CN101489587B - 一种可用作疫苗的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包括病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质的组合物。该组合物也可以有选择地包括三种不同的二糖，或者，可选择该组合物包括一种主要的糖和至少一种，优选两种，次要的糖。本发明还涉及病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质用于制备药物组合物的用途，优选用于制备疫苗的用途。本发明进一步涉及治疗或预防人体病毒相关疾病的方法。此外，本发明还涉及一种使病毒适应于合适细胞系的方法。本发明也可用于生产一种病毒悬浮液，它适用于制造稳定的、活/灭活的、单价和/或多价的、液态/冻干的轮状病毒疫苗组合物，用于人体的经口和/或鼻或任何其他合适的给药途径中。
Description
技术领域
本发明涉及一种包括病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质，以及主要的糖和次要的糖的组合物。本发明还涉及病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质用于制备药物组合物的用途，优选用于制备疫苗的用途。本发明进一步涉及一种治疗或预防人体病毒相关疾病的方法。此外，本发明还涉及一种使病毒适应于合适细胞系的方法。
本发明也可用于生产一种病毒悬浮液，它适用于制造稳定的、活/灭活的、单价和/或多价的、液态/冻干的轮状病毒疫苗组合物，用于人体的经口和/或鼻或任何其他合适的给药途径中。
背景技术
轮状病毒感染是婴儿和幼儿中与腹泻相关的死亡最主要的原因。每年轮状病毒肠胃炎引发全世界310,000-590,000婴儿和幼儿的死亡。国际卫生机构已在推动轮状病毒疫苗研制的进展，作为预防与轮状病毒感染相关病的发病和死亡的最好的方法。国际卫生组织在1997年，以及在2000年再一次，建议所有新的轮状病毒疫苗应在亚洲和非洲测试，并且该测试应该与在美国和欧洲实施的试验同时进行。通过这样做，在贫穷的发展中国家中，可以在研制的早期证明该疫苗的安全性和效力，从而加快将新疫苗用于最需要它们的儿童。
迄今为止，所有研制的轮状病毒疫苗都已经基于活的轮状病毒菌株，这些菌株已经从人或动物体分离，并且在活体外再被分类和适应于细胞培养、按配方配制成口服用药。基于动物体的单价和多价的菌株，都已经被证明有效力，从而可作为候选疫苗。RotaShield(Wyeth-Ayerst)获得了许可，但是随后又被撤回。
天然人-牛重配的、天然减毒的人体轮状病毒菌株116E被描述具有人体G9菌株的特征，其中天然地引入了与P[11]基因片段同源的单个牛VP4基因。被描述具有G10P[11]的特征的I321菌株主要由牛基因组成，并且仅有两个人源的基因片段VP 5和VP 7。这两个轮状病毒疫苗菌株已经各自按小批量制备成单价的口服轮状病毒疫苗液体制剂，用于在印度实施的临床试验。
按照国家过敏和易传染疾病研究所(NIAID)与国家卫生研究所(NIH)在美国Bethesda签署的材料转让协定，巴拉特(Bharat)生物技术国际有限公司(BBIL)从国家卫生研究所(NIH)获得人类轮状病毒菌株116E和I321。该两株轮状病毒菌株完整的基因组序列已有报道。经过在原代非洲绿色猴子肾(AGMK)细胞底物中，然后在MA104细胞底物中，随后在连续传代的AGMK(SPAGMK)细胞底物中进行传代，使该原始的116E(G9[P11])和I321(G10P[11])适应在细胞培养中生长。MA104和SPAGMK细胞底物是未经国家规范管理局(NRA)批准用于商业疫苗生产的。因此，优选使116E和I321以及其他的轮状病毒疫苗菌株适应于被批准、公认、许可和特征已完全清楚的细胞底物，如Vero细胞底物和/或人二倍体细胞，如MRC-5细胞的底物。
WO 02/11540描述了包括适合于轮状病毒疫苗口服给药的缓冲剂的轮状病毒疫苗配方。在WO 02/11540中披露的配方还包括使该疫苗组合物稳定而防止效力损失的化合物。更具体的，在WO 02/11540中披露的组合物包括糖、磷酸盐和至少一种羧酸盐。用WO 02/11540配方达到的稳定性差别很大，尤其在温度超过20摄氏度，显示出在效力上有相当大的损失。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供一种显示有优良稳定性的、其他的病毒抗原组合物，优选轮状病毒组合物。
本发明的目标是通过一种组合物来达到的，该组合物包括病毒抗原、与所述病毒抗原不同的第一蛋白质，所述第一蛋白质选自人血清白蛋白(HSA)和重组人血清白蛋白(rHA)、与所述病毒抗原不同的第二蛋白质，第二蛋白质是至少部分水解的，所述第二蛋白质选自乳白蛋白。第二蛋白质比任何一种单独的蛋白质给疫苗制剂带来更高的稳定性。
