CN103877565A - 治疗膀胱癌的基因针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗膀胱癌的基因针剂及其制备方法，每1L基因针剂由以下体积量的成分组成：IFN-β0.8mL-1.2mL，人血白蛋白0.2mL-0.3mL，溶解了4.5-5.2g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液380mL-480mL，余量为医用注射用水。本发明基因针剂通过腺病毒载体的扩增和纯化、动物体内验证IFN-β基因可用性和基因针剂制备步骤制得。本发明采用AdhIFN-β诱导膀胱癌细胞在动物体内的凋亡，为人膀胱癌的治疗提供理论依据；本发明基因针剂安全、高效、易用，制备方法简单。

Description

治疗膀胱癌的基因针剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗膀胱癌的基因针剂及其制备方法，属于生物医学工程技术领域。

背景技术

世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，不同人群的膀胱癌组织类型不同目前膀胱癌的治疗，多以手术治疗辅以化疗为主。肌层浸润性膀胱癌根治性膀胱切除术后，高达50%的患者会出现转移，与传统放化疗大面积无选择的杀伤肿瘤及正常组织不同，基因治疗有选择的作用于肿瘤细胞，组织特异性调控序列和单链抗体的靶向治疗是解决这一问题的有效策略。

干扰素IFN是一个通过调节天然糖蛋白来调整细胞生长和分化的家族，干扰素IFN抑制癌基因的表达，上调凋亡，激活淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞，干扰素毒副作用较丝裂霉素、卡介苗BCG小，且作用比较显著。

腺病毒(adenovirus，Ad)是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，腺病毒由于宿主范围广，对人致病性低，在基因治疗、基因免疫等方面应用开发得较好的一种基因载体，在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因，能有效进行增殖，滴度高，与人类基因同源，不整合到染色体中，无插入致突变性，能在悬浮培养液中扩增，能同时表达多个基因等诸多优点，近年来受到广泛关注，被认为是很有潜力的基因治疗载体。

张辉等人（干扰素-β基因对人膀肌移行细胞癌系253JB-V^R体外增殖及凋亡的影响，山东医药，2008年第48卷第8期）以重组腺病毒AdhIFN-β转染人膀胱移行细胞癌细胞TCC系253JB—V^R，应用RT-PCR检测hIFN-β基因在253JB-V^R中的表达，应用细胞生长抑制试验、集落形成能力试验检测hIFN-β基因对253JB-V^R细胞体外增殖的影响，为膀胱癌的基因治疗提供理论依据。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗膀胱癌的基因针剂。

本发明的另一目的还在于提供一种治疗膀胱癌的基因针剂的制备方法。

本发明的原理：腺病毒Ad转染干扰素IFN-β，使hIFN-β基因导入膀胱肿瘤细胞253J B-V^R中，在253J B-V^R中表达hIFN-β蛋白，hIFN-β蛋白能有效刺激机体的特异性抗肿瘤免疫反应，从而发挥抑制细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡的作用，对正常细胞则无损伤。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1 L基因针剂由以下体积量的成分组成：IFN-β0.8 mL-1.2 mL，人血白蛋白0.2 mL -0.3 mL，溶解了4.5-5.2 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液380 mL-480 mL，余量为医用注射用水。

