KR20060126917A

KR20060126917A - 백신

Info

Publication number: KR20060126917A
Application number: KR1020067004369A
Authority: KR
Inventors: 브리지트 데시리 알베르테 콜라우; 비트라이스 아르세네 버지니에 데 보스
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2003-09-02
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-12-11
Also published as: AU2004268375B2; MA28035A1; IS8325A; NO342397B1; HRP20160299T1; IL173921A0; WO2005021033A2; CA2536734C; CA2536734A1; JP2007516215A; JP5588586B2; RU2006106427A; EP1660123B1; BRPI0414073A; WO2005021033A3; MXPA06002459A; NZ545639A; HRP20130407T1; EP2272532A3; PL2272532T3

Abstract

본 발명은 하나의 로타바이러스 혈청형에 의한 로타바이러스 감염에 대해 면역 반응을 야기하는 방법을 제공하고, 이 방법은 피검자에게 상이한 혈청으로부터 약독화된 로타바이러스 백신을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

Description

백신 {VACCINE}

본 발명은 로타바이러스(rotavirus) 백신 제형에 관한 것이다. 본 발명은 다른 로타바이러스 혈청형으로부터의 로타바이스 감염과 관련된 질병의 예방에서의, 로타바이러스 혈청형으로부터 약독화된 로타바이러스 집단의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비-G1 혈청형으로부터 로타바이러스 감염과 관련된 질병의 예방에서의, G1 혈청으로부터의 약독화된 로타바이러스 집단의 용도에 관한 것이다.

급성 감염성 설사는 세계의 많은 지역에서 질병 및 사망의 주된 원인다. 개발 도상 국가에서, 설사병의 영향은 놀랍다. 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카에 대해, 설사는 매년 30 내지 40억 건이 일어나고, 이중 약 5백만 내지 1000만 건이 사망에 이른다[참조: Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974(1979)].

로타 바이러스는 영아 및 유아들의 심각한 설사의 가장 중요한 원인 중 하나인 것으로 인지되어 왔다[참조: Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996]. 로타바이러스 질병은 매년 백만명이 넘는 사망의 원인이 된 다. 로타바이러스 유도된 질병은 가장 보편적으로는 6 내지 24개월 된 아이에게 영향을 미치며, 최고 유병률은 일반적으로 온화한 기후 지역의 서늘한 달 동안 및 열대 지역의 연중에 발생한다. 로타바이러스는 일반적으로 1 내지 약 3일의 인큐베이션 기간으로 장에서 증식하여 방출되어 음식물을 통하여 감염되는 경로에 의해 사람과 사람으로 전달된다. 6개월 내지 24개월령 군에서의 감염과 달리, 신생아는 일반적으로 무증상이거나 단지 약한 증상을 갖는다. 유아에게서 일반적으로 직면되는 심각한 질병과는 대조적으로, 대부분의 성인은 예전의 로타바이러스 감염의 결과로서 보호되어, 대부분 성인 감염은 약하거나 무증상이다[참조: Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982].

로타바이러스는 일반적으로 구형이고, 이들의 명칭은 특유한 외측 및 내측 또는 이중 쉘형의 캡시드 구조로부터 유래된다. 일반적으로, 로타바이러스의 이중 쉘형 캡시드 구조는 게놈을 함유하는 내측 단백질 쉘 또는 코어를 둘러싸고 있다. 로타바이러스의 게놈은 11개 이상의 별개의 바이러스 단백질을 코드화하는 이중 가닥 RNA로 된 11개의 단편으로 구성된다. VP4 및 VP7으로서 명명된, 이들 바이러스 단백질중 두가지가 이중 쉘형 캡시드 구조의 외측에 배열된다. 로타바이러스의 내측 캡시드는 VP6으로 명명된 로타바이러스 단백질인 한 단백질을 제공한다. 면역 반응을 일으켜 로타바이러스 감염이 일어나게 하는 이러한 세개의 특이적 로타바이러스에 관한 중요성은 아직 분명하지 않다. 그럼에도 불구하고, VP6 단백질은 항원 그룹 및 항원 서브그룹을 결정하고, VP4 및 VP7은 혈청형 특이성의 결정 요소이다.

지금까지, 적어도 14개의 로타바이러스 G 혈청형 및 11개의 로타바이러스 P 혈청형이 확인되었다[참조: Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330]. 이들 중에서, 10G 혈청형 및 6 P 혈청형이 사람 로타 바리어스 중에서 확인되었다.

VP7 단백질은 스트레인(strain)에 의존하는, 게놈 단편 7, 8 또는 9의 번역 생성물인 38,000 MW 글리코단백질(비글리코실화된 경우에는 34,000MW)이다. 이 단백질은 로타바이러스 감염이 일어나게 하는 중화 항체의 형성을 촉진시킨다. VP4 단백질은 게놈 단편 4의 번역 생성물인 약 88,000MW의 비글리코실화된 단백질이다. 또한, 이 단백질은 로타바이러스 감염이 일어나게 하는 항체 중화를 촉진시킨다.

VP4 및 VP7 단백질은 중화 항체가 유도되는 바이러스 단백질이기 때문에, 이들은 로타바이러스 질병에 대해 보호 효과를 제공할 수 있는 로타바이러스 백신의 개발에 주 후보물질인 것으로 여겨진다.

유아기 동안의 자연적인 로타바이러스 감염은 방어 면역성을 유도해 내는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 약독화된 생(live) 로타바이러스 백신이 매우 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 백신은 경구용인 것이 바람직한 데, 그 이유는 이것이 바이러스 감염의 자연 경로이기 때문이다.

로타바이러스 감염을 예방하기 위한 초기 백신 개발은 바이러스의 발견 후 1970년대에 시작하였다. 초기에, 동물 및 사람으로부터의 약독화된 스트레인을 연구하였고, 혼합되거나 실망스런 결과를 얻었다. 보다 최근의 노력은 사람-동물 재조합체(reassortant)에 집중되었고, 이는 보다 성공적이었다.

89-12로서 공지된 로타바이러스 스트레인은 워드(Ward)에 의해 기술되었다[참조: US 특허 번호 제 5,474,773호, Bernstein, D.L. et al, Vaccine, 16(4), 381-387, 1998]. 89-12 스트레인은 1988년에 자연 로타바이러스 질병에 걸린 14개월 된 유아로부터 수집된 대변 시편으로부터 분리되었다. 미국 특허 제 5,474,773호에 따르면, 이후 HRV89-12 사람 로타바이러스는 이후 워드에 의해 기술된 바와 같이 1차 아프리카 그린 몽키의 신장(AGMK) 세포에서 2회 계대배양(passage)시키고, MA-104 세포에 4회 계대배양시키므로써 배양 적응되었다[참조: J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984]. 이후, MA-104 세포 (경로 9) 중에서 3회 플라크 정제되고, 이들 세포 중에서 2회 추가로 계대배양된 후 성장되었다. 1회 추가 계대배양은 수탁 번호 ATCC VR 2272 하에 ATCC로의 수탁을 위해 이루어졌다(경로 12). 수탁된 스트레인은 89-12C2로서 공지되어 있다.

번스타인(Bernstein) 등에 의한 1998년 논문(Vaccine)은 하기에서 백신(1998) 논문으로서 언급된다. 상기 논문은 경구적으로 투여된 생 사람 로타바이러스 백신 후보물질의 안정성 및 면역원성을 기술하고 있다. 상기 백신은 스트레인 1차 AGMK 세포에 플라크 정제 없이 26회 계대배양한 후, 확립된 AGMK 세포주에 추가로 7회 계대배양하므로써(총 33회 계대배양) 약독화된 스트레인 89-12로부터 수득되었다.

이후, 연속해서 26회 계대배양된 상기 물질이 P26으로 언급되고, 연속해서 33회 계대배양된 물질이 P33으로서 언급될 것이다. 일반적으로, 89-12 스트레인을 n회 계대배양하므로써 유도된 로타바이러스는 Pn으로서 언급될 것이다.

하기 실시예에서 P33 물질은 베로(Vero) 세포 상에서 추가로 5회 계대배양되었다. 이는 P38로서 언급된다.

백신(1998) 논문에 기술된 P26 및 P33 분리물질은 배양물 수탁 기관에 수탁되지도 않았고, 유전적 특징화를 확립하기 위해 분석되지 않았다.

이제, 상기 문헌에 기술된 P26 집단이 변이형의 혼합물을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이는 하기 기술되는 바와 같이 유전적 특징화에 의해 달성되었다(실시예 참조). 그러므로, P26은 추가 계대배양을 위한, 특히 백신 제품 제조를 위한 신뢰성있게 일관된 집단이 아니다. 유사하게, P33은 변이형의 혼합물을 포함하고, 따라서 백신 제품 제조를 위한 신뢰성있게 일관된 집단이 아니다.

P26 물질은 세개 이상의 VP4 유전자 변이형의 혼합물인 것으로 밝혀졌다. P33 및 P38도 유사하게 두 변이형의 혼합물이다. 이러한 변이형은, 이러한 변이형에 대해 P33로 백신접종된 유아로부터 혈청의 중화 항원 역가를 평가하는 경우, 중화 에피토프의 관점에서 ATCC에 수탁된 89-12C2와는 항원적으로 상이한 것으로 보인다.

또한, P33 물질이 유아에 투여되는 경우, 두개의 확인된 변이형은 복제되고 배설되는 것으로 밝혀졌다. 100명의 백신접종된 유아중, 단지 2명만이 로타바이러스 감염으로 인한 위장염의 징후를 나타냈고, 20%의 플라세보 그룹이 감염되었다. 이러한 발견은, 확인된 변이형이 로타바이러스 질병으로부터의 보호와 관련되어 있음을 시사한다.

WO 0112797호는 로타바이러스 변이형을 분리시키는 방법 및 클로닝된(동종) 사람 로타바이러스 스트레인으로부터 유래된 개선된 생 약독화된 로타바이러스 백신을 기술하고 있다. 또한, 단일 변이형 또는 실질적으로 단일 변이형을 포함하고, 이러한 변이형이 VP4 및 VP7로서 명명된 주요 바이러스 단백질중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는 약독화된 로타바이러스 집단(분리물)을 기술하고 있다. G9 이형(heterotypic) 스트레인에 대한 이러한 경구용 약독화된 사람 로타바이러스 백신의 보호 효능은 라틴 아메리칸 인펀츠(Latin American infants)(Perez et al. 42nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy(ICAAC 2002) 27-30 September 2002, San Diego)에 보고되었다. WO 0112797의 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 인용된다.

도 1은 P43의 VP4 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열이다.

도 2는 P43의 VP7 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열이다.

본 발명에서, 본 발명자들은, VP4 및 VP7로서 명명된 주요 바이러스 단백질중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 정의되는 단일 변이형 또는 실질적으로 단일 변이형을 포함함을 특징으로 하는 약독화된 로타바이러스 집단이 백신에 사용된 것과 상이한 혈청형의 로타바이러스 감염에 의한 질병에 대해 교차 보호효과(cross protection)를 제공하는 백신으로서 사용될 수 있음을 밝혀냈다.

특히, G1 로타바이러스 집단[예를 들어, 부다페스트 조약 하에 1999년 8월 13일자 수탁 번호 99081301로, 유럽피안 콜렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐(European Collection of Animal Cell Culture(ECACC), 백신 리서치 앤 프로덕션 라보레토리(Vaccine Research and Production Laboratory), 퍼블릭 헬쓰 라보레토리 서비스(Public Health Laboratory Service), 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 앤 리서치(Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom)에서 수탁된 바와 같음]의 사용은 G1 및 하나 이상의 비-G1 로타바이러스 혈청형, 예컨대, G2, G3, G4 및 G9 로타바이러스 혈청형 둘 모두에 의한 질병을 예방하는 데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 로타바이러스 혈청형으로부터의 로타바이러스 감염과 관련된 질병의 예방에서의, 로타바이러스 혈청형으로부터의 약독화된 로타바이러스 집단의 용도에 관한 것으로, 이러한 혈청형은 바람직하게는 로타바이러스 G 단백질의 서열과 관련하여 정의된다.

바람직하게는, 로타바이러스 집단은, VP4 및 VP7로서 명명된 주 바이러스 단백질중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 정의된 단일 변이형 또는 실질적으로 단일 변이형을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 로타바이러스 집단은 교차 보호 효과를 제공하기에 적합한 ECACC 수탁번호 99081301로부터의 VP4 및/또는 VP7 바이러스 단백질을 포함한다.

바람직하게는, 약독화된 로타바이러스 혈청형은 G1이고, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형과 같은 비-G1 로타바이러스 혈청형 및 G1에 의한 질병에 대해 교차 보호효과를 제공할 수 있다.

