CN101235363A - 猪传染性胃肠炎华毒弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎华毒(H)弱毒疫苗株(Transmissible gastroenteritis virus)及其应用。本发明弱毒疫苗株的微生物保藏号是：CCTCC－V200609。本发明TGEV弱毒株安全性好，对于猪传染性胃肠炎(TGE)病毒具有良好的免疫保护率。本发明弱毒株可应用于制备成诊断猪传染性胃肠炎的诊断试剂，还可应用于制备成防治猪传染性胃肠炎的单苗或联苗(活或灭活疫苗)等。

Description

猪传染性胃肠炎华毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及猪传染性胃肠炎华毒弱毒疫苗株及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)引起的一种高度接触性消化道急性病毒性传染病。以呕吐、水样腹泻、脱水和10日龄以内的仔猪高死亡率为特征。本病对各种年龄的猪只均易感，但以2周龄以下的仔猪最为易感，病死率可高达100％。

本病的病原为主传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)，属于nidovirales病毒目冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员。有囊膜，形态多样，呈球形或椭球形，直径90～160nm，在双层囊膜上面，覆有10～24nm的球棒状纤突，间隔较宽。TGEV只有一个血清型。

体外培养TGEV的敏感的细胞有猪甲状腺细胞、猪睾丸细胞、胎猪肾细胞和仔猪肾细胞。IBRS-2、ST、PK15细胞系是实验室中进行病毒增殖常用的细胞系。病毒感染后的复制、增殖机制与本属其他成员相似，病毒的成熟发生于细胞浆中，通过内质网出芽，在细胞浆的空泡中常可见到病毒粒子。

目前尚无特效的抗本病毒的制剂，临床上多采用对症疗法以减轻症状和减少病死率。治疗原则是：减少饥饿，防止脱水和酸中毒。可采用输液、补充电解质如葡萄糖盐水和营养液，以及有助于消化的药物，如乳酶生、麦芽粉、蛋白酶等，同时加强保温措施，这些措施可以较少3～4日龄以上的小猪的病死率。TGE常与其他肠道菌如大肠杆菌等发生混合感染，常用的抗菌药物有土霉素、呋喃类、磺胺类等药物治疗，以缓解合并症症状，减少病死率。

目前尚缺乏一种有效的防治猪传染性胃肠炎病毒的疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的猪传染性胃肠炎华毒弱毒(H)疫苗株(Transmissible gastroenteritis virus，TGE)，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于猪传染性胃肠炎(TGE)病毒具有良好的保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种猪传染性胃肠炎华毒(H)弱毒疫苗株(Transmissible gastroenteritis virus，TGE)，其微生物保藏号是：CCTCC-V200609；分类命名：猪传染性胃肠炎病毒弱毒疫苗株TGE H；保藏时间是：2006年11月16日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：武汉大学中国典型培养物保藏中心。

本发明采用培养液中加二甲基亚砜处理细胞的方法使27-4代华毒株强毒适应于胎猪肾细胞，并传至165代，自92代进行了5轮克隆纯化，并自116代开始选直径1mm以内小空斑传代。第100代以后的病毒滴度为10^4.47～10^6.1TCID₅₀/0.3ml。以鼻内途径免疫接种的母猪中和抗体价最高，持续期最长为10个月。第120及135代毒分别作猪体连续传代5及6代，均未见毒力增强，将我们克隆培育的弱毒疫苗毒株命名为猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株。

本发明TGEV弱毒株的形态学观察：病毒细胞培养物上清离心后，将收获的病毒悬液5000rpm离心30min，取上清，然后上清液15000rpm超速离心，4℃离心2h，沉淀用适量pH7.0PBS溶液悬浮，磷钨酸负染电镜检查。结果可见到典型的冠状病毒粒子的照片，病毒粒子呈球形，大小100～180nm，具有纤突。

通过对本发明TGE H毒株的基因序列进行分析，发现了本疫苗毒株的特有基因序列特征，其特有基因序列特征如下：ORF3基因序列总长度为1203bp(SEQ IDNO：1)，其中，ORF3a的基因序列总长度为193bp(SEQ ID NO：2)，ORF3b的基因序列总长度为：735bp(SEQ ID NO：3)，ORF3a-3b之间的基因间隔序列总长度为：87bp(SEQ ID NO：4)。