所述IFN-β的基因在动物体内转染膀胱移行细胞癌细胞TCC系253J B-V^R并成功表达，诱导膀胱肿瘤细胞253J B-V^R凋亡。

所述磷酸缓冲溶液是浓度为0.01 mol/L，pH值为7.0-7.2的磷酸钠或者磷酸钾缓冲溶液。

所述基因针剂为淡白色澄清液体。

本发明基因针剂使用时，从-20℃取出，待完全融化后，轻轻混匀，尽量勿使药液沾染瓶盖，对直径≥4 cm 的肿瘤，用生理盐水稀释至4 mL。

所述基因针剂注射方法为静脉注射、肌内注射、皮下注射或者瘤内注射。

所述基因针剂的用法与用量：放射治疗前72 h开始注射，一周1 次，每次1012VP，4周为一个疗程。

一种治疗膀胱癌的基因针剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）腺病毒载体的扩增和纯化

A. 在DMEM完全培养液中接种HEK293细胞，当HEK293细胞生长至80-90%，用无血清DMEM将细胞清洗2-3次；

B. 将无血清DMEM稀释的未经扩增和纯化的AdhIFN-β加入到步骤a培养得到HEK293细胞中，轻轻晃动使其均匀铺满瓶底，置37℃，5%CO₂孵箱中培养1-2 h，加入DMEM完全培养液继续培养，3-5 d后，当所有细胞均出现细胞病变效应CPE时，收集细胞于离心管中，以5000 r/min离心5 min，弃上清；5%DMEM重悬，弃上清，收集下层悬浊液；

C. 将步骤b得到的悬浊液在液氮和37℃反复冻融3次，使细胞破裂释放病毒，台式离心机上16000 r/min离心10 min，去除细胞碎片，收集病毒上清，-80℃保存；

D. 按腺病毒纯化试剂盒说明书纯化并浓缩病毒；

（2）动物体内验证IFN-β基因可用性

以重组腺病毒AdhIFN-β转染受试动物膀胱移行细胞癌细胞TCC系253J B-V^R，局部或全身注射0.5-1h，重组腺病毒开始进入肿瘤细胞，3 周后，重组腺病毒DNA 被降解；

（3）基因针剂的制备

a. 配制磷酸盐缓冲溶液；称取8.5 g NaCl、2.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.38 g NaH₂PO₄·2H₂O，用1L医用注射用水溶解，调pH值为7.0-7.2，浓度为0.01 mol/L，然后在118-122℃条件下湿热灭菌20-40 min；

按所述的基因针剂的组成准备合适量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸盐缓冲溶液； 

b. 将聚甜素溶解在380-480 mL步骤a的磷酸盐缓冲液中，加入IFN-β，然后医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，氢氧化钠溶液或者磷酸溶液调节PH值为7.0-7.2，用0.22 μm微孔滤膜对混合溶液过滤，得到混合溶液Ⅰ；

c. 人血白蛋白加入20-50 mL注射用水中溶解，医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，得到混合溶液Ⅱ；

d. 混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ混合，用0.22 μm微孔滤膜过滤混合溶液，即得本发明基因针剂；

e. 2 mL 西林瓶包装基因针剂，每小盒装1 支，每支含重组腺病毒hIFN-β基因颗粒1012VP。

步骤（1）所述DMEM培养液含200 mM的L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，培养液pH值为7.2，-20℃贮存备用。

本发明的积极有益效果：

1. 本发明采用AdhIFN-β诱导膀胱癌细胞在动物体内的凋亡，为人膀胱癌的治疗提供理论依据；

2. 本发明基因针剂安全、高效、易用，制备方法简单。

具体实施方式

下面结合一些具体实施例对本发明进一步说明。

材料及来源

HEK293细胞、253J B-V^R 人膀胱TCC细胞，2012年5月，中国医学科学院；

IFN-β、AdhIFN-β重组腺病毒、hIFN-β基因重组腺病毒载体，2012年3月，郑州大学消化疾病研究所；

空载体病毒AdGep，2012年5月，郑州大学第二附属医院；

小鼠，购自天津医科大学动物实验中心。

基因针剂

实施例1 

一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1L针剂组成为：1 mL IFN-β，0.2 mL人血白蛋白，溶解了5.04 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液450 mL，余量为医用注射用水。

实施例2 

一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1L针剂组成为：0.8 mL IFN-β，0.3 mL人血白蛋白，溶解了4.5 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液480 mL，余量为医用注射用水。

实施例3

一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1L针剂组成为：1.2 mL IFN-β，0.25 mL人血白蛋白，溶解了4.62 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液380 mL，余量为医用注射用水。

