KR20180041761A - 안정한 약독화된 재조합 뎅기 생백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약독화된 재조합 4가(tetravalent) 뎅기 생백신, 및 안정한 조성물의 제조 방법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는, 약독화된 재조합 뎅기 생(live) 바이러스, 안정화제, 벌킹제(bulking agent) 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물, 및 이러한 안정한 조성물의 사용 방법에 관한 것이며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 △30 및/또는 △31 결실된 또는 돌연변이화된 뎅기 균주로부터 생성된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특히 뎅기 바이러스(들)를 포함할 수 있는 동결건조된 생 약독화된 면역원성 및/또는 백신 조성물용 안정화제에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 이들 안정화제를 함유할 수 있는, 뎅기 바이러스(들)의 안정화된, 동결건조된 생 약독화된 면역원성 및/또는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 하기 개시내용에 기재되어 있거나 하기 개시내용으로부터 명백히 알 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

Description

안정한 약독화된 재조합 뎅기 생백신
본 발명은 약독화된 재조합 4가(tetravalent) 뎅기 생백신, 및 안정한 조성물의 제조 방법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는, 약독화된 재조합 뎅기 생(live) 바이러스, 안정화제, 벌킹제(bulking agent) 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물, 및 이러한 안정한 조성물의 사용 방법에 관한 것이며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 △30 및/또는 △31 결실된 또는 돌연변이화된 뎅기 균주로부터 생성된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특히 뎅기 바이러스(들)를 포함할 수 있는 동결건조된 생 약독화된 면역원성 및/또는 백신 조성물용 안정화제에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 이들 안정화제를 함유할 수 있는, 뎅기 바이러스(들)의 안정화된, 동결건조된 생 약독화된 면역원성 및/또는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 하기 개시내용에 기재되어 있거나 하기 개시내용으로부터 명백히 알 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
뎅기 바이러스(DENV)는 황열 바이러스(YFV), 웨스트 나일 바이러스(WNV), 일본 뇌염 바이러스(JEV) 및 진드기-매개 뇌염 바이러스를 포함하기도 하는 플라비비리대(Flaviviriade) 과(family)의 플라비바이러스(Flavivirus) 속의 구성원이다. 플라비바이러스 게놈은, 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유하는 11 kb의 단일-가닥, 양성-센스 RNA 분자이다. RNA는 다단백질로 번역되며, 이러한 다단백질은 적어도 10개의 유전자 생성물로 가공된다: 3개의 구조 단백질 - 뉴클레오캡시드 또는 코어(C), 프리멤브레인(prM; Premembrane) 및 외피(E), 및 7개의 비구조(NS) 단백질 - NS 1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B 및 5. 중화 검정법을 기반으로, 4개의 항원적으로 별개의 혈청형(DENV 1 내지 4)이 존재한다. 모든 혈청형은 무증상 징후뿐만 아니라 보다 중증의 및 치명적인 DHF 및 DSS를 유발하는 능력을 갖고 있다. DENV는 주로 숲모기(Aedes mosquito)(이집트 숲모기 및 흰줄 숲모기)에 의해 인간에 전파된다. 뎅기병의 유병률(prevalence)은 아시아-태평양 지역 및 아메리카에서 특히 높다. 4개의 모든 DENV 혈청형은 현재 이들 영역에서 순회하고 있다. 국제 여행 및 기후 변화가 증가함에 따라, 사람들은 전형적인 열대 및 아열대 영역을 넘어서 뎅기 감염의 위험에 처해 있다. 뎅기병은 가장 중요한 신생 벡터-매개 바이러스 질병들 중 하나가 되고 있다. 지난 20년간, 뎅기는 급속히 퍼져, 100여개가 넘는 나라들에서 풍토적이다. 추정상 매년 5,000만 건의 뎅기 감염이 세계적으로 발생하고 있으며, 그 중 약 500,000 건이 중증 뎅기이고, 20,000건이 사망에 이르는 사례이다. 대략, 전세계 인구의 2/5가 뎅기 감염의 위험에 처해 있다. 따라서, 많은 국가들의 정부들에게 뎅기열의 예방 및 치료는 중요한 과제이다.
뎅기는 특히 어린이의 생명 소실, 및 질병을 갖고 있는 세계 신생 경제에 대한 경제적 타격이라는 두 가지 측면에서 상당한 부담이 되어 왔다. 임의의 혈청형으로 인한 일차 감염은 해당되는 특정 혈청형에 대해 평생의(lifetime) 면역성을 유도할 것이지만, 상이한 혈청형으로 인한 후속적인 감염은 항체 의존적 증강(ADE; antibody dependent enhancement)으로 공지된 현상으로 인해 질병의 중증도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 4개의 모든 혈청형에 맞춘 효과적인 백신 후보의 개발은, 특히 가장 취약한 어린이 및 청소년에게 상당히 중요하고, 이러한 백신 후보는 안전하고 비용 효과적일 것이다.
이상적인 뎅기 백신은 상업적으로 실현 가능하기 위해 몇 가지 인자들을 충족시켜야 한다. 첫째, 백신은 ADE의 위험성을 감소시키기 위해 4개의 DENV 혈청형 각각에 대해 보호적이어야 한다. 둘째, 면역화는 안전해야 하고, 교차 반응성 항체 또는 교차 반응성 T 세포에 의해 유발되는 허용 불가능한 부작용을 유발하지 않아야 한다. 셋째, 백신을 가장 필요로 하는 개체에게 알맞은 가격이어야 한다. 뎅기 백신의 개발에 있어서 몇 가지 장애가 여전히 존재한다. 하나는, 복잡한 발병 기전이 완전히 이해되지 않고 있다는 점이다. 또 다른 장애는 적합한 동물 모델의 부족이다.
현재, 밀접하게 관련된 다수의 바이러스들에 이용 가능한 백신들이 존재하긴 하지만, 뎅기에 이용 가능한 라이선스(licensed) 백신은 존재하지 않는다. 세계 보건 기구는 뎅기 백신 및 치료제의 개발을 오랫동안 우선시 해왔다. 그러나 현재까지, 뎅기를 함유하는 임의의 종류의 백신 또는 치료의 비성공적인 개발로 인해, 현재까지 추구해 온 방식들은 벡터 조절 및 개체 예방 단계이었으며, 이들 방식은 지속하기 힘들 뿐만 아니라 비용이 많이 든다. 벡터 조절 프로그램은 뎅기 바이러스의 확산(spread)을 조절하기에 충분치 않다. 현실적인 대안의 부재 하에, 뎅기 백신의 개발은 공중 위생적으로 긴급한 사안이 되었다. 다른 바이러스 백신과 유사하게, 후보 뎅기 백신의 성공 또는 실패는 중화 항체에 전적으로 달려 있을 수 있다. 단일 DENV 유형으로 인한 감염은 동일한 바이러스 유형에 의한 감염에 대해 평생 동안의 항체 반응 및 견고한 보호를 초래하지만, 다른 뎅기 혈청형에게는 여전히 취약하다.