本发明TGEV弱毒株的适应细胞比较广泛，例如，可以是猪肾原代细胞、猪甲状腺细胞、IBRS-2、ST或PK15等细胞。

本发明弱毒株制备成疫苗的方法：

选用生长良好的PK或PK15细胞，倒掉培养液后，换以含5％病毒种子液的新鲜培养液(乳汉液或)，置37℃继续培养。接毒后，每日观察。发现生长异常、污染的细胞应废弃。培养2-3日后，约有80％的细胞出现病变，并与对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存。将收获的两种病毒每5瓶毒液为一组分别取样，进行无菌检验，应无细菌生长工。效价均应≥106.0TCID50/ml。将检验合格的猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻细胞毒液等量混合液与保护剂(蔗糖明胶保护剂，明胶49g；蔗糖280g加无离子水700ml加热溶解后，分装，110～116℃灭菌30～60分钟。)按7∶1混合(病毒液保持在10-20℃，保护剂40-50℃)，充分摇均后分装，边分装边摇动，8ml疫苗瓶分装量为2～3ml，迅速进行冷冻真空干燥。

将本发明疫苗分6批次对3日龄仔猪的主动免疫保护率为98.1％(101/103)，被动免疫的保护率98.5％(135/137)，而对照组的发病率均在90％以上，表明本发明疫苗对于猪传染性胃肠炎(TGE)病毒具有良好的免疫保护率。

本发明弱毒株的安全性好，安全性试验结果表明，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全无副反应。

本发明疫苗免疫的主要目的是保护仔猪，免疫所遵循的原则是乳汁免疫(即被动免疫)，通常对妊娠的母猪于产前45d或15d进行肌内、鼻内各接种1ml，仔猪出生后，从乳汁中获得保护性抗体，被动免疫保护率在95％以上。本疫苗用于主动免疫时，主要用于未接种TGE疫苗且受本并威胁的猪群的仔猪。生后1-2日龄的仔猪即可进行口服接种，免疫里产生期为5-7d。本发明疫苗免疫效果已达到或超过外国同类疫苗，与日本的TO163比较试验结果，本发明疫苗免疫效果比TO163高13.7％。

本发明疫苗的使用方法：

(1)接种途径滴鼻、口服、后海穴位注射(尾根与肛门之间的凹陷处)、肌肉注射。

(2)接种剂量：(1头份)。

本发明疫苗的免疫持续期是母猪为1产，其它猪只6个月。

本发明弱毒株应用范围较宽，例如，可应用于制备成诊断猪传染性胃肠炎的诊断试剂，还可应用于制备成单苗或联苗(活或灭活疫苗)疫苗等。

附图说明

图1本发明弱毒株与Purdue TGEV毒株的序列相比结果。

图2本发明弱毒株与Miller M6毒株的序列相比结果。

图3本发明弱毒株与Miller M60毒株的序列相比结果。

图4本发明弱毒株与Purdue P115毒株的序列相比结果。

图5本发明弱毒株与SC-Y毒株的序列相比结果。

图6本发明弱毒株与TS毒株的序列相比结果。

图7本发明弱毒株与virulent Purdue毒株的序列相比结果。

图8102代弱毒疫苗对中和抗体效价的影响。

图9135代弱毒疫苗对中和抗体效价的影响。

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

具体实施方式

实施例1本发明猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株的制备

采用乳汉液中加二甲基亚砜处理猪肾元代细胞的方法使27～4代华毒株(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保藏)强毒适应于胎猪肾细胞，并传至165代，自92代进行了5轮克隆纯化，并自116代开始选直径1mm以内小空斑传代。第100代以后的病毒滴度为10^4.47～10^6.1TCID₅₀/0.3ml。以鼻内途径免疫接种的母猪中和抗体价最高，持续期最长为10个月。第120及135代毒分别作猪体连续传代5及6代，均未见毒力增强，将所克隆培育的弱毒疫苗毒株命名为猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株并提交保藏，其微生物保藏号是：CCTCC-V200609；保藏时间是：2006年11月16日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：武汉大学中国典型培养物保藏中心。

试验例1本发明猪传染性胃肠炎(TGE)华毒弱毒(H)疫苗株的基因序列特征分析

根据GenBank中发表的Purdure TGEV毒株(AJ271965)的序列设计一对引物，用于扩增TGEV H弱毒株-疫苗株(165代)的ORF3序列，引物分别为：

TGEVORF3U：5`-AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3`

TGEVORF3L：5`-CAACAGGAACCAGAAAATGA-3`

最终的测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

上海生工测序后的TGEV H弱毒株-疫苗株(165代)ORF3基因的测序，根据所测得的序列结果显示：与国外的毒株进行Blast比对，然后去掉不属于ORF3的序列，最终得出的TGEV H弱毒株-疫苗株(165代)ORF3基因序列总长度为1203bp(SEQ ID NO：1)。

