구별되는 플라비바이러스 유래의 상이한 외피 및 막 단백질을 발현한다. 또한, 서나일 바이러스 및 뎅기 바이러스는 현저하게 분기한다(divergent). 상기 결과는 본 발명의 조성물은 플라비비리대 과뿐만 아니라 다른 바이러스 과의 다양한 일원의 액상 안정화에 유용할 수 있음을 제시한다. 실시예 1에 약술한 대표적인 절차에 의해 실온(∼21℃) 및 4℃에서 플라비바이러스를 안정화시키는 능력을 조사하였다. 표 4에 나타낸 예시적인 결과는 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 조성물이 21℃에서 7일 동안 및 4℃에서 48일 동안 바이러스 활성을 효과적으로 보존한다는 것을 나타낸다.
PBS, 또는 15% 트레할로오스, 2% F127 및 1% rHSA를 포함하는 조성물(F1)에서 21시간 동안 37℃에서 보관된 상이한 키메라 플라비바이러스의 안정성
바이러스 제형 남아있는 바이러스 역가(%)
DEN-2/WN PBS 2
F1 45
DEN-2/D1 BPS 0.2
F1 22
DEN-2/D3 BPS 0.3
F1 30
DEN-2/D4 BPS 1
F1 28
PBS, 또는 15% 트레할로오스, 2% F127 및 1% rHSA를 포함하는 조성물(F1)에서 7 또는 48일 동안 상이한 온도에서 보관된 플라비바이러스의 안정성
바이러스 온도 제형 남아있는 바이러스 역가(%)
7일 48일
DEN-2 PDK-53 21℃ PBS 0 0
21℃ F1 100 0
4℃ BPS 0 0
4℃ F1 100 100
DEN-2/WN 21℃ BPS 0 0
21℃ F1 100 0
4℃ BPS 0 0
4℃ F1 100 100
대체 성분의 이용
rHSA 및 상이한 플루로닉 코폴리머의 안정성에 대한 소 혈청 알부민(BSA) 및 젤라틴의 안정화 효과를 비교하기 위하여 다른 예시적인 방법을 사용하였다. 실시예 1 및 실시예 2에서 이미 약술한 바와 같은 DEN-2 PDK 53 바이러스 안정성 분석을 수행하였다. 전술한 실시예들은 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 제형이 DEN-2 PDK 53 양친 백신 바이러스의 열안정성을 선택적으로 개선한다는 것을 제시하였다. 도 3의 예에 나타난 바와 같이, 소 혈청 알부민의 안정화 효과는 단독으로든 또는 트레할로오스 및 F127과의 조합으로든 rHSA의 안정화 효과에 필적하였다. 도 3은 또한 단리된 부형제로서, 젤라틴은 37℃에서 DEN-2 PDK 53을 안정화시키는데 있어 rHSA에 필적한다는 것을 보여준다. 그러나, 상기 예시적인 방법에서는 젤라틴은 BSA와 달리 트레할로오스 및 F127을 모두 함유하는 조성물에서는 rHSA의 효과적인 대체물인 것으로 보이지 않는다. 따라서, 플라비바이러스 백신의 안정화를 돕기 위해 rHSA 이외의 단백질이 트레할로오스 및 F127과 조합되어 사용될 수 있지만, 혈청 알부민 또는 매우 연관된 단백질을 사용하는 것이 예시적인 방법에 따라서는 보다 적합하다. 또한, 도 3은 단리된 부형제로서 폴리머 플루로닉 P123이 DEN-2 PDK-53 바이러스를 안정화시키는 능력에 있어서 플루로닉 F127에 필적한다는 것을 보여준다. 그러나, 상기 예시적인 방법에서, P123은 트레할로오스 및 혈청 알부민을 모두 함유하는 조성물에서는 F127에 대한 효과적인 대체물인 것으로 보이지 않는다. 도 4에 예시된 바와 같이, 트레할로오스, rHSA 및 플루로닉 코폴리머 대신에 폴리솔베이트 20(Tween 20)과 같이 보통 사용되는 다른 약학적 계면활성제를 함유하는 조성물은 플루로닉 코폴리머를 함유하는 제형과 비교하여 상대적으로 DEN-2 PDK 53을 안정화시키는데 효과적이지 않다. 이들 예시적인 방법은 독특한(distinct) 고분자량 플루로닉 코폴리머 계면활성제를 함유하는 제형의 안정화 효과가 더 낫다는 것을 제시한다.
