MX2008014391A

MX2008014391A - Una composicion util como vacuna.

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Publication number: MX2008014391A
Application number: MX2008014391A
Authority: MX
Inventors: Krishna Murthy Ella; Victor Jerusha Augustus Harshavardhan Gutla; Krishna Mohan Vadrevu; Smita Singhania
Original assignee: Bharat Biotech Int Ltd
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2009-03-06
Also published as: BRPI0711608B1; BRPI0711608A2; US20100068227A1; AU2007251122A1; ZA200809622B; GB2451216B; CN101489587B; AU2007251122B2; CN101489587A; GB2451216A; BRPI0711608B8; WO2007132480A2; WO2007132480B1; GB0821386D0; WO2007132480A3; US9642907B2

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende un antígeno viral, una primera proteína y una segunda proteína. Opcionalmente, la composición también comprende tres disacáridos diferentes, u, opcionalmente, la composición comprende un azúcar primario y al menos uno, preferentemente dos azúcares secundarios. La presente invención también se refiere al uso de un antígeno viral, una primera proteína y una segunda proteína para la elaboración de una composición, preferentemente una vacuna. La presente invención, adicionalmente se refiere a un método de tratamiento o prevención de virus asociados a enfermedades en humanos. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método de adaptación de un virus a una línea de célula adecuada. La invención también es útil para la producción de suspensiones de virus para elaborar composiciones de vacuna para rotavirus vivo/inactivado, monovalente y/o polivalente, líquido/liofilizado estable, para administración oral y/o nasal o cualquier otra vía adecuada de administración en un humano.

Description

UNA COMPOSICIÓN ÚTIL COMO VACUNA CAMPO DE LA INVENCIÓN: La presente invención se refiere a una composición que comprende un antigeno viral, una primera proteina y una segunda proteina y azúcar primaria y azúcar secundaria. La presente invención también se refiere al uso de un antigeno viral, una primera proteina y una segunda proteina para la fabricación de una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna. La presente invención además se refiere a un método de tratamiento o prevención de padecimientos asociados a virus en humanos. Además, la presente invención se refiere a un método para adaptar un virus a una linea celular adecuada. La invención también es útil para la producción de suspensiones de virus adecuadas para hacer composiciones de vacunas para rotavirus liquidas/liofilizadas, monovalentes y/o polivalentes, vivas/inactivadas, estables, para vía oral y/o nasal o cualquier otra vía adecuada de administración en humanos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN: La infección por rotavirus es la mayor causa de muertes relacionadas con la diarrea en infantes y niños menores. En todo el mundo, cada año la gastroenteritis por rotavirus causa la muerte de 310,000-590,000 infantes y niños menores. Agencias internacionales de salud han promovido el desarrollo de vacunas para el rotavirus como el mejor método para la prevención de la morbilidad y mortalidad, asociada con la infección por rotavirus. En 1997 y, de nuevo, en 2000, la WHO recomendó que todas las nuevas vacunas para rotavirus se prueben en Asia y África y que esta prueba se realice concurrentemente con. ensayos realizados en los Estados Unidos y Europa. Al hacer esto se podría demostrar la seguridad y eficacia de las vacunas en países pobres y en vías de desarrollo durante su desarrollo, acelerando así la disponibilidad de nuevas vacunas para los niños quiénes son los que más las necesitan. Todas las vacunas para rotavirus desarrolladas hasta la fecha se han basado en cepas de rotavirus vivo que se han aislado de humanos o animales y re-clasificadas in vitro y adaptado a cultivo celular, formulado para suministro oral. Ambas cepas monovalentes y multivalentes de base animal, han demostrado su eficacia como vacunas candidatas. RotaShield ( yeth-Ayerst ) se autorizó aunque luego se retiró. La cepa 116E del rotavirus humano, reclasificada de humano-bovino natural, atenuada naturalmente, se caracteriza como una cepa G9 humana en la cual se introduce de manera natural un solo gen VP4 bovino, homólogo al segmento del gen P[ll]. La cepa 1321 se caracteriza como una G10P [11] que está compuesta principalmente de genes bovinos y tiene solamente dos segmentos de genes, VP5 y VP7 de origen humano.

Estas dos cepas de la vacuna para rotavirus se han preparado individualmente como lotes piloto de formulaciones liquidas de vacuna para rotavirus, orales, monovalentes, para ensayos clínicos a realizarse en India. Bharat Biotech International Ltd. (BBIL) obtuvo las cepas 116E e 1321 del rotavirus humano, del Instituto Nacional de Salud (NIH) según el acuerdo de transferencia de materiales con el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) , NIH, Bethesda, USA. Se reporta la secuencia genómica completa de las cepas 116E e 1321 del rotavirus. Las 116E (G9[ll]) e 1321 (G1ÜP[11]) originales se adaptaron para hacerse crecer en cultivo celular por medio de pasadas en células primarias de riñon de mono verde africano (AGMK) luego en el substrato celular MA104 y más tarde en AG KA Pasadas en Serie (SPAGMK) . Los substratos celulares MA104 y SPAGMK no son aprobados por las Autoridades Reguladoras Nacionales (NRA) para la producción de vacunas comerciales. De ahí que sea preferible adaptar la 116E e 1321 y otras cepas de la vacuna para rotavirus a un substrato celular aprobado, certificado, autorizado y completamente caracterizado como el substrato celular Vero y/o células diploides humanas como MRC-5. La O 02/11540 describe formulaciones de vacuna para rotavirus las cuales incluyen agentes amortiguadores aprobados para administración oral de vacunas para rotavirus.