특히, G1 약독화된 로타바이러스 집단[예를 들어, 부다페스트 조약 하에 1999년 8월 13일자 수탁 번호 99081301로, 유럽피안 콜렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐(ECACC), 백신 리서치 앤 프로덕션 라보레토리, 퍼블릭 헬쓰 라보레토리 서비스, 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 앤 리서치(Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom)에서 수탁된 바와 같음]의 사용은 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형과 같은 비-G1 로타바이러스 혈청형 중 하나 이상, 바람직하게는 두개 이상, 보다 바람직하게는 세개 이상, 매우 바람직하게는 네개 이상 및 G1에 의한 질병을 예방하는 데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 일면에서, 면역 반응은 두개 상의 로타바이러스 비-G1 혈청형에 대해, 일반적으로 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 및 G14로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 혈청형에 대해 유발된다. 백신 조성물의 혈청형과 상이한, 두개 이상, 세개 이상, 네개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상의 이들 혈청형에 대해 이형 보호효과를 갖는 것이 바람직하다. 매우 바람직하게는, 면역 반응은 동형(G1) 보호효과 이외에, G2, G3, G4 및 G9의 비-G1 혈청형중 하나 이상, 바람직하게는 두개 이상, 보다 바람직하게는 세개 이상, 매우 바람직하게는 네개 이상에 대해 유발된다.

특히, 본 발명에 따르면, G1 또는 G9가 아닌 로타바이러스에 대해 면역 반응을 유발시키기 위한 백신 조성물의 제조에서의, G1 혈청형으로부터의 약독화된 로타바이러스 스트레인의 용도가 제공된다. 바람직한 일면에서, 면역 반응은 추가로 G9 혈청형 및/또는 G1 혈청형에 의한 로타바이러스 감염에 대해 유발된다. 특히, 바람직한 일면에서, 면역 반응은 두개 이상의 로타바이러스 혈청형에 대해 유발되며, 이러한 혈청형은 G1 또는 G9가 아니다. 일반적으로 G1 또는 G9 이외의 임의의 혈청형은 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 및 G14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 백신 조성물의 혈청형과 상이한, 두개 이상, 세개 이상, 네개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상의 이러한 혈청형에 대해 이형 보호효과를 갖는 것이 바람직하다. 매우 바람직하게는, 면역 반응은 G2, G3, G4 및 G9의 비-G1 혈청형 모두에 대해 유발된다.

또한, 본 발명은 상이한 혈청형으로부터의 약독화된 로타바이러스 백신을 포함하는 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하여, 로타바이러스 혈청형으로부터의 로타바이러스 감염에 대해 면역 반응을 유발시키는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 방법은 본원에서 정의된 바와 같은 단일 변이형 또는 실질적으로 단일 변이형을 포함하는 로타바이러스 G1 혈청형 백신을 포함하는 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하여, 로타바이러스 비-G9 혈청형에 대해 면역 반응을 유발시키는 방법이다.

바람직하게는, 백신 조성물 내의 로타바이러스 집단은 G1P1A P[8] 특이적이다. 보다 바람직하게는, 상기 로타바이러스 집단은 면역 반응을 유발시켜 전형적으로 교차 보호 효과를 제공하는데 적합한 ECACC 기탁물 99081301로부터의 VP4 및/또는 VP7 바이러스성 단백질을 포함한다. 바람직하게는, ECACC 기탁물 99081301 또는 이로부터 유래한 것이 로타바이러스 백신으로서 사용된다.

일 구체예에서, 본 발명은, 기타 G 혈청형에 대한 면역 반응의 유도와 함께 G9에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 그러한 G1 스트레인의 사용이 일반적으로 배제되지 않더라도, G9 혈청형에 대한 면역 반응을 단독으로 유도하기 위한 상기 기술된 방법 또는 용도에서는, ECACC 99081301에 상응하는 로타바이러스 스트레인의 사용이 배제된다.

적합하게는, 본 발명은 상기 기술된 방법 또는 용도에서 G1P8 로타바이러스 스트레인에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 백신은 2회 투약 계획으로 사용된다.

바람직하게는, 상기 백신은 위장염에 대한 교차 보호를 제공한다. 따라서, 또 다른 일면에서, 조성물이, 백신접종된 개인 집단에서, 조성물 내에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 감염에 대해 상이한 유형의 로타바이러스의 감염에 의해 야기된 설사에 대해, 60% 이하의 보호율을 제공하는 본 발명에 따른 방법이 제공된다. 또 다른 일면에서, 조성물이, 조성물 내에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 감염에 대해 상이한 유형의 로타바이러스의 감염에 의해 야기된 위장염에 대해, 81% 이하의 보호율을 제공하는 본 발명에 따른 방법이 제공된다. 더욱 추가의 일면에서, 조성물이, 2개 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스 감염에 의해 야기된 중증 위장염에 대해 백신접종된 개인 집단에서 83% 이하의 보호율을 제공하는 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하는, 본 발명에 따른 방법이 제공된다.

바람직하게는, 조성물 내에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 감염에 대해 상이한 유형의 로타바이러스에 의해 감염된 백신접종된 개인 집단에서 달성된 설사 및/또는 위장염 및/또는 중증 위장염에 대한 보호율은 10 내지 90%, 보다 바람직하게는 20 내지 80%, 가장 바람직하게는 50% 이상이다.

교차 보호를 제공하는데 사용된 로타바이러스 백신은 하기한 바람직한 특징을 지닌다:

바람직하게는, 본 발명에 따른 로타바이러스 집단은 클론화된 변이체이다.

단일 변이체 또는 사실상 단일 변이체를 포함하는 집단은, 10% 이하, 바람직하게는 5% 미만, 및 가장 바람직하게는 1% 미만의 상이한 변이체 또는 변이체들을 함유하는 로타바이러스 집단을 의미한다. 바이러스 집단은 적당한 세포 타입을 계대배양시키거나, 일련의 하나 이상의 클로닝 단계를 수행함으로써 동질체(homogeneity) 또는 사실상 동질체로 정제될 수 있다.

본 발명의 이점은, 단일 변이체를 포함하는 집단이 일치되는 백신 로트를 제형화시키는데 보다 적합하다는 것이다. 주 바이러스 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 규정된 특정 변이체는, 로타바이러스 감염 예방에서의 증강된 효능과 연관될 수 있다.

바람직한 일면에서, 본 발명의 로타바이러스 집단에서 단일 또는 사실상 단일 변이체는, VP4 유전자가 하기한 것중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 변이체이다: 출발 코돈으로부터 788 위치에 아데닌 염기(A), 802 위치에 아데닌 염기(A), 및 501 위치에 티민 염기(T).

추가 일면에서, 본 발명의 상기 집단에서 단일 또는 사실상 단일 변이체는, VP7 유전자가 하기한 것중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 변이체이다: 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 897 위치에 아데닌 염기(A), 또는 897 위치에서 구아닌(G). 바람직하게는, 897 위치에 아데닌(A)이 존재한다.

바람직한 일면에서, 본 발명에 따른 집단에서의 단일 변이체는 VP4 유전자 서열에서의 출발 코돈으로부터 788 위치에 아데닌(A) 및 501 위치에 티민(T)을 지닌다.

또 다른 바람직한 일면에서, 본 발명에 따른 집단에서 단일 변이체는 VP7 서열에서 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌/구아닌(A/G)을 보유한다. 가장 바람직하게는, VP7 서열에서의 897 위치에 아데닌(A)이 존재한다.

특히 바람직한 일면에서, 본 발명에 따른 집단에서의 단일 변이체는 VP4 유전자 서열에서 출발 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌(A), 및 501 위치에 티민(T)을 보유하며, VP7 서열에서 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 및 897 위치에 아데닌/구아닌(A/G)을 보유한다. 가장 바람직하게는, VP7 서열에서 897 위치에 아데닌(A)이 존재한다.

또 다른 일면에서, 단일 변이체는 누클레오티드 서열이 도 1에 도시된 바와 같은 VP4 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열, 및/또는 누클레오티드 서열이 도 2에 도시된 바와 같은 VP7 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 사용하기에 바람직한 로타바이러스 집단은,

적합한 세포형 상에서 로타바이러스 제조물을 계대배양시키고;

a) 제한 희석, 또는 b) 개별 플라크 단리 중 어느 하나의 단계를 이용하여 동질 배양물을 임의적으로 선택하거나;

VP4 및/또는 VP7 유전자 서열의 적합한 영역의 서열 결정을 수행함으로써, 사실상 단일 변이체의 존재를 검사하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.

바람직하게는, 상기 집단은 상기 기술된 바와 같이 P33 또는 P26 스트레인로부터 유래한다.

서열 결정은, 정량적 또는 반정량적 하이브리드화 기술, 예컨대 슬롯 블롯(slot blot) 하이브리드화 또는 플라크 하이브리드화에 의해 적절히 수행될 수 있다.

바람직하게는, 선택된 변이체는, 출발 로타바이러스 집단이 사람 피검체, 특히 어린이에게 투여되는 경우에 복제되어 배설되는 변이체이다.

본 발명에 따른 방법으로부터 생산되는 클론화된 바이러스 집단은 적당한 세포주 상으로 추가로 계대배양시킴으로써 증폭될 수 있다.

상기 방법에서 로타바이러스 집단의 계대배양에 적합한 세포형으로는 아프리카 녹색 원숭이 신장(AGMK) 세포가 있으며, 이는 세포주 또는 1차 AGMK 세포를 확립시킬 수 있다. 적합한 AGMK 세포주에는, 예를 들어 베로(Vero) (ATCC CCL-81), DBS--FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) 및 CV-1 (ATCC CCL-70)이 포함된다. 또한 MA-104 (붉은털 원숭이) 및 MRC-5 (사람-ATCC CCL-171) 세포주가 적합하다. 베로 세포는 증폭 목적으로 특히 적합하다. 베로 세포 상에서 계대배양시키면 높은 생산율의 바이러스가 얻어진다.

상기 방법으로부터 생산되는 바이러스 집단에 단일 변이체가 존재하는 지의 여부를 검사하고, 상기한 단일 변이체의 성질을 결정하기 위한 기술에는, 당업계에 공지된 표준 서열화 또는 하이브리드화 과정이 포함되며, 이에 대해서는 이하에 기술한다.

바람직한 일면에서, 본 발명의 방법은 적합한 로타바이러스, 특히 이의 계대배양된 유도체 또는 89-12 스트레인의 특징을 지닌 로타바이러스를 이용하여 수행된다.

특히 바람직한 단일 변이체 집단은 P43으로서, 이는 일련의 말단 희석 클로닝 단계 후에 클론화된 물질을 증폭을 위해 베로 세포 상으로 계대배양시키는 단계에 의해, P33 (적합한 세포형에 대한 배양물 중에서 단리된 사람 로타바이러스의 33호 계대배양)으로부터 얻어졌다.

P43 집단은, 부다페스트 조약 하에 기탁 번호 99081301로 1999년 8월 13일자로, 영국 SP4 0JG 윌트셔 살리스베리 로트 다운에 소재한 더 유로피안 컬렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐스(ECACC:The European Collection of Animal Cell Cultures)[백신 리서치 앤드 프로덕션 라보라토리, 퍼블릭 헬쓰 라보라토리 서비스, 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 앤드 리서치(Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research]에 기탁되었다.

이렇게 명시된 공적 입수 경로가, 사람 로타바이러스 P43을 얻는 가장 간편한 방법이라 하더라도, 유사하고 기능적으로 사실상 동일한 로타바이러스는 본 발명의 교시 사항의 측면에서 이러한 방법 또는 기타 방법으로 생산될 수 있다. 그러한 기능적으로 사실상 동일한 로타바이러스는 본 발명의 사람 로타바이러스 P43과 생물학적으로 등가인 것으로 간주되며, 따라서 본 발명의 일반적인 범주 내에 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 P43 변이체의 특징을 지닌 로타바이러스 집단을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

또한, 본 발명은, 추가 계대배양, 클로닝, 또는 생 바이러스를 이용한 기타 과정에 의해 증폭시키는 것과 같은 추가 과정을 실시하거나, 유전 공학적 기술 또는 재조합 기술에 의한 것을 포함하는 임의 방식으로 P43을 개질시킴으로써, 기탁된 P43 ECACC 99081301로부터 유래한 물질을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러한 단계 및 기술은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에 포함되는 기탁된 P43으로부터 유래한 물질에는 단백질 및 유전자 물질이 포함된다. 특히 주목되는 것은, P43의 하나 이상의 단편 또는 하나 이상의 항원을 포함하는 재조합 로타바이러스, 예를 들어 11 게놈 단편 또는 이의 일부가 P43의 게놈 단편 또는 이의 일부로 대체된 로타바이러스의 병독성 스트레인을 포함하는 재조합체이다. 구체적으로, NSP4를 코딩하는 단편 또는 부분 단편이 P43 단편 또는 부분 단편인 로타바이러스 재조합체가 유용한 특성을 지닐 수 있다. 재조합 로타바이러스 및 이들을 제조하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다 [참조: Foster, R. H. and Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. AIDS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998].

