CN107899007A

CN107899007A - 猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107899007A
Application number: CN201711080927.0A
Authority: CN
Inventors: 董剑辉; 陈瑞; 张磊
Original assignee: Shaanxi Nuweilihua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shaanxi Nuweilihua Biotechnology Co ltd; Yulin University
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2017-11-06
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-11-06
Also published as: CN107899007B

Abstract

本发明提供了一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法，灭活前，三种病毒的含量均≥10^7.0TCID50/mL，灭活后各个抗原的体积比例为1:1:1。本发明的三联灭活疫苗解决了目前市场上缺少有效的防治猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒病三种疾病的多联疫苗的问题，尤其是解决了缺少近些年新流行的猪δ冠状病毒病的疫苗。该发明的三联灭活疫苗经济实用，简化了免疫程序，能够有效地降低防疫成本，为国内养殖企业同时预防三种疾病的发生提供了一种新的方法。

Description

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物多联灭活疫苗及其制备方法，特别是指一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是以呕吐、腹泻和脱水为特征的猪肠道传染性疾病。主要是由PED病毒感染引起，该病毒主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口途径自然感染。各种年龄猪均易感，尤以哺乳仔猪最为严重，病死率可达100%。是影响全球养猪业的最重要病毒之一。

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis , TGE）也是引起猪腹泻的一种重要接触性病毒性肠道传染病，发病急，传播快，以引起两周龄以内仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率为特征，周龄较大的猪只虽然几乎没有死亡，但是生长缓慢，饲料利用率低，给养猪业造成严重的经济损失。

猪δ冠状病毒( Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)也称猪丁型冠状病毒，是一种新型冠状病毒，临床特征主要引起母猪和仔猪的急性水样腹泻。2012年PDCoV首次在香港猪粪便中检测到，随后该病在全球不同地区陆续被发现。我国猪群PDCoV的感染严重，部分地区猪群中腹泻病料样品中PDCoV阳性率超过25％。目前对于PDCoV，没有有效的治疗措施和疫苗。

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒均属于冠状病毒科病毒，抗原形态相似，这三种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，临床上较难分辨，而三种病毒彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控三种疾病显得尤为重要。目前PEDV、TGEV、PDCoV等的混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，对养猪业造成很大的损失。国内已有传染性胃肠炎和流行性腹泻二联疫苗，但是对于PDCoV，仍没有有效的治疗措施和疫苗，因此尽快研制出一种能够有效防治猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的疫苗已成当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供由本发明人自行分离、保存的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒，利用三种毒株制备猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗，用于防治猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒三种疾病。

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗，抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL、猪传染性胃肠炎病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL和猪δ冠状病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL。

优选地，本发明的三联灭活疫苗是由猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒灭活后制备获得，灭活后各个抗原的体积比例为1:1:1。

优选地，本发明的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒的灭活是分别将病毒液按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟后获得。

优选地，本发明的三联灭活疫苗中含有佐剂，抗原与佐剂的质量比例为1:1。

优选地，本发明的佐剂为Montanide ISA 206佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1) 猪流行性腹泻病毒液制备：将长满致密单层的Vero细胞，按0.2%剂量接种猪流行性腹泻病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

2) 猪传染性胃肠炎病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按1%剂量接种传染性胃肠炎病毒，并加入维持液，在37℃下培养；

3) 猪δ冠状病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按2%剂量接种德尔塔冠状病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

4) 当细胞病变在80％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2 次后，保存于-20℃以下，备用；

5) 对收获的病毒液进行病毒含量和无菌检验，将病毒含量在10^7.0TCID₅₀/mL以上、无菌检验合格的病毒用于灭活；

6) 三种病毒液分别用BEI灭活，灭活检合格后，按照体积比例为1:1:1进行混合。

7) 与Montanide ISA 206佐剂按照质量比例为1:1乳化即可制成双相油乳剂联苗。

优选地，本发明的三联灭活疫苗的制备方法中，所述的维持液为MEM培养基，含有100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。