在一个实施方案中该组合物进一步包括三种不同的二糖，其中，优选所述三种不同的二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、蜜二糖和松二糖。在蔗糖被用作主要的糖时，次要的糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖的联合物。特定浓度的糖的联合物进一步提高了包含蛋白质添加剂的疫苗制剂的稳定性。术语“主要的糖”，用于此处，意味着指某种以大于任何其他糖的量而与其他糖一起存在于组合物中的糖。这些其他的糖在此处也可认为是“次要糖”。该“主要糖”在此处也可被认为是“主体糖”。
在一个实施方案中，所述的至少部分水解的第二蛋白质，选自乳白蛋白水解产物、酵母水解液、胨，以及明胶水解产物。
在一个实施方案中，所述的第一蛋白质在制剂中的含量为0.1％(w/v)-2％(w/v)，优选0.1％(w/v)-0.45％(w/v)，以及，所述的至少部分水解的第二蛋白质，以至少部分水解的产物存在于制剂中，其含量为0.01％(w/v)-10％(w/v)。
优选所述的三种不同的二糖，或所述的主要的糖和所述的至少两种次要的糖是以下联合物中的一种：
a)蔗糖，乳糖和麦芽糖，
b)蔗糖，麦芽糖和海藻糖，
c)蔗糖，乳糖和海藻糖，
d)麦芽糖，乳糖和海藻糖。
优选所述的三种不同的二糖在制剂中的总量为20％(w/v)-70％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，蔗糖的量，如果含有，为40％(w/v)-55％(w/v)，优选50％(w/v)；乳糖的量，如果含有，为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，优选0.5％(w/v)；麦芽糖的量，如果含有，为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，优选0.5％(w/v)，以及海藻糖的量，如果含有，为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，优选0.5％(w/v)。
在一个实施方案中，所述的病毒抗原是一种活病毒，比如一种活的减毒病毒，其中，优选所述的活病毒选自一组轮状病毒。
优选所述的活病毒是一种人体活病毒，比如人体轮状病毒。
在一个特别优选的方案中，所述的人类轮状病毒是轮状病毒菌株116E或I321。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括一种效价为104-107FFU/0.5ml的活轮状病毒、0.1％(w/v)-0.45％(w/v)的人血清白蛋白、0.01％(w/v)-10％(w/v)的乳白蛋白水解物，以及下述a)和b)两者之任一种：
a)蔗糖的量为40％(w/v)-55％(w/v)，以及
乳糖的量为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，以及
麦芽糖的量为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，
或
b)蔗糖的量为40％(w/v)-55％(w/v)，以及
麦芽糖的量为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)，以及
海藻糖的量为0.1％(w/v)-10.0％(w/v)。
在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括一种缓冲溶液，用来调整所述组合物pH值至6.8-7.8，其中，优选所述的缓冲溶液是磷酸盐/柠檬酸盐缓冲溶液。
在一个实施方案中，本发明的组合物在Eagles极限必需培养基中制成，其中，优选其缓冲于pH为6.8-7.8的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲溶液中。
优选所述磷酸盐/柠檬酸盐缓冲溶液是大约310mM的磷酸盐和大约100mM的柠檬酸盐。
在一个实施方案中，本发明的组合物是一种疫苗。
稳定的疫苗制剂的制备存在巨大的挑战。该制剂的稳定性取决于在该疫苗组合物中合成一体的赋形剂之间的相互作用。蛋白质和糖之间的氢键必须占优势而使疫苗稳定。糖和抗原蛋白质有效的接触必须有适当的比例，以保持该疫苗的稳定。在一定的温度下，要求糖浓度有一个临界值，以具有一定数量的蛋白质和糖之间的氢键来保持疫苗稳定一段给定的时间。糖通过替代结构水，能够与磷脂膜和蛋白质形成氢键。本研究中提供了各种稳定剂，用于使减毒的轮状病毒116E和I321在2-8℃、25℃和37℃稳定一段长的时间。
糖和蛋白质与缓冲成分的适当组合，可在长的存储期内保存病毒，并且使其存活和有活性。这些添加剂对悬浮在液体中的轮状病毒给于了结构上的支持。海藻糖在疫苗配方中优选用作稳定剂，因为它稳定病毒的蛋白质结构并且恢复其在长期存储中的效力。蔗糖和麦芽糖的联合使糖和蛋白质(疫苗)有效接触，从而保持疫苗稳定。在糖和疫苗蛋白的有效接触以保持疫苗的稳定中，由乳白蛋白水解产物支持的人血清白蛋白起了重要的作用。