특히 주목되는 물질은 P43의 자손, 및 P43의 면역학적 활성 유도체이다. 면역학적 활성 유도체란, P43 바이러스를 이용하여 또는 이로부터 얻어진 물질, 특히 숙주 동물 내로 주입된 경우에 로타바이러스에 대해 반응성인 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스의 항원을 의미한다.

로타바이러스를 적합한 세포주, 예를 들어 베로 세포로 적응시킴에 있어서, 상기 바이러스를 임의의 잠재적인 오염물질, 예컨대 임의의 존재할 수 있거나, 그렇지 않으면 오염을 일으킬 임의의 우발 성분인 임의의 잠재적인 오염물질이 제거되도록 처리할 필요가 있을 수 있다. 에테르 감지성 우발 바이러스의 경우에, 이는 이하에 기술된 에테르 처리에 의해 실시될 수 있다. 본 발명은 또한, 약독화된 생 로타바이러스 또는 이와 함께 제형화된 백신을 얻기 위한 전반적인 과정에서 임의 단계로서 그러한 에테르 처리를 포함시키는 것에 관한 것이다.

단일 또는 사실상 단일 로타바이러스 변이체를 포함하는 백신이 바람직하지만, 단일 변이체 또는 사실상 단일 변이체의 사용은 필수적이지 않다. 본 발명의 교차 보호 로타바이러스 스트레인은 다른 로타바이러스 스트레인와 조합되어, 로타바이러스 감염 또는 질환에 대한 부가적인 보호 또는 교차 보호를 제공할 수 있다.

따라서, P43과 그 밖의 로타바이러스 변이체, 예를 들어 기타 클론화된 변이체의 혼합물, 또는 P43과 기타 바이러스, 특히 기타 약독화된 바이러스의 혼합물이 본 발명의 범주에 포함된다. 그러한 혼합물은, 이하 기술되는 본 발명의 백신에 유용하다.

본 발명은 또한, 적당한 애쥬번트 또는 약제학적 담체와 혼합된, 사실상 단일 변이체 집단을 바람직하게는 포함하는, 교차 보호를 제공할 수 있는 생 약독화된 로타바이러스 백신을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 로타바이러스 백신은 단일 로타바이러스 스트레인을 함유하는 1가 로타바이러스 백신이다.

본 발명은, 생 약독화된 로타바이러스가 사람 로타바이러스이며 장겹침증을 유발시키지 않는 생 로타바이러스 백신을 제공하는 데에 특히 유리하다.

본 발명에 따른 약독화된 로타바이러스 스트레인와 함께 사용하기에 적합한 약제학적 담체에는, 특히 유아에게 경구 투여하기에 적합한 당업계에 공지된 것들이 포함된다. 그러한 담체에는 이들에 한정되는 것은 아니나, 탄수화물, 다가알코올, 아미노산, 알루미늄 히드록사이드, 마그네슘 히드록사이드, 히드록시어패타이트(hydroxyapatite), 탈크, 티타늄 옥사이드, 철 히드록사이드, 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 미세결정성 셀룰로오스, 젤라틴, 식물성 펩톤, 잔탄(xanthane), 카라게난, 아라비아 고무, β-시클로덱스트린이 포함된다.

본 발명은 또한, 예를 들어 적합한 안정화제의 존재하에서 바이러스를 동결 건조시키거나, 본 발명에 따른 바이러스를 적당한 애쥬번트 또는 약제학적 담체와 혼합시킴으로써, 로타바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바이러스를 지질 기재 비히클, 예컨대 비로좀 또는 리보좀 중에서, 수중유형 에멀젼 중에서 또는 담체 입자와 함께 제형화시키는 것이 유리할 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 경구 백신용으로 당업계에 공지된 것과 같은 면역증강제를 제형에 포함시킬 수 있다. 그러한 면역증강제에는, 세균성 독소, 특히 홀로톡신(holotoxin)(전체 분자) 또는 B 사슬 단독(CTB) 및 E. Coli의 열불안정성 엔테로톡신(LT)형태의 콜레라 독성(CT)이 포함된다. 미분화 LT보다 이들의 활성 형태로 덜 전환되기 쉬운 돌연변이된 LTs(mLTs)는, WO 96/06627호, WO 93/13202호 및 US 5,182,109호에 기술되어 있다.

유리하게 포함될 수 있는 추가 면역증강제는 사포닌 유도체, 예컨대 QS21 및 모노포스포릴 지질 A, 특히 3-데-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)이다. 경구 애쥬번트로서의 정제된 사포닌은 WO 98/56415호에 기술되어 있다. 사포닌 및 모노포스포릴 지질 A는 개별적으로 또는 조합(예를 들어, WO 94/00153호)되어 사용될 수 있으며, 기타 성분과 함께 보조 시스템으로 제형화될 수 있다. 3D-MPL은 몬타나에 소재한 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem)에 의해 제조된 공지된 애쥬번트가며, 이의 제조물은 GB 2122204호에 기술되어 있다.

경구 면역접종을 위한 비히클 및 애쥬번트에 대한 일반적인 논의는 관련 문헌 (참조: Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995)으로부터 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 피검체에게, 본 발명에 따른 유효량의 백신 조성물을 투여함으로써, 사람 피검체, 특히 유아를 면역접종시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 생 약독화된 백신은 경구 투여에 의해 투여된다.

바람직한 일면에서, 본 발명에 따른 약독화된 로타바이러스 스트레인은 제산제와 함께 제형화되어, 위산에 의한 백신의 불활성화를 최소화시킨다. 적합한 제산제 성분에는, 무기성 제산제, 예를 들어 알루미늄 히드록사이드 Al(OH)₃ 및 마그네슘 히드록사이드 Mg(OH)₂가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 시판되는 제산제에는 알루미늄 히드록사이드 및 마그네슘 히드록사이드를 함유하는 미란타(Mylanta: 상품명)가 포함된다. 이들은 수 불용성이며, 현탁되어 제공된다.

알루미늄 히드록사이드는, 이것이 제산 효과 뿐만 아니라 애주번트화 효과(ajuvantation effect)를 제공할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 백신 조성물의 특히 바람직한 성분이다.

본 발명의 백신에서 제산제로서 사용하기에 적합한 것은 또한 유기성 제산제, 예컨대 유기산 카르복실레이트 염이다. 본 발명의 백신 조성물에서 바람직한 제산제는 유기산 카르복실레이트 염, 바람직하게는 시트르산의 염, 예컨대 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨이다.

본 발명의 백신 조성물에 사용될 수 있는 특히 바람직한 제산제는 불용성 무기염, 탄산칼슘(CaCO₃)이다. 탄산칼슘은 로타바이러스와 회합(association)될 수 있으며, 로타바이러스 활성은 탄산칼슘과의 회합 중에 유지된다.

충전 단계 동안에 탄산칼슘의 침전을 방지하기 위해서, 바람직하게는 증점제(viscous agent)가 제형 내에 존재한다.

사용될 수 있는 가능한 증점제에는 유사가소성 부형제가 포함된다. 유사가소성 용액은, 교반 하에서의 점도에 비해 정지 상태에서 보다 높은 점도를 지니는 용액으로서 정의된다. 이러한 유형의 부형제로는 천연 중합체, 예컨대 아라비아 고무, 어드라간테(adragante) 고무, 아가-아가, 알지네이트, 펙틴; 또는 반합성 중합체, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스(Tyloses C^®), 메틸셀룰로오스(Methocels A^®, Viscotrans MC^®, Tylose MH^® and MB^®), 히드록시프로필셀룰로오스 (Klucels^®) 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스(Methocels E^®및 K^®, Viscontrans MPHC^®)이 있다. 일반적으로, 이들 유사가소성 부형제는 요변성 부여제(thixotropic agent)와 함께 사용된다. 사용될 수 있는 대안적인 증점제는 낮은 유동성을 지닌 유사가소성 부형제이다. 충분한 농도의 이들 중합체는 구조적인 유체 배열을 야기하여, 결과적으로 정지 상태에서 낮은 유동성을 지닌 높은 점도의 용액을 형성시킨다. 이러한 시스템을 유동 및 이동시키는 데 특정 량의 에너지가 필요하다. 구조적인 유체 배열을 일시적으로 파괴하여 유체 용액을 얻는데 외부 에너지 (교반)가 필요하다.

그러한 중합체의 예로는 카르보폴(Carbopols)^®및 잔탄 고무가 있다.

요변성 부형제는 정지 상태에서는 겔 구조물이 되는 반면, 교반하에서는 유체 용액을 형성한다. 요변성 부형제의 예로는, 비검(Veegum)^®(마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 아비셀(Avicel) RC^®(약 89% 미세결정성 셀룰로오스 및 11% 카르복시메틸셀룰로오스 Na)가 있다.

본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 잔탄 고무 또는 전분으로부터 선택된 증점제를 포함한다.

이에 따라 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 탄산칼슘 및 잔탄 고무와 함께 조합된다.

본 발명에 사용된 조성물의 기타 성분은 당, 예를 들어 수크로오스 및/또는 락토오스를 적합하게 포함한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은, 예를 들어 향미제(특히 경구용 백신에 대해) 및 정균제를 포함하는 추가 성분을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 다양한 형태가 예측된다.

바람직한 일 구체예에서, 백신은 액체 제형으로서 투여된다.

바람직하게는, 액체 제형은, 투여 전에, 적어도 하기 2개 성분으로부터 재구성된다:

i) 바이러스 성분,

ii) 액체 성분.

이러한 구체예에서, 바이러스 성분 및 액체 성분은 일반적으로, 편리하게는 단일 용기의 개별 구획일 수 있는 개별 용기, 또는 최종 백신 조성물이 공기에 노출되지 않고 재구성될 수 있도록 하는 방식으로 연결될 수 있는 개별 용기로 존재한다.

재구성 전에, 바이러스는 건조 형태 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 성분은 동결건조된다. 동결건조된 바이러스는 수 용액 상태의 바이러스보다 더욱 안정하다. 동결건조된 바이러스는 액체 제산제 조성물을 이용하여 적절히 재구성되어, 액체 백신 제형을 생산할 수 있다. 대안적으로, 동결건조된 바이러스는 물 또는 수용액을 이용하여 재구성될 수 있는데, 이 경우 동결건조된 바이러스 조성물은 바람직하게는 제산제 성분을 함유한다.

바람직하게는, 백신 제형은 하나의 구획 또는 용기 내에서 탄산칼슘 및 잔탄 고무로 제형화된 바이러스 성분을 포함하며, 이는 제 2 구획 또는 용기 내에 존재하는 물 또는 수용액으로 재구성된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 백신 조성물은 고체 제형, 바람직하게는 입에 넣는 경우에 즉시 용해되기에 적합한 동결건조된 케이크이다. 동결건조된 제형은 편리하게는 약제학적 블리스터 팩 내에서 정제 형태로 제공될 수 있다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 경구 투여용 정제를 신속하게 용해시키는 형태의 로타바이러스 백신을 제공한다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 생 약독화된 로타바이러스 스트레인, 특히 사람 로타바이러스 스트레인을 포함하며, 입에 넣은 경우에 즉시 용해될 수 있는 동결건조된 고체인 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 신속히 용해되는 정제는, 용해되지 않은 정제의 삼킴을 방지하기에 충분히 신속히 피검체의 입에 용해된다. 이러한 방법은 소아 로타바이러스 백신에 특히 유용하다.

바람직하게는 상기 바이러스는, 탄산칼슘과 같은 무기 제산제, 및 잔탄 고무와 같은 증점제로 제형화되는 생 약독화된 사람 로타바이러스이다.

본 발명의 추가 일면은, 바이러스 성분이 탄산칼슘 및 잔탄 고무로 제형화되는 임의의 로타바이러스 스트레인인 동결건조된 제형을 제공하는 것이다.