Las formulaciones descritas en WO 02/11540 también incluyen compuestos para estabilizar las composiciones de vacuna contra la pérdida de potencia. Más específicamente, las composiciones descritas en WO 02/11540 comprenden una azúcar, fosfato y al menos un carboxilato. Las estabilidades logradas con las formulaciones de WO 02/11540 varían enormemente, y en especial a temperaturas por arriba de 20 grados Celsius, parecen mostrar pérdidas considerables de potencia. De acuerdo con esto, era un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones alternativas de un antígeno viral, preferiblemente composiciones de rotavirus, las cuales muestren una buena estabilidad. Los objetivos de la presente invención se solucionan mediante una composición que comprende un antígeno viral, una primera proteína diferente de dicho antígeno viral, dicha primera proteína se selecciona de albúmina de suero humano (HSA) y albúmina humana recombinante (rHA), una segunda proteína diferente de dicho antígeno viral, la cual segunda proteína es al menos parcialmente hidrolizada, dicha segunda proteína se selecciona de lactalbúmina . La segunda proteína confiere estabilidad mejorada a la formulación de vacuna que cualquiera de la proteína sola. En una modalidad la composición comprende además tres diferentes disacáridos, en donde preferiblemente, dichos tres diferentes disacáridos se seleccionan de sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, gentobiosa, melibiosa y turanosa. Cuando se usa sacarosa como azúcar primaria y azúcar secundaria se selecciona de la combinación de sacarosa, lactosa, maltosa y trehalosa. La combinación de azúcares a concentraciones particulares confiere además estabilidad a la formulación de vacuna que contiene aditivos de proteina. El término "azúcar primaria", como se usa en la presente, se entiende que se refiere a una azúcar que está presente en una composición con otras azúcares, a una cantidad mayor que cualquiera de las otras azúcares presentes. Tales otras azúcares también se mencionan en la presente como "azúcares secundarias". La "azúcar primaria" también se refiere en la presente como "azúcar a granel". En una modalidad dicha segunda proteina la cual está al menos parcialmente hidrolizada se selecciona de hidrolizado de lactalbúmina, hidrolizado de levadura, peptona, e hidrolizado de gelatina. En una modalidad dicha primera proteina está presente en la formulación en una cantidad en el rango de 0.1% (p/v) a 2% (p/v) , preferiblemente 0.1% (p/v) a 0.45 (p/v) y dicha segunda proteina la cual está al menos parcialmente hidrolizada está presente en la formulación, como hidrolizado al menos parcial, en una cantidad en el rango de 0.01% (p/v) a 10% (p/v). Preferiblemente, dichos tres diferentes disacáridos, o dicha azúcar primaria y dichas aL menos dos azúcares secundarias son una de las siguientes combinaciones: a) sacarosa, lactosa y maltosa, b) sacarosa, maltosa y trehalosa, c) sacarosa, lactosa y trehalosa, d) maltosa, lactosa y trehalosa. Preferiblemente, la cantidad de dichos tres diferentes disacáridos juntos en la formulación, es de 20% (p/v) a 70% (p/v) . En una modalidad preferida la cantidad de sacarosa, si está presente, es de 40% (p/v) a 55% (p/v) , preferiblemente 50% (p/v) , la cantidad de lactosa, si está presente, es de 0.1% (p/v) a 10.0% (p/v), preferiblemente 0.5% (p/v), la cantidad de maltosa, si está presente, es de 0.1% (p/v) a 10.0% (p/v), preferiblemente 0.5% (p/v), y la cantidad de trehalosa, si está presente, es de 0.1% (p/v) a 10.0% (p/v), preferiblemente 0.5% (p/v) . En una modalidad, dicho antigeno viral es un virus vivo, tal como virus atenuado vivo, en donde, preferiblemente, dicho virus vivo se selecciona del grupo que comprende rotavirus . Preferiblemente, dicho virus vivo es un virus vivo humano, tal como rotavirus humano. En una modalidad particularmente preferida dicho rotavirus humano es la cepa 116E ó I 321 del rotavirus.

En una modalidad, la composición de conformidad con ¦ la presente invención comprende un rotavirus vivo a una titulación en el rango de 104 a 107 FFU/0.5 mi, albúmina de suero humano en el rango de 0.1% (p/v) a 0.45% (p/v) , hidrolizado de lactalbúmina en el rango de 0.01% (p/v) a 10% (p/v) , y cualquiera de a) sacarosa en una cantidad en el rango de 40% a 55% (p/v) , y lactosa en una cantidad en el rango de 0.1% a 10.0% (p/v), y maltosa en una cantidad en el rango de 0.1% a 10.0% (p/v), o b) sacarosa en una cantidad en el rango de 40% a 55% (p/v) , y maltosa en una cantidad en el rango de 0.1% a 10.0% (p/v), y trehalosa en una cantidad en el rango de 0.1% a 10.0% (p/v) . En una modalidad la composición de conformidad con la presente invención comprende además un amortiguador para ajustar el pH a dicha composición a un valor en el rango de 6.8 a 7.8, en donde, preferiblemente, dicho amortiguador es un amortiguador de fosfato/citrato . En una modalidad la composición de conformidad con la presente invención se constituye en medio esencial Mínimo de Eagle, en donde, preferiblemente, la misma se amortigua en un amortiguador de fosfato/citrato a un pH entre 6.8 y 7.8. Preferiblemente, dicho amortiguador de fos fato/citrato es aproximadamente de 310 mM de fosfato y aproximadamente 100 mM de citrato.

En una modalidad la composición de conformidad con la presente invención es una vacuna. La preparación de formulación de vacuna presenta desafios significativos. Las interacciones entre los excipientes incorporados en la composición de vacuna determinan la estabilidad de la formulación. El enlace proteina e hidrógeno del azúcar necesita ser dominante para dar como resultado la estabilización de la vacuna. Los contactos efectivos de azúcar y vacuna de proteina antigénica deberán ser con una relación apropiada para mantener estable a la vacuna. Se requiere una concentración critica de azúcar para tener un número de enlace de proteina e hidrógeno de la azúcar para mantener estable la vacuna durante un periodo dado de tiempo, a una temperatura dada. 'Las azúcares tienen la capacidad de enlazar el hidrógeno a la membrana de fosfolipidos y proteínas sustituyéndolos por agua estructural. El presente estudio proporciona los estabilizadores utilizados para estabilizar el Rota-virus 116E e 1321 atenuado, vivo, contra 2-8°C, 25 °C y 37°C durante un período extendido de tiempo. La combinación apropiada de las azúcares y proteínas con el componente amortiguador preserva y permite la supervivencia y actividad del virus en un largo período de almacenamiento. Estos aditivos dan apoyo estructural al Rota Virus suspendido en el estado líquido. Se prefiere utilizar trehalosa como estabilizador en la formulación de la vacuna, puesto que la misma estabiliza la estructura de la proteina del virus y restaura la potencia en almacenamiento prolongado. La combinación de Sacarosa y Maltosa hace contactos efectivos de azúcar y proteina (vacuna) para mantener estable la vacuna. La albúmina de suero humano sustentada por Hidrolizado de lactalbúmina juega un papel importante en el contacto' efectivo de la azúcar y la proteina de vacuna para mantener estable la vacuna. Los objetivos de la presente invención también se solucionan mediante el uso de un antigeno viral, una primera proteina y una segunda proteina, cada una siendo como se define anteriormente, y, de manera opcional, tres diferentes disacáridos, como se definen anteriormente, para la fabricación de una composición de conformidad con la presente invención, preferiblemente para la fabricación de una vacuna, para el tratamiento o prevención de padecimientos asociados con virus, preferiblemente padecimientos asociados con rotavirus, tales como diarrea y gastroenteritis. Preferiblemente, dicho tratamiento o prevención comprende administrar tres dosis orales de una cantidad segura y efectiva de la composición a un infante de entre 8-20 semanas de edad