实施例4

 一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1L针剂组成为：0.9 mL IFN-β，0.21 mL人血白蛋白，溶解了5.2 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液400 mL，余量为医用注射用水。

实施例5

一种治疗膀胱癌的基因针剂，每1L针剂组成为：1.1 mL IFN-β，0.26 mL人血白蛋白，溶解了4.93 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液420 mL，余量为医用注射用水。

制备方法

实施例1

上述基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制磷酸盐缓冲溶液：称取8.5 g NaCl、2.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.38 g NaH₂PO₄·2H₂O，用1L医用注射用水溶解，调pH值为7.0，浓度为0.01 mol/L，然后在121℃条件下湿热灭菌30 min； 

按基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的组成准备合适量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸盐缓冲溶液； 

（2）将聚甜素溶解在磷酸盐缓冲液中，加入IFN-β，然后医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，氢氧化钠溶液或者磷酸溶液调节pH值为7.0，用0.22 μm微孔滤膜对混合溶液过滤，得到混合溶液Ⅰ；

（3）人血白蛋白加入50 mL医用注射用水中溶解，然后用医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，得到混合溶液Ⅱ；

（4）将Ⅰ和Ⅱ溶液混合，得到Ⅰ和Ⅱ的混合溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤混合溶液，即得本发明基因针剂。

实施例2

上述实施例1-5任意之一所述的基因针剂的制备方法，包括以下步骤：

上述基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制磷酸盐缓冲溶液：称取8.5 g NaCl、2.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.38 g NaH₂PO₄·2H₂O，用1L医用注射用水溶解，调pH值为7.1，浓度为0.01 mol/L，然后在118℃条件下湿热灭菌40 min；

按基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的组成准备合适量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸盐缓冲溶液； 

（2）将聚甜素溶解在磷酸盐缓冲液中，加入IFN-β，然后医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，氢氧化钠溶液或者磷酸溶液调节pH值为7.1，用0.22 μm微孔滤膜对混合溶液过滤，得到混合溶液Ⅰ；

（3）人血白蛋白加入20 mL医用注射用水中溶解，然后用医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，得到混合溶液Ⅱ；

（4）将Ⅰ和Ⅱ溶液混合，得到Ⅰ和Ⅱ的混合溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤混合溶液，即得本发明基因针剂。

实施例3

上述基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制磷酸盐缓冲溶液：称取8.5 g NaCl、2.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.38 g NaH₂PO₄·2H₂O，用1L医用注射用水溶解，调pH值为7.2，浓度为0.01 mol/L，然后在122℃条件下湿热灭菌20 min；

按基因针剂实施例1-5任意之一所述的基因针剂的组成准备合适量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸盐缓冲溶液；  

（2）将聚甜素溶解在磷酸盐缓冲液中，加入IFN-β，然后医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，氢氧化钠溶液或者磷酸溶液调节pH值为7.2，用0.22 μm微孔滤膜对混合溶液过滤，得到混合溶液Ⅰ；

（3）人血白蛋白加入40 mL医用注射用水中溶解，然后用医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，得到混合溶液Ⅱ；

（4）将Ⅰ和Ⅱ溶液混合，得到Ⅰ和Ⅱ的混合溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤混合溶液，即得本发明基因针剂。

使用方法：从-20℃取出，待完全融化后，轻轻混匀，尽量勿使药液沾染瓶盖，对直径≥4cm 的肿瘤，用生理盐水稀释至4 mL。

所述基因针剂的用法与用量：放射治疗前72 h开始注射，一周1 次，每次1012VP，4周为一个疗程。

动物试验

实验分为四组：A空白对照组（注射生理盐水）、B高剂量药物组（每次2024VP）、C中剂量药物组（每次1012VP）和D低剂量药物组（每次506VP）。

小鼠（购自天津医科大学动物实验中心）24只，6～8 周龄，雌性，体重16-20g，每一组6只，动物均为自由饮水采食。

253J B-V^R用0.025%胰蛋白酶和0.01%依地酸EDTA溶液采集253J B-V^R 人TCC肿瘤细胞，培养液CMEM中单层培养，轻敲培养瓶分离细胞，细胞培养液CMEM洗涤，再次在HBSS 中悬浮，然后选取对数生长期253J B-V^R 人TCC肿瘤细胞-80℃冻存24h，移入液氮内保存；所述培养液CMEM含200 mM的L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素和10%胎牛血清；

