CN117414419A - 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗制备方法及其应用 - Google Patents

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗制备方法及其应用，属于兽用生物制品领域。本发明要解决的技术问题是：如何有效的预防猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒所引起的猪腹泻。为解决该技术问题，本发明提供一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗及其制备方法，所述三联灭活疫苗包含灭活的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒。本发明所提供的疫苗能够有效预防由猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒引起的猪腹泻。

Description

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗 制备方法及其应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，涉及兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗制备方法及其应用。
背景技术
猪腹泻是一种常见的影响猪生长最明显的多因素疾病，其发病率和死亡率高而造成巨大经济损失。引起仔猪腹泻的重要病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒等。
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)引起猪的一种高度接触性消化道传染病。以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为主要特征。其他年龄的猪也易感，但5周龄以上的猪很少死亡。多发生于寒冷季节，以每年12月至次年4月为发病高峰，3～4天内即暴发流行，迅速传播。
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)(感染引起的各个日龄猪的一种急性肠道传染病。在我国多发生在每年12月份至次年1～2月，夏季也有发病的报道。各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、肥育猪的发病率很高，尤以哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15～90％。主要的临床症状为粪便稀薄、水样腹泻，偶见呕吐。症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3～4天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50％以上。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常。
猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是近年来新发现的一种猪冠状病毒，可引起猪，特别是哺乳仔猪严重腹泻、脱水及呕吐的高度接触性传染病。中国猪δ冠状病毒毒株与全球流行毒株具有较高的核苷酸同源性(>98.9％)。现在已扩散到世界各地，造成养猪业的重大经济损失，引起了全球关注。但是，目前国内外均没有上市销售的猪δ冠状病毒疫苗。
针对猪病毒性腹泻的防控主要是商品化的疫苗，目前国内外有多款针对猪病毒性腹泻的疫苗。疫苗主要分为灭活疫苗和活疫苗，且多以猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联疫苗为主，也有猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒三联活疫苗和猪流行性腹泻灭活疫苗。但目前市场上尚未有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗或活疫苗。因此，需要研发一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联疫苗。
发明内容
本申请要解决的技术问题是：如何有效的预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒所引起的猪腹泻。
为解决该技术问题，本申请提供了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗及其制备方法。
一方面，本发明提供了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗的活性成分为灭活的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株。
优选地，本发明所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪传染性胃肠炎病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202370；所述猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201624；所述猪δ冠状病毒LYG/14株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪δ冠状病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202369。