本发明的目标还通过下述技术方案来实现：使用如上述定义的病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质，以及，任选如上述定义的三种不同的二糖来制造本发明的组合物，优选用于制造一种疫苗，用来治疗或预防与病毒相关的疾病，优选与轮状病毒相关的疾病，比如腹泻和肠胃炎。
优选所述的治疗或预防包括，将3份口服剂量为安全和有效量的本发明组合物施给8-20周的婴儿，每次1份剂量。
优选本发明的用途是病毒感染的预防，优选人体轮状病毒感染和/或轮状病毒肠胃炎的预防。
本发明的目标也通过一种治疗或预防与病毒相关的、优选与人体轮状病毒相关的疾病的方法来实现，该方法是将有效量的本发明的组合物施给人。
优选本发明的方法包括，将3份口服剂量为安全和有效量的本发明组合物施给8-20周的婴儿，每次1份剂量。
在一个实施方案中，本发明的方法用于病毒感染的预防，优选人体轮状病毒感染和/或轮状病毒肠胃炎的预防。
本发明的目标通过使病毒适应于合适的细胞系，例如Vero细胞，的方法来实现，该方法包括通过所述合适的细胞系的培养使所述病毒连续地进行传代，每次传代发生在含有氯化钙和胰蛋白酶的培养基中。
优选所述的氯化钙含量为0.1mg/ml-1mg/ml，所述胰蛋白酶含量为0.1μg/ml-30μg/ml。
在一个实施方案中，所述的连续传代包括2-20代，优选2-5代。优选每次传代在24小时-10天的期间内完成。
优选所述病毒是人体轮状病毒
本发明人已经发现，在药物组合物中包括选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白的第一蛋白质以及至少部分水解的第二蛋白质，可提高就病毒效力而论的组合物的稳定性。尤其在温度为25℃和37℃时，本发明的组合物显示出增强的稳定性。
短语“第二蛋白质是至少部分水解的”，用于这里，意思是指一种状态，其中该第二蛋白质已至少部分降解为其各自的氨基酸组块。因此，上述的短语也意味着包括下述各种状态，其中，第二蛋白质不再以完整的分子存在，而是仅作为其碎片的聚集体。上述短语意味着还包括一种状态，即其中第二蛋白质完全水解。所有这些状态也意味着被短语“蛋白质水解产物”所包括，比如“乳白蛋白水解产物”，它可以包括完全水解的蛋白质，即，蛋白质被分解为它各自的氨基酸；或蛋白质部分降解，这样就存在肽和氨基酸的聚集体。这种蛋白质的水解产物可以很容易由本领域普通技术人员制备，例如通过酸水解，或可通过商业渠道获得。
对于因含有第一蛋白质和第二蛋白质所达到的稳定效果，可以通过含有三种不同二糖的联合物，或含有一种主要糖和至少两种次要糖的联合物而有选择地增强。优选联合物是蔗糖、乳糖和麦芽糖，以及蔗糖、麦芽糖和海藻糖。本发明的组合物可作为一种疫苗用于接种疫苗来抗病毒感染和病毒相关疾病。优选这些组合物被缓冲在一个合适的pH，通常在6-8，优选在6.8-7.8。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物可以在Eagles极限必需培养基中配制。优选该组合物被缓冲，例如用磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液缓冲。
本发明人也已经设计出一种使病毒适应于合适细胞系的方法，这种方法可以用于，例如轮状病毒。这种方法是通过细胞培养，使病毒连续地传代而实施的，其中传代在氯化钙和胰蛋白酶存在的条件下发生。这样可获得一种简单的使病毒适应于一种给定细胞系的方法，而且，能够生产出高效价的病毒。
更具体地举例来说，本发明人已经使116E和I321轮状病毒菌株适应Vero细胞来生产高效价的轮状病毒收获物，并且进一步表征被适应的116E和I321，用于制造稳定的、活的、单价的、液体轮状病毒疫苗组合物。在接种疫苗以前，给孩子服用口服柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液抗酸剂组合物，用于缓冲孩子们胃的酸性。
到目前，所有报道的轮状病毒疫苗菌株是天然的、活的、人牛、天然或人工减毒轮状病毒菌株，或是具有VP4、VP7以及其他人或牛轮状病毒菌株基因的各种组合的人或牛的基因工程菌株。轮状病毒菌株116E(G9P[11])和I321(G10P[11])是天然人-牛重配的、自然减毒的以及对婴儿和幼儿赋予相当高的免疫水平的菌株。在高效价的母体抗体存在下，116E菌株所具有的在新生儿体内复制而不诱发疾病的能力，也使其更有希望成为活的、自然减毒的单价轮状病毒疫苗的候选菌株。
本发明提供用于药用组合物的病毒，优选轮状病毒，该病毒显示出高的稳定性和长的寿命，尤其是温度在20℃以上时。本发明还提供一种使轮状病毒，如天然人-牛重配的、天然减毒的轮状病毒菌株116E(G9P[11])和I321(G10P[11])适应于合适的细胞，例如Vero细胞的方法。该方法包括在活化和维持病毒的培养基中，胰蛋白酶(0.1μg/ml-o 30μg/ml)和/或氯化钙(100μg/ml-1000μg/ml)的优化剂量，1-10天内，在该培养基上可收获高效价(104-108FFU/ml)的病毒。本发明还提出了上述适应的菌株用来制造稳定的、活的、单价的、液体轮状病毒疫苗组合物的用途。此外，本发明为病毒抗原的应用提供了第一蛋白质、第二蛋白质以及可选择的三种不同二糖的联合物来制造本发明的组合物，该组合物用于病毒相关疾病的治疗或预防，优选轮状病毒相关的疾病的治疗或预防。