收集培养的253J B-V^R 人TCC肿瘤细胞细胞，使用PBS稀释至细胞数1.5×10⁸/mL，接种于小鼠腋下，每只小鼠的接种量为0.1 mL，肿瘤接种后第6天，肿瘤直径达0.2 cm 左右时开始注射本发明实施例1制备的基因针剂，瘤内注射，一周1 次，观察小鼠体重、状态的变化。

从给药后裸鼠体重变化以及状态可见，A、C鼠进食和活动正常，体重比较稳定，而B和D组裸鼠状态萎靡不振，进食较少，试验结果表明，本发明基因针剂适当剂量用药可有效抑制肿瘤生长，在一定程度上提高了小鼠对药物的顺应性，不良反应有所降低。

细胞凋亡率的测定

试验分为三组：

实验组：AdhIFN-β转染253J B-V^R细胞组；

对照组：AdGep转染253J B-V^R细胞；

空白对照组：未转染细胞。

将用药后小鼠的肿瘤细胞在37℃，5% CO₂饱和湿度培养箱培养72h，取对数生长期的253J B-V^R细胞接种到六孔板中，每孔1×10⁶个细胞，细胞生长至80%，实验组和对照组分别加入AdhIFN-β和AdGep，对照组不需加入任何病毒，0.2%胰蛋白酶消化各组细胞，再加入完全培养基并使细胞分散均匀，离心，分别制备各组单细胞悬液；将细胞悬液移入1.5ml离心管中，4℃，500 r/min离心5 min，形成细胞团，移去上清液，冰预冷的PBS溶液清洗细胞2-3次，每管细胞数≥10⁶个，流式细胞仪检测，每组试验重复3次，计算细胞凋亡率，结果见表1。

表1 细胞凋亡率

1组与2组，1组与3组相比，P＜0.01 ；2组与3组相比，P＞0.05。

结果表明，本发明基因针剂作用后，小鼠膀胱肿瘤细胞凋亡率高，提高了小鼠的存活时间。

细胞生长抑制试验、集落形成能力试验检测hIFN-β基因对小鼠体内253J B-V ^R 细胞增殖的影响

试验分为三组：

实验组：AdhIFN-β转染253J B-V^R细胞；

对照组：AdGep转染253J B-V^R细胞组；

空白对照组：未转染细胞。

（1）MTT法测定转染AdIFN-β后对膀胱癌细胞253J B-V^R存活率和抑制率的影响

a. 把小鼠的膀胱癌细胞253J B-V^R接种于25 cm²的培养瓶中，待细胞生长至80%时，消化细胞调节浓度为1×10⁵ cell/mL，以每孔0.1 mL接种于96孔平底型培养板中，于37℃、5%CO₂孵育箱中培养1天；

b. 分别以 AdIFN-β、AdGep转染膀胱癌细胞253J B-V^R，空白对照组不加任何病毒，在细胞孵育箱中培养；

c. 每日同一时间取一块培养板，吸弃各孔上清，每孔加入100 μL培养液，然后加入5 mg/mL MTT溶液20 μL/孔，37℃继续孵育4 h后，吸弃各孔上清，加入分析纯DMSO150 μL/孔，室温下将培养板置于振荡器上振荡10 min使结晶完全溶解，酶联免疫检测仪在492nm波长下测定各孔吸光度（测定时以空白对照孔调零），每组试验重复3次，计算细胞生长抑制率。