技术效果

本发明通过提供了一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法，解决了目前市场上缺少有效的防治猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒病三种疾病的多联疫苗的问题，尤其是解决了近些年新流行的猪δ冠状病毒病没有疫苗的情况。该发明的三联灭活疫苗经济实用，免疫方法简单，不仅简化了免疫程序，而且有效地降低了防疫成本，为国内养殖企业同时预防三种疾病的发生提供了一种新的方法。

附图说明

图1 猪流行性腹泻病毒接种到Vero上的病变图片。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。

图2 猪流行性腹泻病毒分离株PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阳性对照；3：阴性对照。

图3 猪传染性胃肠炎病毒接种到ST上的病变图片。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。

图4 猪传染性胃肠炎病毒分离株PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阳性对照；3：阴性对照。

图5 猪δ冠状病毒接种到ST上的病变图片。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。

图6 猪δ冠状病毒分离株PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阳性对照；3：阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 毒株的来源

1、猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株

将某猪场采集、经RT-PCR检测为猪流行性腹泻抗原阳性的病料，按照1:10的比例（重量：体积）加入PBS，反复冻融3 次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤两次，过滤液于-20℃以下保存备用。

将长满致密单层的Vero细胞，按10%剂量接种过滤液，吸附后加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。传至第2 代时出现明显细胞病变（图1），第5代后病变基本稳定。

应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中PEDV的M蛋白基因设计检测引物对：上游引物PEDV-F：5’-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3’；下游引物PEDV-R：5’-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC -3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃ 45s 、60℃ 45s、72℃ 45s 进行35个循环后，72℃ 7min 延伸。PEDV 扩增片段为645bp。结果见图2。

按现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的5代种毒命名为PEDV-KB2013-4株，其微生物保藏号是CGMCC No.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2、猪传染性胃肠炎病毒BD株

将河北某猪场采集、经RT-PCR检测为猪传染性胃肠炎抗原阳性的病料，按照1:10的比例（重量：体积）加入PBS，反复冻融3 次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤两次，过滤液于-20℃以下保存备用。

将长满致密单层的ST细胞，按10%剂量接种过滤液，吸附后加入维持液，在37℃下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。传至第3代时出现明显细胞病变（图3），第6代后病变基本稳定。

应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中TGEV的N蛋白基因设计检测引物对：上游引物TGEV-F：5’-AGACAAACTCGCTATCGCATGG-3’；下游引物TGEV-R：5’-TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s 进行35个循环后，72℃ 7min 延伸。PEDV 扩增片段为528bp。结果见图4。

按现行《中国兽药典》附录对第6代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的6代种毒命名为TGEV-BD株，其微生物保藏号是CGMCC No.13856；保藏时间是2017年06月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

3、猪δ冠状病毒SD株

将山东某猪场采集、经RT-PCR检测为猪δ冠状病毒抗原阳性的病料，按照1:10的比例（重量：体积）加入PBS，反复冻融3 次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤两次，过滤液于-20℃以下保存备用。

将长满致密单层的ST细胞，按10%剂量接种过滤液，吸附后加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。传至第5代时出现明显细胞病变（图5）。

第8代后病变基本稳定。

应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中PDCoV的M蛋白基因设计检测引物对：上游引物PDCoV-F：5’-CGCGTAATCGTGTGATCTATGT-3’；下游引物PDCoV-R：5’-CCGGCCTTTGAAGTGGTTAT-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃ 30s、56℃ 30s、72℃30s进行35个循环后，72℃ 7min 延伸。PEDV 扩增片段为540bp。结果见图6。

按现行《中国兽药典》附录对第8代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的8代种毒命名为PDCoV-SD株，其微生物保藏号是CGMCC No.13853；保藏时间是2017年06月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2 毒株的特性

1、特异性

将猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种毒种，分别用MEM培养基稀释为200 TCID₅₀/0.1ml，与相对应等量的PEDV、TGEV、PDCoV特异性阳性血清混合，置37℃中和1小时，分别接种已长成良好单层的Vero细胞、ST细胞、ST细胞的96孔细胞培养板，接种4孔，200μl//孔，同时设正常细胞对照和未中和的病毒对照，置37℃、含5% CO₂的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变。阳性血清中和组和正常细胞对照组均不出现细胞病变；未中和的病毒对照组全部出现细胞病变。