优选地，本发明所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株均由ST全悬浮细胞生产；灭活前猪传染性胃肠炎病毒SHXB株的病毒含量≥108.5TCID50/ml，灭活前猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株的病毒含量≥107.5TCID50/ml，灭活前猪δ冠状病毒LYG/14株的病毒含量≥107.5TCID50/ml。
优选地，本发明所述的ST全悬浮细胞是在中国典型培养物保藏中心保藏的ST全悬浮细胞，其保藏编号为：CCTCC NO:C2023179。
优选地，本发明所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株的配比为1:5:3。
优选地，本发明所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗由所述活性成分和佐剂组成。
优选地，本发明所述佐剂为水性佐剂，所述水性佐剂为GEL 01佐剂。
再一方面，本发明还提供了一种制备所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
S1)使用ST全悬浮细胞分别培养猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株，获得三种病毒的培养液；
S2)将S1)制备的三种病毒的培养液分别灭活，获得灭活的三种病毒的培养液；使用除菌PBS溶液将灭活好的猪传染性胃肠炎病毒液、猪流行性腹泻病毒液和猪δ冠状病毒液分别稀释至108.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml；
S3)将S2)稀释好的灭活的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株培养液、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株培养液和猪δ冠状病毒LYG/14株培养液按质量比为1:5:3的比例混合，获得抗原混合液；
S4)将S3)制备的抗原混合液与佐剂按质量比为9:1的比例混合，获得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗。
优选地，本发明所述的步骤S1)中使用ST全悬浮细胞培养猪传染性胃肠炎病毒SHXB株包括以下步骤：
1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；
2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3.0×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，每日观察记录细胞密度，培养24～36小时进行收毒；
3)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。
再一方面，本发明还提供了一种所述的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株在制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联疫苗中的应用。
本申请开发的疫苗具有以下特点：PEDV、PDCoV、TGEV均为中国主要流行毒株之一，对野毒具有良好的保护力；三种病毒均使用ST全悬浮细胞实现无血清全悬浮生产、抗原含量高、批次间稳定；使用水性佐剂，安全性好；诱导中和抗体能力强，免疫效果好。同时，本申请为猪相关病毒性腹泻的防治提供了实验依据和解决方案。本申请还掌握PEDV、PDCoV、TGEV全悬浮无血清发酵罐培养工艺、疫苗配制和免疫效果评价等相关技术，为进一步探究该病的病原学及防控奠定了基础。
需要说明的是，虽然本发明在实施例中使用猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株的是猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，但是，在猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株的基础上，本领域的技术人员可以通过连续传代导致猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株致弱，从而实现猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联活疫苗的研制。因此，本发明的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株在既可以用于制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，也可以用于制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联活疫苗。
同样的，本发明的ST全悬浮细胞既可以用于猪流行性腹泻病毒ZJ/15株的生产，也可以用于其他猪流行性腹泻病毒的生产，如本申请人分离的猪流行性腹泻病毒JSCZ1601株(未保藏，其具体基因组序列参见GenBank:KY070587)也可以用本发明的ST全悬浮细胞进行培养生产。本发明的ST全悬浮细胞既可以用于猪δ冠状病毒LYG/14株的生产，也可以用于其他猪δ冠状病毒的生产，如本申请人分离的猪δ冠状病毒CZ2020株(未保藏，其具体基因组序列参见GenBank:OK546242.1)也可以用本发明的ST全悬浮细胞进行培养生产。同理，本发明的ST全悬浮细胞即可用于猪传染性胃肠炎病毒SHXB株的生产，也可以用于其他猪传染性胃肠炎病毒的生产。