按照要求，本发明具体实施方案公开于此；然而，理所当然，该公开的实施方案仅是本发明的范例，该范例可以不同的形式体现。因此，公开于此的具体的结构和实用的细节决不能解释为限制，而是仅仅作为该权利要求的基础，并且作为对本领域的普通技术人员进行讲授的代表性的基础，以便在实际中灵活地将本发明应用于任何恰当地详述的结构中。此外，这里使用的术语和短语目的不是用于限制本发明，而是用来提供可以理解本发明的描述。
术语“一个(种)”，使用于此，被定义为一个(种)或超过一个(种)。术语“多个(种)”，使用于此，被定义为二个(种)或超过二个(种)。术语“另一个(种)”，使用于此，被定义为至少有第二个(种)或更多。术语“包括”和/或“具有”，使用于此，被定义为包含(即，开放语言)。
人体轮状病毒呈现一种非常窄的组织培养宿主范围。因此，不同菌株的分离和连续传代通常在细胞培养中进行，比如猿MA-104或原代猴子肾(AGMK)细胞，这两者都不适合于疫苗生产。前者的细胞没有被承认为一种用于疫苗生产的底物，而后者的细胞以他们被各种猿的微生物试剂，包括反转录病毒，污染而出名。
许多特征已很清楚的轮状病毒已在不适合用于疫苗生产的市售实验室细胞培养体系中被分离、连续传代和经三度噬菌斑纯化。在疫苗研制中必须使用这些病毒的情况下，可随后将该病毒在证实为用于疫苗研制和生产的细胞底物中传代和生物克隆。最理想是，在疫苗中使用的病毒应只在被证明是适用于疫苗生产的组织培养细胞中被分离和传代。Vero细胞系和MRC-5细胞系符合这个必要条件，因为它们支持轮状病毒有效地生长。
本发明涉及一种包括病毒抗原的组合物，和涉及一种使人-牛天然重配和自然减毒菌株116E(G9P[11])和I321(G10P[11])适应于Vero细胞的方法。原始的116E和I321轮状病毒疫苗菌株已被适应于AGMK、MA104以及SPAGMK细胞底物。SPAGMK是一种未经国家规范管理局(NRA)批准用于疫苗商业化生产的细胞系。因此，优选不但要使该轮状病毒疫苗菌株(116E，I321)适应食品医药管理局或国家规范管理局批准的细胞底物，如Vero细胞、人二倍体细胞、MRC-5等，而且要在尽可能短的期限内，收获高效价病毒用于轮状病毒的疫苗商业化生产。根据在科学文献中可用的资料，已研究过若干用于适应的方法，但是就病毒收获量和时间周期而言，没有发现满意的方法。新的病毒适应方法被优选用于轮状病毒疫苗菌株的大量生产，在该方法中，我们对不同的时间周期使用了不同浓度的氯化钙和胰蛋白酶，用以病毒的活化和维持培养基的标准化。对于口服的轮状病毒疫苗组合物，该病毒在下述组合物中被稳定，该组合物包括选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白和猪血清白蛋白的第一蛋白质，以及至少部分水解的第二蛋白质，所述第二蛋白质选自人乳清蛋白、牛类乳清蛋白和猪乳清蛋白。优选该组合物还可选择地包括三种不同二糖的联合物，所述的三种不同的二糖，选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、龙胆二糖、蜜二糖和松二糖。
更多可能被加入该组合物的成分包括明胶、明胶水解产物、酪胨、山梨糖醇、氨基酸，比如丙氨酸，组氨酸，精氨酸，谷氨酰胺、以及抗菌素。在该疫苗服用之前，口服一种抗酸剂化合物，例如柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液，用来缓冲胃的酸性，并保证该活性疫苗的传输。
根据一个实施方案，通过下述方法将轮状病毒疫苗菌株116E和I321适应于Vero细胞底物(ATCC编号-CCL-81)，并在十天内收获高效价病毒：在不同的收获病毒的时间间隔，采用标准化的100μg/ml-1000μg/ml的氯化钙浓度和/或0.1μg/ml-30μg/ml的胰蛋白酶浓度。该病毒收获量通过酶联免疫吸附测定方法来评定，也可通过测量溶血灶形成单位(FFU)/ml，依据病毒在适当的细胞底物中的传染性效价来评定。
在本技术领域中，已知轮状病毒是通过胰蛋白酶将VP4分裂为VP5和VP8(7，8)而使其传染性增强的。VP5在该寄主细胞膜上打洞使该轮状病毒进入。
通过电泳型(图13和14)以及核苷酸序列(数据没有显示)进一步描述适应的轮状病毒，即疫苗候选菌株的特征。
抗轮状病毒疫苗菌株的抗体按照用于免疫诊断和免疫治疗目的的制备标准方案产生。
轮状病毒疫苗菌株通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测，其中，VP4和VP7基因和/或VP4和VP7基因有选择性地杂交的核酸通过下述方法扩增：利用VP4基因(类型p11)和/或VP7基因的正反向引物，以及在(G9P[11]，G10P[11])VP4基因和/或VP7基因内部，或位于一相邻的基因的第二引物进行扩增。