약독화된 생백신의 개발 노력은 효과적인 접근법들 중 하나로 간주된다. 야생형 뎅기 바이러스는, 면역 반응을 발생시키는 능력은 유지한 채 인간에서 사용되기 위해 조직 배양 시 계대배양에 의해 약독화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키메라(chimeric) 백신 후보는 뎅기 단백질을 이용하여 라이선스 황열 바이러스 백신을 변형시킴으로써 제조된다. 약독화된 생백신의 또 다른 중요한 특징은, 천연 감염 시의 반응을 매우 근접하게 모방하는 지속된 면역 반응을 유도하는 능력이다. 몇 가지 약독화된 뎅기 생백신 후보가 개발되어 왔으며, 인간 또는 비-인간 영장류에서 평가되어 왔다. 제1 약독화된 뎅기 생백신 후보는, 야생형 뎅기 바이러스를 마우스의 뇌에서 계대배양하고 인간용으로 약독화된 돌연변이체의 선별에 의해 개발된 숙주 범위 돌연변이체였다(문헌[Kimura, R. & Hotta, S. 1944 Japanese J Bacteriology 1 :96-99; Sabin, A.B. & Schlesinger, R.W. 1945 Science 101 :640; Wisseman, C.L. Jr. et al. 1963 A'n J Trop Med 12:620-623]). 이들 후보 백신 바이러스가 인간에서 면역원성이긴 하였지만, 세포 배양물에서의 이들의 불량한 성장은 추가의 개발을 단념시켰다. 부가적인 생 약독화된 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4 백신 후보는 조직 배양물에서 계대배양(문헌[Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25:554-9; Bancroft, W.H. et al. 1981 Infect Immuno 31:698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ 65:189-95; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33:684-9; 15Hoke, C.H. Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43:219-26; Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88]) 또는 화학적 돌연변이형성(문헌[McKee, K.T. Jr. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36:435-42])에 의해 개발되었다. 이들 접근법을 사용하여 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형 각각에 대해 약독화와 면역원성 사이의 만족할만한 균형을 달성하고 4개의 뎅기 바이러스 각각에 대해 안전하고 만족할만한 면역원성을 가진 4가 백신을 제형화하기는 것이 매우 어려운 것으로 입증되었다(문헌[Kanesa-thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19:3179-88; Bhamarapravati, N. & Sutee, Y. 2000 Vaccine 18 Suppl 2: 44-7]).
면역화의 목적은 4개의 혈청형 각각에 대한 장수명의(long-lived) 중화 항체 반응의 유도에 의해 뎅기 바이러스 질병에 대해 보호하는 것이다. 이형(heterotypic) 뎅기 바이러스에 대해 기존의 항체를 갖고 있는 인간에서 질병 중증도의 증가가 발생할 수 있기 때문에, 4개의 모든 혈청형에 대한 동시적인 보호가 필요하다. 이러한 면역화는 약독화된 바이러스 생백신을 이용하여 경제적으로 달성될 수 있다. 출원인들은 WO1993006214, WO2002095075, WO2003092592 및 WO2008022196에 보고된 바와 같이 이러한 백신을 성공적으로 개발하였다. 미국 아틀랜타주 소재의 미국 국립보건원(NIH)에서, 야생형 뎅기 바이러스 균주에 대한 약독화가, 바이러스 게놈의 3' 말단의 비번역 영역 내에서의 신규 30개 뉴클레오타이드 결실에 의해 유도되었다. 이러한 결실은 원숭이 및 인간에서의 몇 가지 연구들(1가 바이러스 균주를 이용한 I상 연구)에서 관찰된 바와 같이 바이러스 혈증(viremia)의 저하와 더불어 바이러스의 안전하고 완전한 약독화를 초래하였다.
생물학적 성분, 예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균류, 단백질, 폴리펩타이드, 당단백질, 특히 약독화된 생 미생물을 포함하는 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 이들 조성물이 제조되고 제형화되며 보관되는 조건에 크게 민감하다. 이러한 생물학적 성분은 화학적 반응(예를 들어, 가수분해, 탈아민화, 마이야르 반응(Maillard's reaction))에 의해 변형되고 분해될 수 있으며, 이러한 화학적 반응의 대부분은 물에 의해 매개된다. 액체인 물은 분자를 이동시켜, 생물학적 성분을 포함하는 조성물 내에서 단백질 형태의 변형을 초래할 수 있다. 물로의 접근을 제한하거나 물을 제거함으로써, 변형 및 분해의 주요 인자가 감소된다. 생물학적 성분에 안정성을 부여하기 위한 선행 방법들은 주로, 물을 동결시키거나 물을 동결건조에 의해 제거하는 단계를 수반하였다.
뎅기 바이러스는 기본적으로 성질이 열에 불안정하고, 더 높은 온도에 노출 시 감염성을 상실한다. 바이러스의 생존력을 유지시키기 위해, 초저온-보관(ultra-storage)(통상 -60℃ 미만)이 필요하다. 이러한 저온에서의 보관은 이러한 보관 온도와 연관된 공급망 관련 문제 및 고비용으로 인해 포장 조건(field condition)에서 선호할만한 옵션이 아니다. 포장 조건에서 성공적이기 위해서는, 백신은 2℃ 내지 8℃에서 안정해야 한다. 바이러스에 열안정성을 부여하기 위해, 안정화제, 벌킹제, 비히클 및 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 다양한 부형제들이 최적 양으로 필요하다.
백신의 성공적인 사용 및 상업화에 있어서, 백신이 운송되고 사용 전에 보관되는 조건 하에 안정성 및 효능의 유지가 보장되도록 이러한 백신이 가공되고 제형화되는 방식이 중추적이다. 동결건조는 일부 백신 생성물의 가공에 관여하는 접근법이고, 본질적으로, 저온 하에 승화를 통해 물을 제거하고 생성물을 소량의 물이 함유된 건조된 케이크(cake)로서 남겨 두는 동결건조 방식이다. 이러한 공정은, 상기 기재된 바와 같이 약독화된 뎅기 바이러스 생백신을 포함하는 백신에 유리할 수 있는데, 왜냐하면 이러한 백신이 저 수분 환경에서 더 안정해지는 경향이 있기 때문이다. 동결건조 공정의 효능에 영향을 미치는 중요한 인자는 백신의 제형이다. 예를 들어, 물의 제거 시, 제형이 생성물의 안정성을 증강시키는 것이 바람직하다. 전형적으로, 백신 제형화는 하기 구성성분들: 벌킹제, 안정화제 및 선택적으로 완충제 중 임의의 구성성분 또는 모든 구성성분들을 함유할 것이다. 따라서, 효과적이고 효율적인 가공 방법 및 제형의 개발이 약독화된 뎅기 생백신을 포함하는 임상적으로 유용하고 상업적으로 성공적인 백신의 개발에 상당히 중요하다.