需要说明的是，本发明申请单位之一“新昌县天姥实验室”为浙江大学与浙江省绍兴市新昌县共建的研究中心，其中本发明所用的“猪流行性腹泻病毒ZJ/15株”为本发明人之一的浙江大学李肖梁老师分离鉴定并保藏(保藏信息见本发明的保藏说明)，并于2016申请专利(专利申请号为201610547327.X)。本申请为三家申请单位合作研发的技术成果之一。因此，在本申请中，“猪流行性腹泻病毒ZJ/15株”是经过协议约定合法合规使用，没有知识产权纠纷和来源问题。
保藏说明
附图说明
图1猪传染性胃肠炎病毒SHXB株感染ST细胞图，其中A是空白对照，B和C是感染后细胞病变。
图2猪传染性胃肠炎病毒SHXB株PCR检测结果。
图3猪δ冠状病毒LYG/14株感染LLC-PK1细胞图，其中A是空白对照，B和C是感染后细胞病变。
图4猪δ冠状病毒LYG/14株PCR检测结果。
图5免疫攻毒后部分仔猪临床观察与解剖结果。其中A和C为免疫组，B和D为对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中无血清培养基购自甘肃健顺生物科技有限公司。
实施例1、三种病毒的分离与鉴定
1.1猪传染性胃肠炎病毒SHXB株
本研究组于2013年3月无菌采集来自上海某猪场发病猪的小肠组织，经组织研磨过滤后，接种ST细胞，获得疑似TGEV病毒的分离物(图1)，通过挑斑纯化试验，获得纯化的TGEV病毒。经过生物学特性鉴定、基因扩增及序列测定(基因片段大小为28542bp，具体序列参见GenBank:OK546242.1)，实时荧光定量PCR检测PRRSV、PEDV、BVDV、PCV2、CSFV、PRV等均为阴性、TGEV为阳性(图2)，经测序证实为猪传染性胃肠炎病毒，命名为Transmissiblegastroenteritis virus/SHXB(猪传染性胃肠炎病毒SHXB株)，简称猪传染性胃肠炎病毒SHXB株(缩写为TGEV(SHXB株))。
其中PCR检测过程和引物如下所示：用商品化的试剂盒分别抽提总RNA和DNA，其中RNA按照商品化逆转录试剂盒进行逆转率获得cDNA；再分别按表1所述引物和方法分别进行TGEV、PEDV、PRRSV、PDCoV、BVDV、CSFV、PRV等检测。
表1检测所用方法和引物汇总表
其中荧光PCR的过程如下：用商品化试剂进行PCR反应。反应体系为：2×AceQ qPCRProbe Master Mix 10μl，ddH2O 6.6μl，Primer1(10μM)、Primer2(10μM)引物、50×ROXReference Dye 1各0.4μl，TaqMan Probe(10μM)0.2μl。循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸30s，并采集荧光信号，进行40个循环。
其中常规PCR的过程如下：
PCR反应体系：2×Taq Master Mix(Dye Plus)10μl，ddH2O 7.2μl，上游引物(10μM)、下游引物(10μM)引物各0.4μl，cDNA2μl。
PCR反应程序：
PRRSV：95℃5分钟后进入循环，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟；
PRV：94℃5分钟后进入循环，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟；
CSFV：95℃5分钟后进入循环，95℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟；
BVDV：95℃5分钟后进入循环，95℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟。
1.2猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株
猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株(缩写为PEDV ZJ/15株)由本研究组(浙江大学团队)分离鉴定，并于2016年申请专利并获得专利权，具体请见CN 106011084 B。
1.3猪δ冠状病毒LYG/14株
本研究组于2014年1月无菌采集来自江苏连云港某猪场发病猪的小肠组织，经组织研磨过滤后，接种LLC-PK1细胞，获得疑似PDCoV病毒分离物(图3)，通过对该PDCoV病毒分离物重复挑斑纯化试验，获得纯化的PDCoV病毒。经过生物学特性鉴定、基因扩增及序列测定(基因片段大小为25370bp，具体序列参见GenBank:KU665558.1)，RT-PCR或PCR检测PRRSV、PEDV、BVDV、PCV2、CSFV、PRV等均为阴性、PDCoV为阳性(图4，具体检测方法见1.1所示)，经测序证实为猪δ冠状病毒，命名为Porcine Deltacoronavirus/CHN-LYG-2014(猪δ冠状病毒CHN-LYG-2014株)，简称猪δ冠状病毒LYG/14株(缩写为PDCoV(LYG/14株))。
实施例2、三种病毒全悬浮培养条件的确定
2.1猪传染性胃肠炎病毒SHXB株培养工艺研究
2.1.1ST全悬浮细胞复苏
从液氮罐中取出ST全悬浮细胞冻存管，立即放入37℃水浴，轻晃冻存管使液体尽快融化。将细胞悬浮液1000r/min离心5分钟。弃去上清液，每支冻存管用20ml培养基悬浮细胞于125ml三角瓶，置37℃、130r/min、含5％CO2摇床培养；每日进行细胞计数，当细胞密度达4～6×106个/ml时，按接种密度为1×106个/ml进行扩大培养。
2.1.2ST全悬浮细胞摇瓶培养工艺条件的筛选
当细胞长至4～6×106个/ml时，用10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml胰酶的无血清培养基将细胞密度调整为2.0×106个/ml、3.0×106个/ml、4.0×106个/ml三种细胞密度。分别按MOI为0.1、0.2、0.3接毒，37℃、130r/min含5％CO2摇床培养。每日进行细胞计数和活力测定，分别于18、24、30、36和42小时取样，进行病毒含量测定和无菌检验，筛选病毒培养最佳工艺。