附图说明
图1：含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在2-8℃存储长达50周后的稳定性数据。
图2：含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在25℃存储后的稳定性数据。
图3：含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在37℃存储后的稳定性数据。
图4：样品1的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图5：样品2的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图6：样品3的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图7：样品4的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图8：样品5的轮状病毒液体在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图9：样品6的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据，以及
图10：样品7的轮状病毒液体制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图11：样品1-4的轮状病毒冻干制剂在2-8℃、25℃以及37℃存储后的稳定性数据。
图12：定量测定(免疫过氧化物酶测定)在不同的胰蛋白酶浓度下收获的被适应的轮状病毒。
图13：116E RNA在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过银染而显色的电泳型。泳道分布：
1轮状病毒116E，SPAGMK参照
2轮状病毒116E，最后一批#61 4004
3[轮状病毒116E，SPAGMK参照+轮状病毒116E，最后一批#61 4004]的混合物
4轮状病毒116E，最后一批#61 4004
5轮状病毒116E，SPAGMK参照
6轮状病毒116E，大批量#61BP4004
7轮状病毒116E，工作病毒库
图14：轮状病毒I321在10％聚丙烯酰胺凝胶上通过银染而显色的电泳型。
泳道分布：
1轮状病毒I321，SPAGMK参照
2轮状病毒I321，最后一批#61 4004
3[轮状病毒I321，SPAGMK参照+轮状病毒I321，最终量#64 4004]的混合物
4轮状病毒I321，最后一批#64 4004
5轮状病毒I321，SPAGMK参照
6轮状病毒I321，大批量# 64BP4004
7轮状病毒I321，工作病毒库
具体实施方式
下面包括的实施例，仅仅用来帮助对该发明的说明和权利要求有更完整的理解。该实施例不以任何方式限制发明权利要求的范围。
实施例1
由美国Bethesdad的NIAID、NIH提供给巴拉特生物技术国际有限公司作为疫苗起始原材料菌株的原始轮状病毒疫苗菌株116E(G9P[11])和I321(G10P[11])在AGMK、MA104和SPAGMK细胞底物上生长。为了进行该轮状病毒疫苗的商业化生产，通过将该轮状病毒连续传代，使这些轮状病毒菌株适应于Vero细胞底物以及人二倍体细胞、MRC-5细胞底物。病毒在细胞底物中的每次传代，针对轮状病毒的活化以及维持培养基在24小时到10天的期间收获高效价病毒，对浓度为100μg/ml-1000μg/ml的氯化钙和/或浓度为0.1μg/ml-30μg/ml的胰蛋白酶进行评价。通过Rotaclone酶联免疫吸附测定试剂盒来测定细胞培养上层清液中该病毒的产量，该试剂盒用于检测预涂于ELISA(酶联免疫吸附测定)孔的特异性抗轮状病毒抗体上的轮状病毒抗原。
轮状病毒库的传染性效价是依据溶血灶形成单位(FFU)/ml通过免疫过氧化物酶测定滴定测量的。简而言之，轮状病毒传染性效价的免疫过氧化物酶测定，是通过在24孔组织培养平板中生长的MA104细胞汇合层来评价的。该细胞然后清洗两次，并且用适当稀释(Log稀释)的活化轮状病毒感染，接着培养12小时。在培养后，该细胞用3.5％福尔马林固定，并且用轮状病毒抗血清检测。对此HRPO共轭第二抗体使用AEC色原标记和染色。
在1-10天内，不同的胰蛋白酶浓度下，病毒最大的收获量可以达到106-188FFU/ml(图12)。
实施例2
轮状病毒菌株116E和I321的特征可以用很多方法描述，这些方法在本技术领域是已知的。这些方法包括，但是不局限于，逆转录PCR、RNA杂交、序列分析和属分组，即RNA电泳型分析。相比于其他的轮状病毒菌株，轮状病毒的菌株116E和I321有清楚的RNA/RNA杂交电泳图谱。它们具有双链的RNA(dsRNA)基因组，包括11个分子量大约为2.0×106-0.2×106千道尔顿的片段，其中VP4蛋白质是88,000道尔顿，VP6是44,000道尔顿以及VP7是38000道尔顿。该11个基因组片段迁移的细微差异产生了一种特有的电泳带图谱。