백신 제형화 분야에서의 발전에도 불구하고, 안정성 및 저장 수명이 개선된 뎅기 약독화된 생백신 제형이 별개로 요망되고 있다. 선행 기술에 공지된 조성물 중 어느 것도 요망되는 수준의 안정성을 부여하지 않는다. 본 발명은 안정성이 증가된 약독화된 뎅기 생백신 제형에 대한 충족되지 못한 요망을 해결한다.
본 발명은 뎅기 균주가 약독화되고 재조합된 안정한 뎅기 백신 조성물을 기재하고 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 뎅기 균주가 약독화되고 재조합된 안정한 동결건조된 뎅기 백신 조성물을 기재하고 있다.
본 발명은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 피험자에서 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 4 및 뎅기 3/4인 △30 결실된 뎅기 균주 또는 뎅기 1/4, 뎅기 2/4, 뎅기 3/4 및 뎅기 4인 키메라 뎅기 균주로부터 선택된다.
나아가, 본 발명은 피험자에서 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 약독화된 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 4 및 뎅기 3/4인 △30 결실된 뎅기 균주 또는 뎅기 1/4, 뎅기 2/4, 뎅기 3/4 및 뎅기 4인 키메라 뎅기 균주로부터 선택된다.
본 발명은 약독화된 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이며, 상기 약독화된 뎅기 생 바이러스는 △30 및/또는 △31 돌연변이를 포함한다.
나아가, 본 발명은 피험자에서 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 약독화된 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 △30 및/또는 △31 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN-1△30), 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN-2/4△30), 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN-3△30/31), 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN-4△30)로부터 선택된다.
나아가, 본 발명은 피험자에서 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스, 안정화제, 벌킹제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 약독화된 뎅기 생 바이러스는 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN-1△30), 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN-2/4△30), 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN-3△30/31), 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN-4△30)로부터 선택된다.
본 발명은 소정의 실시형태를 참조로 하여 기재될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 오로지 청구항에 의해서만 제한된다.
용어 "생(live)"은 이의 종래의 의미로 사용되며, 생 바이러스는 불활성화(inactivation)되지 않은 바이러스, 즉 허용 세포(permissive cell) 상에서 복제할 수 있는 바이러스이다. 약독화된 뎅기 생 바이러스는 동물 또는 인간에서 상응하는 야생형 바이러스에 의해 유발되는 질병을 유도하지 않고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 뎅기 바이러스이다.
용어 △30 돌연변이는 3'-UTR로부터 30개 뉴클레오타이드의 제거에 의해 뎅기 바이러스에서 생성되는 균주에 관한 것이다. 용어 △31 돌연변이는 3'-UTR로부터 31개 뉴클레오타이드의 제거에 의해 뎅기 바이러스에서 생성되는 균주에 관한 것이다. △30/31 돌연변이는 오리지널 △30 돌연변이 및 비인접한 31개 nt 결실을 포함한다. △31 돌연변이는 또한, 조합된 △30/31 결실 돌연변이에서 △30 또는 △31의 기여를 식별하기 위해서만 발생될 수 있다. WO2008022196의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 키메라," "키메라 바이러스," "뎅기 키메라" 및 "키메라 뎅기 바이러스"는 하나의 혈청형의 뎅기 바이러스의 면역원성을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 상이한 혈청형의 뎅기 바이러스의 백본으로부터 유래된 추가의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명의 감염성 구축물을 의미한다.
이러한 개시내용에서, "포함하다," "포함하는," "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에 대해 기재된 의미를 가질 수 있고, "수반하다", "수반하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 구성되는, 또는 본질적으로 구성된다"도 마찬가지로 미국 특허법에 기재된 의미를 가지고, 용어는 개방되어 있어서, 언급된 사항의 기본적인 또는 신규 특징이, 언급된 것보다 더 많은 것의 존재에 의해 변하지 않는 한 언급된 것보다 더 많은 것이 존재하는 것을 허용하지만, 선행 기술의 실시형태는 배제한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성 조성물", "면역학적 조성물" 및 "면역원성 또는 면역학적 조성물"은 벡터로부터 발현되는 관심 항원 또는 면역원에 대한 면역 반응을 이끌어내며; 예를 들어, 피험자에게 투여 후, 표적화된 관심 면역원 또는 항원에 대한 면역 반응을 이끌어내는 임의의 조성물을 망라한다. 용어 "백신용 조성물", "백신" 및 "백신 조성물"은 관심 항원에 대해 보호성 면역 반응을 유도하거나, 항원에 대해 유효하게 보호하며; 예를 들어, 피험자에게 투여 또는 주사 후, 표적화된 항원 또는 면역원에 대해 보호성 면역 반응을 이끌어내거나, 벡터로부터 발현되는 항원 또는 면역원에 대해 유효한 보호를 제공하는 임의의 조성물을 망라한다.
본원에 사용된 바와 같이 "동결건조(freeze-drying)"는 동결건조(lyophilization)를 포함하고, 현탁액이 얼려지고, 이후 물이 저온에서 승화에 의해 제거되는 공정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "승화"는 조성물의 물리적 특성의 변화를 지칭하며, 여기서, 조성물은 액체로 되지 않은 채 고체 상태에서 기체 상태로 바로 변화한다.
"인간 혈청 알부민" 또는 "HSA"는 585개의 아미노산 잔기로 구성된 비-당화된 단량체 단백질을 지칭하며, 분자량이 66 kD이다. 이의 전반적인 구조는 17개의 이황화 가교에 의해 유지되고, 이러한 이황화 가교는 9개의 이중 루프의 순차적인 시리즈를 생성한다. HSA는 또한, 인간 혈장 알부민으로도 지칭될 수 있다. 인간 혈청 알부민의 모든 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "콜라겐"은 비제한적으로 조직으로부터 추출되거나 재조합적으로 생성된 콜라겐, 콜라겐 유사체, 콜라겐 유도체, 변형된 콜라겐 및 변성된 콜라겐, 예컨대 젤라틴을 포함하여 임의의 공급원으로부터 유래된 모든 형태의 콜라겐을 지칭한다. 예를 들어, 콜라겐은 인간 또는 다른 포유류 공급원을 포함하는 동물 조직, 예컨대 소 또는 돼지의 진피 및 인간 태반으로부터 추출되고 정제될 수 있거나, 재조합적으로 또는 다른 방식으로 생성될 수 있다. 동물 공급원, 예컨대 소 및 돼지 공급원 유래의 용액 중 정제된, 실질적으로 비-항원성 콜라겐의 제조는 당업자의 범위 내에 있다. 예를 들어, 유형 I 콜라겐을 포함하는 콜라겐은 산성 pH 용해를 통해 또는 펩신 분해에 의해 돼지 진피로부터 추출된 다음, 식염수 침전을 이용하여 정제될 수 있다. 유형 I, II, III, IV 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 유형의 콜라겐이 본 개시내용의 제형화에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "가수분해된 콜라겐"은 천연(native) 콜라겐보다 낮은 분자량, 즉 100 달톤 내지 300,000 달톤 범위의 분자량을 가진 콜라겐 가수분해물 폴리펩타이드로서 정의되며, 가수분해에 의해 유도된다. 가수분해된 콜라겐은 분말화된 형태 또는 수용액으로 상업적으로 입수 가능하다. 상업적인 제조는 전형적으로 4가지 방법들 중 1가지 방법에 의해 달성된다: (1) 알칼리 가수분해; (2) 효소적 가수분해; (3) 산 가수분해; 및 (4) 발효에 의한 합성. 이들 방법 중 임의의 방법은 소(뼈 및 피부가 바람직함), 돼지, 어류, 조류 또는 합성 공급원으로부터 가수분해된 콜라겐을 유도하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "젤라틴"은 동물에서 주된 구조 및 결합 단백질인 콜라겐의 유도체이다. 젤라틴은 콜라겐의 변성으로부터 유도되고, Gly-X-Y 반복부를 가진 폴리펩타이드 서열을 함유하고, 여기서 X 및 Y는 가장 빈번하게는 프롤린 및 하이드록시프롤린 잔기이다. 이들 서열은 3중 나선형 구조에 기여하고, 젤라틴 폴리펩타이드의 젤화 능력에 영향을 미친다. 현재 입수 가능한 젤라틴은 전형적으로 소 및 돼지 공급원 유래의 동물 가죽 및 뼈의 가공을 통해 추출된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 가수분해된 젤라틴은, 펩타이드 결합 중 일부가 산 또는 효소에 의해 절단된 젤라틴을 지칭한다. 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴의 천연 버전 및 재조합 버전 둘 다 본 발명의 범위에 포함된다.