en el momento de la dosis 1. Preferiblemente, el uso de conformidad con la presente invención es para la prevención de una infección por virus, preferiblemente una infección por rotavirus y/o gastroenteritis por rotavirus en humanos. Los objetivos de la presente invención también se solucionan mediante un método de tratamiento o prevención de padecimientos asociados con virus, preferiblemente padecimientos asociados con rotavirus en humanos administrando a un humano una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, el método de conformidad con la presente invención, comprende administrar tres dosis orales de una cantidad segura y efectiva de la composición a un infante de entre 8-20 semanas de edad en el momento de la dosis 1. En una modalidad el método de conformidad con la presente invención, para la prevención de una infección por virus, preferiblemente una infección por rotavirus y/o gastroenteritis por rotavirus en humanos. Los objetivos de la presente invención se solucionan mediante un método para adaptar un virus a una linea celular adecuada, tal como las células Vero, que comprende pasar en serie dicho virus a través de cultivos de dicha linea celular adecuada, cada pasada tiene lugar en un medio en la presencia de cloruro de calcio y tripsina. Preferiblemente, dicho cloruro de calcio está presente en el rango de 0.1 mg/1 a 1 mg/ml, y dicha tripsina está presente en el rango de 0.1 µg/ l a 30 g/ml. En una modalidad dichas pasadas en serie comprende 2-20 pasadas, preferiblemente 2-5 pasadas. Preferiblemente, cada pasada se realiza durante un periodo de tiempo en el rango de 24 horas a 10 días. Preferiblemente, dicho virus es el rotavirus humano . Los presentes inventores han encontrado que incluyendo una primera proteina seleccionada de albúmina de suero humano, albúmina humana recombinante y una segunda proteina la cual es al menos parcialmente hidrolizada en una composición farmacéutica, se puede mejorar la estabilidad de esta composición con respecto a su potencia viral. Especialmente a temperaturas de 25°C y 37°C, las composiciones de conformidad con la presente invención muestran una estabilidad mejorada. La frase "la segunda proteina es al menos parcialmente hidrolizada", como se usa en la presente, significa que se refiere a un escenario, en el cual esta segunda proteina al menos se ha dividido parcialmente en sus respectivos bloques componentes de aminoácidos. La frase antes mencionada por lo tanto también significa que incluye escenarios, en donde la segunda proteina no existe más como una molécula completa, sino solamente como una colección de fragmentos de la misma. La frase antes mencionada significa que también incluye un escenario en donde la segunda proteina está completamente hidrolizada. También significa que todos estos escenarios se incluirán en la frase "hidrolizado de proteina", tal como "hidrolizado de lactalbúmina" , la cual puede incluir una proteina completamente hidrolizada, es decir una proteina dividida en sus respectivos aminoácidos, o una proteina parcialmente dividida, de tal manera que exista una colección de péptidos y aminoácidos. Tales hidrolizados de proteina se pueden hacer fácilmente por alguien de experiencia en la técnica, por ejemplo mediante hidrólisis con ácido, o los mismos se pueden obtener comercialmente . El efecto estabilizador logrado mediante la presencia de la primera .proteina y la segunda proteina se mejora opcionalmente por la presencia de una combinación de tres diferentes disacáridos, o de una combinación de una azúcar primaria y al menos dos azúcares secundarias. Las combinaciones preferidas' son sacarosa, lactosa y maltosa, y sacarosa, maltosa y trehalosa. Las composiciones de conformidad con la presente invención pueden usarse como una vacuna para la vacunación contra infección por virus y padecimientos asociados con virus. Preferiblemente, estas composiciones se amortiguan a un pH apropiado, usualmente entre 6 y 8, preferiblemente entre 6.8 y 7.8. Por ejemplo, en una modalidad, la composición de conformidad con la presente invención puede formularse en medio esencial mínimo de Eagle.

Preferiblemente, esta composición se amortigua, por ejemplo utilizando un amortiguador de fosfato/citrato . Los presentes inventores también han diseñado un método para adaptar un virus a una linea celular adecuada, el cual método puede utilizarse por ejemplo con el rotavirus. Tal método se realiza haciendo pasar en serie el virus a través de cultivos celulares, en donde la pasada tiene lugar en la presencia de cloruro de calcio y tripsina. Esto permite una manera fácil de adaptar el virus a una linea celular dada y además hace posible la producción de virus a altas titulaciones . Más específicamente y a manera de ejemplo, los presentes inventores han adaptado las cepas 116E e 1321 del rotavirus a células Vero para producir cosechas de rotavirus de alta titulación y además han caracterizado las 116E e 1321 adaptadas para hacer composiciones de vacuna para rotavirus, líquidas, monovalentes, vivas, estables. Antes de la vacunación, se da una composición antiácida oral de amortiguador de citrato-bicarbonato para amortiguar la acidez estomacal del niño. Todas las cepas de vacuna para rotavirus, reportadas hasta la fecha son cepas de rotavirus ya sea naturales, vivas, de humano-bovino, atenuadas natural o artificialmente, o cepas de bovino-humano genéticamente modificadas, con varias combinaciones de VP4, VP7 y otros genes de cepas de rotavirus humano, bovino. Las cepas de rotavirus 116E (G9P[11] e 1321 (G10P[11]) son un reclasificado humano-bovino, natural, naturalmente atenuado y confiere un nivel sustancial de inmunidad en infantes y niños menores. También la capacidad de la cepa 116E de replicarse en recién nacidos sin provocar padecimientos en la presencia de altas titulaciones de anticuerpo maternal lo hace un candidato de vacuna para rotavirus, monovalente, naturalmente atenuado, vivo, más prometedor. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas de virus, preferiblemente rotavirus, la cuales muestran alta estabilidad y longevidad especialmente a temperaturas por arriba de 20 °C. La presente invención también proporciona un método para adaptar el rotavirus, por ejemplo las cepas 116E (G9P [11]) e 1321 (G10P[11]) de rotavirus naturalmente atenuado, de reclasificado humano-bovino, natural, a células adecuadas, por ejemplo células Vero. El método incluye dosis optimizada de tripsina (0.1 ug/ml a 30 ug/ml) y/o cloruro de calcio (100 ug/ml a 1000 pg/ml) para la activación del virus y medio de mantenimiento del virus donde la alta titulación (104 a 108 FFU/ml) de cosecha de virus, está dentro de uno a diez días. También se concibe el uso de las cepas adaptadas para hacer la composición de vacuna para rotavirus, liquida, monovalente, viva, estable. Además, la presente invención proporciona el uso de un antigeno viral, una primera proteina, una segunda proteina y, opcionalmente , una combinación de tres diferentes disacáridos para la fabricación de una composición de conformidad con la presente invención para el tratamiento o prevención de padecimientos asociados con virus, preferiblemente padecimientos asociados con el rotavirus. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS: Figura 1: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus con diferentes estabilizadores después de almacenamiento a 2-8°C durante 50 semanas. Figura 2: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus con diferentes estabilizadores después de almacenamiento a 25°C. Figura 3: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus con diferentes estabilizadores después de almacenamiento a 37°C. Figura 4: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 1. Figura 5: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 2. Figura 6: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 3.