2、毒力

用17～19日龄健康易感仔猪（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性）共15头，分为3组。第1组各经口服接种猪流行性腹泻病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.0 TCID₅₀/ml），第2组经口服接种猪传染性胃肠炎病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5 TCID₅₀/ml），第3组经口服接种猪δ冠状病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5TCID₅₀/ml）。连续观察10日，各组的试验猪均至少有4头发病。

3、免疫原性

用3～5日龄健康易感仔猪（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性）30头，分为6组，第1~3组为免疫组，第4~6组对照组。第1~3组分别经肌肉注射按照本发明方法单独制备的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗、猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗和猪δ冠状病毒灭活疫苗各1.0ml。免疫后14日，第1、4组各经口服接种猪流行性腹泻病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.0 TCID₅₀/ml），第2、5组经口服接种猪传染性胃肠炎病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5 TCID₅₀/ml），第3、6组经口服接种猪δ冠状病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5 TCID₅₀/ml）。连续观察10日。4~6组对照猪均至少4头发病，1~3组免疫猪均全部健活。

实施例3 猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗的制备及检验

1、材料与方法

1.1 细胞

Vero细胞、ST细胞均购自中国兽医药品监察所。

1.2 制苗用病毒液的制备

猪流行腹泻病毒毒种的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将长满致密单层的Vero细胞，按0.2%剂量接种检验合格的猪流行性腹泻病毒种毒，加入终浓度为10μg/mL的胰酶、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM维持液，37℃培养48～72h，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，冻融2次后，置-20℃以下备用。

猪传染性胃肠炎病毒毒种的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将长满致密单层的ST细胞，按1%剂量接种检验合格的猪传染性胃肠炎病毒种毒，加入终浓度为100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM维持液，37℃培养48～72h，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，冻融2次后，置-20℃以下备用。

猪δ冠状病毒毒种的制备：用转瓶细胞培养法制备病毒。将长满致密单层的ST细胞，按2%剂量接种检验合格的猪δ冠状病毒种毒，加入终浓度为10μg/mL的胰酶、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM维持液，37℃培养48～72h，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，冻融2次后，置-20℃以下备用。

1.3 制苗用病毒液的检验

1.3.1 纯净性检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

1.3.2 病毒含量测定

猪流行腹泻病毒含量测定，将病毒用含有10μg/mL胰酶的MEM培养基作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用1小时，弃液，加入含有10μg/mL胰酶的MEM培养基，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5%CO₂的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀。

猪传染性胃肠炎病毒含量测定，将病毒用MEM培养基作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别接种已长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用1小时，弃液，加入MEM培养基，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5%CO₂的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀。

猪δ冠状病毒含量测定，将病毒用含有10μg/mL胰酶的MEM培养基作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 4个稀释度，分别接种已长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用1小时，弃液，加入含有10μg/mL胰酶的MEM培养基，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5%CO₂的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀。

1.4 灭活及其检验

将检验合格的病毒液分别按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟。灭活后的病毒液按照体积比例为1:1:1进行混合，置于2～8℃保存。

将灭活后的三种病毒液分别接种已长成良好单层的Vero细胞、ST细胞、ST细胞，每组接种3瓶，置37℃作用60分钟后，弃液，加入相应的MEM维持液，同时设正常细胞对照和未灭活病毒对照，置37℃、含5%CO₂的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变。灭活病毒组和正常细胞对照组均不出现细胞病变，未灭活病毒对照组全部出现细胞病变，则判为病毒灭活完全。

1.5 三联疫苗的乳化与分装

取相同重量的灭活病毒液和Montanide ISA 206，分别加热至30℃±2℃，将MontanideISA 206倒入双层夹套容器并将温度保持在30℃。以低速（200r/min）搅拌并逐渐将灭活病毒液加入，流速5L/min~6L/min。待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至300r/min，30℃持续搅拌20~30分钟。将容器冷却至15℃以下，并在冷却过程中持续搅拌。停止搅拌，将乳液在15℃以下静置24小时。分装并加盖密封后，放置于4℃左右备用。