콜라겐 또는 젤라틴과 유사한 펩타이드 구성성분이 또한, 본 발명에 포함된다.
약독화된 생백신은 복제-능력이 있는 바이러스로서, 야생형 바이러스에 의해 유도되는 것과 유사한 면역 반응 및 면역 기억을 유도할 수 있다. 약독화된 생 바이러스는 낮은 수준의 복제, 및 따라서 낮은 수준의 염증 때문에 질병을 유발하지 않는다. 장기간 면역성을 제공하는 성공적인 약독화된 생백신의 주요한 예로는, 백시나 바이러스, 폴리오바이러스(사빈(Sabin)), 및 플라비비리대 과의 2개의 구성원인 황열 바이러스(YF-17D) 및 일본 뇌염 바이러스(JEV SA14-14-2)에 대한 것들이 있다. 약독화된 뎅기 생백신은 마우스, 원숭이 및 인간에서 보호성 중화 항체 역가(titer)를 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 균형화된 T 세포 반응이 보호에 기여한다는 증거가 축적되고 있으며, 백신에서의 T 세포 에피토프의 중요성을 강조하고 있다.
약독화된 생백신 또는 면역원성 조성물은 하기 이점들을 가진다: 이는 특히 자가-복제성인 경우 저용량으로 투여될 수 있으며; 피험자에서 천연/야생형 감염을 근접하게 모방하고; 피험자에게 면역학적으로 중요한 모든 가능한 항원들을 동시에, 즉 단일 투여로 제공한다. 일반적으로, 약독화된 생 미생물을 기반으로 한 면역원성 조성물 또는 백신 조성물이 고도로 효과적인 유형의 면역 반응을 유도하는 능력을 가지고 있는 데에 동의한다. 이러한 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은, 일단 동물 숙주가 면역화되면, 숙주 내로의 병원체 도입이 이전의 세포-매개성 면역 또는 체액성 면역의 가속화된 상기(recall)를 유도하며, 이는 감염이 임상적으로 유의한 비율을 차지할 수 있기 전에 유기체의 추가의 성장을 조절할 수 있는 이점을 가진다. 당업계는, 사멸화된 병원체(사멸화된 백신)를 기반으로 한 면역원성 조성물 또는 백신 조성물이 일반적으로 이러한 유형의 반응을 달성할 수 없거나 거의 달성하지 못하는 데에 수긍하고 있다. 그러나, 약독화 수준에 따라 생 병원체를 함유하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은, 면역화 시 면역화된 숙주가 병에 걸릴 수 있고 보호에 맞선 질병이 유발되는 위험성을 제시한다. 따라서, 생 병원체의 면역성을 갖고 있으나 피험자에게 투여 시 바람직하지 못한 부작용은 유발할 수 없는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물이 고도로 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 백신은 4가이고, 뎅기 유형 1, 2, 3의 3' 비번역 영역 내에 공통의 뉴클레오타이드 결실을 함유하고, 제1 뎅기 바이러스 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뎅기 바이러스 유래의 비-구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서, 제2 뎅기 바이러스는 TL2 스템-루프(stem-loop) 구조에 상응하는 뎅기 게놈의 3' 비번역 영역으로부터 약 30개 뉴클레오타이드의 결실에 의해 약독화된다. 본 발명에 따른 백신은, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 3' 비번역 영역(3-UTR)에 포함하는 뎅기 바이러스 또는 키메라 뎅기 바이러스를 사용함으로써 제조된다: (a) 각각의 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4에서 TL-2 상동성 구조를 제거하는 △30 돌연변이, 및 각각의 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4에서 TL-3 상동성 구조의 5' 경계로부터 가능한 한 멀리 5' 방향에서 서열을 제거하는, 3' UTR로부터 결실된 △30 돌연변이에 부가적인 뉴클레오타이드; 및 (b) 제1 혈청형의 뎅기 바이러스의 3'-UTR을 제2 혈청형의 뎅기 바이러스의 3'-UTR로 대체하며, 선택적으로 3'-UTR로부터 결실된 △30 돌연변이, 및 이러한 △30 돌연변이에 부가적인 뉴클레오타이드를 함유함.