본 발명의 백신은, 전형적인 백신접종자에게서 현저한 유해 부작용없이 로타바이러스 감염에 대한 효과적인 보호를 제공하기에 적합한 양의 생 바이러스를 이용하여, 공지된 기술로 제형화되고 투여될 수 있다. 생 바이러스의 적합한 양은 일반적으로 투여당 10⁴ 내지 10⁷ 포커스 형성 단위(ffu)일 것이다. 백신의 전형적인 투여량은 투여당 10⁵ 내지 10⁶ ffu를 포함할 수 있으며, 시간에 걸쳐서 수회 투여, 예를 들어 2개월의 간격으로 2회 투여로 제공될 수 있다. 그러나, 특히 개발도상국에서는, 2회 초과, 예를 들어 3회 또는 4회 투여의 투약계획에 의해 효과가 얻어질 수 있다. 투약간 간격은 2개월보다 더 많거나 더 적을 수 있다. 단일 투여 또는 수회 투여의 투약 계획에 대한 생 바이러스의 최적량, 및 투약에 대한 최적 타이밍은 항체 역가 및 피검체에서의 기타 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 백신은 또한 기타 질환, 예를 들어 소아마비 바이러스에 대한 보호를 위한 기타 적합한 생 바이러스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 경구 투여를 위한 기타 적합한 생 바이러스 백신은 개별 용량으로 그러나 동시에 본 발명에 따른 로타바이러스 백신 조성물로 제공될 수 있다.

백신(1998) 논문에 기술된 P33 물질로 백신접종된 1년 4 내지 6개월령의 유아로부터 채취한 혈청을 P33, P38, P43 및 89-12C2의 중화에 대해 시험하였다.

모든 시험된 혈청의 중화 역치 범위는 P33, P38 및 P43에 대해 유사하였다. 통계학적 분석으로부터, 3개의 모든 바이러스에 대한 전반적인 중화 역가에서 현저한 차이점이 나타나지 않는다. 이는, P33, P38 및 P43의 순응적 및 비순응적 중화 에피토프가 모두 P33 백신접종된 유아의 항-P33 혈청에 의해 잘 인지되고 있음을 제안한다. 이러한 확인 사항은, 상기 시험관 검정에서 밝혀진 중화 에피토프가 P33, P38 및 P43 사이에서 교대되지 않았음을 직접적으로 제안하는 것이다.

그러나, P89-12C2의 중화 역치 범위는 P33, P38및 P43과는 현저히 상이하다. 이러한 확인 사항은, P33, P38 및 P43의 순응적 및 비순응적 중화 에피토프가 모두 P33 백신접종된 유아의 항-P33 혈청에 의해 잘 인지되지 않음을 제안한다. 이러한 확인 사항은, 상기 시험관 검정에서 밝혀진 중화 에피토프가 89-12 C2와 P33, P38 및 P43 사이에서 교대되었음을 직접적으로 제안하는 것이다.

본 발명의 매우 바람직한 구체예에는 하기 것들이 포함된다:

1. G1 또는 G9가 아닌 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물의 제조에서 G1 혈청형으로부터의 약독화된 로타바이러스 스트레인의 용도.

2. 면역 반응이 G9 혈청형 및/또는 G1 혈청형에 의한 로타바이러스 감염에 대해 추가적으로 유도되는, 제 1번에 따른 용도.

3. 면역 반응이 2개 이상의 로타바이러스 혈청형에 대해 유도되며, 이들 혈청형이 G1 또는 G9가 아닌, 제 1번 또는 제 2번에 따른 용도.

4. G1 또는 G9 이외의 혈청형이 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 및 G14로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제 1번 내지 제 3번 중 어느 하나에 따른 용도.

5. 면역 반응이 G2, G3, G4 및 G9의 비-G1 혈청형 모두에 대해 유도되는, 제 1번 내지 제 4번 중 어느 하나에 따른 용도.

6. G1 로타바이러스 백신 조성물이 단일 로타바이러스 변이체 또는 사실상 단일 로타바이러스 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 VP4 또는 VP7로 명명된 주 바이러스성 단백질 중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 규정되는, 제 1번 내지 제 5번 중 어느 하나에 따른 용도.

7. 조성물이, 누클레오티드 서열 중에, 출발 코돈으로부터 788 위치에 아데닌 염기(A), 802 위치에 아데닌(A), 및 501 위치에 티민(T) 중 하나 이상을 포함하는 VP4 유전자를 지닌 로타바이러스를 포함하는, 제 6번에 따른 용도.

8. VP4 유전자가, 출발 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌 염기(A), 및 501 위치에 티민 염기(T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는, 제 7번에 따른 용도.

9. 조성물이, 누클레오티드 서열 중에, 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 897 위치에 아데닌(A), 및 897 위치에 구아닌(G) 중 하나 이상을 포함하는 VP7 유전자를 지닌 로타바이러스를 포함하는, 제 6번에 따른 용도.

10. VP7 유전자가, 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 및 897 위치에 아데닌(A) 또는 구아닌(G)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는, 제 7항에 따른 용도.

11. 조성물이, 누클레오티드 서열 중에, 출발 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌(A), 및 501 위치에 티민(T)을 포함하는 VP4 유전자를 지닌 로타바이러스를 포함하며; VP7 유전자가, 누클레오티드 서열 중에, 출발 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌(A)을 포함하는, 제 1번 내지 제 10번 중 어느 하나에 따른 용도.

12. 조성물이, 조성물 내에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 G1 혈청형에 대해 다양한 유형의 로타바이러스에 의한 감염에 의해 야기된 위장염 및/또는 설사에 대해 보호할 수 있는, 제 1번 내지 제 11번 중 어느 하나에 따른 용도.

13. 조성물이, 2가지 이상의 혈청형의 로타바이러스 감염에 의해 야기된 중증 위장염에 대해 백신접종된 개인 집단에서 83% 이하의 보호율을 제공하며, 이들 혈청형이 조성물 내에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 G1 혈청형에 대해 상이한, 제 12번에 따른 용도.

14. 중증 위장염이 4개 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스의 감염에 의해 야기되는, 제 13번에 따른 용도.

15. 비-G1 혈청형이 G2, G3, G4 및 G9 혈청형인, 제 14번에 따른 용도.

16. 로타바이러스 스트레인이 ECACC 수탁번호 제99081301호이거나 ECACC 수탁번호 제99081301호로부터 수득가능하거나 유도가능함을 특징으로 하는 제1번 내지 제15번 중 어느 하나에 따른 용도.

17. 백신이 2-투약 계획으로 사용됨을 특징으로 하는 제1번 내지 제16번 중 어느 하나에 따른 용도.

하기 비제한적인 실시예에 의해 본원발명을 설명한다.

실시예

실시예 1: 계대(passage) 26(p26)에서 스트레인 89-12가 변이체의 혼합물이라는 증명

상이한 계대 로트로부터의 VP4 및 VP7 유전자의 서열분석

계대 P26(1차 AGMK 세포), 계대 P33(확립된(1차에 대한 반대로서) AGMK 세포주), 계대 P41 및 계대 P43으로부터의 VP4 및 VP7의 서열 분석을 수행하였다. 전체 RNA 추출물을 역전사하여 1개 튜브/1개 단계로 PCR을 통해 증폭시켰다.

프라이머 Rota 5bis 및 Rota 29bis로 전체 VP4 유전자를 증폭시켰고, 프라이머 Rota 1 및 Rota 2bis로 전체 VP7 유전자를 증폭시켰다. PCR 물질을 상이한 프라이머를 사용하여 서열분석하였다(표 1 참조).

계대 P26 서열은 계대 P33 서열과 VP4에서는 3개 염기(출발 코돈으로부터 위치 501, 788, 및 802bp)가 상이하고, VP7에서는 3개 염기(출발 코돈으로부터 108, 605, 및 897bp)가 상이하였다.

VP4 및 VP7의 계대 P26 서열 스캔은 돌연변이된 위치에서 계대 P33 서열의 존재를 배경으로서 보여준다. 따라서, 계대 P26이 적어도 2개의 변이체의 혼합물이라는 것을 알 수 있다.

계대 P33 서열 스캔은 VP4에서는 동질성으로 보이고 VP7에 대해서는 이질성으로 보인다(표 2 참조).

계대 P38(계대 33으로부터 유래)는 베로(Vero) 세포 상에서 5 계대를 거쳤으며 계대 P33(AGMK 세포주)로서 동일한 세트의 VP4 및 VP7 서열을 보였다. 따라서, P33과 P38 간에는 집단간 주요한 변화가 없었다.

표 1: RT-PCR 및 서열분석에 사용된 올리고누클레오티드

표 2: 하이브리드화에 사용된 올리고누클레오티드

표 2의 굵은 글씨체의 염기는 VP4와 VP7의 특이적 서열 변화의 위치이다.

표 3: VP4 및 VP7 유전자의 서열 변화

주의. 생산 로트의 수준으로 발전된 3개 클론 중 두번째 클론에서, VP7 897 bp 위치 누클레오티드는 P43 선택된 클론에서와 같이 A가 아니라 G이다. 이는 아미노산 서열에서 이소루신 대신에 메티오닌을 생성한다. 선택된 P43 클론 및 출발 코돈으로부터 897bp에서 VP7에 G가 있는 클론 둘 모두에 대응하는 변이체가 P33 물질로 백신화된 유아의 변으로 배출되었다.

표 3.1은 특정 위치에서 두개의 대안적인 염기가 있고, 여기에서, 두개 중 첫번째 것은 주요 집단에서 나타나는 염기이고, 두번째 것은 소수 집단에서 나타나는 염기이다. 주요 및 소수 변이체 집단은 서열분석에서 시그날의 강도에 의해 판단되었다.

표 3.2는 변이체간의 누클레오티드 차이로부터 초래되는 아미노산 변화를 도시한다.

표 4

슬롯 블롯 하이브리드화(Slot blot hybridization)

AGMK 세포상에서 계대 P26 내지 P33간의 집단 차이는 슬롯 블롯 하이브리드화에 의해 추가로 확인되었다. RT/PCR에 의해 생성되는 VP4 및 VP7 유전자 단편을 각 변이체에 특이적인 올리고누클레오티드 프로브와 하이브리드화시켰다(표 3.1 및 3.2 참조). Rota 16, Rota 35, 및 Rota 36과 하이브리드화하고 Rota 15와는 화이브리드화하지 않는 P26과 대조하여, P33 물질의 VP4 PCR 단편은 위치 788번 및 802번에서 단지 Rota 16과만 하이브리드화하고 Rota 15 또는 Rota 35 또는 Rota 36과는 하이브리드화하지 않았다. 이러한 결과는 P26에 적어도 3개 변이체가 존재함을 확립하였다(표 4 참조).

P33 물질의 VP7 PCR 단편에 대해서, 위치 897은 Rota 41과 Rota 42와 하이브리드화하였다. 이러한 결과는 P33 물질에 적어도 2개의 변이체가 존재함을 확립하였다.

실시예 2: P43 클론의 단리 및 특성규명

동종 바이러스 집단으로서 P33 성분을 단리하기 위하여, 베로 세포상에서의 P33/AGMK의 3개 종말점 희석(three end-point dilution)을 수행하였으며 생성된 바이러스를 베로 세포를 감염시키는데 사용하였다.

양성 웰을 하기 2개 기준을 사용하여 전통적인 방식으로 선택하였다: 웰에서 검출되는 최대 개수의 촛점 및 플레이트상의 가장 많이 단리된 양성 웰에 의해 증명되는 증식. 96개 웰 미세역가 플레이트에서 3개 종말점 희석 계대 후에, 10개 양성 웰을 제로 세포에서 연속하여 증폭시키고 이들의 수율을 평가하였다.

수율에 근거하여, 3개의 클론을 생산 로트의 계대 수준으로 발전시켰다. 다클론성 항체에 의한 면역인지(microrecognition)가 3개 클론간 및 클론과 P33간 둘 모두에 대해 유사한 것으로 관찰되었다. 클론의 동종성을 슬롯 블롯 하이브리드화에 의해서 검사하였다. 단일 클론의 최종 선택은 수율 및 서열에 기초하였다.

선택된 클론을 베로 세포상에서 연속적인 계대 배양에 의해 증폭시켜 마스터 시드(Master Seed), 작업 시드(Working seed), 및 최종 생산 로트를 생성하였다.

선택된 클론은 VP4 및 VP7(동일성)의 서열분석 및 PCR 증폭된 물질의 VP4 및 VP7 (동종성)의 특이적 슬롯 블롯 하이브리드화에 의해 상이한 계통 수준에서 유전학적으로 특징으로 하였다. P43의 VP4 및 VP7 유전자의 서열이 도 1 및 도 2에 각각 주어져 있고 P41과 동일하였다

선택된 클론의 동종성은 P26/1차 AGMK의 서열분석 동안 확인된 각 변이체를 위하여 VP4 및/또는 VP7 영역에서 누클레오티드 변화를 구별하는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 선택적 하이브리드화에 의해 검사하였다(표 4를 참조).