Figura 7: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 4. Figura 8: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 5. Figura 9: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 6 y Figura 10: Datos de estabilidad para la formulación liquida de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C para la muestra 7. Figura 11: Datos de estabilidad para la formulación liofilizada de rotavirus después de almacenamiento a 2-8°C, 25°C y 37°C durante 50 semanas para la muestra 1-4. Figura 12: Ensayo cuantitativo (Ensayo con Inmunoperoxidasa) de cosecha de virus adaptada a diferentes concentraciones de tripsina . Figura 13: Electroferotipificación de ARN 116E en gel de poliacrilamida al 10% visualizado con tinción de plata. Perfil del Carril: 1 Rotavirus 116E, Referencia SPAG K 2 Rotavirus 116E, Lote final # 61 4004 3 Mezcla de [Rotavirus 116E, Referencia SPAGMK + Rotavirus 116E, Lote final # 61 4004] 4 Rotavirus 116E Lote final # 61 4004 5 Rotavirus 116E, Referencia SPAGMK 6 Rotavirus 116E, Lote a granel # 61BP4004 7 Rotavirus 116E, Banco de Virus de Trabajo Figura 14: Electroferotipificación de Rotavirus 1321 en gel de poliacrilamida al 10% visualizado con tinción de plata. Perfil del Carril: 1 Rotavirus 1321, Referencia SPAGMK 2 Rotavirus 1321, Lote final # 64 4004 3 Mezcla de [Rotavirus 1321, Referencia SPAGMK + Rotavirus 1321, Lote final # 64 4004] 4 Rotavirus 1321 Lote final # 64 4004 5 Rotavirus 1321, Referencia SPAGMK 6 Rotavirus 1321, Lote a granel # 64BP4004 7 Rotavirus 1321, Banco de Virus de Trabajo DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A medida que se necesite, se describen en la presente modalidades de la presente invención; sin embargo, se entenderá que las modalidades descritas son solamente ejemplificantes de la invención, las cuales se pueden incorporar de varias formas. Por lo tanto, los detalles estructurales y funcionales, específicos, descritos en la presente no se interpretaran como limitantes, sino meramente como una base para las reivindicaciones y como una base representativa para enseñar a un experto en la técnica a emplear de diversos modos la presente invención en virtualmente cualquier estructura apropiadamente detallada. Además, no se pretende que los términos y frases utilizados en la presente sean limitantes sino más bien que proporcionen una descripción comprensible de la invención. El término "un", como se usa en la presente, se define como uno o más de uno. El término "pluralidad", como se usa en la presente, se define como dos o más de dos. El término "otro", como se usa en la presente, se define como al menos un segundo o más. Los términos "que incluyen" y/o "que tienen", como se usan en la presente, se definen como que comprenden (es decir, lenguaje abierto). El rotavirus humano exhibe un rango hospedero muy estrecho de cultivo de tejido. Como consecuencia, el aislamiento y pasada en serie de varias cepas usualmente se realiza en cultivos celulares tales como MA-104 de simio o riñon de mono primario (AGMK) , ambos de los cuales son inadecuados para la producción de la vacuna. Las células antecesoras no se han validado como un substrato para la producción de la vacuna y las células predecesoras son notorias por su contaminación con varios agentes microbianos de simio incluyendo los retrovirus. Muchos rotavirus bien caracterizados se han aislado, pasado en serie y purificado en placas por triplicado en sistemas de cultivo de células de laboratorio, disponibles comercialmente, no son adecuados para la producción de la vacuna. En aquéllos casos donde era necesario utilizar tales virus en el desarrollo de la vacuna, los virus . se pasaron subsecuentemente y se clonaron biológicamente en un substrato celular certificado para el desarrollo y producción de la vacuna. En el mejor de los casos, el virus que se utilizara en vacunas deberá aislarse y pasarse solamente en células de cultivo de tejido, certificadas por ser aceptables para la producción de la vacuna. La linea celular Vero y la linea celular MRC-5 cumplen este requerimiento debido que las mismas apoyan el crecimiento eficiente de los rotavirus . La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un antigeno viral y a un método de adaptación de reclasificado natural de humano-bovino, del rotavirus, y las cepas 116E (G9P[11]) e 1321 (GlOPfll]) naturalmente atenuadas a las células Vero. Las cepas originales 116E e 1321 de la vacuna para rotavirus se adaptaron al substrato celular AGMK, MA104 y SPAGMK. La SPAGMK es una linea celular no aprobada por la Autoridad Reguladora Nacional (NRA) para la producción comercial de vacunas. Por lo tanto fue preferible no solamente adaptar las cepas (116E, 1321) de la vacuna para rotavirus, a las células Vero similares a los substratos celulares, células diploides humanas, MRC-5, etc., aprobadas por la NRA, sino también lograr la cosecha de alta titulación del virus dentro de la duración más corta posible para la producción comercial de la vacuna para rotavirus. Conforme a los datos disponibles en la literatura científica, se estudiaron varios métodos de adaptación pero no se encontraron satisfactorios en términos del rendimiento de la cosecha de virus y período de tiempo. El nuevo método de adaptación del virus en el cual el uso de cloruro de calcio y tripsina a varias concentraciones durante diferentes períodos de tiempo, para la activación del virus y en medio de mantenimiento estandarizado por nosotros, se prefirió para la producción en masa de las cepas de la vacuna para rotavirus. Para la composición oral de la vacuna para rotavirus, el virus se estabiliza en una composición que comprende una primera proteína seleccionada de albúmina de suero de humano, albúmina humana recombinante, albúmina de suero de bovino y albúmina de suero de porcino, y una segunda proteína la cual está al menos parcialmente hidrolizada, dicha segunda proteína se selecciona de lactalbúmina humana, lactalbúmina bovina y lactalbúmina porcina. Opcionalmente y de manera preferible, la composición también comprende una combinación de tres diferentes disacáridos, dichos tres diferentes disacáridos, se seleccionan de sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, gentobiosa, melibiosa y turanosa. Los componentes adicionales que pueden agregarse a la composición incluyen gelatina, hidrolizado de gelatina, casitona, D-sorbitol, aminoácidos, tales como alanina, histidina, arginina, glutamina y antibióticos. Antes de la administración de la vacuna se administra de manera oral una composición antiácida, por ejemplo un amortiguador de citrato-bicarbonato para amortiguar la acidez estomacal, y para asegurar el suministro de la vacuna activa. De acuerdo con una modalidad, se logró una adaptación de las cepas 116E