본 발명에 따른 제형화에 바람직한 균주는, 바이러스 게놈이 WO02095075A1의 표 1 내지 표 37 중 임의의 표의 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 단독으로 또는 조합하여 선택되는 돌연변이의 도입에 의해 변형된 표현형을 가진 플라비바이러스이다. 보다 구체적으로는 온도-민감성, 숙주-범위 한정된 돌연변이체 플라비바이러스는 돌연변이체 200, 201로 지정되며, 여기서, 상기 바이러스는 NS5 유전자의 아미노산 2687 및 2688에 차지-클러스터-투(charge-cluster-to)-알라닌 돌연변이를 포함하고, 선택적으로 △30 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 위치는 뎅기 바이러스 유형 4의 다단백질에 주어진다. 본 발명에 따른 균주는 NS3 유전자의 뉴클레오타이드 위치 4995에 돌연변이를 포함하는 약독화된 뎅기 바이러스일 수 있으며, 여기서, 상기 넘버링은 원형의 DEN4 단리 균주(isolate strain) 814669(Dominica 1981)를 기반으로 하며, 상기 돌연변이는 T로부터 C로의 뉴클레오타이드 치환을 초래하고, 상기 약독화된 뎅기 바이러스는 야생형 뎅기 바이러스와 비교하여 약독화되고, 선택적으로 △30 돌연변이를 추가로 포함하거나; 본 발명에 따른 균주는 돌연변이를 포함하는 약독화된 뎅기 바이러스일 수 있으며, 여기서, 이러한 돌연변이는 아미노산 위치 1632에 세린 또는 아스파라긴으로부터 프롤린으로의 아미노산 치환을 가진 NS3 단백질을 초래하며; 상기 넘버링은 원형의 DEN4 단리 균주 814669(Dominica 1981)에 의해 인코딩되는 바이러스 폴리펩타이드를 기반으로 하고; 상기 약독화된 뎅기 바이러스는 야생형 바이러스와 비교하여 약독화된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 4가이고, 뎅기 유형 1, 2, 3의 3' 비번역 영역 내에 공통의 뉴클레오타이드 결실을 함유하고, 제1 뎅기 바이러스 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뎅기 바이러스 유래의 비-구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서, 제2 뎅기 바이러스는 TL2 스템-루프 구조에 상응하는 뎅기 게놈의 3' 비번역 영역으로부터 약 30개 뉴클레오타이드의 결실에 의해 약독화되고, 선택적으로 헤로(Hero) 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서의 온도 민감성, 모기 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서의 숙주 세포 제한, 네로(Nero) 세포에서의 25개의 개선된 복제에 대한 숙주-세포 적응, 또는 마우스 또는 원숭이에서의 약독화로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하고, 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원을 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
동결건조, 또는 동결건조 공정은 탈수된 생성물의 제조 시 물을 제거하기 위해 보편적으로 사용되는 기술이다. 일반적으로, 수성 조성물의 "동결건조"는 3개의 단계를 수반한다. 첫째, 수성 조성물을 저온 조건 하에 얼린다. 둘째, 얼려진 물을 감압 및 저온 조건 하에 승화에 의해 제거한다. 이 단계에서, 조성물은 통상 약 15%의 물을 함유한다. 셋째, 잔여 물을 감압 및 더 높은 온도 조건 하에 탈착에 의해 추가로 제거한다. 동결건조 공정의 종료 시, "패스털(pastille)" 또는 "케이크"로도 지칭되는 동결건조된 생성물이 생성된다. 동결건조된 생성물은 매우 소량의 잔여 물(약 0.2 중량%/중량 내지 약 5 중량%/중량), 및 주로 비정질 형태의 건조 물질을 함유한다.
그러나, 생물학적 성분의 면역원성의 실질적인 상실은 면역원성 조성물 및 백신 조성물의 제조 단계 동안, 예를 들어 동결건조 이전 및 동안, 및 또한 보관 동안 관찰된다. 생물학적 성분의 온전성(integrity)은, 면역원성 조성물 및 백신 조성물의 면역화 효율이 보유되는 것을 보장하기 위해 보호되어야 한다. 생물학적 성분의 면역원성은 숙주 또는 피험자에게 투여 시 면역학적 반응을 유도하고 자극하는 능력에 의해 측정된다.
피험자의 조작 및 투여 횟수를 제한하기 위해, 당업계에서는 다가 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제공하려는 강한 요망이 존재한다. 정의에 의하면, 다가 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 동일한 병원체 또는 적어도 2개의 상이한 병원체들로부터 기원하거나 유래되는 1개 초과의 활성 면역원성 구성성분을 포함한다. 상이한 속(genus)들 유래의 바이러스는 동결건조 단계 및 후속적인 보관 기간 동안 안정성이 다양하여, 생존력 또는 감염성의 상실을 초래할 수 있다. 바이러스, 예컨대 뎅기의 경우, 보편적으로 투여되는 활성 면역원성 구성성분은 약독화된 생 바이러스이다. 면역계를 효율적으로 자극하기 위해, 약독화된 생 바이러스는 면역화된 피험자에서 복제되어야 한다. 생존력 또는 감염성의 상실은 다가 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 동결건조 공정 동안, 조성물의 보관 동안, 또는 재구성(reconstitution) 후 조성물의 투여 이전에 발생할 수 있다. 따라서, 안정화제는 이러한 동결건조된 조성물에 첨가되어 왔다. 그러나, 감염성 및/또는 생존력을 보유하는 다가 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 수득하기 위해, 상이한 생 약독화된 병원체들의 생존력 및 감염성을 보존시킬 수 있는 안정화제가 특히 유리할 것이다.
백신 및 면역원성 조성물은 여러 가지 치명적인 병원체들로부터 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 감소시킴으로써 공중 보건에 거대한 영향을 미쳤다. 그러나, 면역원성 조성물 및 백신 조성물 내의 첨가제로 인한 의도치 않은 부작용은 면역원성 조성물 및 백신 조성물의 임의의 보호적 및 치료적 속성을 능가할 수 있는 잠재적인 위험을 계속해서 제기하고 있다.
본 발명은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를 포함할 수 있는 동결건조된 생 약독화된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물용 안정화제를 포함하는 최적화된 제형을 제공함으로써 당업계의 요망을 해결한다. 이들 안정화제는 특히 동결건조 공정 동안, 및 콜드 체인(cold chain)으로부터 단기간 운송될 수 있기에 충분한 기간 동안 냉장 온도 및 실온에서 동결건조된 생성물의 장기간 보관 동안 이들 뎅기 바이러스의 생존력 및 감염성을 보존시킬 수 있다. 중요하게는, 뎅기 바이러스의 동결건조된 안정화된 생 약독화된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물용의 현재 청구된 안정화제는 재구성 후 피험자에게 주사되기에 안전하고 적합하다.
이에 일 양태에서, 본 발명은 동결건조된 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스 면역원성 조성물 또는 백신 조성물용 안정화제를 제공하며, 이는 비제한적으로 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 가수분해된 콜라겐 또는 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴으로부터 선택되는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 조성물은 비제한적으로 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 덱스트란으로부터 선택되는 당 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 약독화된 뎅기 생 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 안정성은 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 젤라틴 또는 이들의 가수분해된 버전들의 존재 하에 증강된다.