轮状病毒菌株116E和I321电泳带状图谱可通过用酚-氯仿法分离染色体dsRNA，随后用CC41阴离子交换基质纯化来进行核对。将纯化的dsRNA在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后用银染法将核酸染色。该11个带状图谱的片段可以与轮状病毒116E和I321参考标准(图13和14)对比。
实施例3
轮状病毒菌株116E和I321可以使用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。通常，RT-PCR包括使来源于包含病毒的样品的RNA与引物接触，该RNA有选择地与VP4基因(类型P11)和/或VP7基因(类型G9/G10)序列杂交，合成反转录酶聚合酶链式反应产物的第一条链。在VP4基因和/或VP7基因内部或位于一相邻的基因的第二组引物，用作合成第二条链的引物。引物可以替换，只要有足够的互补碱基存在用于选择性杂交。
实施例4
下列非限制性实施例，是为了更好的阐述准备用作活的、天然减毒的口服轮状病毒疫苗(116E和/或I321)的液体制剂的稳定性。
稳定剂是加入疫苗中的普通的药用赋形剂和/或特定的化学化合物，它们相互作用并且使生物大分子稳定，它在低温存储下使用。
在不同的温度2-8℃、25℃和37℃下，测定轮状病毒在多种稳定剂联合物中的稳定性。
收获感染轮状病毒的Vero细胞，在稳定剂中净化和纯化，并且配制成液体制剂。各份制剂使用同一批从被感染的Vero细胞收获的轮状病毒。该轮状病毒疫苗的液体制剂随后在2-8℃、25℃、37℃培养，用于加速的稳定性研究。对于实时的稳定性研究，该轮状病毒疫苗的液体制剂在2-8℃培养12个月。在上述的培养之后，用免疫过氧化物酶试验测定病毒效价。
此外，制造了一些样品来获得本发明的组合物：
样品1用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-50％，乳糖-0.5％，麦芽糖-0.5％，人血清白蛋白-0.4％以及乳白蛋白水解物0.05％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐缓冲液，具有10^6.02FFU/0.5ml的起始效价，并且在2-8℃下，50周后效价没有降低。(图1和4)
在25℃样品1稳定至14周，其后，24周后发现log效价降低0.5。(图2和4)
在37℃，样品1在3周后log效价降低0.7，6周后进一步降低1.41，8周后又降低了1.28，10周后再降低了0.11。
样品2用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中制备：包含蔗糖-50％，乳糖-0.5％，麦芽糖-0.5％，人血清白蛋白-0.4％以及乳白蛋白水解物0.05％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐缓冲液，起始效价为10^6..41FFU/0.5ml，在2-8℃下，50周后显示log效价降低0.06。(图1和5)
在25℃样品2在24周后显示log效价降低0.91。(图2和5)
在37℃样品2在3周后显示log效价降低0.94，6周后log效价进一步降低1.78，8周后log效价再降低了3.18，第8-第10周效价没有降低，接着10周后log效价降低了3.15。(图3和5)
样品3用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-50％，乳糖-0.5％，麦芽糖-0.5％，海藻糖0.95％，人血清白蛋白-0.4％以及乳白蛋白水解物0.05％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐缓冲液，拥有10^6..22FFU/0.5ml起始效价，在2-8℃下，50周后显示效价没有降低。(图1和6)
在25℃下，样品3在12周后显示效价没有降低，24周后log效价降低0.88。(图2和6)
在37℃下，样品3在3周后显示log效价降低0.87，而且6周后log效价进一步降低0.52，10周后log效价再降低了1.27，接着12周后log效价降低了1.0，此外14周后log效价又降低了0.3。(图3和6)
样品4用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-50％，麦芽糖-0.5％，乳糖-0.5％，人血清白蛋白0.4％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐的缓冲液，拥有10^6..19FFU/0.5ml的起始效价，并且在2-8℃50周后显示效价没有降低。(图1和7)
在25℃下，样品4在6周后显示log效价降低0.87，而且10周后log效价进一步降低0.42，接着16周后log效价降低了0.05，此外24周后log效价降低了1.73。(图2和7)