도 4에서 예시적인 데이터를 추가로 설명한다. 도 4는 상이한 계면활성제를 함유하는 조성물에서 DEN-2 PDK 53 바이러스의 안정성을 보여준다. 각각의 제형에서 37℃에서 23시간 동안 DEN-2 PDK53을 보관하였다. 본 예에서 평가된 계면활성제는 n-옥틸-β-D-글루코피라노시드(β-OG), 폴리솔베이트 20(P 20), 폴리솔베이트 80(P 80) 및 F127(F)을 포함한다. 다른 제형 성분들은 트레할로오스(T) 및 rHSA(A)를 포함한다. 수치는 투입 역가에 대하여 배양 후 남아있는 바이러스 역가의 백분율로 표현된다.
상이한 조성물의 안정화 효과 비교
한 예시적인 조성물의 안정화 특성을 본 기술분야에 알려진 조성물과 비교하였다. 본 기술분야에 개시된 살아있는 플라비바이러스 백신에 대한 안정화 조성물(미국 특허 제4,500,512호)은 PBS 내에서 4% 락토오스, 2% 솔비톨, 0.1 g/ℓ CaCl2, 0.076 MgSO4 및 0.0005 M 내지 0.05 M 범위의 아미노산을 포함한다. Adebayo 등에 의해 보고된 다른 조성물(1998)은 10% 수크로오스, 5% 락트알부민, 0.1 g/ℓ CaCl2, 0.076 g/ℓ MgSO4로 이루어져 있다. 한 예시적인 방법에서, 이들 제형의 안정화 특성을 본 발명의 특별한 구현예와 비교하였다. 한 예시적인 조성물인 F1에서, 상기 조성물은 15% 트레할로오스, 2% F127 및 1% 재조합 HSA를 포함한다. F2는 아미노산이 제외된 미국 특허 제4,500,512호의 제형이고, F3은 아미노산인 히스티딘 및 알라닌을 갖는 동일한 제형이다. F4는 Adebayo 등의 조성물이다. 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 백신 바이러스를 0.5 ㎖의 각 조성물 내에서 37℃에서 23시간 동안 배양한 후, 실시예 1에 개시된 바와 같이 바이러스 활성 및 역가를 분석하였다. 도 5에 예시된 바와 같이, 예를 들면 제형 F1과 같은 일부 구현예는 전술한 조성물에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 개시된 예에서, 바이러스 활성은 본 기술분야에 알려진 제형(제형 F3 및 F4)에 보관된 후에는 실질적으로 회복되지 않는 반면, 본 발명에 개시된 조성물에 보관된 후에는 최초 바이러스 역가의 50% 이상이 회복되었다. 상기 결과는 이전의 제형들은 액상으로 보관하는 동안에 살아있는 바이러스 백신의 안정성을 촉진하는데 효과적이지 않다는 것을 보여준다.
다중 냉동-해동 후의 바이러스 활성 보존
한 예시적인 방법에서, 선택된 조성물이 냉동-해동 사이클 후에 바이러스 활성을 보존하는 능력을 나타내었다. 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 백신 바이러스를 스크루 뚜껑 바이알 내에서 0.5 ㎖의 각 조성물 내에 현탁시켰다. 첫 번째 냉동-해동 사이클 바이알은 -80℃에서 24시간 동안 냉동시키고 37℃에서 신속하게 해동시켰다. 그 즉시 상기 바이알을 -80℃에서 1시간 동안 냉동 및 37℃에서 신속하게 해동하는 두 번째 냉동-해동 사이클을 수행하였다. 이후, 실시예 1에 개시된 바와 같은 플라크 역가 분석에 의해 바이러스 역가 및 활성을 평가하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 특별한 조성물은 2회의 냉동-해동 사이클을 통해서도 완전한 바이러스 활성을 효과적으로 보존하였다. 아울러, 이들 2가지 부형제를 포함하는 조성물은 한 가지 부형제만을 함유하는 것들에 비해 보다 효과적이었다. 상기 특별한 예시적인 실험 결과는 본 발명에 개시된 조성물 및 방법이 플라비바이러스 백신에 대한 효과적인 동결보존제이며, 동결건조, 스프레이 건조, 또는 다른 탈수 기술 동안에 바이러스의 보존을 촉진할 수 있음을 제시한다.