e 1321 de la vacuna para rotavirus al substrato celular Vero (Número ATCC - CCL-81) para una cosecha titulación elevada dada dentro de diez dias mediante la estandarización de la concentración del cloruro de calcio que varia de 100 pg/ml a 1000 g/ml y/o concentración de tripsina que varia de 0.1 g/ml a 30 g/ml a diferentes intervalos de tiempo de la cosecha del virus. El rendimiento de la cosecha del virus se ensayó con ELISA asi como en términos de titulaciones de infectividad del virus en un substrato celular adecuado midiendo las Unidades Formadoras de Focos (FFU)/ml. Se sabe en la técnica que la infectividad del rotavirus se intensifica mediante escisión con tripsina de VP4 en VP5 y VP8 (7,8). El VP5 permeabiliza la membrana celular hospedera para la entrada del rotavirus. El virus del rotavirus adaptado, candidato de la vacuna se caracterizó además sometiéndolo a electroferotipificación (Figuras 13 y 14) y secuenciación de nucleótidos (datos no mostrados). Los anticuerpos se incrementan contra las cepas de la vacuna para rotavirus siguiendo el protocolo estándar para la preparación de propósitos de inmunodiagnóstico e inmunoterapia . Las cepas de la vacuna para rotavirus se detectan mediante reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) en donde el ácido nucleico que hibridiza selectivamente el gen VP4 y VP7 y/o gen VP4 y VP7, se amplifica utilizando cebadores delanteros y reversos para el gen VP4 (Tipo Pll) y/o gen VP7 y un segundo cebador, ya sea dentro del gen (GP9 [11], G10P [11] VP4 y/o gen VP7, o localizado en un gen adyacente. Los siguientes ejemplos se incluyen solamente para ayudar a un entendimiento más completo de la invención descrita y reivindicada en la presente. Los ejemplos no limitan de ninguna manera el alance de la invención reivindicada . EJEMPLO 1 Las cepas 116E ( GP9 [11]) e 1321 (GlOPfll]) originales de la vacuna para rotavirus, se suministraron por NIAID, NIH, Bethesda, USA a Bharat Biotech International Limited como las cepas del Material de Partida para la Vacuna, se hicieron crecer en substrato celular AGMK, MA104 y SPAGMK. Para la producción comercial de la vacuna para rotavirus estas cepas de rotavirus se adaptaron al substrato celular Vero y células diploides humanas, substrato celular MRC-5 mediante pasadas en serie del rotavirus. La concentración del cloruro de calcio que varia de 100 µg/ml a 1000 g/ml y/o concentración de tripsina que varia de 0.1 µg/ l a 30 g/ml, se evalúa para la activación del rotavirus y en medio de mantenimiento durante periodos de tiempo que varían de 24 horas a 10 días para cosecha de virus de- alta titulación, en cada pasada viral en el substrato celular. El rendimiento del virus en sobrenadante de cultivo celular se ensaya con equipo Rotaclone ELISA para la detección del antígeno del rotavirus en pozos ELISA pre-revestidos con anticuerpos anti-rotavirus . La titulación de infectividad de la recolección del rotavirus se titula en términos de Unidad Formadora de Focos (FFU)/ml mediante Ensayo con inmunoperoxidasa. En pocas palabras, el ensayo con inmunoperoxidasa para titulaciones de infectividad de rotavirus, se estimaron haciendo crecer capas confluentes de células MA104 en placas de cultivo de tejido de 24 pozos. Las células se lavaron entonces dos veces e infectaron con Rotavirus activado, se diluyeron (diluciones Log), adecuaron e incubaron durante 12 horas. Después de la incubación las células se fijaron en Formalina al 3.5% y probaron con antisuero de Rotavirus. Para esto el Anticuerpo secundario conjugado HRPO se etiqueta y tiñe utilizando AEC Chromogen . La cosecha máxima de rotavirus se podría lograr, variándola de 106 - 188 FFU/ml a varias concentraciones de tripsina dentro de uno a diez días (Figura 12). EJEMPLO 2 Las cepas 116E e 1321 del rotavirus se pueden caracterizar mediante una serie de métodos, los cuales son conocidos para un experto en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a RT-PCR, hibridación con ARN, análisis de secuencia y agrupamiento genérico, es decir electroferotipificación de ARN. El rotavirus de las cepas 116E e 1321 tienen distinto patrón de electroforesis híbrida ARN/ARN, en comparación con otras cepas de rotavirus. Las mismas tienen genoma de ARN de doble hebra (dsARN) que consiste de 11 segmentos que varían en peso molecular de aproximadamente 2.0 x 106 a 0.2 x 106 kilo Daltons, fuera de lo cual la proteína VP4 es de 88, 000 Daltons, VP6 es de 44,000 Daltons y VP7 es de 38000 Daltons. La sutil diferencia en la movilidad de los 11 segmentos genómicos, produce un patrón característico de banda Electroforética . El patrón de banda electroforética de las cepas 116E e 1321 del rotavirus se puede verificar mediante el aislamiento del dsARN genómico mediante el método de Fenol-Clor.oformo seguido por purificación con matriz de intercambio aniónico CC41. El dsARN purificado se somete a electroforesis en Gel de poliacrilamida al 10% seguido por tinción con plata para ácidos nucleicos. El patrón de banda de 11 segmentos se puede comparar con el Estándar de referencia del Rotavirus 116E e 1321 (Figura 13 y 14). EJEMPLO 3 Las cepas 116E e 1321 del rotavirus se pueden detectar utilizando reacción en cadena la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) . Generalmente, la RT-PCR comprende poner en contacto el ARN que se obtiene de una muestra que contiene virus con cebadores, el cual se hibridiza selectivamente con la secuencia del gen VP4 (tipo Pll) y/o gen VP7 (tipo G9/G10) y sintetizando la primera hebra del producto RT-PCR. Un segundo conjunto de cebadores, ya sea dentro del gen VP4 y/o gen VP7, o localizado en un gen adyacente, podría servir como el cebador para la segunda síntesis de la hebra. Los cebadores pueden tener substituciones siempre que existan suficientes bases complementarias para la hibridación selectiva. EJEMPLO 4 El siguiente ejemplo no limitativo se presenta para ilustrar mejor la estabilidad de la formulación líquida preparada para la Vacuna oral para rotavirus, atenuada naturalmente, viva (116E y/o 1321) . Los estabilizadores son excipientes farmacéuticos generales y/o compuestos químicos específicos, los cuales interactúan y estabilizan las moléculas biológicas, agregadas a la vacuna y se usan en conjunción con el almacenamiento a temperatura más baja. La estabilidad del rotavirus a diferente rango de temperatura de 2-8°C, 25°C y 37°C se probaron en múltiples combinaciones de estabilizador. Las Células Vero infectadas con rotavirus se cosechan, clarifican y purifican en estabilizadores y se formulan como preparación liquida. El mismo lote de rotavirus cosechado de células Vero infectadas, se utiliza en diferentes formulaciones de dosis. Las preparaciones líquidas de vacunas para rotavirus se incuban entonces a 2-8°C, 25°C y 37°C para estudios de estabilidad acelerada. Para el estudio de estabilidad de tiempo real, las preparaciones líquidas de vacunas para rotavirus, se incuban a 2-8°C durante 12 meses. Después de estas incubaciones, las titulaciones de virus se midieron mediante Ensayo con inmunoperoxidasa . Además, se produjo una serie de muestras para llegar a la composición de conformidad con la presente invención: La Muestra 1 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 m de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Lactosa - 0.5%, Maltosa - 0.5%, albúmina de suero humano - 0.4% e hidrolizado de lactalbúmina - 0.05% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10? 