VP4 단편은 Rota 16과 하이브리드화되었고 Rota 15, Rota 35, 또는 Rota 36과는 하이브리드화하지 않았다. VP7 단편은 Rota 41과 하이브리드화하였고 Rota 42와 하이브리드화하지 않았다.

이러한 결과는 P43이 동종 집단임을 확인하였다.

실시예 3: 잠재적 우발성 바이러스의 제거

에테르를 P33(AGMK 증식)에 첨가하여 1 시간 동안 20%의 최종 농도로 하였다. 다음, 에테르를 35분 동안 N₂로 발포하였다. P33의 역가에 아무런 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 4: 약독화된 생백신의 제형화

상기 기술된 생산 로트를 하기 방법에 의해 유아를 대상으로 한 경구 투여용으로 제형화하였다.

1. 동결건조 바이러스

표준 기술을 바이러스 용량을 제조하기 위하여 사용하였다. 냉동된 정제 바이러스 벌크(bulk)를 해동하고 적절한 배지 조성물, 이 경우에 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium)로, 요망되는 표준 바이러스 농도로, 이 경우에 10^6.2ffu/㎖로 희석하였다. 다음에 희석된 바이러스를 동결건조 안정화제(수크로오즈 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%)로 표적 바이러스 역가, 이 경우에 10^5.6ffu/용량으로 추가로 희석하였다. 안정화된 바이러스 조성물의 0.5㎖ 분취량을 무균상태로 3㎖ 바이얼로 옮겼다. 다음에 각 바이얼을 고무 마개로 부분적으로 폐쇄하고 샘플을 진공하에서 냉동 건조하였고, 다음에 바이얼을 완전히 폐쇄하고 알루미늄 캡을 바이얼 둘레를 크림핑(crimping)하여 마개를 적소에 놓았다.

사용을 위해서 바이러스를 하기 제산제 재구성물(reconstituent) 중 하나를 사용하여 재구성하였다.

(a) 시트레이트 재구성물

소듐 시트레이트를 물에 용해하고 여과에 의해 멸균하고 1.5㎖ 용량 당 544mg Na₃시트레이트.2H₂O의 농도 1.5㎖ 양으로 재구성물 용기로 무균적으로 옮겼다. 재구성물 용기는 예를 들어 3㎖ 바이얼, 또는 4 ㎖ 바이얼, 또는 2㎖ 시린지 또는 경구 투여를 위한 연질 플라스틱의 짤 수 있는 캡슐일 수 있다. 무균 상태 하에서 멸균 성분을 유지하는데 대한 대안으로서 최종 용기가 오토클레이브(autoclave) 처리될 수 있다.

(b) Al(OH) ₃ 재구성물

무균 수산화알루미늄 현탁액(밀란타(Mylanta-상표))를 무균상태로 멸균수 중에 희석하고 무균상태로 각각 48㎎ Al(OH)₃를 함유하는 2㎖ 양의 재구성물 용기(예를 들어 2㎖ 시린지 또는 연질 플라스틱의 짤 수 있는 캡슐)에 옮겼다. 무균 상태에서 무균 성분을 사용하는 것의 대안으로 수산화알루미늄 현탁액을 (바람직하게는 희석된 단계에서) γ선 조사하는 것이다.

표준 성분이 현탁액에 침전(setting)되는 것을 방지하기 위하여 포함되었다. 이러한 표준 성분은 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필메틸셀룰루오즈, 미결정질 셀룰로오즈, 및 실리콘 폴리머를 포함한다. 정균제 예를 들어 부틸파라벤, 프로필파라벤 또는 음식에 사용되는 다른 정균제, 및 향미료가 또한 포함될 수 있다.

2. 액체 제형 중의 Al(OH) ₃ 와 동결건조된 바이러스

표준 기술이 바이러스 용량을 제조하기 위하여 사용되었다. 냉동 정제된 바이러스 벌크를 해동하고 적절한 배지 조성물, 이 경우에 둘베코 수정 이글 배지로, 요망되는 표준 바이러스 농도로, 이 경우에 10^6.2 ffu/㎖로 희석하였다. 수산화알루미늄 현탁액을 첨가하여 48㎎/용량의 최종 양에 도달하도록 하였고, 바이러스 조성물은 동결건조 안정화제(수크로오즈 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%)로 표적 바이러스 역가, 이 경우에 10^5.6 ffu/용량으로 희석하였다. 안정화된 바이러스 조성물의 0.5㎖ 분취량을 무균적으로 3㎖ 바이얼에 옮겼다. 다음에 동결건조 및 바이얼의 밀폐를 파트 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.

3. 발포제 프리젠테이션(presentation)을 위한 Al(OH) ₃ 와 동결건조된 바이러스

표준 기술이 바이러스 용량을 제조하기 위하여 사용되었다. 냉동 정제된 바이러스 벌크를 해동하고 적절한 배지 조성물, 이 경우에 둘베코 수정 이글 배지로, 요망되는 표준 바이러스 농도로, 이 경우에 10^6.2 ffu/㎖로 희석하였다. 수산화알루미늄 현탁액을 첨가하여 48㎎/용량의 최종 양에 도달하도록 하였고, 바이러스 조성물을 수크로오즈, 덱스트란, 또는 아미노산 4%, 또는 젤라틴, 또는 식물 펩톤, 또는 잔탄일 수 있는 동결건조 안정화제로 10^5.6ffu/용량으로 희석하였다. 무균 충진 작업을 사용하여 0.5㎖의 용량 또는 바람직하게는 이것 미만을 발포제 캐비티(cavity)로 옮겼다. 조성물을 동결건조하고 발포제 캐비티를 열 밀봉으로 밀봉하였다.

임의의 표준 성분이 수산화알루미늄 현탁액이 침전되는 것을 방지하기 위하여 포함되었다. 이러한 표준 성분은 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필셀룰로오즈, 미결정질 셀룰로오즈, 및 실리콘 폴리머를 포함한다. 향미료가 또한 포함될 수 있다.

실시예 5: 다양한 제형을 위한 로타바이러스 적정

5.1: 락토오즈 기재 제형 및 수크로오즈 기재 제형의 비교

표 5

배치 n°	제형 조성	동결건조전 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에 서 1주 후 바이러스 역가
98G06/01	락토오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^5.22	10^4.67
98G06/03	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^5.28	10^4.92

P43 로타바이러스를 상기 표에 도시된 바와 같이 수크로오즈 또는 락토오즈로 제형화하였다.

동결건조전 바이러스 역가는 완결된 제형화 액체(수크로오즈 덱스트란 소르비톨 아미노산 함유)에서 동결건조 단계를 거치지 않은 바이러스 역가이다.

양호한 결과는 동결 건조 단계에서 <0.5 로그 감소 및 "37℃에서 1주" 동안 <0.5 로그 감소가 달성된 결과들이다.

바이러스 역가의 정확도는 약 + 또는 - 0.2 로그이다.

상기 결과는 수크로오즈가 락토오즈 대신 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

5.2: 아르기닌 및 말티톨에 의한 소르비톨의 대체 효과

표 6

배치 n°	제형 조성	동결건조후 시간=0에서의 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주 후의 바이러스 역가
98L16/01	락토오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.8	10^4.8
98L16/02	락토오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% 아르기닌: 3%	10^4.8	10^4.9
98L16/04	락토오즈: 2% 덱스트란: 4% 말티톨: 3% 아미노산: 2% 아르기닌: 3%	10^4.7	10⁵

결과는 아르기닌(동결건조 동안 바이러스의 안정성을 향상시키고 또한 위 산성을 상쇄하기 위하여 염기성 배지에 제공되는 것으로 공지)의 첨가가 바이러스 역가를 유지시킨다는 것을 증명하였다.

소르비톨은 동결건조된 케이크의 유리 전이 온도를 너무 큰 정도로 감소시키는 경향이 있었다. 이는 상기 도시된 바와 같이 소르비톨 대신에 말티톨을 사용함에 의해 극복될 수 있고 바이러스 역가는 여전히 유지되었다.

5.3: 다양한 제형 조성

이 실험은 많은 제형이 가능함을 증명한다.

표 7

배치 n°	제형 조성	동결건조전 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주 후 바이러스 역가
99C111/01	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^5.24	10^5.07
99C11/02	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 말티톨: 3% 아미노산: 2%	10^5.09	10^4.92
99C11/04	덱스트란: 4% 말티톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.89	10^5.06

배치 n°	제형 조성	동결건조후 시간=0에서 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주후 바이러스 역가
99C17/01	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^5.40	10^5.41
99C17/02	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 1.5% 아미노산: 2%	10^5.30	10^4.93
99C17/03	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 아미노산: 2%	10^5.31	10^5.24
99C17/04	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 말티톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.42	10^4.45
99C17/05	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 말티톨: 1.5% 아미노산: 2%	10^4.39	10^4.40

99C17/06	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3%	10^5.44	10^4.97
99C17/07	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 1.5%	10^5.11	10^4.89

5.4: 로타바이러스와 Al(OH) ₃ 제산제간의 회합:

표 8

로타바이러스	Al(OH)₃	H₂O	실온에서 접촉 시간	원심분리	상청액 바이러스 역가 ffu/㎖	펠릿 바이러스 역가 ffu/㎖
10^5.6 ffu/㎖	0.240㎖중의 48㎎	0.76㎖	30분	8000rpm, 10분	10^3.66
10^5.6 ffu/㎖	0.240㎖중의 48㎎	0.76㎖	30분	8000rpm, 10분	10^4.41
10^5.6 ffu/㎖		1㎖	30분	8000rpm, 10분	10^5.68
동결건조된 케이크중의 로타바이러스	0.120㎖중의 12㎎	1.38㎖	30분	8000rpm, 10분	검출 수준 이하	10^4.7

Al(OH)₃이 제산제로서 사용되었다. 이는 로타바이러스가 불용성 무기 염(Al(OH)₃)과 회합함을 보이는데, 이는 로타바이러스가 Al(OH)₃와 함께 원심분리되기 때문이다(상청액의 바이러스 활성 감소).

5.5: 바이러스 적정 전 소듐시트레이트에 의한 Al(OH) ₃ 제산제의 용해

표 9

바이러스 샘플	용해	조건	바이러스 역가 ffu/㎖
동결건조전 99B10/06 액체 제형: 10^5.43	1.5㎖ Na₃시트레이트	실온에서 24h	10^5.11
99B10/06: 동결건조된 10^5.43	1.5㎖ Na₃시트레이트	실온에서 24h	10^4.53

로타바이러스가 Al(OH)₃와 회합하는 경우에 모든 것(Al(OH)₃ 포함)을 동결건조하는 것이 가능하다. 동결건조 후에, 소듐시트레이트 중에 Al(OH)₃을 용해시킴에 의해 로타바이러스를 회수하는 것이 가능하다. 이러한 단계는 로타바이러스에 손상을 주지않고 이러한 용해 단계 후에 이의 활성을 유지시킨다.

5.6: Al(OH) ₃ -로타바이러스 회합의 유리 후의 로타바이러스의 감염력:

바이러스 유리(담체의 용해에 의한)의 메카니즘은 생체내에서 매우 잘 일어날 수 있다. 실제로 pH 6 미만에서, 수산화알루미늄은 완전히 용해되고 따라서 로타바이러스는 위에서 유리될 것이다.

Al(OH)₃ + 3H⁺ → Al⁺⁺⁺(수용성) + 3H₂O

위에서, Al⁺⁺⁺ 이온은 흡수되지 않는다(참조: J.J. Powell, R. Jugdaohsingh and R.P.H. Thompson, The Regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153).

장에서, pH의 증가로 인하여, 알루미늄의 불용성 형태가 침전되고(Al(OH)₃ 또는 AlPO₄), 천연 방식에 의해 제거된다. 새로이 형성된 Al(OH)₃ (또는 AlPO₄) 침전물이 유리 로타바이러스와 재회합할 수 있을 지는 알려져 있지 않다. 이는 Al(OH)₃-로타바이러스 회합 그 자체의 감염력에 대한 의문을 제기한다.

다른 메카니즘에 의한 Al(OH)₃-로타바이러스 회합으로부터 로타바이러스의 유리가 또한 가능하다. 라이신은 예를 들어 Al(OH)₃상의 바이러스 흡착을 간섭한다. 붕소산염, 황산염, 탄산염 및 인산염과 같은 다른 음이온은 수산화알루미늄에 특이적으로 흡착되는 것으로 공지되어 있고, 따라서 이론적으로 이는 Al(OH)₃-로타바이러스 회합으로부터 로타바이러스를 (흡착 부위에 대한 경쟁에 의해) 이탈시키는 것이 가능하여야 한다.