다른 살아있는 약독화된 바이러스의 안정화
상기에 예시된 실시예에서는 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 조성물에서 몇 가지 살아있는 약독화된 플라비바이러스의 효과적인 액상 안정화를 보여준다. 본 발명에서 개시된 조성물 또한 다른 살아있는 약독화된 바이러스를 안정화시키는데 효과적일 수 있음이 예측된다. 예를 들면, 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 제형은 살아있는 약독화된 홍역 바이러스, 약독화된 신드비스 바이러스, 약독화된 인플루엔자 바이러스, 재조합된 약독화된 아데노바이러스 또는 재조합된 약독화된 백시니아 바이러스를 안정화시키는데 사용될 수 있다. 한 예시적인 방법에서, 상기 비-플라비바이러스 바이러스들은 세포 배양으로부터 수확한 후 직접 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 조성물 내에 액상으로 현탁 및 유지될 수 있다. 다른 예시적인 방법에서, 비-플라비바이러스 바이러스들은 동결 또는 스프레이 건조 전 또는 후에 조성물 내에 현탁될 수 있다. 통계학적으로 개선된 바이러스의 안정성은 상기 구현예의 제형이 플라비바이러스 과 이외의 다른 약독화된 바이러스 백신에 적용될 수 있음을 나타낼 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 이후 다른 살아있는 약독화된 바이러스로 적용분야가 확장될 수 있음을 인식하고 있다.
안정성 및 생체내 면역원성
분형제와 분자성 또는 세포성 성분 사이의 분자적인 상호작용은 바이러스 백신의 안정성을 향상시킬 뿐만 아니라 생체내에서 세포 또는 조직의 손상 증가를 초래할 수 있다. 제형들은 살아있는 동물에서 이들 바이러스 백신의 면역원성을 줄일 수 있다. 상기 실시예에서, 예시적인 조성물은 피하 주사후에 안전하고, 본질적으로 면역적으로 불활성함을 보여준다. 실험을 위하여 아래와 같은 4가지 상이한 예시적인 조성물을 선택하였다.
제형 1: 15% 트레할로오스, 2% F-127, 1% rHSA
제형 2: 15% 트레할로오스, 2% F-127, 1% rHSA, 1 mM CaCl2/0.5 mM MgSO4
제형 3: 15% 트레할로오스, 2% F-127, 1% rHSA, 0.5% 키토산
제형 4: 22.5% 트레할로오스, 3% F-127, 1.5% rHSA
제형 5: PBS
본 발명에 개시된 어떤 구현예에서, 8 또는 9마리 NIH 스위스 마우스 군을 0일(d0)에 1×105 pfu의 제형화된 DEN-2 PDK-53/WN 재조합 플라비바이러스 백신으로 피하 주사함으로써 면역시키고, d29에 동일하게 제형화된 백신으로 부스트(boost)시킨 후, d45에 103 pfu의 병원성 서나일 균주(NY99)로 공격(challenge)하였다. 대조군 마우스(8마리의 4개 군)는 바이러스 없이 제형 1-4만을 접종하였다. 어떠한 면역화된 마우스에서도 투여 후 부작용은 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 실시예에서, 백신 바이러스가 존재하거나 존재하지 않는 예시적인 제형에 의해서는 명확한 부작용이 초래되지 않는다. d0에 면역화하기 전, d28에 부스트하기 전, d44에 공격하기 전 및 공격한 후 d75에 혈청을 수집하였다. 상기 혈청에서 서나일 중성화 항체의 역가를 플라크 감소 중성화 검사(plaque reduction neutralization test, PRNT)에 의해 측정하였다. 본 연구의 결과는 표 5에 나타나 있다.