1.6 物理性状检验

外观：为均匀乳剂。

剂型：为水包油包水型。用一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

1.7 无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

1.8 安全检验用3～5日龄健康易感仔猪（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性）5头，各经颈部肌肉注射疫苗2.0ml，连续观察14日。试验猪应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。

1.9 效力检验

1.9.1 抗体测定用3～5日龄健康易感仔猪（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性）5头，各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，接种14日后，连同对照猪5头一并采血，分离血清，测定猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒中和抗体。免疫组猪中和抗体均应不低于1:16，对照组猪中和抗体均应不高于1:4。

1.9.2 免疫攻毒法用3～5日龄健康易感仔猪（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性）15头（分为1~3组，每组5头），各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，另外15头（分为4~6组，每组5头）颈部肌肉注射同剂量PBS，免疫后14日，第1、4组各经口服接种猪流行性腹泻病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.0 TCID₅₀/ml），第2、5组经口服接种猪传染性胃肠炎病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5 TCID₅₀/ml），第3、6组经口服接种猪δ冠状病毒毒种2.0ml（病毒含量为10^5.5 TCID₅₀/ml）。连续观察10日。4~6组对照猪应至少4头发病，1~3组免疫猪应全部健活。

2 结果

2.1 抗原含量结果

3批猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒分别培养三批，批号为2016001、2016002和2016003，抗原的含量见表1，其病毒液含量均符合要求。

表1 抗原含量测定

2.2 抗原的灭活效果测定将培养三批的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒分别进行灭活，灭活是彻底的（结果见表2）。

表2 3批抗原的灭活检验效果

2.3 物理性状检验结果

按照乳化工艺试制的3批次疫苗均为水包油包水型均匀乳剂。用一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，均呈云雾状扩散。吸取3批次的疫苗各10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相均不超过0.5ml。3批次疫苗黏度测定结果（见表3）均符合规定。

表3 3批疫苗的黏度测定结果

疫苗批号	2016001	2016002	2016003
				黏度（cp）	55	57	54

2.4 无菌检验结果

按照《中国兽药典》附录的方法对3批疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长，见表4。

表4 3批疫苗的无菌检验结果

2.5 安全性检验结果

将3批次疫苗分别以大剂量免疫3日龄健康仔猪，各免疫5头，免疫后14天内，3批次疫苗免疫猪采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，疫苗吸收良好，注射部位均无炎症反应。结果表明（见表5），3批次疫苗免疫仔猪均安全。

表5 3批疫苗的安全性检验结果

2.6 效力检验结果

2.6.1 中和抗体检测结果

3批疫苗分别按1.8.1中的方法进行效力检验，结果3批疫苗的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒中和抗体效价检验均合格，见表6。

表6 3批疫苗免疫后的中和抗体检测结果

2.6.2 免疫仔猪攻毒保护结果

3批疫苗分别按1.8.2中的方法进行效力检验，结果3批疫苗的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒攻毒保护检验均合格，见表7。

表7 3批疫苗免疫后的攻毒保护结果

实施例4 猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗与市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联灭活疫苗和自制的猪δ冠状病毒灭活疫苗免疫效力比较试验。

1 材料

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗，实施实例3中的疫苗制品（批号：2016002）；

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，吉林正业生物制品股份有限公司（批号为2015015）。

猪δ冠状病毒灭活疫苗，实验室试制产品；

2 方法

2.1 猪δ冠状病毒灭活疫苗的制备方法

将检验合格的猪δ冠状病毒液，按照实施例3中1.3项的方法进行灭活并检验合格后，按实施例3中1.4项的方法进行乳化配制灭活疫苗。实施例3中1.5~1.8项的方法进行检验。