따라서, 로타바이러스는 로타바이러스-Al(OH)₃ 회합으로부터 유리될 수 있고 유리된 로타바이러스는 활성이 유지된다. 이러한 유리는 Al(OH)₃를 (위에서 HCl에 의해 또는 시험관내에서 Na₃시트레이트에 의해) 용해시킴에 의해 또는 염기성 아미노산(라이신)에 의해 로타바이러스를 이탈시킴에 의해 수행될 수 있다.

5.7: Al(OH) ₃ -로타바이러스 회합체의 감염력

동결건조된 로타바이러스의 단일 용량을 물로 재구성하여 두 부분으로 나누었다. 기준으로 고려되는 제 1 부분에 추가의 부피의 물을 첨가하였다. 제 2 부분에 0.240㎖의 물 중의 24㎎의 Al(OH)₃ 현탁액을 첨가하였다(전임상 바이러스 역가).

Al(OH)₃가 존재하는 경우에, 로타바이러스는 활성이고 바이러스 역가는 기준 샘플에 비해 더 높았다.

이러한 실험은 동결건조된 용량을 분할하지 않고 12㎎ Al(OH)₃또는 24㎎ Al(OH)₃를 첨가함에 의해 반복하였다.

여기서 기준 샘플은 시트레이트-중탄산염 완충액으로 재구성된 것이었다. 따라서, 바이러스 역가는 다시 Al(OH)₃의 존재시에 더 높았다.

상기 실시예에서처럼, 로타바이러스는 Al(OH)₃ 입자와 회합하였는데, 이는 바이러스가 원심분리에 의해 제거될 수 있기 때문이다. DRVC003A46은 동결건조 제형화된 로타바이러스(수크로오즈 2%, 덱스트란 4%, 소르비톨 3%, 아미노산 2%)이다.

SDSAA=수크로오즈 2%, 덱스트란 4%, 소르비톨 3%, 아미노산 2%.

상청액에 수행된 바이러스 역가에 따르면, 로타바이러스를 흡착하는데 필요한 Al(OH)₃의 양은 (하나의 동결건조된 용량 5.7로그 스케일-업 바이러스 역가로 출발하여) 적은 것으로 보였다:

표 10

Al(OH)₃	흡착 시간	상청액 중의 역가

12㎎	1시간 RT	2.7
24㎎	1시간 RT	3.4
48㎎	1시간 RT	3.4
72㎎	1시간 RT	2.0
96㎎	1시간 RT	검출량 미만

12㎎	밤새	2.7
24㎎	밤새	검출량 미만
48㎎	밤새	2.5
12㎎	중간	검출량 미만
24㎎	중간	2.0
48㎎	중간	검출량 미만

Al(OH)₃ 상에 로타바이러스를 흡착시키는데 필요한 시간은 짧은 것으로 보였다:

동결건조된 로타바이러스의 1개 용량을 24㎎ Al(OH)₃의 존재하에 재구성하였고, 0, 15, 60분 및 24시간 후에 원심분리하였다. "퀼로(Culot)"를 바이러스 적정 전에 SDSAA 중에 현탁시켰다.

표 11

시간	퀼로	상청액
0분	5.26	3.17
15분	5.34	<1.44
60분	5.96	<1.44
24시간	6.13	<1.44

5.8: CaCO ₃ 를 제산제로서 사용

백신 중에서 알루미늄을 피하기 위하여, 제산제 Al(OH)₃를 다른 불용성 염: CaCO₃(탄산칼슘)에 의해 대체하였다.

CaCO₃로 관찰된 현상은 Al(OH)₃에 대해 기술된 것들과 대등하였다:

- 로타바이러스와 무기염과의 회합

- 무기염과 회합된 경우에 로타바이러스 활성의 유지

- 산에 의해 무기염기의 해리에 의해 회합으로부터 로타바이러스의 유리 가능성

- 제산제 및 로타바이러스의 공동-동결건조의 가능성

CaCO ₃ 및 로타바이러스 회합

1차 시도에서, 동결건조된 로타바이러스(바이러스 역가 5.7)을 물 중의 CaCO₃의 현탁액(1.5㎖ 중의 50㎎)으로 재구성하였고, 다음 원심분리하고, 상청액의 바이러스 역가를 펠릿과 비교하였다.

이는 90% 초과의 로타바이러스가 CaCO₃와 회합함을 나타낸다.

또한, 바이러스가 회합된 경우에, 적정을 달성하고 본래의 바이러스 양을 회수하는 것이 가능하였다.

또한, 바이러스 역가는 CaCO₃ 없이 수득된 역가보다 다소 높았다.

CaCO ₃ 와 로타바이러스 회합의 양

동결건조된 로타바이러스를 물 중에서 CaCO₃ 현탁액(1.5㎖)로 재구성하였고:

10㎎

50㎎

100㎎

다음에 원심분리하고, 상청액의 바이러스 역가를 퀼로와 비교하였다.

표 12

CaCO₃	엑스템포(Extempo) + 원심분리		1 시간 + 원심분리
	퀼로	상청액	퀼로	상청액
100㎎	4.57	3.01	4.79	3.09
50㎎	4.17	4.15	4.22	3.86
10㎎	3.17	4.77	3.87	4.87

따라서, 완전히, 보다 많은 CaCO₃ 및 보다 많은 바이러스가 회합하였고, 상청액에서 보다 적게 발견되었다. 그러나, 전체 용량이 완전히 회수되지는 않았다(앞서 얻어진 바와 같은 적어도 5.3 또는 심지어 5.8을 기대-상기 참조).

베이비 로세트-라이스(Baby Rossett-Rice) 제산제 적정 동안 로타바이러스의 CaCO ₃ 보호

10개 용량의 동결건조된 로타바이러스(DRVC003A46) 및 50㎎의 CaCO₃ 를 사용하여, 두가지 타입의 베이비 로세트 라이스 적정을 수행하였다:

고전적인 로세트-라이스 적정에서, 제산제는 로타바이러스와 혼합되고 HCl을 이 배지에 붓는다.

"역" 베이비 로세트-라이스에서는 상황이 반대이다:제산제를 HCl 푸울에 적가한다(생체내에서 일어나는 바와 같음).

표 13

고전적인 베이비 로세트-라이스 적정
동결건조된 로타바이러스 저장 온도	완충액	이론적 바이러스 역가	실측된 바이러스 역가
4℃	60㎎ CaCO₃	5.3	4.6
-80℃	60㎎ CaCO₃	5.3	4.6
4℃	24㎎ Al(OH)₃	5.4	<2.9
-80℃	24㎎ Al(OH)₃	5.4	<2.9

역 베이비 로세트-라이스 적정
동결건조된 로타바이러스 저장 온도	완충액	이론적 바이러스 역가	실측된 바이러스 역가
4℃	60㎎ CaCO₃	5.3	4.6
-80℃	60㎎ CaCO₃	5.3	4.6
4℃	24㎎ Al(OH)₃	5.4	<2.9
-80℃	24㎎ Al(OH)₃	5.4	<2.9

따라서, 이러한 시험관내 실험에서, 탄산칼슘은 HCl의 존재로부터 약 20%의 로타바이러스를 보호할 수 있고, 반면에 수산화나트륨을 그럴 수 없었다.

5.9: CaCO ₃ 제산제의 존재하에서 로타바이러스의 동결건조

표 14

배치 n°	조성	동결건조후 시간=0에서 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주 후 바이러스 역가
99K08/01	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 50㎎	10^5.28	10^5.10
99K08/02	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎	10^5.16	10^5.15
00C24/01	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.3%	10^5.07	10^4.69
00C24/03	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.3%	10^5.07	10^4.85
00E09/25	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.25%	10^5.03	10^4.91
OOE09/30	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.30%	10^5.01	10^4.87
00F26/06	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 전분: 2%	10^4.50	10^4.70

이는 "올 인 원(all in one)"-로타바이러스 및 제산제(CaCO₃)를 함께 동일한 바이얼에서 동결건조시킨 것이다. 충진 단계 동안 CaCO₃ 의 침강을 막기 위하여, 증점제가 필요하다. 이러한 증점제의 예에는 잔탄 및 전분이 포함된다. 로타바이러스 활성은 잔탄 검 및 전분의 존재하에서 조차 유지된다.

5.10 구강에 존재하는 경우에 빠른 붕해를 위한 동결건조된 정제:

하기 제형은 "lyoc" 개념을 증명한다. 즉, 구강에서 동결건조된 케이크의 빠른 용해이다.

표 15

배치 n°	제형 조성	동결건조 전 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주 후 바이러스 역가
99B10/06	수크로오즈 4% 소듐 글루타메이트 3.7% Al(OH)3 48㎎	10^5.11	10^4.53
99C11/12	말티톨 3% Al(OH) 48㎎ 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈 1%	10^4.16	10^3.79

배치 n°	제형 조성	동결건조 후 시간=0에서 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주후 바이러스 역가
00C24/05	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.3%	10^5.02	10^4.54
00C24/06	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% CaCO₃: 60㎎ 잔탄: 0.3%	10^4.86	10^4.56
00F26/11	수크로오즈: 1% 덱스트란: 2% 소르비톨: 1.5% 아미노산: 1% CaCO₃: 60㎎ 전분: 2%	10^4.70	10^4.40

"lyoc 개념"에서 잔탄 및 전분 둘 모두가 사용되었다(동결건조된 케이크의 빠른 용해 특성을 유지).

실시예 6: 로타바이러스 백신 조성물을 위한 제산제로서 탄산칼슘의 용도

물 중의 CaCO₃의 현택액이 로타바이러스에 대한 제산제로서 사용되는 경우에 탄산칼슘 입자가 물중에 위치한 때에 빠르게 침강하는 문제가 있는데, 이는 분말 밀도 값이 2.6에 달하고 평균 입자 크기가 30μm이기 때문이다. 이러한 침강은 다음에 의해 저속화될 수 있다:

1. 주변 매질의 밀도를 증가시킴

2. 주변 매질의 점성을 증가시킴

3. 입자 크기를 감소시킴

4. 입자가 서로 떨어져 있도록 함

6.1: 주변 매질의 밀도를 증가시킴

CaCO₃-물 현탁액(시린지에 위치된 경우)을 동결건조된 케이크(수크로오즈 2%, 덱스트란 4%, 소르비톨 3%, 아미노산 2%를 함유)에 위치시키는 경우에, 주변 매질의 밀도가 증가되지만 CaCO₃ 침강 속도는 CaCO₃-물 현탁액으로부터 그다지 상이하지 않았다.

6.2 주변 매질의 점도를 증가시킴

유사가소성(pseudoplastic) 부형제

유사가소성 용액은 교반하의 점도와 비교하여 정치시에 더 높은 점도를 가지는 용액으로 정의된다.

이러한 타입의 통상적인 부형제는 다음과 같다:

천연 폴리머 예를 들어:

아라비아 검

어드라간테 검(adragante gum)

아가-아가

알지네이트

펙틴

반합성 폴리머 예를 들어:

카르복시메틸셀룰로오즈(틸로시즈(Tyloses) C®)

메틸셀룰로오즈(메토셀즈(Methocels) A®, 비스코트란(Viscotran) MC®, 틸로즈(Tylose) MH® 및 MB®)

하이드록시프로필셀룰로오즈(클루셀즈(Klucels)®)

하이드록시프로필메틸셀룰로오즈(메토셀즈(Methocels) E® 및 K®, 비스코트란즈(Viscontrans) MPHC®)

일반적으로, 이러한 유사가소성 부형제는 요변성제(thixotropic agent)와 함께 사용된다.

낮은 유량(flowing capacity)를 가지는 유사가소성 부형제

이러한 폴리머는 충분한 농도에서 구조적 액체 정렬을 유도하여 정치시에 낮을 유량을 가지는 고점도 용액을 생성한다. 특정량의 에너지가 시스템에 주어져 흐름 및 전달을 가능하게 할 필요가 있다. 외부 에너지(교반)가 액체 용액을 수득하기 위하여 구조적 액체 배열을 일시적으로 파괴하기 위하여 필요하다. 이러한 폴리머의 예는 카르보폴(Carbopol)® 및 잔탄 검이다.

요변성 부형제

이러한 부형제로 정치시에 겔 구조를 수득한다; 교반시에는 액체 용액을 수득한다.