제형화된 DEN2/WN 백신에 의해 유도된 중성화 항체 및 보호
프라임 후
(dd28)		 부스트 후
(d44)		 공격 후
(d75)
제형 수 GMT1 % SC2 GMT % SC GMT % SC 생존 % 생존
1 8 30 87.5 123 100 761 100 8/8 100
2 8 10 62.5 226 100 830 100 8/8 100
3 8 40 100 123 100 1810 100 8/8 100
4 9 10 66.7 137 100 1660 100 8/9 88.9
5 9 10 66.7 109 100 1742 100 9/9 100
대조군 32 1 0 1 0 1280 100 7/32 21.9
1GMT=기하평균 역가; 10 미만의 역가는 임의적으로 1의 값을 지정하였음.
2%SC=10 초과의 PRNT 역가를 갖는 혈청-변환된 동물의 백분율.
상기 DEN-2/WN 백신을 제공받은 대부분의 동물들은 제형이 사용되지 않거나(제형 5) 예시적인 제형(제형 1-4) 중 하나가 사용된 것과 무관하게 첫 번째 도스 후 혈청-변환되었다. 또한, 백신화된 동물 모두는 부스터 투여 후 혈청-변환되었다. 기하평균 PRNT 역가(GMT)는 상기 백신 군들 사이에 거의 차이가 없음을 나타낸다. 역가는 처음 면역화 후에는 낮았고, 부스트 후에는 3-10배 증가하였으며, 이후 공격시 급격한 면역기억 반응(anamnestic response)을 나타내었다. 모든 백신화된 동물들은 백신의 제형과는 독립적으로 공격에 대해 100% 생존하였다. 대조군 동물들은 단지 22%만이 생존하였다; 생존한 것들은 공격 후 잠재적인 중성화 항체 반응의 증거를 보였다. 한가지 이점은 본 실시예는 상기 예시적인 제형이 마우스에서 서나일 질병을 방지하기 위한 예시적인 재조합 DEN-2/WN 백신의 능력을 감소시키지 않음을 나타낸다는 것이다.
다른 예에서, 25℃ 또는 4℃에서 다양한 기간 동안 보관된 서나일 키메라 플라비바이러스를 안정화시키기 위하여 트레할로오스, rHSA 및 F127을 함유하는 액체 조성물을 사용하였다. 1×104 pfu의 키메라 DEN-2/WN 백신 바이러스를 각각의 온도에서 배양하고, 실시예 1에 개시된 바와 같이 1주 또는 2주 간격으로 바이러스 활성을 평가하였다. 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 트레할로오스, rHSA 및 F127을 함유하는 제형은 각각 25℃ 및 4℃에서 보관하는 동안 상기 DEN-2/WN 백신 바이러스의 열안정성을 현저하게 개선하였다. 25℃에서, 바이러스 활성의 손실은 7일에 걸쳐 1 log 이하였다. 4℃에서, 트레할로오스, F127 및 rHSA를 포함하는 예시적인 제형에서 보관될 때, 바이러스 불활성화는 12주까지의 기간 동안 무시할 만하였다.
다른 예시적인 방법에서, 탈수된 DEN-2 PDK 53 백신과 함께 트레할로오스, rHSA 및 플루로닉 코폴리머를 포함하는 조성물의 안정화 효과를 나타내었다. 1×104 pfu의 DEN-2 PDK 53 백신 바이러스를 본 발명에 개시된 절차에 따라 제형화하였다. 제형화된 백신을 혈청 바이알에 위치시키고, 통상의 동결건조 절차를 수행하였다. 건조된 백신은 진공 하에 마개를 하고, 37℃ 또는 4℃에서 14일 동안 보관한 후, 멸균수를 첨가하여 그 원래 액체 부피로 백신을 재구성하였다. 상기 재구성된 백신의 바이러스 활성을 앞서 약술한 바와 같이 평가하였다. 37℃에서, 포스페이트 버퍼된 식염수 내에 제형화된 트레할로오스, rHSA 및 플루로닉 코폴리머를 함유하는 조성물의 존재 하에, 1 log의 평균 바이러스 역가 손실이 관찰되었다(도 9). 4℃에서 14일 동안 보관된 제형화된 탈수 DEN-2 PDK 53 바이러스 백신의 경우에는 바이러스 활성의 손실이 관찰되지 않았다. 상기 결과는 본 발명에 개시된 조성물을 이용한 탈수된 바이러스 백신이 효과적으로 보존됨을 나타낸다.