나아가, 단백질 안정화제는 저분자량 젤라틴, 가수분해된 젤라틴, 콜라겐, 가수분해된 콜라겐, 재조합 젤라틴, 재조합 콜라겐, 가수분해된 콜라겐 유도체, 단백질 가수분해물, 숙시닐화된 젤라틴, 어류 젤라틴, 소 젤라틴, 돼지 젤라틴, 조류 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 나아가, 알부민은 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 및 재조합 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 백신은 4가 백신이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 백신에 사용되는 뎅기 바이러스 균주는 △30 돌연변이를 운반한다. 보다 추가의 바람직한 실시형태에서, 뎅기 균주는 뎅기 바이러스 유형 1, 뎅기 바이러스 유형 2, 뎅기 바이러스 유형 3, 뎅기 바이러스 유형 4로부터 선택된다. 보다 다른 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 뎅기 균주는 뎅기 1 백본, 뎅기 2 백본, 뎅기 3 백본 또는 뎅기 4 백본을 포함하는 키메라이다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 뎅기 균주는 베로(Vero) 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서 온도 민감성인 표현형을 가진다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물의 안정성은 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 젤라틴의 존재에 의해 증강된다. 보다 바람직한 실시형태에서, 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 젤라틴은 10 내지 30 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 인간 혈청 알부민은 10 내지 30 mg/0.5 ml, 또는 10 내지 15 mg/0.5 ml, 보다 구체적으로는 12.5 mg/0.5 ml 또는 1O mg/0.5 ml의 양으로 존재한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 콜라겐 또는 젤라틴은 1 내지 30 mg/0.5 ml, 보다 구체적으로는 15 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다. 다른 구체적으로 바람직한 실시형태에서, 콜라겐 또는 젤라틴은 12 내지 25 mg/0.5 ml, 보다 구체적으로는 15 mg/0.5 ml 또는 22 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 백신은 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스의 측면에서 4가 백신이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 뎅기 바이러스는 △30 돌연변이 및/또는 △31 돌연변이를 운반한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 뎅기 균주는 뎅기 바이러스 유형 1, 뎅기 바이러스 유형 2, 뎅기 바이러스 유형 3, 뎅기 바이러스 유형 4로부터 선택된다. 본 발명의 범위 내의 일부 백신에서, 하나 이상의 뎅기 균주는 뎅기 1 백본, 뎅기 2 백본, 뎅기 3 백본 또는 뎅기 4 백본을 포함하는 키메라이다. 추가의 실시형태에서, 뎅기 균주는 베로 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서 온도 민감성인 표현형을 가진다. 가장 바람직한 실시형태에서, 뎅기 균주는 베로 세포에서 전파(propagated)된다.
가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30)를 포함하는 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물의 안정성은 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 젤라틴의 존재에 의해 증강된다. 구체적인 선택에서, 뎅기 바이러스는 3.0 log10 PFU/0.5 ml 이상의 용량으로 존재한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 백신은 벌킹제 및/또는 완충제를 추가로 포함한다. 보다 구체적으로, 벌킹제는 락토스, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 완충제는 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트, 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트, 모노소듐 글루타메이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 백신은 보충 배지를 추가로 포함할 수 있을 것이다.
보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 백신을 제공하며, 여기서 조성물의 최종 pH는 약 6.0 내지 8.0이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 뎅기 바이러스는 3.0 log10 PFU/0.5 ml 이상의 용량으로 존재한다.
또 다른 실시형태에서, 안정화제는 락토스, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 덱스트란, 말토덱스트린, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시에틸 전분 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
동결건조된 백신을 재구성함으로써 수득되는 안정화된 백신이 또한, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
보다 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 완충제를 추가로 제공하며, 이러한 완충제는 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트, 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트, 모노소듐 글루타메이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 둘베코스 모디파이드 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 리보비츠(Leibovitz) L-15 배지와 같은 보충 배지를 포함한다.
최종 백신의 바람직한 pH는 6.0 내지 8.0의 범위이고, 가장 바람직하게는 7.0±0.5의 범위이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 a) 뎅기 혈청형 1에 대해 면역원성인 제1 약독화된 바이러스, b) 뎅기 혈청형 2에 대해 면역원성인 제2 약독화된 바이러스, c) 뎅기 혈청형 3에 대해 면역원성인 제3 약독화된 바이러스, 및 d) 뎅기 혈청형 4에 대해 면역원성인 제4 약독화된 바이러스를 포함하는 안정한 4가 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서, a), b), c) 및 d)는 각각 i) 제1 뎅기 바이러스 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, ii) 제1 뎅기 바이러스 또는 제2 뎅기 바이러스 유래의 비-구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 iii) 3' 비번역 영역을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서, 3' 비번역 영역은 TL2 스템-루프 구조에 상응하는 약 30개 뉴클레오타이드의 결실을 함유하고, 3' 비번역 영역, 및 비-구조 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 둘 다 제1 뎅기 바이러스 또는 제2 뎅기 바이러스로부터 유래된다. 본 발명의 소정의 바람직한 양태에서, 본 발명은 이전의 주장들 중 임의의 주장에 따른 백신 조성물을 제공하며, 여기서 뎅기 균주는 베로 세포에서 전파된다.
본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 안정한 조성물은 뎅기 바이러스 유형 1(rDEN1 △30-1545 및/또는 rDEN 1/4△30), 뎅기 바이러스 유형 2(rDEN2△30-7169 및/또는 rDEN2/4△30-1495, 7163), 뎅기 바이러스 유형 3(rDEN3/4△30 및/또는 rDEN3-3'D4△30 및/또는 rDEN3△30/31), 뎅기 바이러스 유형 4(rDEN4△30-7132, 7163, 8308 및/또는 rDEN4△30-200, 201 및/또는 rDEN4△30-4995)로부터 선택되는 약독화된 백신 후보 생 바이러스를 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 rDEN1d30-1545 03JB186 TD-1A+V2, rDEN2/4d30-1495, 7163 04JBV351 TD-1A+V2 9/1/04, rDEN3△30/31-7164 06JBC577 V6+1A1+V2 5/8/08 Joe 및 06JBV591 DEN4△30-7132,7163,8308 6/8/06 V3-1A1+V2를 포함하는 안정한 제형에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30)를 포함하는 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물의 안정성은 인간 혈청 알부민 및/또는 젤라틴 및/또는 콜라겐의 존재에 의해 증강된다.
본 발명의 백신 제형은 바이러스 및 안정화제 구성성분을 포함하며, 이러한 안정화제 구성성분은 비제한적으로 인간 혈청 알부민, 콜라겐 및 젤라틴으로부터 선택되는 약 10 내지 약 30 mg/0.5 ml 양의 단백질 안정화제; 비제한적으로 락토스, 수크로스, 만니톨 및 트레할로스로부터 선택되는 약 10 내지 약 100 mg/0.5 ml 양의 당 안정화제; pH를 약 6.5 내지 약 7.5로 조정하기 위한 양의 생리학적 활성 완충제를 포함한다. 본 발명에서, 보충 배지가 조성물에 첨가되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 인간 혈청 알부민 및/또는 콜라겐 또는 젤라틴은 1 내지 30 mg/0.5 ml, 또는 10 내지 30 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 인간 혈청 알부민은 10 내지 15 mg/0.5 ml, 보다 바람직하게는 12.5 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 콜라겐 또는 젤라틴은 10 내지 30 mg/0.5 ml, 보다 바람직하게는 15 mg/0.5 ml의 양으로 존재한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 백신 생성물은 재구성용의 동결건조된 분말이고 피하 투여를 위한 것이다. 백신은 인간 혈청 알부민 및 락토스 모노하이드레이트와 같은 안정화제 내에서 제형화되고, 여기에 수크로스가 벌킹제로서 첨가된다. 백신은 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4) 및 모노소듐 글루타메이트로 이루어진 완충제 내에서 희석된다. 둘베코스 모디파이드 이글스 배지 및/또는 리보비츠 L-15 배지가 최종 백신에 배지 보충제로서 첨가될 수 있다. 최종 백신의 pH는 7.0±0.5의 범위이다.