요변성 부형제의 예에는 비이검(Veegum)®(마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 아비셀(Avicel) RC®(약 89% 미결정질 셀룰로오즈 및 11% 카르복시메틸셀룰로오즈 Na)가 있다.

6.3 입자 크기를 감소시킴

CaCO₃ 입자 크기의 감소는 화합물의 제산능의 감소를 초래한다.

6.4 입자를 서로 떨어져 있도록 함

이는 CaCO₃ 입자보다 더 작은(약 1 μm) 불용성 입자가 응집하는 것을 막기 위하여 CaCo₃ 입자 사이에 위치된다.

실시예 7: 제품 설계

하기 도해가 가능한 제품 설계의 예를 설명한다.

7.1 시린지 중의 CaCO ₃

동결건조된 바이얼 중의 로타바이러스의 임상 배치를 이미 가지고, 제산제를 시린지에 담긴 재구성 액체 중에 위치시킬 수 있다.

이러한 제품 설명에서, CaCO₃의 침강은 충전 단계 동안 뿐만 아니라 제품의 완전한 보관(shelf-live) 동안(적어도 2년) 관리되어야 한다.

7.2 동결건조된 바이얼 중의 CaCO ₃

7.3 발포제 중의 동결건조

이러한 경우에 로타바이러스, CaCO₃, 및 잔탄 검이 함께 발포제로 직접 동결건된다.

실시예 8: 상이한 스트레인의 로타바이러스의 동결건조

표 16

배치 n°	로타바이러스 스트레인	제형 조성	동결건조후 시간=0에서 바이러스 역가	동결건조 및 37℃에서 1주 후 바이러스 역가
OOF26/01	G1 SB purif n°61 PRO/0232	수크로오즈: 2% 덱스트란: 45 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.6	10^4.7
00F26/02	G2(DS-1)	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.4	10^4.4
00F26/03	G3(P)	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.6	10^4.5
00F26/04	G4(VA-70)	수크로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.8	10^4.8
00F26/05	G9(W161)	수클로오즈: 2% 덱스트란: 4% 소르비톨: 3% 아미노산: 2%	10^4.6	10^4.5

스트레인 DS-1, P 및 VA70은 문헌("Fields" Raven Press 1990, second edition)의 1361쪽에 혈청형 G2, G3, 및 G4 각각을 위한 인간 로타바이러스 기준 스트레인으로서 기술된다.

이러한 실험에서 로타바이러스 스트레인은 동결건조되었다. 모두에 대해, 바이러스 역가 모두는 동결 건조동안에 유지되었고 안정화가 가속화되었음을(37℃에서 1주) 보였다.

실시예 9: 로타바이러스 백신의 하나의 구강 투여의 성인에서의 제 1 상 안전성 연구.

제 1 상 연구를 수행하여 18 내지 45세의 건강한 성인에서 10^6.0 ffu의 단일 경구 용량의 P43 백신의 안전성 및 반응원성을 평가하였다.

임상 실험을 이중 맹검하였고 무작위로 하였다. 이는 플라시보-대조되고 자급식(self-contained)이었다. 연구를 벨기에에서 하나의 단일 중심에서 수행하였다.

연구 집단

총 33명의 피검자, 플라시보 그룹 11명 및 백신 그룹 22명을 등록하고 모두 연구를 완료하였다. 모든 지원자를 카프카스인이었다. 백신화 당시의 이들의 연령을 35.3세이었고, 18세 내지 44세 범위내였다. 시험을 1월에 시작해서 1달에 걸쳐서만 수행하였다.

재료

백신

임상 시험의 P43 백신을 우수의약품제조기준에 따라 제조하고 정제하고 제형화하고 동결건조하였다. 로트를 품질 관리 및 품질 확인에 의해 출하하였다. 각 백신 바이얼은 하기 성분을 함유하였다.

활성 성분:

P43 스트레인 분. 10^5.8ffu

부형제, 안정화제:

수크로오즈 9㎎

덱스트란 18㎎

소르비톨 13.5㎎

아미노산 9㎎

플라시보

플라시보 바이얼을 제조하고 출하하였다. 각 플라시보 바이얼은 하기 성분을 함유하였다.

부형제, 안정화제:

수크로오즈 9㎎

덱스트란 18㎎

소르비톨 13.5㎎

아미노산 9㎎

희석제

주사용수를 백신 및 플라시보를 재구성하기 위한 희석제로서 사용하였다.

투여

백신 또는 플라시보의 투여 전 약 10 내지 15분에 두 그룹 모두의 피검자에 킬란타(Mylanta)® 10㎖을 경구로 투약하였다. 밀란타®은 등록된 제산제이다. 제산제는 위의 pH를 증가시키고, 위 통과 동안 로타바이러스의 불활성화를 예방한다.

백신을 제조하기 위하여 바이얼 당 10^5.8 ffu를 함유하는 동결건조된 P43의 두개 바이얼을 주사용수 1.5㎖로 재구성하였다. 이는 용량당 10^6.1 ffu의 계산된 바이러스 역가를 달성하였다. 재구성된 백신을 단일 경구 용량으로서 즉각 투여하였다.

플라시보를 제조하기 위하여, 동결건조된 플라시보의 두개 바이얼을 1.5㎖의 주사용수로 재구성하고 단일 용량으로 경구로 투여하였다.

안전성 및 반응원성

하기 범주의 안정성 및 반응원성이 적용되었다:

원하는 일반 증상은 열, 설사, 구토, 메스꺼움, 복통, 및 식욕상실이었다. 이들을 투여후 8일 동안 기록하였다. 원하지 않은 증상을 투여 후 30일 동안 기록하였다. 원하지 않은 증상을 투여 후 30일 동안 기록하였다. 심각한 역 결과(event)가 전체 연구 기간 동안 기록되었다. 설사 샘플을 투여 후 8일 동안 수집하였다.

결과는 원하는 증상, 원하지 않는 증상 및 심각한 역 결과가 각각의 관찰 기간 동안 보고되지 않았다.

설사 증례는 보고되지 않았다.

결론

SB 바이올로지칼즈 P43 백신은 18 내지 44세의 건강한 성인 지원자에게 10^6.1 ffu의 용량으로 단일 용량으로서 이중-맹검 방식으로 경구로 투여된 경우에 플라시보에 비해 안전하였다.

실시예 10 - G1 및 비-G1(G9) 로타바이러스로 인한 위장염을 예방하는데 있어 인간 1가 로타바이러스 백신, 로타릭스(Rotarix) ^TM 의 두개 용량의 효능

무작위, 이중-맹검의 플리시보-대조된 제 2 상 시험을 수행하여 유아 면역화를 위한 G1P 인간 스트레인 89-12로부터 유래된 백신의 보호 효능을 평가하였다.

구체적으로, 사용된 백신을 로타릭스^TM이라 명명하였고, 이는 로타바이러스 성분으로서 ECACC 수탁번호 제99081301호로서 기탁된 약독화된 G1 인간 스트레인을 포함한다.

493명의 건강한 유아에게 바이러스 농도(10⁶ ffu)의 로타릭스^TM 또는 플라시보(504) 두 용량을 2 및 4개월령에, DTPw-HBV 및 Hib 백신과 동시에 투여하였고, OPV는 2주 간격으로 투여하였다. 설사 샘플을 로타바이러스의 존재에 대해 시험하였고(ELISA), 혈청형을 양성 샘플에서 결정하였다(RT-PCR). 2차 투약 2주 후로부터 보고된 설사 에피소드가 효능 분석을 위해 고려되었다. 증상 정도를 10-포인트 스케일을 사용하여 결정하였다(Ruuska and Vesikari, 1990). 11 이상의 점수가 심각한 질환으로 정의된다.

결과. 효능의 중간 분석을 상기 언급된 군에 대해 수행하였고, 단리된 혈청형은 G1 및 G9 였고, 거의 대등하게 분포되었다. 플라시보 그룹에서 총 발병률(attack rate) 6개월의 관찰 기간 동안 G1에 대해 4.8% 내지 G9에 대해 3.6%로 다양하였다. 10⁶ ffu의 로타릭스^TM의 두개 용량은 G1에 의해 유발되는 모든 타입의 설사에 대해 83% 효능[95% CI: 50.4-95.7]으로 보호하였고, 심각한 위장염에 대해 92%의 효능[Cl: 33.0-96.4]로 보호하였다. 설사가 G9에 의해 유발된다면, 모든 타입의 설사에 대한 보호는 심각한 위장염에 대해 60%[95% CI: 0.2-86.0] 및 81% [95% CI: 33.0-96.4]였다. 이러한 효능 종말점 각각에 대해, 플라시보 군과 비교하여 HRV 그룹에서 설사 에피소드의 통계학적으로 유의할만한 감소가 있었다(p<0.05, 양측 피셔 정확 검정(two-sided Fisher's exact test)).

결론. 이러한 결과는 동종 G1 스트레인에 대해 어린 유아를 보호하고 G9 스트레인에 대해 교차 보호하는데 있어 2개 용량의 1가 HRV 백신, 로타릭스^TM의 효능을 강력하게 뒷받침한다.

실시예 11 - G1 및 비-G1 (G2, G3, G4, G9) 로타바이러스로 인한 위장염을 예방하는 데 있어 3개의 상이한 농도로 투여되는 인간 1가 로타바이러스 백신, 로타릭스 ^TM 의 2개 용량의 효능

무작위, 이중-맹검, 플라시보-대조된 제 2 상 시험을 유아 면역화를 위한 G1P 인간 스트레인 89-12로부터 유래된 백신의 보호 효능 및 하스피탈리제이션(hospitalization)에 대한 효능을 평가하기 위하여 수행하였다.

구체적으로, 사용된 백신을 로타릭스^TM으로 명명하였고 로타바이러스 성분으로서 ECACC 수탁번호 제99081301호로서 기탁된 약독화된 G1 인간 스트레인을 포함한다.

건강한 유아에 세개의 상이한 바이러스 농도(468명은 10^4.7ffu를 투여받고, 460명은 10^5.2ffu를 투여받고, 464명은 10^5.8ffu를 투여받았다)의 로타릭스^TM의 2개 용량 또는 플라시보(454명)를 2개월 및 4개월령에 DTPw-HBV 및 Hib 백신과 동시에 투여하였고, OPV를 2주 간격으로 투여하였다. 설사 샘플을 로타바이러스(ELISA)의 존재에 대해 시험하였고, 혈청형을 양성 샘플(RT-PCR)로 결정하였다. 피검자가 1살이 될때까지 2차 투약 2주 후로부터 보고된 설사 에피소드가 효능 분석을 위해 고려되었다. 증상 정도를 20개 포인트 스케일을 이용하여 결정하였다(참조: Ruuska and Vesikari, 1990). 11 이상의 점수가 심각한 질병을 정의한다.

결과:

결과를 하기 표에 도시하였다. 백신 그룹에서 유아는 플라시보 그룹의 어린이 보다 상당히 적은 로타바이러스 위장염 에피소드를 가졌다(p<0.001, 양측 피셔 정확 검정). 용량에 따라, 심각한 로타바이러스 위장염에 대한 보호 효능이 86%(95% CI: 63%-96%)에 달하고, 임의의 로타바이러스 위장염에 대해서는 70%(95% CI: 46%-84%)에 달하였다. 이러한 효능 종말점 각각에 대해 플라시보 그룹에 비하여 HRV 그룹에서 설사 에피소드에 통계학적으로 유의할 만한 감소가 있었다(p<0.001, 양측 피셔 정확 검정). 여러 로타바이러스 혈청형(G1, G2, G3, G4, 및 G9)를 위장염 변으로부터 확인하여(ELISA 및 RT-PCR) 또한 비-G1 혈청형에 대한 백신 효능을 계산하게 하였다. 특히 비-G1 혈청형(G2, G3, G4, 및 G9)에 대한 표 19로부터 알 수 있는 바와 같이, 용량에 따라 심각한 로타바이러스 위장염에 대한 효능은 83%에 달하고(95%Cl: 40%-97%), 이는 1가 G1-기재 G1P1A P[8] 인간 로타바이러스 백신이 이형 (즉, 비-G1) 스트레인에 대한 교차 보호 효과를 유발한다는 개념의 증거를 제공한다.