6"02 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, no muestra descenso en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 4) La muestra 1 a 25°C es estable hasta 14 semanas y después de esto se observa un descenso de 0.5 log en la titulación después de 24 semanas (Fig. 2 & 4) La muestra 1 a 37°C muestra un descenso en la titulación de 0.7 log después de 3 semanas, además un descenso de 1.41 log después de 6 semanas, y además un descenso de 1.28 log después de 8 semanas y además un descenso de 0.11 log después de 10 semanas (Fig. 3 & 4) La Muestra 2 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 m de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Maltosa - 0.5%, Trehalosa -0.5%, albúmina de suero humano - 0.4% e hidrolizado de lactalbúmina ¦ - 0.05% a un pH de 7.4, tuvo 0 días de titulación de 10? 6·41 FFU/0.5 mi y a 2-8°C muestra un descenso de 0.06 log en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 5) La muestra 2 a 25°C muestra un descenso de 0.91 log después de 24 semanas. (Fig. 2 & 5) La muestra 2 a 37°C muestra un descenso de 0.94 log después de 3 semanas, un descenso adicional de 1.78 log después de 6 semanas, un descenso adicional de 3.18 log después de 8 semanas, no hubo un descenso en la titulación de la 8a semana a la 10a semana y un descenso adicional de 3.15 log después de 10 semanas. (Fig. 3 & 5) La Muestra 3 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 mM de fosfato y 100 m de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Maltosa - 0.5%, Trehalosa -0.95%, albúmina de suero humano - 0.4% e hidrolizado de lactalbúmina - 0.05% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10? 6-22 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, no muestra descenso en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 6) La muestra 3 a 25°C no muestra descenso hasta las 12 semanas y después de 24 semanas muestra un descenso de 0.88 log en la titulación. (Fig. 2 & 6) La muestra 3 a 37°C muestra un descenso de 0.87 log después de 3 semanas y un descenso adicional de 0.52 log después de 6 semanas un descenso adicional de 1.27 log después de 10 semanas y un descenso adicional de 1.0 log después de 12 semanas y descendió adicionalmente a 0.3 log después de 14 semanas (Fig. 3 & 6) La Muestra 4 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 mM de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Maltosa - 0.5%, Lactosa - 0.5%, albúmina de suero humano - 0.4% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10? 6·'19 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, no muestra descenso en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 7) La muestra 4 a 25°C muestra un descenso de 0.53 log en la titulación después de 6 semanas y un descenso adicional de 0.42 log después de 10 semanas y un descenso adicional de 0.05 log en la titulación después de 16 semanas y un descenso adicional de 1.73 log después 24 semanas. (Fig. 2 & 7) La muestra 4 a 37°C muestra un descenso de 1.96 log en la titulación después de 3 semanas y un descenso adicional de 1.43 log en la titulación después de 6 semanas. (Fig. 3 & 7) La Muestra 5 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 mM de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 40%, Maltosa - 5%, e Hidrolizado de lactalbúmina - 1.0% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10? 6"35 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, no muestra descenso en la titulación después de 16 semanas y un descenso de 0.15 log después de 50 semanas. (Fig. 1 & 8) La muestra de 5 a 25°C muestra un descenso de 0.46 log en la titulación desde el día 0 de la titulación después de 6 semanas. Se observa un descenso adicional de 0.62 log en la titulación después de 10 semanas. Se observa un descenso adicional de 0.78 log en la titulación después de 16 semanas y un descenso adicional de 2.06 log después de 24 semanas. (Fig. 2 & 8) La muestra 5 a 37°C muestra un descenso de 1.04 log en la titulación después de 3 semanas desde el día 0 de la titulación y un descenso adicional de 1.58 log en la titulación después de 6 semanas. (Fig. 3 & 8) La Muestra 6 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 mM de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Maltosa - 0.5%, Trehalosa - 0.5% y albúmina de suero humano - 0.4% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10? 6?9 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, no muestra descenso en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 9) La muestra 6 a 25°C muestra un descenso de 0.32 log en la titulación desde el día 0 de la titulación después de 6 semanas. Se observa un descenso adicional de 0.46 log en la titulación después de 8 semanas. Se observa un descenso adicional de 0.82 log en la titulación después de 16 semanas y un descenso adicional de 1.36 log después de 24 semanas. (Fig. 2 & 9) La muestra 6 a 37°C muestra un descenso de 2.17 log en la titulación después de 3 semanas desde el día 0 de la titulación y un descenso adicional de 1.18 log en la titulación después de 6 semanas. (Fig. 3 & 9) La Muestra 7 formulada con medio esencial mínimo de Eagle, amortiguada en 310 mM de fosfato y 100 mM de citrato que contiene Sacarosa - 50%, Trehalosa - 0.5%, e Hidrolizado de lactalbúmina - 0.05%, Albúmina de Suero humano - 0.4% a pH de 7.4, tuvo una titulación de 0 días de 10?. 