보다 다른 바람직한 실시형태에서, 백신은 젤라틴 및 트레할로스로 이루어진 안정화제 내에서 제형화되고, 여기에 수크로스 및 만니톨이 벌킹제로서 첨가된다. 백신은 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4) 및 모노소듐 글루타메이트로 이루어진 완충제 내에서 희석된다. 둘베코스 모디파이드 이글스 배지 및/또는 리보비츠 L-15 배지가 최종 백신에 배지 보충제로서 첨가될 수 있다. 최종 백신의 pH는 7.0±0.5의 범위이다.
바람직한 실시형태에서, 백신 조성물 내 뎅기 바이러스는 NLT 3.0 log10 PFU/0.5 ml의 용량으로 존재한다.
나아가, 본 발명은 유효량의 상기 기재된 백신을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질병의 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 감염 위험에 있는 성인 또는 어린이에서 일차적인 예방적 제제로서 투여될 수 있거나, 감염된 환자를 치료하기 위한 이차적인 제제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DEN 바이러스 및 키메라 DEN 바이러스의 경우, 백신은 DEN 바이러스 감염 위험에 있는 성인 또는 어린이에서 사용될 수 있거나, DEN 바이러스-감염 환자의 치료를 위한 이차적인 제제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 DEN 바이러스-관련 백신 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 환자의 예로는, (i) DEN 바이러스가 유행인 지역의 어린이, (ii) 해외여행자, (iii) 군복무자 및 (iv) DEN 바이러스가 유행인 지역의 환자가 있다. 더욱이, 질병이 확산되고 있는 것으로 관찰된 지역(예를 들어 스리랑카, 동아프리카 및 라틴아메리카) 또는 향후 확산될 것으로 관찰될 수 있는 지역의 거주자는 본 발명에 따라 치료될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 기재된 안정화된 백신 조성물을 함유하는 제1 용기, 및 백신 재구성용 수용액을 함유하는 제2 용기를 포함하는 백신 키트를 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하기 제형 표 1에 관한 것이다.
Figure pct00007
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포
1PFU: 플라크 형성 단위(Plaque forming unit)
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하기 제형을 제공한다:
Figure pct00008
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포
1PFU: 플라크 형성 단위
실시예
실시예 1
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 3에 제시되어 있다:
Figure pct00009
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 가수분해된 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HCl / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정
최종 벌크 백신을 USP 유형 I, 튜브형 유리 바이얼에 충전하고, 마개가 1/2 정도 씌워진 백신 바이얼을 포함하는 트레이를 동결건조기에 넣었다. 동결건조를 하기 파라미터에서 수행하였다:
· 바이얼을 -40℃ 내지 -60℃ 범위의 온도에서 8시간 동안 동결시켰다
· 일차 건조를 약 -50℃ 내지 약 -15℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 50시간 동안 수행하였다.
· 이차 건조를 약 +0℃ 내지 약 +30℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 15시간 동안 수행하였다.
공정의 완료 후, 바이얼에 마개를 씌워 밀봉하고, 라벨링한 다음, 2-8℃의 서늘한 곳에서 보관하였다.
시험 결과: 상기 실시예의 시험 결과는 하기와 같다:
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과
Figure pct00010
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다.
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과
Figure pct00011
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다.
최종 벌크(액체)의 안정성 결과
Figure pct00012
실시예 2
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 7에 제시되어 있다:
Figure pct00013
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 3
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 8에 제시되어 있다:
Figure pct00014
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2PO4), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 4
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 9에 제시되어 있다:
Figure pct00015
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 가수분해된 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 5
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 10에 제시되어 있다:
Figure pct00016
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-1 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 6
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 11에 제시되어 있다:
Figure pct00017
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 가수분해된 젤라틴을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2PO4), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트, 둘베코스 모디파이드 이글스 배지 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 7
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 12에 제시되어 있다:
Figure pct00018
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 락토스 모노하이드레이트을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2PO4), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후; 계산된 양의 인간 혈청 알부민 멸균 용액을 블렌드에 첨가하고, 후속해서 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 첨가하였다. 주사용 멸균수(SWFI)를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정
최종 벌크 백신을 USP 유형 I, 튜브형 유리 바이얼에 충전하고, 마개가 1/2 정도 씌워진 백신 바이얼을 포함하는 트레이를 동결건조기에 넣었다. 동결건조를 하기 파라미터에서 수행하였다:
· 바이얼을 -40℃ 내지 -60℃ 범위의 온도에서 8시간 동안 동결시켰다
· 일차 건조를 약 -50℃ 내지 약 -15℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 50시간 동안 수행하였다.
· 이차 건조를 약 +0℃ 내지 약 +30℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 15시간 동안 수행하였다.
공정의 완료 후, 바이얼에 마개를 씌워 밀봉하고, 라벨링한 다음, 2-8℃의 서늘한 곳에서 보관하였다.
시험 결과: 상기 실시예의 시험 결과는 하기와 같다:
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과
Figure pct00019
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다.
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과.
Figure pct00020
최종 벌크(액체)의 안정성 결과
Figure pct00021
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다.
실시예 8
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 16에 제시되어 있다:
Figure pct00022
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다. 용액의 제조를 위해, 락토스 모노하이드레이트을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후; 계산된 양의 인간 혈청 알부민 멸균 용액을 블렌드에 첨가하고, 후속해서 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 첨가하였다. 주사용 멸균수(SWFI)를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 9
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 17에 제시되어 있다:
Figure pct00023
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다. 용액의 제조를 위해, 락토스 모노하이드레이트를 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후; 계산된 양의 인간 혈청 알부민 멸균 용액을 블렌드에 첨가하고, 후속해서 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 첨가하였다. 주사용 멸균수(SWFI)를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 10
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 18에 제시되어 있다:
Figure pct00024
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다. 용액의 제조를 위해, 락토스 모노하이드레이트을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후; 계산된 양의 인간 혈청 알부민 멸균 용액을 블렌드에 첨가하고, 후속해서 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 첨가하였다. 주사용 멸균수(SWFI)를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 실시예 1에 기재된 바와 같다.
상기에서 인용된 모든 특허, 공개문헌 및 요약은 이들 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태만 본원에 기재되어 있더라도, 본 발명은 본원에서 청구된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 다른 구체적인 형태들에서 구현될 수 있다. 이에, 본 발명의 실시예 및 실시형태는 예시적이며 비제한적인 것으로 간주되어야 하고, 본 발명은 본원에 주어진 상세한 설명으로 한정되지 않는다.