荧光显微镜下观察AdhIFN-β感染的细胞从第3天开始体积变小、变形，细胞浆中出现空泡，贴壁细胞出现皱缩、变圆，随即脱落死亡，空白对照组及AdGFP感染组细胞无明显改变，感染AdhIFN-β的细胞孔中细胞数明显少于对照组，第3、5、7天的细胞生长抑制率分别为24.3%，42.5%，54.5%，与对照组比较有明显差异（P<0.05），AdGFP感染组3、5、7天的细胞生长抑制率为4.3%，4.2%，6.0%，AdGFP感染组与空白对照组比较无明显差异（P>0.05）。

（2）集落形成能力试验检测

分别制备1.2%和0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌，40℃放置；无菌制备出 2×DME， 37℃水浴保存；按1：1混合1.2%的琼脂糖和2×DME后，取3 mL混合液注入60mm平皿，冷却凝固，置CO₂溫箱中，备用。

用AdhIFN-β、AdGFP分别感染小鼠的膀胱癌细胞253J B-V^R细胞，空白着对照组不加任何病毒，24 h后消化细胞并计数，调节浓度为2×10³ cell /mL，按1：1比例在无菌试管中混合0.7%琼脂糖和2×DME，再向管中加入0.2 mL的小鼠的膀胱癌细胞253J B-V^R悬液（1×10³个细胞），充分混匀，注入已铺有1.2%的琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层，待上层琼脂凝固后，置入37℃ CO₂溫箱中，培养10天，每组试验重复3次，计算细胞克隆形成数，见表2。

表2 肿瘤细胞克隆形成率

1组与2组，1组与3组相比，P＜0.01；2组与3组相比，P＞0.05。

上述结果表明：dIFN-β 253J B-V^R与AdGFP  253J B-V^R、253J B-V^R相比，肿瘤细胞克隆形成能力明显下降；而AdGFP  253J B-V^R与253J B-V^R相比则无明显差异。

Claims (4)

1.一种治疗膀胱癌的基因针剂，其特征在于，每1 L基因针剂由以下体积量的成分组成：IFN-β0.8 mL-1.2 mL，人血白蛋白0.2 mL -0.3 mL，溶解了4.5-5.2 g聚甜素的磷酸盐缓冲溶液380 mL-480 mL，余量为医用注射用水。

2.根据权利要求1所述的一种治疗膀胱癌的基因针剂，其特征在于，所述IFN-β的基因在动物体内转染膀胱移行细胞癌细胞TCC系253J B-V^R并成功表达，诱导膀胱肿瘤细胞253J B-V^R凋亡。

3.根据权利要求1所述的一种治疗膀胱癌的基因针剂，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液是浓度为0.01 mol/L，pH值为7.0-7.2的磷酸钠或者磷酸钾缓冲溶液。

4.一种权利要求1所述的治疗膀胱癌的基因针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制磷酸盐缓冲溶液：称取8.5 g NaCl、2.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.38 g NaH₂PO₄·2H₂O，用1 L医用注射用水溶解，调pH值为7.0-7.2，浓度为0.01 mol/L，然后在118-122℃条件下湿热灭菌20-40 min；

按权利要求1所述的基因针剂的组成准备合适量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸盐缓冲溶液；

（2）将聚甜素溶解在380-480 mL步骤（1）的磷酸盐缓冲液中，加入IFN-β，然后医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，氢氧化钠溶液或者磷酸溶液调节pH值为7.0-7.2，用0.22 μm微孔滤膜对混合溶液过滤，得到混合溶液Ⅰ；

（3）人血白蛋白加入20-50 mL医用注射用水中溶解，然后用医用注射用水定容到500 mL，混合均匀，得到混合溶液Ⅱ；

（4）将Ⅰ和Ⅱ溶液混合，得到Ⅰ和Ⅱ的混合溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤混合溶液，即得本发明基因针剂。