6·34 FFU/0.5 mi y a 2-8°C, muestra un descenso de 0.24 log en la titulación después de 50 semanas. (Fig. 1 & 10) La muestra 7 a 25°C muestra un descenso de 0.67 log en la titulación desde el día 0 de la titulación después de 6 semanas. Se observa un descenso de 3.43 log en la titulación después de 24 semanas. (Fig. 2 & 10) La muestra 7 a 37 °C muestra un descenso de 3.24 log en la titulación después de 8 semanas desde el día 0 de la titulación. (Fig. 3 & 10) Las Muestras 1-4 liofilizadas muestran estabilidad a 2-8°C, 25°C y 37°C hasta 50 semanas sin ningún descenso en la titulación (Fig. 11). Los estabilizadores utilizados son las combinaciones de 0.1% a 1.0% de HAS, 1% de SPG (= sacarosa fosfato glutamato) , 1.2% de L-Arginina, 1% de D-Sorbitol, 1% de Gelatina y 2% de Trehalosa. (fig. 11) Se puede ver a partir de las figuras 1-6 que las muestras de conformidad con la presente invención, particularmente las muestras 1-3 muestran una longevidad y estabilidad mucho mejores a temperaturas elevadas por arriba de 25°C, especialmente durante periodos más prolongados de tiempo. De ahi que, las combinaciones particularmente preferidas de conformidad con la presente invención, incluyan albúmina de suero humano como la primera proteina, hidrolizado de lactalbúmina como la segunda proteina, y sacarosa, maltosa, trehalosa, o sacarosa, maltosa, lactosa como la combinación de los tres diferentes disacáridos. EJEMPLO 5 El agente amortiguador o agentes neutralizantes de ácidos necesitan darse oralmente antes de la administración de la formulación oral de la vacuna para rotavirus, atenuada naturalmente, viva, liquida, para neutralizar la acidez estomacal. El agente amortiguador no se limita a amortiguador de citrato-bicarbonato, amortiguador de fosfato, succinato, lactato, maleato, fumarato, etc. Composición Amortiguadora, Neutralizante de Ácidos (gramos/litro): Citrato de Sodio 9.6, Bicarbonato de Sodio 25.6, pH de 6.5 a 8.8 La capacidad neutralizante de ácidos (ANC) del amortiguador neutralizante de ácido se puede medir mediante la prueba USP. La ANC del amortiguador de citrato-bicarbonato puede ser de 0.35 a 0.50 mEq/ml. Se puede estudiar el efecto del Amortiguador de Citrato-Bicarbonato (CB) en la Infectividad de la Vacuna Monovalente para Rotavirus en la presencia y ausencia de Jugo Gástrico simulado (34.8 mEq de HC1 como Jugo Gástrico simulado) . La formulación de la vacuna para rotavirus junto con el amortiguador de citrato-bicarbonato en la presencia de 34.8 mEq de HC1 como Jugos Gástricos simulados desciende 0.1 a 0.2 log en la titulación del rotavirus dentro de dos horas. EJEMPLO 6 Para la preparación de la formulación liofilizada de la vacuna para rotavirus, el rotavirus se estabiliza en la composición estabilizadora de conformidad con la presente invención como se ejemplifica en el Ejemplo 4. Para la liofilización se dializa ya sea el rotavirus a granel en el estabilizador para la remoción total del medio de cultivo de tejido o el rotavirus a granel se diluye 8-15 veces en el estabilizador. La formulación ha mostrado buenos resultados de los estudios de estabilidad. En la especificación precedente, se han descrito modalidades especificas de la presente invención. Sin embargo, alguien de experiencia ordinaria en la técnica aprecia que se pueden hacer varias modificaciones y cambios sin apartarse del alcance de la presente invención como se establece en las reivindicaciones más adelante. De acuerdo con esto, la especificación y figuras se apreciarán en un sentido ilustrativo más que restrictivo, y se pretende que el total de tales modificaciones se incluyan dentro del alcance de la presente invención. Los beneficios, ventajas, soluciones a problemas, y cualquier elemento (s) que pueda provocar algún beneficio, ventaja, o solución que ocurra o sea más pronunciado, no se interpretara como un aspecto o elemento critico, requerido o esencial de cualquiera o todas las reivindicaciones. La invención se define solamente mediante las reivindicaciones anexadas incluyendo cualquier enmienda hecha durante la espera en que esta solicitud y todos los equivalentes de aquellas reivindicaciones se presenten. Los aspectos de la presente invención descrita en la especificación, las reivindicaciones y/o en los dibujos acompañantes, pueden, ambos por separado, y en cualquier combinación de los mismos, ser el material para realizar la invención en varias formas de la misma.

REFERENCIAS 1. Parashar UD, Hummelman EG, Bresee JS, Miller MA, Glass RI . Global illeness and deaths caused by rotavirus disease in children. Emerg Infect Dis 2003; 9, 565-72. 2. World Health Organization (WHO) . Report of the meeting on future directions for rotavirus vaccine research in developing countries. Geneva:WHO, 2000:1-56. 3. Bresee JS, Hummeman E, Nelson AS, Glass RI . Rotavirus in Asia: The valué of surveillance for informing decisions about the introduction of new vaccines . J Infect Dis 2005; 192: Sl-S5. 4. Glass RI, Bhan MK, Ray P, Bahal R, Parashar UD, Greenberg H, Rao DC, Bhandari N, Maldonado Y, Ward RL, Bernstein DI, Gentsch JR. Development of candidate rotavirus vaccines derived from neonatal strains in India. J Infect Dis 2005; 192: S30-S35. 5. Glass RI, Gentsch, Bhan MK, Bimal K. Rotavirus strain G9P11. United States Patent, Patent Number 5,773,009, Jan 30, 1998. 6. Jagannath MR, Vethanayagam Reddy BS, Raman S, Rao D. Characterization of human symptomatic rotavirus solates MP409 and MP480 having xlong' RNA electropherotype and subgroup I specificity, highly related to the P6[l], G8 type bovine rotavirus A5, from Mysore, India. Arch . Virology 2000, 145: 1-19. 7. López S, Arias CF, Bell JR, Strauss JH, and Espejo RT . Primary structure of the cleavage site associated with trypsin enhancement of rotavirus SA11 infectivity. Virology 1985, 144:11-19. 8. Ericson BL, Graham DY, Masón BB and Estes MK. Two types of glycoprotein precursors are produced by simian rotavirus SA11. Virology 1983, 127:320-332. 9. Denisova E, Dowling W, LaMonica R, Shaw R, Scarlata S, Ruggeri F, and Mackow ER. Rotavirus capsid protein VP5 permeabilizes membranes . Journal of Virology 1999, 73:3147-3153. 10. Gentsch JR, Glass RI, Woods P, et. al. Identification of group A rotavirus gene 4 type by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992, 30:1365-73. 11. Gentsch JR, Das BK, Jiang B, Bhan MK, and Glass RI . Similarity of the VP4 protein of human rotavirus stra n 116E to that of the bovine B223 strain. Virology 1993, 194 ,: 424-430. 12. Stability of Pseudorabies virus during freeze drying and storage: Effect of suspending media" Ellen M Scott and W. Wood side. Journal of Clinical Microbxology. July 1976. p 1-5. Vol. 4

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Una composición caracterizada en que comprende un antigeno viral, una primera proteína diferente de dicho antígeno viral, dicha primera proteína se selecciona de albúmina de suero humano y una segunda proteína diferente de dicho antígeno viral, la cual segunda proteína está al menos parcialmente hidrolizada, dicha segunda proteína se selecciona de hidrolizado de lactalbúmina, hidrolizado de levadura, peptona, hidrolizado de gelatina, e hidrolizado de proteína de huevo, y tres diferentes disacáridos.
2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada en que dichos tres diferentes disacáridos se seleccionan de sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, gentobiosa, melibiosa y turanosa.