실시예 11
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 19에 제시되어 있다:
Figure pct00025
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를 상기 표에 기재된 바와 같이 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다. 용액의 제조를 위해, 가수분해된 콜라겐을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2PO4), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HC1 / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정
최종 벌크 백신을 USP 유형 I, 튜브형 유리 바이얼에 충전하고, 마개가 1/2 정도 씌워진 백신 바이얼을 포함하는 트레이를 동결건조기에 넣었다. 동결건조를 하기 파라미터에서 수행하였다:
· 바이얼을 -40℃ 내지 -60℃ 범위의 온도에서 8시간 동안 동결시켰다
· 일차 건조를 약 -50℃ 내지 약 -15℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 50시간 동안 수행하였다.
· 이차 건조를 약 +0℃ 내지 약 +30℃의 온도, 약 20 mtorr 내지 약 800 mtorr의 진공 하에 약 15시간 동안 수행하였다.
공정의 완료 후, 바이얼에 마개를 씌워 밀봉하고, 라벨링한 다음, 2-8℃의 서늘한 곳에서 보관하였다.
시험 결과: 상기 실시예의 시험 결과는 하기와 같다:
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과
Figure pct00026
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다
약독화된 (재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 안정성 결과
Figure pct00027
*주목: 후속적인 시간 간격의 결과가 초기와 같거나 그보다 높다면, 역가 손실은 0으로 간주된다.
실시예 12
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 22에 제시되어 있다:
Figure pct00028
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1PFU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다.
용액의 제조를 위해, 콜라겐을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2PO4), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HPO4), 모노소듐 글루타메이트 및 둘베코스 모디파이드 이글스 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HCl / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 이전 실시예에 기재된 바와 같다.
실시예 13
조성물: 약독화된(재조합, 동결건조된) 뎅기 4가 생백신의 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 23에 제시되어 있다.
Figure pct00029
* 전파에 사용된 세포 기질: 베로 세포 1FU: 플라크 형성 단위
벌크 백신의 제형화
혈청형 1, 2, 3 및 4의 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스를, 안정화제, 완충제 및 벌킹제를 함유하는 용액과 혼합하여, 4가 제형을 제조하였다. 용액의 제조를 위해, 가수분해된 콜라겐을 유리병 내의 주사용수(WFI)로 옮기고, 분산시켜 투명한 용액을 제조하였다. 상기 용액에, 잔여 부형제{만니톨, 트레할로스, 수크로스, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트(KH2P04), 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트(K2HP04), 모노소듐 글루타메이트 및 리보비츠 L-15 배지}를 순차적으로 첨가하였다. 블렌드의 pH를 1.0 N HCl / 1.0 N NaOH 용액을 사용하여 7.0±0.2로 조정하였다. 생성된 블렌드를 0.2 μ 멸균 등급 필터를 사용하여 여과하고, 5±3℃ 범위의 온도까지 냉각시켰다. 이후, 계산된 양의 특이적인 뎅기 바이러스(혈청형 1, 2, 3 및 4)를 블렌드에 첨가하고, 주사용 멸균수를 해당 부피가 될 때까지 첨가하였다. 필요하다면, pH를 다시 7.0±0.2 범위 내로 조정하였다.
벌크 백신의 동결건조 공정: 이전 실시예에 기재된 바와 같다.

Claims (42)

  1. 약독화된 재조합 뎅기 생(live) 바이러스를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 조성물의 안정성이 인간 혈청 알부민 및/또는 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴 및/또는 콜라겐 또는 가수분해된 콜라겐의 존재에 의해 증강되는, 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 백신 조성물이 약독화된 재조합 뎅기 생 바이러스의 측면에서 4가(tetravalent)인, 백신 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뎅기 바이러스가 △30 돌연변이 및/또는 △31 돌연변이를 운반하는, 백신 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 균주가 뎅기 바이러스 유형 1, 뎅기 바이러스 유형 1, 뎅기 바이러스 유형 3, 뎅기 바이러스 유형 4로부터 선택되는, 백신 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뎅기 균주가 뎅기 1 백본, 뎅기 2 백본, 뎅기 3 백본 또는 뎅기 4 백본을 포함하는 키메라(chimeric)인, 백신 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 균주가 베로(Vero) 세포 또는 인간 간 세포주 HuH-7에서 온도 민감성인 표현형을 갖는 것인, 백신 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물이 벌킹제(bulking agent) 및/또는 완충제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 벌킹제가 락토스, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 완충제가 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트, 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트, 모노소듐 글루타메이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신 조성물.
  10. 제1항, 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물이 보충 배지를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 최종 pH가 약 6 내지 약 7인, 백신 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조되는, 백신 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 균주가 베로 세포 내에서 전파되는, 백신 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 뎅기 바이러스가 3.0 log10 PFU/0.5 ml의 용량으로 존재하는, 백신 조성물.
  15. 제12항에 따른 동결건조된 백신을 재구성함으로써 수득되는 안정화된 백신.
  16. 제1항에 있어서, 인간 혈청 알부민 및/또는 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴이 1 mg/0.5 ml 내지 30 mg/0.5 ml의 양으로 존재하고/거나 콜라겐 또는 가수분해된 콜라겐이 1 mg/0.5 ml 내지 30 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 인간 혈청 알부민이 10 mg/0.5 ml 내지 15 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 인간 혈청 알부민이 12.5 mg/0.5 ml 또는 10 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴이 12 mg/0.5 ml 내지 25 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴이 22 mg/0.5 ml 또는 15 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 콜라겐 또는 가수분해된 콜라겐이 12 mg/0.5 ml 내지 25 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 콜라겐 또는 가수분해된 콜라겐이 22 mg/0.5 ml 또는 15 mg/0.5 ml의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  23. 뎅기 바이러스 혈청형 1(rDEN 1△30), 뎅기 바이러스 혈청형 2(rDEN 2/4△30), 뎅기 바이러스 혈청형 3(rDEN 3△30/31), 뎅기 바이러스 혈청형 4(rDEN 4△30)를 포함하는 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물로서, 여기서, 조성물의 안정성이 인간 혈청 알부민 및/또는 가수분해된 젤라틴의 존재에 의해 증강되는, 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 뎅기 바이러스가 3.0 log10 PFU/0.5 ml 이상의 용량으로 존재하는, 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물.
  25. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00030
  26. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00031
  27. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00032
  28. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00033
  29. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00034
  30. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00035
  31. 하기 식에 따른 안정한 동결건조된 4가 백신 조성물:
    Figure pct00036
  32. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00037
  33. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00038
  34. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00039
  35. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00040
  36. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00041
  37. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00042
  38. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00043
  39. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00044
  40. 하기 식에 따른 안정한 4가 백신:
    Figure pct00045
  41. 유효량의 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 백신을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 뎅기 바이러스에 의해 유발되는 질병의 예방 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 백신 조성물을 포함하는 제1 용기 및 백신 재구성용 수용액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 백신 키트.
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