도 9는 상이한 온도에서 동결건조된 DEN-2 PDK 53의 안정성을 나타낸다. 37℃ 또는 4℃에서 2주 동안 배양한 후 제형화된 동결건조 DEN-2 PDK 53 백신 바이러스의 log 역가 손실을 표시하였다. 제형 F1(15% 트레할로오스, 2% F127, 1% rHSA) 및 F2(15% 트레할로오스, 2% F127, 0.01% rHSA)는 포스페이트 버퍼된 식염수 내에 제형화되었다. 제형 F3(15% 트레할로오스, 2% F127, 0.01% rHSA)은 10 mM 트리스 염기 내에 제형화되었다.
본 명세서에 개시 및 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 견지에서 과도한 실험없이 만들어지고 수행될 수 있다. 상기 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 개시되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 상기 조성물 및 방법 및 본 발명에 개시된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 도입될 수 있음은 본 기술분야의 당업자에게 있어서 자명하다. 보다 구체적으로, 화학적 및 물리적으로 모두 연관된 어떤 제제가 본 발명에 개시된 제제 대신 치환되어서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다. 본 기술분야의 당업자에게 자명한 이러한 유사한 치환체 및 변형들 모두 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 정신, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.
특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 조약을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 본 출원에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 그 전체가 인용에 의해 명백하게 본 발명에 포함되어 있다.

Claims (26)

  1. 하나 이상의 살아있는 약독화된 뎅기바이러스; 및
    혈청 알부민과 트레할로오스를 포함하는 안정화 조성물;
    을 포함하고,
    37℃에서 21시간 보관될 때 상기 약독화된 뎅기바이러스의 잔존 역가가, 상기 혈청 알부민과 트레할로오스 중 어느 하나만을 이용하는 경우에 비해 3배 이상 향상되는 것인, 살아있는 약독화된 뎅기바이러스 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 안정화 조성물은 수성 형태인 뎅기바이러스 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 안정화 조성물은 부분적으로 또는 전체적으로 탈수된 뎅기바이러스 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈청 알부민은 척추동물 종으로부터 유래된 혈청 알부민인 뎅기바이러스 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화 조성물은 염을 더 포함하는 뎅기바이러스 조성물.
  8. 혈청 알부민과 트레할로오스를 포함하는 안정화 조성물과, 하나 이상의 살아있는 약독화된 뎅기바이러스를 조합하는 단계;를 포함하고,
    37℃에서 21시간 보관될 때 상기 약독화된 뎅기바이러스의 잔존 역가가, 상기 혈청 알부민과 트레할로오스 중 어느 하나만을 이용하는 경우에 비해 3배 이상 향상되는 것인, 살아있는 약독화된 뎅기바이러스 조성물의 불활성화를 감소시킬 수 있는 방법.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 살아있는 약독화된 뎅기바이러스와 상기 안정화 조성물의 조합물을 부분적으로 또는 전체적으로 탈수시키는 단계;를 더 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 살아있는 약독화된 뎅기바이러스와 상기 안정화 조성물의 조합물을 개체에 투여하기 전에, 상기 조합물을 부분적으로 또는 전체적으로 재-수화시키는 단계;를 더 포함하는 방법.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 살아있는 약독화된 뎅기바이러스의 불활성화의 감소는 한 번 이상의 냉동 및 해동 사이클 동안에도 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 뎅기바이러스 조성물을 포함하는, 뎅기바이러스 감염의 개시를 감소시키거나 방지하기 위한 약학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 적어도 하나의 용기; 및
    혈청 알부민과 트레할로오스를 포함하는 안정화 조성물 내의, 하나 이상의 살아있는 약독화된 뎅기바이러스;
    을 포함하고,
    37℃에서 21시간 보관될 때 상기 약독화된 뎅기바이러스의 잔존 역가가, 상기 혈청 알부민과 트레할로오스 중 어느 하나만을 이용하는 경우에 비해 3배 이상 향상되는 것인, 살아 있는 약독화된 뎅기바이러스의 불활성화를 감소시키는 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 혈청 알부민은 척추동물 종으로부터 유래된 혈청 알부민인 키트.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
KR1020187009180A 2007-04-06 2008-04-04 살아있는 약독화된 바이러스를 위한 방법 및 조성물 KR102134980B1 (ko)

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