其中，ORF3a的基因序列总长度为193bp(SEQ ID NO：2)，ORF3b的基因序列总长度为735bp(SEQ ID NO：3)，ORF3a-3b之间的基因间隔序列总长度为87bp(SEQID NO：4)。

根据所测得的TGEV H弱毒株-疫苗株(165代)ORF3基因的序列，与国外的毒株进行比对和序列分析得出以下结论：

(1)、与Purdue TGEV毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与Purdue毒株的同源性为94.31％，TGEV H弱毒株从ORF3序列的ATG开始的第193为到221位一共缺失了29个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为：

TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT，

其中ORF3a缺失了24个核苷酸，具体缺失为：

TCAATAGTCATATAGTTGTTTAAT；

在ORF3a和ORF3b之间的间隔序列缺失了5个核苷酸，具体缺失为：ATCAT。

从ORF3的ATG上游序列的第60位到第75位一共缺失了16个核苷酸，也就是说在TGEV H弱毒株的S基因和ORF3基因之间的核苷酸序列存在缺失，具体的缺失序列为：TTTCTGCTAGAGAATT。

具体的比对结果见图1。

(2)、与Miller M6毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与Miller M6毒株的同源性达到99.5％，只是存在点突变。具体的比对结果见图2。

(3)、与Miller M60毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与Miller M6毒株的同源性为55.36％，MillerM60毒株缺失了531个核苷酸，具体的比对结果见图3。

(4)、与Purdue P115毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与Purdue P115毒株的同源性为90.83％，Purdue P115毒株在S基因和ORF3基因之间存在缺失，按照设计的引物扩增的序列可知，目前缺失了大约56个核苷酸，目前所知的具体的缺失为：

AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不过具体在Purdue P115毒株在S基因和ORF3基因之间缺失多少核苷酸还有待于进一步的研究。

而TGEV H弱毒株则在从ORF3序列的ATG开始的第193为到221位一共缺失了29个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为：TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比对结果见图4。

(5)、与SC-Y毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与SC-Y毒株的同源性为90.75％，SC-Y毒株在S基因和ORF3基因之间存在缺失，按照设计的引物扩增的序列可知，目前缺失了大约56个核苷酸，目前所知的具体的缺失为：AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不过具体在SC-Y毒株在S基因和ORF3基因之间缺失多少核苷酸还有待于进一步的研究。

而TGEV H弱毒株则在从ORF3序列的ATG开始的第193为到221位一共缺失了29个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为：TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比对结果见图5。

(6)、与TS毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与TS毒株的同源性达到99％，只是存在点突变。并且与其他毒株相比，缺失的核苷酸也在同一个位置，不排除为同一毒株的可能。具体的比对结果见图6。

(7)、与virulent Purdue毒株的序列相比，TGEV H弱毒株与virulent Purdue毒株的同源性为90.99％，virulent Purdue毒株在S基因和ORF3基因之间存在缺失，按照设计的引物扩增的序列可知，目前缺失了56个核苷酸，目前所知的具体的缺失为：

AATTGAAAAAGTGCACGTCCATTAAATTTAAAATGTTAATTTTATTATCTGCTATAA，不过具体在virulent Purdue毒株在S基因和ORF3基因之间缺失多少核苷酸还有待于进一步的研究。而TGEV H弱毒株则在从ORF3序列的ATG开始的第193位到221位一共缺失了29个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为：TCAATAGTCATATAGTTGTTTAATATCAT。比对结果见图7。

试验例2本发明弱毒株的保护效力试验

一、试验材料：

1.华毒株强毒：系上海市畜牧兽医研究所1977年12月赠给的第27代小肠毒。我们通过1～2日龄乳猪传至16代(即华27-16代)，1978年3月适应于胎猪肾细胞培养。

2.Miller/10(M)毒株：系1978年11月自匈牙利中央兽医研究所引进的冻干毒。启封后，部分直接接种于FPK细胞并传代，作为M株细胞毒用于毒株间对比试验及制备诊断用高免血清；另一部分接种1～2日龄乳猪传代，作为M株强毒用于交互免疫试验。

3.日本TGE弱毒疫苗TO163阳性血清及荧光抗体均系日本农林省家畜卫生试验场于1980年3月和7月赠给。疫苗毒经FPK细胞增至1～2代用于免疫试验；阳性血清及荧光抗体用于培育弱毒株的定性鉴定试验。