病毒含量测定：将病毒用含5.0μg/ml胰酶的DMEM培养液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度，分别接种长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。置37℃、含5％ CO2培养箱中培养，同时设置8孔正常细胞对照。每日观察，记录细胞病变(CPE)孔数，观察至96小时。按Reed-Müench法计算TCID50。
结果显示：不同接毒量的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株接种不同生长密度ST全悬浮细胞培养。当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，于24、36小时时间点取样的病毒含量均高于其它时间点，病毒含量为≥108.5TCID50/ml，结果如表2所示。
为节约使用细胞，确定最优培养增殖条件：当细胞密度达6×106个/ml以上时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，继续培养24～36小时收获细胞培养物，病毒滴度为108.5TCID50/ml以上。
表2猪传染性胃肠炎病毒SHXB株不同培养条件检测结果
2.1.3ST全悬浮细胞15L反应器培养工艺条件的筛选
按照摸索的摇瓶工艺，进行15L生物反应器的放大，当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3.0×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒。分别按温度37℃、pH7.0、7.2、7.4；DO 30％、40％、50％转速60r/min、80r/min、100r/min等参数进行培养。每日进行细胞计数和活力测定，培养24～36小时收毒，进行病毒含量测定和无菌检验，筛选病毒培养最佳工艺条件。
不同培养参数的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株接种15L生物反应器进行培养。当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3.0×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，当参数设置为：pH 7.2、DO 40～50％、温度37℃、转速80～100r/min培养24～36小时收毒，病毒含量均高于其它参数，病毒含量为≥108.5TCID50/ml，结果如表3所示。
根据以上结果，确定最优培养增殖条件：当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3.0×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，每日观察记录细胞密度，培养24～36小时进行收毒。
同时，将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。
表3病毒最佳培养条件筛选结果
2.1.4ST全悬浮细胞200L反应器培养工艺条件的验证
按照摸索的15L生物反应器上的接收毒工艺，在200L反应器中按照相同培养条件繁殖3批病毒液，每批约100L，三批病毒过柱澄清后病毒含量分别为108.67TCID50/ml、108.71TCID50/ml、108.67TCID50/ml。说明按照此摸索的工艺能完成工艺放大培养，且工艺稳定。
病毒过柱澄清：为方便工业化生产，我们选择过滤的方式去除细胞碎片(也有使用连续离心的方式去除，但连续离心设备昂贵，操作不方便，时间长，工业化生产成本高)，我们选择两级过滤，第一级过滤为过20μm滤膜，以去除大的细胞和碎片；第二级过滤为过1.5μm滤膜，以去除小的细胞碎片。过滤过程中均需要保证在无菌的条件的进行，因病毒液过0.22μm滤膜损失极大，也很容易堵塞，导致无法操作或成本奇高。整套过滤设备均为商品化采购，如thermofisher或默克或国产设备等均可满足需求。过滤后的滤液即为病毒液。
2.2猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株培养工艺研究
参照实施例2中“2.1猪传染性胃肠炎病毒SHXB株培养工艺研究”的方法，对猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株的ST全悬浮细胞培养工艺进行研究和放大。最终确定猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株的培养工艺为：当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×106个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，培养48～54小时收获细胞培养物。此时的培养的病毒含量均≥107.50TCID50/ml。
按照摸索的15L生物反应器上的接收毒工艺，在200L反应器中按照相同培养条件繁殖3批病毒液，每批约100L，三批病毒过柱澄清后病毒含量分别为107.67TCID50/ml、107.80TCID50/ml、107.80TCID50/ml。说明按照此摸索的工艺能完成工艺放大培养，且工艺稳定。
2.3猪δ冠状病毒LYG/14株培养工艺研究
参照实施例2中“2.1猪传染性胃肠炎病毒SHXB株培养工艺研究”的方法，对猪δ冠状病毒LYG/14株的ST全悬浮细胞培养工艺进行研究和放大。最终确定猪δ冠状病毒LYG/14株的培养工艺为：当细胞密度达6.0×106个/ml以上时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至4.0×106个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，培养24～36小时收获细胞培养物。此时的培养的病毒含量均≥107.50TCID50/ml。