在37℃下，样品4在3周后显示log效价降低1.96，并且6周后log效价进一步降低1.43。(图3和7)
样品5用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-40％，麦芽糖-5％，乳糖-0.5％，乳白蛋白水解物-1.0％，pH为7.4的310mM磷酸盐以及100mM柠檬酸盐的缓冲液，拥有10^6..35FFU/0.5ml起始效价，并且在2-8℃16周后显示效价没有降低，50周后log效价降低0.15。(图1和8)
在25℃下，样品5在6周后显示log效价从起始效价降低了0.87。而且在10周后观察到log效价降低了0.62，16周后观察到log效价再降低了0.78，24周后log效价又降低了2.06。(图2和8)
在37℃下，样品5在3周后显示log效价从起始log效价降低了1.04，并且6周后log效价降低了1.58。(图3和8)
样品6用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-50％，麦芽糖-0.5％，海藻糖-0.5％，人血清白蛋白0.4％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐的缓冲液，拥有10^6.19FFU/0.5ml的起始效价，并且在2-8℃50周后显示效价没有降低。(图1和9)
在25℃下，样品6在6周后显示log效价从起始log效价降低了0.32。8周后观察log效价进一步降低了0.46，16周后观察到log效价再降低了0.82，此外，24周后又观察到log效价降低了1.36。(图2和9)
在37℃下，样品6在3周后显示log效价从起始log效价降低了2.17，6周后log效价进一步降低了1.18。(图3和9)
样品7用Eagles极限必需培养基在下述缓冲液中配制：包含蔗糖-50％，麦芽糖-0.5％，海藻糖-0.5％，乳白蛋白水解物-0.05％，人血清白蛋白-0.4％，pH为7.4的310mM磷酸盐和100mM柠檬酸盐的缓冲液，拥有10^6.34FFU/0.5ml的起始效价，在2-8℃50周后显示log效价降低0.24。(图1和10)
在25℃下，样品7在6周后显示log效价从起始log效价降低了0.67。24周后观察log效价进一步降低了3.43。(图2和10)
在37℃下，样品7在8周后显示log效价从起始log效价降低了3.24。(图3和9)
冻干的样品1-4显示出在2-8℃、25℃and 37℃下，50周后效价不降低的稳定性(图11)。使用的稳定剂是0.1％-1.0％HAS，1％SPG(＝蔗糖，磷酸盐，谷氨酸)，1.2％L-精氨酸，1％D-山梨(糖)醇，1％明胶以及2％海藻糖的联合物。(图11)
从图1-6可以看出，本发明的这些样品，即样品1-3，在高于25℃温度下显示更长的寿命和更好的稳定性，尤其对于比较长的时段。
因此，根据本发明，特别优选的组合物包括作为第一蛋白质的人血清白蛋白，作为第二蛋白质的乳白蛋白水解物，以及作为三种不同二糖的联合物的蔗糖、麦芽糖、海藻糖，或蔗糖、麦芽糖、乳糖。
实施例5
在服用口服、活的、自然减毒的轮状病毒疫苗制剂之前，必须口服缓冲剂或酸中和试剂，用于中和胃的酸性。该缓冲剂不局限于柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、琥珀酸、乳酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸等。酸中和缓冲液组成(克/升)：柠檬酸钠9.6、碳酸氢钠25.6，pH6.5-8.8。
酸中和缓冲液的酸中和容量(ANC)可通过USP测试来测定。
柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液的酸中和容量能达到0.35-0.50mEq/ml。
可以在模拟胃液(34.8mEq HCl作为模拟胃液)存在和缺少的条件下，研究柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液(CB)对单价轮状病毒疫苗传染性的影响。
轮状病毒疫苗制剂与柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液一起，在作为模拟胃液的34.8mEq HCl存在的条件下，在两小时内log轮状病毒效价降低0.1-0.2。
实施例6
为制备冻干的轮状病毒疫苗制剂，按照实施例4所举的例子，使该轮状病毒在本发明稳定化的组合物中稳定。为了冻干，该轮状病毒主体大部分被透析到稳定剂中，以将组织培养基全部去除，或者该轮状病毒主体在稳定剂中被稀释8-15倍。研究结果已显示出该制剂具有优良的稳定性。
在上述说明书中，已经描述了本发明具体的实施方案。然而，本领域的普通技术人员会意识到，在不偏离下面权利要求所述的本发明范围的前提下，可以作各种修改和变更。因此，该说明书和附图可认为是一种说明而不是限制的意思，而且所有这样的修改都包括在本发明的范围内。利益、好处、问题的解决，以及任何可以使利益、好处、问题的解决发生或者趋于明确的因素，都不能被解释为任何或所有权利要求重要的、必须的、或基本的特征和元素。结果，发明仅由附加的权利要求来确定，其中包括本申请审理过程中的一些修改和这些权利要求的所有等效物。