二、试验方法

1、免疫试验

试验母猪为血清中和试验阴性的1～2产母猪(个别的为3产)。

主动免疫试验：使用3日龄哺乳仔猪，口服2ml传代毒，经7～10天安全性观察后，攻击强毒，做主动免疫试验。

被动免疫试验：妊娠母猪产前15天即15天左右先以肌肉、后以鼻内接种5毫升传代毒。于每次接毒前、产仔当日、攻毒前及观察结束时，采母猪血清测中和抗体效价。仔猪生后3日龄时攻击强毒测定被动免疫保护率。

主动免疫攻毒剂量为20个ID50，被动免疫攻毒剂量为100个ID50，所用强毒系华毒27～7代至27～16代之间的传代毒。攻毒途径为口服。

中和试验：用固定病毒稀释血清的方法在FPK及猪肾传代细胞IBRS2上进行，指示毒为华株细胞毒及M株细胞毒，剂量为100～1000TCID50/0.3毫升，阳性对照血清为M株高免血清。被检血清灭活后，做2n连续稀释。在对照系统完全成立时，以抑制指示毒CPE作用的血清最高稀释度的倒数为该血清的中和抗体效价。

三、试验结果

1华毒株传代毒的克隆化

在165代过程中，进行的五批克隆纯化(92、110、116、130及145代)。除首批选过2mm斑外，均选1mm斑，前两批各连续选三次，每次选6～27个单斑混合(称群体斑)传代。从116代开始选一个1mm以内的单斑(称单体斑)传代。每隔5代左右进行一次斑径的检测，检测中发现有5～10％的2mm或更大的空斑出现时，则进行再次纯化。克隆化前后的传代华毒株对三日龄仔猪主动免疫的安全性不同，克隆纯化前对仔猪的发病率为83.3％，死亡率40％，选群体斑纯化后对仔猪的发病率为23.1％，无死亡。从116代后选斑以后，仔猪的发病率明显的降低(为5.7％)，无死亡(见表1)；被动免疫的保护率也有所提高(见表2)。

表1克隆化前后的华弱毒株与TO163毒株对3日龄哺育仔猪主动免疫对比试验

表2华弱毒株与TO163毒株被动免疫比较试验

2不同接种途径对中和抗体效价的影响

首先对60头后备猪(体重70～80斤)分鼻内、肌肉、口服三种途径各接种102代毒3毫升，267天内进行4次中和抗体跟踪检测，证明以鼻内途径接种猪的中和抗体价最高；第一次检测口服途径高于肌肉途径，但第二、三次肌肉途径明显高于口服途径的抗体效价(图8-A)。

为验证试验的可重复性，又对25头后备猪接种135代毒(1ml)跟踪检测，三种途径的比较结果同首次一致，因第二次接种剂量小，故中和抗体效价低(图8-B)。

试验结果表明，以纯化株经鼻内、肌肉途径免疫妊娠母猪，其中和抗体效价较高(见表2)。

另外，还表明首次弱毒接种跟踪检测结果，中和抗体效价最长可持续13个月，尤以鼻内途径持续最长，在弱毒接种后9个月时仍达100％阳性，而肌肉接种为50％，口服仅22.2％。

3主动免疫试验

测定对3日龄哺乳仔猪的安全性是检查TGE弱毒株安全性的一个重要指标。接种后观察7～10天做攻毒试验，以检测对仔猪的主动免疫情况。传代毒第92代以前的安全性很差，发病率为83.3％，死亡率为40％，但对耐过的猪攻毒则有88.2％的保护率；92代克隆化(选群体斑)后(102代)发病率降为23.1％，无死亡，攻毒后100％保护。116代克隆纯化(选单斑)之后，发病率降低到5.7％，无死亡。135～160代共计免疫110头仔猪，只有4头发病(3.6％)，其中2头死亡(1.8％)。在相同条件下，与日本TGE TO163对仔猪安全性的试验结果相比虽不如TO163(见表1、3)，但作为弱毒株使用是可以的。

表3华弱毒株135～160代对3日龄哺乳仔猪主动免疫试验

2.4被动免疫试验

接种未经克隆纯化的72、75、82、97代传代毒母猪的3日龄哺乳仔猪，攻毒保护率为92.8％，发病率为7.2％；克隆纯化后的102、106、120、130代保护率为97.4％，发病率为2.6％(见表2)。135代后测定结果也相似(见表4)。克隆纯化前后的传代毒与日本TO163株的被动免疫比较试验结果看出，比日本TO163株的保护率高出13.7％或18.3％(见表2)，优于日本TO163株。