2.2 试验分组

用批号为2016002的三联灭活疫苗、市售批号为2015015的二联灭活疫苗、2.1项的方法制备的猪δ冠状病毒灭活疫苗，对3～5日龄健康易感仔猪（三种病毒的抗原抗体均为阴性）分别经颈部肌肉注射1.0ml，每种疫苗接种的仔猪数量见表1，14d后分别进行采血，并于采血当天用强毒攻击。阴性对照组的15头不作免疫，分为3组，分别用于三种病毒攻毒的阴性对照。三个疫苗组分别设有一组（5头）空白对照组，只免疫不进行攻毒。具体分组情况见表8。

表8 试验分组情况表

2.3 效力试验

2.3.1 抗体测定

分别参照实施例3中1.8.1项的方法进行效力检验。按照2.2中的试验分组情况，对免疫后14d的60头猪分别采血，分离血清，测定猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒的中和抗体。

2.3.2 免疫攻毒保护

分别参照实施例3中1.8.2项的方法进行效力检验。按照2.2中的试验分组情况，对免疫后14d的仔猪分别用对应的强毒进行攻击。连续观察10日，记录各组仔猪的发病情况。

3 实验结果与讨论

3.1 抗体测定结果

用批号为2016002的三联灭活疫苗、市售批号为2015015的二联灭活疫苗、2.1方法制备的猪δ冠状病毒灭活疫苗分别对3～5日龄健康易感仔猪进行免疫，14d后的中和抗体结果见表2。结果表明三联灭活疫苗和猪δ冠状病毒灭活疫苗免疫后仔猪血清中对猪δ冠状病毒的中和效价均不低于1:16，而市售二联灭活疫苗免疫产生的中和效价均低于三联灭活疫苗的水平，且达不到实施例3中1.8.1项的效力检验要求。因此，本发明的三联灭活疫苗免疫后产生的抗体水平要优于市售二联灭活疫苗。

表9 三联灭活疫苗、市售二联灭活疫苗和单苗免疫后的中和抗体效价比较

3.2 免疫攻毒保护结果

用批号为2016002的三联灭活疫苗、市售批号为2015015的二联灭活疫苗、2.1方法制备的猪δ冠状病毒灭活疫苗分别对3～5日龄健康易感仔猪进行免疫，14d后分别用对应的强毒进行攻击，连续观察10日，攻毒保护的结果见表3。结果表明三联灭活疫苗和猪δ冠状病毒灭活疫苗免疫后的仔猪均能够抵挡相应病毒强毒的攻击，保护率为5/5，保护效果较好，市售二联灭活疫苗免疫后对猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的保护率分别为2/5和3/5，保护效果均低于另外两种疫苗，并且达不到实施例3中1.8.2项的效力检验要求。由此可见，本发明的三联灭活疫苗对三种病毒强毒的攻击有很好的保护效果，且保护效果优于市售二联灭活疫苗。

表10 三联灭活疫苗、市售二联灭活疫苗和单苗免疫后攻毒保护效果比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗中抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL、猪传染性胃肠炎病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL和猪δ冠状病毒的含量≥10^7.0TCID50/mL。

2.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗是由猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒灭活后制备获得，灭活后各个抗原的体积比例为1:1:1。

3.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒的灭活是分别将病毒液按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟后获得。

4.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗中含有佐剂，抗原与佐剂的质量比例为1:1。

5.根据权利要求4 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂。

6.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒微生物保藏号是CGMCC No.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

7.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒微生物保藏号是CGMCC No.13856；保藏时间是2017年06月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

8.根据权利要求1 所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪δ冠状病毒微生物保藏号是CGMCC No.13853；保藏时间是2017年06月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

9.一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗的制备过程包括以下步骤：

2) 猪传染性胃肠炎病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按1%剂量接种猪传染性胃肠炎病毒，并加入维持液，在37℃下培养；

3) 猪δ冠状病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按2%剂量接种猪δ冠状病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

6) 三种病毒液分别用BEI灭活，灭活检合格后，按照体积比例为1:1:1进行混合；

10.根据权利要求6 所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的维持液为MEM 培养基，含有100U/ml 青霉素和100μg/ml的链霉素。