연구 동안 보고된 로타바이러스 위장염 에피소드의 특징

표 17

		RIX4414 10^4.7ffu	RIX4414 10^5.2 ffu	RIX4414 10^5.8ffu	플라시보
임의의 로타바이러스 위장염		21	22	15	51
모든 로타바이러스 위장염 에피소드 중에 특이적 특징을 가진 에피소드의 개수(백분률)가 보고되었다.
증상 정도 점수	<7 7-10 ≥11	4(19) 5(24) 12(57)	8(36) 4(18) 10(45)	2(13) 8(53) 5(33)	5(10) 12(24) 34(67)
확인된 로타바이러스 혈청형
	야생형 G1	12(57)	6(27)	7(47)	30(59)
	G2	0	0	1(7)	3(6)
	G3	1(5)	0	0	2(4)
	G4	0	0	1(7)	0
	G9	8(38)	14(64)	7(47)	15(29)
	개과 동물	0	0	0	1(2)
	알려지지 않음	0	2(9)	0	0

로타바이러스 위장염에 대한 RIX4414 인간 로타바이러스 백신의 2회 용량의 보호 효능

표 18

		임의의 로타바이러스 위장염		심각한 로타바이러스 위장염		로타바이러스 위장염에 대한 하스피탈리제이션
	N	n(%)	효능 (95% CI)	n(%)	효능 (95% CI)	n(%)	효능 (95% CI)
푸울링된 백신 그룹	1392	58(4)^*	61(42-74)	27(2)^*	74(56-85)	9(0.6)^*	79(48-92)
RIX4414 10^5.8ffu	464	15(3)^*	70(46-84)	5(1)^*	86(63-96)	3(0.6)‡	79(25-96)
RIX4414 10^5.2ffu	460	22(5)^*	56(25-75)	10(2)^*	71(40-87)	1(0.2)^*	93(54- 100)
RIX4414 10^4.7ffu	468	21(4)^*	58(29-76)	12(3)^*	66(32-84)	5(1)†	65(-2-90)
플라시보	454	49(11)	-	34(7)	-	14(3)	-

^*양측 피셔 정확 검정에 의한 백신 및 플라시보 그룹간의 각 비교에 대해서 p<0.001(α=0.05의 유의 수준)

†P양측 피셔 정확 검정에 의한 백신 및 플라시보 그룹간의 각 비교에 대해서 p=0.037(α=0.05의 유의 수준)

‡양측 피셔 정확 검정에 의한 백신 및 플라시보 그룹간의 각 비교에 대해서 p=0.007(α=0.05의 유의 수준)

N=피검자 수

n/%= 하나 이상의 특정 로타바이러스 위장염 에피소드가 보고된 피검자 수

정확한 95% 신뢰 구간이 도시된다.

혈청형 특이적 중증 로타바이러스 위장염에 대한 RIX4414 인간 로타바이러스 백신의 2회 용량의 보호 효능

표 19

	심각한 로타바이러스 위장염 N n% 효능(95%Cl) p-값^*
G1 야생형 로타비아러스
푸울링된 백신 그룹	1392	13(0.9)	74(41-88)	<0.001
RIX4414 10^5.8ffu	464	2(0.4)	88(48-99)	<0.001
RIX4414 10^5.2ffu	460	4(0.9)	75(24-95)	0.006
RIX4414 10^4.7ffu	468	7(1.5)	58(-9-85)	0.057
플라시보	454	16(4)	-	-
비-G1 로타바이러스(주로 G2, G3, 및 G4 타입과 G9 타입)
푸울링된 백신 그룹	1392	14(1)	73(42-88)	<0.001
RIX4414 10^5.8ffu	464	3(0.6)	83(40-97)	0.001
RIX4414 10^5.2ffu	460	6(1)	65(7-89)	0.020
RIX4414 10^4.7ffu	468	5(1)	71(19-92)	0.009
플라시보	454	17(4)	-	-

^*백신 및 플라시보 그룹간의 각 비교에 사용된 양측 피셔 정확 검정(유의 수준 α=0.05)

N=피검자 수

정확한 95% 신뢰 구간이 도시된다.

결론:

이러한 결과는 동종성 G1 스트레인에 의해 유발되는 임의의 및 심각한 로타바이러스 위장염에 대해 어린 유아를 보호하고 이종성 스트레인, 즉 G2, G3, G4, 및 G9에대한 넓은 교차 보호에 있어 1가 HRV 백신, 로타릭스^TM의 2회 용량의 효능을 강력하게 지지한다.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals sa <120> Vaccine <130> VU60489 <160> 34 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 2350 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 1 atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat 60 gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120 gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180 gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240 tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300 ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360 atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420 gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480 accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540 ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600 cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660 aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720 tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780 tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840 gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900 caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960 ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg 1020 tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca 1080 tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca 1140 ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct 1200 gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta 1260 aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga 1320 acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac 1380 tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag 1440 actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta 1500 cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca 1560 ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact 1620 aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt 1680 tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt 1740 agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta 1800 actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta 1860 aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta 1920 aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca 1980 gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta 2040 atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg 2100 ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata 2160 atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg 2220 ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca 2280 attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga 2340 ggatgtgacc 2350 <210> 2 <211> 1009 <212> DNA <213> Rotavirus <400> 2 atgtatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt 120 tatgtagcat tatttgcctt gacaagagct cagaattatg ggcttaactt accaataaca 180 ggatcaatgg acactgtata cgctaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240 ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatta atgatggtga atggaaagac 300 tcattgtcac aaatgtttct cacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360 tattcaagta ttgttgattt ttctgtcgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420 ctaatgaaat atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480 aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaatacg 600 caaatgttag gaataggttg tcaaacaaca aatgtagact cgtttgaaat ggttgctgag 660 aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca 720 actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc caagagagaa tgtagctgta 780 atacaagttg gtggctctaa tgtattagac ataacagcag atccaacgac taatccacaa 840 actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tactatagta 900 gattatatta accaaatcgt gcaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata gatatatctt agattagatc gatgtgacc 1009 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ggttagctcc ttttaatgta tggta 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 caagtactca aatcaatgat gg 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tgttgatttt tctgtcgatc cac 23 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc 32 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tggcttcgcc attttataga ca 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 atttcggacc atttataacc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tggcttcact catttataga ca 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 atttcagacc atttataacc tag 23 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ggagtagtat atgaaagtac aaataatag 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ctattatttg tactttcata tactactcc 29 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 tcgatacagt ataagagagc acaag 25 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ttcattaact tgtgctctct tatactg 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gtatatgtag actattggga tg 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 catcccaata gtctacatat ac 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 tgtaactccg gcaaaatgca acg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 cgttgcattt tgccggagtt aca 23 <210> 22 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<400> 32 atccctatta tactgcattt ctttc 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 atccccatta tactgcattt ctttc 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 atccctatta tactgcattc ctttc 25

Claims

하나의 로타바이러스 혈청형으로부터 로타바이러스 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 상이한 혈청형으로부터 약독화된 로타바이러스 스트레인을 포함하는 조성물을 피검자에 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 혈청형이 로타바이러스 G 단백질의 서열을 기준으로 정하여짐을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 둘 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 셋 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 넷 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스 스트레인이 단일 로타바이러스 변이체 또는 실질적으로 단일 로타바이러스 변이체이고, 상기 변이체가 VP4 및 VP7, 바람직하게는 VP7로서 지정된 주요 바이러스 단백질 중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 정해짐을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 788번 위치의 아데닌 염기(A), 802번 위치의 아데닌 염기(A), 및 501번 위치의 티민 염기(T) 중 하나 이상을 포함하는 VP4 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, VP4 유전자가 출발 코돈으로부터 788번 위치 및 802번 위치에 아데닌 염기(A) 및 501번 위치에 티민 염기(T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 605번 위치의 티민(T), 897번 위치의 아데닌(A), 897번 위치의 구아닌(G) 중 하나 이상을 포함하는 VP7 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, VP7 유전자가 출발 코돈으로부터 605번 위치에 티민(T) 및 897번 위치에 아데닌(A) 또는 구아닌(G)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 788번 위치 및 802번 위치에 아데닌(A), 및 501번 위치에 티민(T)을 포함하는 VP4 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함하고; VP7 유전자가 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 605번 위치에 티민(T) 및 897번 위치에 아데닌(A)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1, 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-G1 혈청형 중 하나 이상에 대해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1, 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 비-G1 혈청형 중 둘 이상에 대해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1 및 G2, G3, G4, 및 G9 혈청형에 대해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 백신화된 개체의 집단에서 조성물에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 유형과 상이한 유형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발되는 설사에 대해 60% 이하의 보호능을 보임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 조성물에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 유형과 상이한 유형의 로타바이러스의 감염증에 의해 유발되는 위장염에 대해 80% 이하의 보호능을 보임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 둘 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발되는 중증 위장염에 대해 백신화된 개체의 집단에서 83% 이하의 보호능을 보이는 G1 로타바이러스 스트레인을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 위장염이 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된 넷 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 위장염이 G2, G3, G4 및 G9 혈청형의 감염에 의해 유발됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 로타바이러스 스트레인이 ECACC 수탁번호 제99081301호이 거나 ECACC 수탁번호 제99081301호로부터 수득되거나 유도될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 2회 투약 계획으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스 스트레인이 적합한 약제학적 담체 또는 제산제 완충액 또는 둘 모두와 함께 제형화됨을 특징으로 하는 방법.
하나의 혈청형으로부터의 약독화된 로타바이러스 스트레인의 상이한 로타바이러스 혈청형으로부터 로타바이러스 감염에 대해 면역 반응을 유발하기 위한 약제 제조용 용도.
제 23 항에 있어서, 혈청형이 로타바이러스 G 단백질의 서열을 기준으로 정하여짐을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 둘 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역 반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 셋 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역 반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스가 넷 이상의 다른 로타바이러스 스트레인에 대해 면역 반응을 유발할 수 있음을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스 스트레인이 단일 로타바이러스 변이체 또는 실질적으로 단일 로타바이러스 변이체이고, 상기 변이체가 VP4 및 VP7, 바람직하게는 VP7로서 지정된 주요 바이러스 단백질 중 하나 이상을 코드화하는 누클레오티드 서열에 의해 정하여짐을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 788번 위치의 아데닌 염기(A), 802번 위치의 아데닌 염기(A) 및 501번 위치의 티민 염기(T) 중 하나 이상을 포함하는 VP4 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 29 항에 있어서, VP4 유전자가 출발 코돈으로부터 788번 및 802번 위치의 아데닌 염기(A) 및 501번 위치의 티민 염기(T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포 함함을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 28 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 605번 위치의 티민(T), 897번 위치의 아데닌(A) 및 897번 위치의 구아닌 중 하나 이상을 포함하는 VP7 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 31 항에 있어서, VP7 유전자가 출발 코돈으로부터 605번 위치의 티민(T) 및 897번 위치의 아데닌(A) 또는 구아닌(G)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 30 항 또는 제 32 항에 있어서, 조성물이 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 788번 및 802번 위치에 아데닌(A) 및 501번 위치에 티민(T)을 포함하는 VP4 유전자를 가지는 로타바이러스를 포함하고, VP7 유전자가 누클레오티드 서열에 출발 코돈으로부터 605번 위치의 티민(T) 및 897번 위치의 아데닌(A)을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1, 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-G1 혈청형에 대 해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 용도.
제 34 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1 혈청형, 및 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 비-G1 혈청형에 대해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 용도.
제 35 항에 있어서, 조성물이 G1 로타바이러스 스트레인을 포함하고, G1 및 G2, G3, G4 및 G9 혈청형에 대해 면역 반응을 유발하는데 사용됨을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 백신화된 개체의 집단에서 조성물에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 유형과 상이한 유형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발되는 설사에 대해 60% 이하의 보호능을 보임을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 조성물에 존재하는 약독화된 로타바이러스의 유형과 상이한 유형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발되는 위장염에 대해 81% 이하의 보호능을 보임을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 둘 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발되는 중증 위장염에 대해 백신화된 개체의 집단에서 83% 이하의 보호능을 보임을 특징으로 하는 용도.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 위장염이 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13, 및 G14로 구성된 군으로부터 선택된 넷 이상의 비-G1 혈청형의 로타바이러스의 감염에 의해 유발됨을 특징으로 하는 용도.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 위장염이 G2, G3, G4, 및 G9 혈청형의 감염에 의해 유도됨을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 로타바이러스 스트레인이 ECACC 수탁번호 제99081301호이거나 ECACC 수탁번호 제99081301호로부터 수득되거나 유도될 수 있음을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 2회-투약 계획으로 투여됨을 특징으로 하는 용도.
제 23 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 로타바이러스 스트레인이 적합한 약제학적 담체 또는 제산제 완충액 또는 둘 모두와 함께 제형화됨 을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 로타바이러스 스트레인이 G1 혈청형이고, G9 혈청형이 아닌 비-G1 혈청형에 대해 면역 반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 방법 또는 용도.