表4华弱毒株135～160代被动免疫试验

试验例3本发明弱毒株的安全性试验

1材料和方法

1.1病毒的稳定性试验：

口服120及135代TGE病毒培养液1毫升，病毒含量10^6.0TCID₅₀/ml，观察7日，剖杀后取小肠冰冻切片后进行免疫荧光检测，用5倍pH 7.20.1M PBS溶液制备悬液，口服1毫升在不吃初乳的仔猪体内进行传代，连续5代，观察每代次仔猪的变化。

1.2安全性试验：使用3日龄哺乳仔猪，用5个代次的病毒(155-165代次之间)，后海穴位注射10头份(病毒的效价为106.0TCID50/头份)，观察28天。母猪，产前40天的妊娠母猪，观察采食、体温、呕吐、腹泻及流产、死胎等指标，并统计母猪窝产仔数。

2试验结果：

2.1稳定性试验

共做2次稳定性试验，第一次以120代毒通过3日龄哺乳仔猪5代，第二次以135代毒通过3日龄人工哺乳猪6代，从表5结果可以看出，传代毒是稳定的，经5-6代返祖试验，毒力并未增强(表5)。

表5华弱毒株120、135代弱毒稳定性试验

代次	返祖代数	仔猪头数	仔猪龄	仔猪饲养方式	途径与剂量	迫杀时间	继代方法	发病头数	检查空肠绒毛	备注
											120代	5	41	65～76小时	哺乳	口服2ml	72小时	取三头仔猪空肠制备10乳剂继代	△△2/41	正常	△△第一代一过性反应2头
135代	6	23	76～80小时	人工哺乳	口服2ml	72小时	取三头仔猪空肠制备10乳剂继代	△2/23	正常	△第一代1头第二代1头一过性反应

2.2安全性试验：

通过上述的试验，证明本发明疫苗大剂量的免疫接种，对仔猪和母猪均无任何影响。试验结果证明，本发明疫苗在妊娠母猪上应用，不会造成母猪流产、死胎等繁殖障碍，实验组与对照组无明显差异，产仔数均在9-13只，属于正常范围，无流产、死胎等繁殖障碍等表现(表6、7)。

安全性试验结果表明，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全无副反应。

序列表

<110>中国农科院哈尔滨兽医研究所

<120>猪传染性胃肠炎华毒弱毒疫苗株及其应用

<130>088

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1203

<212>DNA

<213>猪传染性胃肠炎华毒(Transmissible gastroenteritis virus)

<400>1

aattgaaaaa gtgcacgtcc attaaattta aaatgttaat tttattatct gctataatag    60

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<213>猪传染性胃肠炎华毒(Transmissible gastroenteritis virus)

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agcatagcaa tacgtggctt agctcatgct gatctaactg tagttagagc agttgaactt   600

ctcaatggtg attttattta tgtattttca caggagcccg tagtcggtgt ttacaatgca   660

gccttttctc aggcggttct aaacgaaatt gacttaaaag aagaagaaga agaccgtacc   720

tatgacgttt cctag                                                    735

<210>4

<211>87

<212>DNA

<213>猪传染性胃肠炎华毒(Transmissible gastroenteritis virus)

<400>4

taaacacaca aaatccaaag cattaagtgt tacaaaacaa ttaaagagag attatagaaa    60

aactgtcgtt ctaaacttca tgcgaaa                                        87

Claims (6)

1. 猪传染性胃肠炎华毒(H)弱毒疫苗株(Transmissible gastroenteritis virus)，其微生物保藏号是：CCTCC-V200609。

2. 按照权利要求1的弱毒疫苗株，其特征在于，所述的弱毒疫苗株的ORF3基因序列为SEQ ID NO：1所示。

3. 按照权利要求2的弱毒疫苗株，其特征在于，所述的ORF3基因主要由ORF3a、ORF3b和ORF3a-3b之间的基因间隔序列所组成；其中ORF3a的基因序列为SEQ ID NO：2所示，ORF3b的基因序列为SEQ ID NO：3所示，ORF3a-3b之间的基因间隔序列为SEQ ID NO：4所示。

4. 一种防治猪传染性胃肠炎的疫苗组合物，由权利要求1的弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。

5. 权利要求1的弱毒疫苗株在制备防治猪传染性胃肠炎药物中的用途。

6. 权利要求1的弱毒疫苗株在制备诊断猪传染性胃肠炎试剂中的用途。

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