在说明书、权利要求和/或在附图中公开的本发明的特征，无论分别地，和按其任何组合，对于以其不同的形式来实现本发明，都可能是重要的。
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Claims (18)
1.一种组合物，包括
一种病毒抗原，其中，所述病毒抗原是活的减毒的人-牛重配轮状病毒；
以0.1％(w/v)～0.45％(w/v)的范围存在的第一蛋白质，所述第一蛋白质为人血清白蛋白；以0.01％(w/v)～10％(w/v)的范围存在的第二蛋白质，所述第二蛋白质为至少部分水解的乳白蛋白；三种不同二糖的联合物，其中，联合物中主要的一种糖为蔗糖、两种次要的糖是选自乳糖、麦芽糖和海藻糖的任意两种，
其中蔗糖的含量为40％(w/v)～55％(w/v)，乳糖0.1％～10.0％(w/v)；麦芽糖0.1％～10％(w/v)；海藻糖0.1％～10.0％(w/v)；以及
缓冲液，所述缓冲液将所述组合物的pH调节至6.8和7.8之间的值，其中所述缓冲液为磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或柠檬酸盐-碳酸盐缓冲液；以及
作为稀释剂的Eagle极限必需培养基。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中蔗糖的含量为50％(w/v)。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中麦芽糖的含量为0.5％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中三种不同的二糖的联合物选自：
a)蔗糖，乳糖和麦芽糖，
b)蔗糖，麦芽糖和海藻糖，
c)蔗糖，乳糖和海藻糖。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中组合物中特定的二糖的浓度为：蔗糖50％(w/v)；乳糖0.5％(w/v)；麦芽糖0.5％(w/v)；海藻糖0.5％(w/v)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的缓冲液为磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH为6.8～7.8，其中，磷酸盐浓度是310mM，以及柠檬酸盐的浓度是100mM。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述活的减毒人-牛重配轮状病毒选自轮状病毒毒株116E或I321。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所用的轮状病毒的效价为104～107FFU/0.5ml。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述轮状病毒株116E或I321通过合适的细胞系的培养连续地传2～20代，使其适应于所述合适的细胞系，以及每次传代发生在24小时～10天的期间，每次传代发生在含有氯化钙和胰蛋白酶的培养基中，其中所述的氯化钙的含量是0.1mg/ml～1mg/ml，以及所述的胰蛋白酶含量是0.1μg/ml～30μg/ml。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的合适的细胞系为Vero细胞；连续地传代为2～5代。
11.根据权利要求1所述的组合物，该组合物是一种液体疫苗。
12.根据权利要求11所述的组合物，所述的组合物在下述条件下是稳定的：在37℃下3周，在25℃下6个月，以及在2℃～8℃下一年。
13.根据权利要求1所述的组合物，该组合物是一种冻干的疫苗。
14.根据权利要求13所述的组合物，该组合物使用的稳定剂是0.1％-1.0％HSA，1％SPG，1.2％L-精氨酸，1％D-山梨(糖)醇，1％明胶以及2％海藻糖的联合物。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的组合物，该组合物在2℃～8℃、25℃和37℃下均能稳定超过50周。
16.根据权利要求1所述的组合物，该组合物可用于制备治疗与轮状病毒相关的疾病的药物。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述的与病毒相关的疾病为与人体轮状病毒相关的疾病。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述的与人体轮状病毒相关的疾病为腹泻及胃肠炎。
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