3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada en que comprende además una azúcar primaria y al menos dos azúcares secundarias, en donde las azúcares primarias y secundarias se seleccionan independientemente de una lista que comprende sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, gentobiosa, melibiosa, celobiosa y turanosa.
4. - La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada en que la azúcar primaria es sacarosa y al menos una de las azúcares secundarias es lactosa .
5. - La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada en que la azúcar primaria es sacarosa la cual está presente en aproximadamente de 40% (p/v) a 55% (p/v) , más preferiblemente de 50% (p/v) .
6. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizada en que al menos una de las azúcares secundarias es maltosa la cual está presente aproximadamente de 0.1% (p/v) a 10.0% (p/v), preferiblemente 0.5% (p/v) .
7. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada en que los tres diferentes disacáridos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones' 2-3, ó la azúcar primaria y al menos las dos azúcares secundarias de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-7, son una combinación seleccionada de la lista de las siguientes combinaciones: a) sacarosa, lactosa y maltosa b) sacarosa, maltosa y trehalosa c) sacarosa, lactosa y trehalosa d) maltosa, lactosa y trehalosa.
8. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada en que la concentración combinada de las azúcares o disacáridos es de aproximadamente 20%-75% (p/v) .
9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada en que la concentración de la respectiva azúcar si se incluye en la composición, es como sigue: sacarosa aproximadamente de 40% a 55% (p/v) , de manera preferible de 50% (p/v) , lactosa aproximadamente de 0.1% a 10.0% (p/v) de manera preferible de 0.5% (p/v), maltosa aproximadamente de 0.1% (p/v) a 10% (p/v) de manera preferible 0.5% (p/v), trehalosa aproximadamente de 0.1% (p/v) a 10.0% (p/v) de manera preferible de 0.5% (p/v) .
10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que dicha primera proteina está presente en la formulación en una cantidad en el rango de 0.1% (p/v) a 0.45% (p/v) y dicha segunda proteina la cual está al menos parcialmente hidrolizada está presente en la formulación, como un hidrolizado al menos parcial, en una cantidad en el rango de 0.01% (p/v) a 10% (p/v) .
11. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que ' comprende además un amortiguador para ajustar el pH de dicha composición, preferiblemente en un valor en el rango de 6.8 a 7.8.
12. - La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada en que dicho amortiguador es un amortiguador de fosfato.
13. - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada en que la concentración de fosfato está entre 310 mM y 400 mM.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada en que dicho amortiguador es un amortiguador de citrato.
15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada en que la concentración de citrato está entre 25 mM a 150 mM.
16. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizada en que el amortiguador es un amortiguador de fosfato-citrato a un pH de aproximadamente 6.8 a 7.8, y en donde preferiblemente la concentración de fosfato es de aproximadamente 310 mM y la concentración de citrato es de aproximadamente 100 mM.
17. - La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada en que dicho amortiguador es un amortiguador de citrato/carbonato a un pH de entre 6.8 y 7.8.
18. - La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada en que dicho amortiguador es un amortiguador de sacarosa/fosfato/glutamato a un pH de entre 6.8 y 7.8.
19. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que comprende además al menos un diluyente seleccionado de una lista que comprende medio de cultivo de tejido, salina normal, salina amortiguada con fosfato y agua.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada en que el diluyente es Medio Mínimo Esencial de Eagle.
21. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que dicho antígeno viral es un virus vivo, tal como un virus vivo, atenuado de manera natural.
22. - La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada en que dicho virus vivo se selecciona del grupo que comprende los rotavirus.
23. - La' composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-22, caracterizada en que dicho virus vivo es un virus vivo humano, tal como rotavirus humano, rotavirus bovino, rotavirus porcino y reclasificado o virus re-arreglado de humano-bovino.
24. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada en que dicho rotavirus humano es un reclasificado de humano-bovino natural, preferiblemente la cepa 116E ó 1321 del rotavirus.
25. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada en que comprende un rotavirus vivo a una titulación en el rango de 104 a 107 FFU/0.5 mi.
26.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que es una vacuna.
27.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que es una vacuna liquida.
28. - La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada en que dicha composición es estable bajo al menos una de las siguientes condiciones: durante 3 semanas a 37°C, durante seis meses a 25°C, durante un año a 2°C-8°C.
29. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la cual es una vacuna liofilizada.
30. - La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada en que comprende un antigeno viral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-30, albúmina de suero humano, Gelatina, al menos un disacárido tal como maltosa, trehalosa, lactosa, al menos un aminoácido tal como L-Glutamina, L-Arginina, al menos un alcohol de azúcar, tal como D-manitol o D-Sorbitol, en donde cada uno de los componentes antes mencionados está en un rango de concentración de 0.1% a 10% (p/v) , en un amortiguador de portador aceptado farmacéuticamente.
31. - La composición liofilizada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-30, caracterizada en que dicha composición es estable durante más de 50 semanas a 2°C-8°C, 25°C, 37°C.
32. - El uso de un antigeno viral, una primera proteina y una segunda proteina, cada una siendo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-31 y tres diferentes sacáridos, para la fabricación de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, preferiblemente para la fabricación de una vacuna, para el tratamiento o prevención del virus asociado, preferiblemente enfermedades asociadas con rotavirus, tales como diarrea y gastroenteritis .
33. - El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque dicho tratamiento o prevención comprende administrar no más de tres dosis orales de una cantidad segura y efectiva de la composición a un infante de entre 8-20 semanas de edad en el momento de la dosis 1.
34. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-33, para la prevención de una infección por virus, preferiblemente una infección por rotavirus y/o gastroenteritis por rotavirus en humanos.
35. - Un método de tratamiento o prevención de padecimientos asociados con - virus, preferiblemente el rotavirus en humanos administrando a un humano una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31.
36. - El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado en que comprende administrar no más de tres dosis de una cantidad segura y efectiva de la composición a un infante de entre 8-20 semanas de edad en el momento de la dosis 1.
37. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-36, para la prevención de una infección por virus, preferiblemente una infección por rotavirus y/o gastroenteritis por rotavirus en humanos.
38. - Un método para adaptar un virus a una línea celular adecuada, tal como células Vero, caracterizado en que comprende pasar en serie dicho virus a través de los cultivos de dicha línea celular adecuada, cada pasada se realiza en un medio en la presencia de cloruro de calcio y tripsina.
39. - El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado en que dicho cloruro de calcio esté presente en el rango de 0.1 mg/ml a 1 mg/ml, y dicha tripsina está presente en el rango de 0.1 g/ml a 30 µg/ml.
40. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-39, caracterizado en que dichas pasadas en serie comprenden 2-20 pasadas, preferiblemente 2-5 pasadas .
41. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-40, caracterizado en que cada pasada se realiza durante un periodo de tiempo en el rango de 24 horas a 10 días.
42.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-41, caracterizado en que dicho virus es un rotavirus.