按照摸索的15L生物反应器上的接收毒工艺，在200L反应器中按照相同培养条件繁殖3批病毒液，每批约100L，三批病毒过柱澄清后病毒含量分别为107.67TCID50/ml、107.80TCID50/ml、107.59TCID50/ml。说明按照此摸索的工艺能完成工艺放大培养，且工艺稳定。
实施例3、疫苗制备
3.1病毒液灭活和检验
灭活：向检验合格的猪传染性胃肠炎病毒液、猪流行性腹泻病毒液及猪δ冠状病毒液(实施例2制备)中分别加入终浓度0.5‰β-丙内酯溶液，搅拌30分钟，将含0.5‰β-丙内酯溶液的病毒液输入至另一灭活容器中，置2～8℃下灭活24小时。灭活后的病毒液置37℃搅拌2小时，随后置2～8℃保存。
灭活检验：将灭活后的猪传染性胃肠炎病毒液、猪流行性腹泻病毒液及猪δ冠状病毒液分别接种已长成良好单层的ST细胞、Vero细胞、LLC-PK1细胞，每组接种3瓶，置37℃作用60分钟后，弃液，加入相应的DMEM维持液，同时设正常细胞对照和未灭活病毒对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变。灭活病毒组和正常细胞对照组均不出现细胞病变，未灭活病毒对照组全部出现细胞病变，则判为病毒灭活完全。
经检验，三种病毒液均灭活彻底。
3.2配苗
配苗前使用除菌PBS溶液将灭活好的三种病毒液(猪传染性胃肠炎病毒液、猪流行性腹泻病毒液和猪δ冠状病毒液)分别稀释至108.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml；将稀释好的三种病毒液(猪传染性胃肠炎病毒液﹕猪流行性腹泻病毒液﹕猪δ冠状病毒液)按1:5:3(质量比)混合均匀，，然后与除菌水溶性佐剂(GEL 01佐剂)按照9:1的比例(质量比)混合于乳化缸内，低速搅拌30分钟。定量分装，分装时随时搅拌，使其混合均匀，加盖密封。置2～8℃保存备用。
按此配制方法，连续配制3批疫苗，每批疫苗5L，定量分装为50ml/瓶。同时对三批疫苗进性状、无菌进行检测，结果显示，三批疫苗性状均为均匀水性混悬液、均无菌。说明三批疫苗物理性状均检验合格。
实施例4、安全性试验
每批疫苗用3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)5头，接种前观察2日，每日上午定时测定体温，取平均值作基础体温。各颈部肌肉接种2.0ml疫苗，接种后每日上午定时测定体温。观察14日，每日观察精神、食欲及接种部位反应等。
结果显示(表4)，三批疫苗免疫后，试验猪均未见精神、食欲和体温明显异常，接种部位无明显肿胀、溃烂。因此，三批疫苗安全试验全部合格。
表4安全性检验结果
实施例5、效力试验
中和抗体测定：用3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)5头，各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，接种21日后，连同对照猪5头一并采血，分离血清，测定猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒中和抗体。结果显示，免疫组三个病毒的中和抗体均≥1:32(1:32～1:128范围内)，对照组均≤1:4。说明，该疫苗的具有良好的免疫效果，免疫后均能产生较高的中和抗体。
免疫攻毒：用三批疫苗分别免疫3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)。每批疫苗用3～5日龄健康易感仔猪30头，分为6组，每组5头，第一组、第二组、第三组各经颈部肌肉接种疫苗1.0ml，第四组、第五组、第六组作为对照。免疫后21日，所有试验猪分别进行攻毒；其中第一组和第四组每头口服TGEV(SHXB株)组织毒10.0ml(病毒含量为10ID50/10.0ml)，第二组和第五组每头口服PEDV(ZJ/15株)细胞毒4.0ml(病毒含量为105.0TCID50/ml)，第三组和第六组每头口服PDCoV(LYG/14株)组织毒10.0ml(病毒含量为10ID50/10.0ml)，连续观察10日。结果显示(图5所示，免疫组均正常，攻毒组出现拉稀；对照组仔猪剖检可见小肠肠管明显变薄、充血，肠系膜出血，肠系膜淋巴结肿大充血等特征。)，三种病毒分别攻毒后，三种病毒的免疫组均5/5保护，相应病毒的对照组均5/5发病。
实施例6、与现有市场疫苗比较试验
6.1物理性状比较
用一批疫苗和国内某厂家同类疫苗(因市场上暂无三联灭活疫苗，故本研究选择猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗作为对照疫苗进行研究)分别进行疫苗的性状、无菌、黏度和稳定性检验，各项检测均合格(表5所示)。
本疫苗因为是水性佐剂，故不需要做黏度和稳定性检验，相对对照疫苗，在物理性状方面的检测，本疫苗具有较好的优势。
表5两批疫苗各项检验结果
疫苗 外观 剂型 稳定性 黏度 无菌检验
201203 均匀水性混悬液 水剂 未检测 未检测 无菌生长
同类疫苗 淡粉红色均匀乳剂 水包油包水 0.0ml 29.8cP 无菌生长
6.2安全性比较
本疫苗以2.0ml/头颈部肌肉注射3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)，对照疫苗以2.0ml/头颈部肌肉注射3～5日龄健康易感仔猪，观察14日，两种疫苗安全试验合格(表6所示)。
虽然两个疫苗检验均合格，但对照疫苗有一头猪在免疫后有轻微反应，本研究疫苗免疫后均无反应。另外，本研究疫苗为水佐剂疫苗，对照疫苗为油佐剂疫苗，在免疫时，本研究疫苗具有较好的通针性，比对照疫苗要好注射。因此，本研究疫苗相对市场疫苗在安全性方面相对要好，且更易抽取和注射。
表6两批疫苗安全试验结果
6.3效力试验
本研究疫苗和同类疫苗用3～5日龄健康易感仔猪30头，随机分成3组，每组10头，其中本研究疫苗免疫组各仔猪颈部肌肉注射1.0ml，对照疫苗免疫组各仔猪颈部肌肉注射1.0ml；免疫后21日，采集血清检测TGEV和PEDV中和抗体效价。免疫后21日，每组随机取5头仔猪，每头口服TGEV(SHXB株)组织毒10.0ml(病毒含量为10ID50/10.0ml)；免疫后21日，每组随机取5头仔猪，每头口服PEDV(ZJ/15株)细胞毒4.0ml(病毒含量为105.0TCID50/ml)；攻毒后均观察10日。
结果显示，本研究疫苗免疫组TGEV和PEDV中和抗体效价较同类疫苗要高，两组疫苗中和抗体均4/5或以上猪只≥1:32；TGEV和PEDV分别攻毒后，本研究疫苗均4/5或以上保护，同类制品均4/5保护，对照组均5/5发病。详见表7。说明本研究疫苗在效力方面与同类疫苗相当或者更好。
表7免疫攻毒及效价检测结果汇总表
综合以上结果，本研究疫苗相对市场疫苗，在物理性状、安全性方面和效力方面均要好。因此，本研究疫苗具有良好的安全性和有效性，适合市场大范围应用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗的活性成分为灭活的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪传染性胃肠炎病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202370；所述猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：
V201624；所述猪δ冠状病毒LYG/14株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪δ冠状病毒，其保藏编号为CCTCC NO:V202369。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株均由ST全悬浮细胞生产；灭活前猪传染性胃肠炎病毒SHXB株的病毒含量≥108.5TCID50/ml，灭活前猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株的病毒含量≥107.5TCID50/ml，灭活前猪δ冠状病毒LYG/14株的病毒含量≥107.5TCID50/ml。
4.根据权利要求3所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述的ST全悬浮细胞是在中国典型培养物保藏中心保藏的ST全悬浮细胞，其保藏编号为：CCTCC NO:C2023179。
5.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株的配比为1:5:3。
6.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗由所述活性成分和佐剂组成。
7.根据权利要求6所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为水性佐剂，所述水性佐剂为GEL 01佐剂。
8.一种制备如权利要求1～7任一权利要求所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1)使用ST全悬浮细胞分别培养猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株，获得三种病毒的培养液；
S2)将S1)制备的三种病毒的培养液分别灭活，获得灭活的三种病毒的培养液；使用除菌PBS溶液将灭活好的猪传染性胃肠炎病毒液、猪流行性腹泻病毒液和猪δ冠状病毒液分别稀释至108.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml、107.0TCID50/ml；
S3)将S2)稀释好的灭活的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株培养液、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株培养液和猪δ冠状病毒LYG/14株培养液按质量比为1:5:3的比例混合，获得抗原混合液；
S4)将S3)制备的抗原混合液与佐剂按质量比为9:1的比例混合，获得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1)中使用ST全悬浮细胞培养猪传染性胃肠炎病毒SHXB株包括以下步骤：
1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；
2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为20～30μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至3.0×106个/ml，按照MOI为0.1～0.2接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，每日观察记录细胞密度，培养24～36小时进行收毒；
3)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。
10.一种如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒SHXB株、猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株和猪δ冠状病毒LYG/14株在制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联疫苗中的应用。
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