CN114107224A - 一种猪传染性胃肠炎病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒及其应用，所述猪传染性胃肠炎病毒命名为猪传染性胃肠炎病毒TGEV‑HuN，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20279，保藏日期为2021年6月2日。本发明还提供了所述猪传染性胃肠炎病毒的分离方法、一种猪传染性胃肠炎疫苗及其制备方法。本发明所述猪传染性胃肠炎病毒具有较强的毒力及传染性，制成疫苗后，免疫原性远高于传统毒株，免疫母猪的后代也具有对猪传染性胃肠炎病毒的抵抗能力，并且克服了传统毒株疫苗因毒株变异导致的疫苗防护能力差的缺点；稳定性好，制备方法简单，成本较低，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，尤其涉及一种猪传染性胃肠炎病毒及其应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)可引起以严重腹泻、呕吐、脱水以及食欲下降等为主要特征的肠道传染病，发病率可高达100％，死亡率为30％～80％，是导致仔猪在早期死亡的主要疾病之一，给许多国家的养猪业造成了巨大的经济损失。
目前已有一些关于猪传染性胃肠炎病毒的预防及治疗的方法。CN112080455A公开了一种表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法，通过分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的融合序列，能够与猪传染性胃肠炎病毒特异性结合，可用于阻断猪传染性胃肠炎病毒的感染。但是此制备方法过于复杂，对技术人员的水平要求较高，且生产成本昂贵，限制了相关产品的实际应用。
目前猪传染性胃肠炎以疫苗免疫预防为主，但现有商品化疫苗免疫效果不佳，且生产成本较高。因此，如何提供一种制备方法简单、免疫效果较好的猪传染性胃肠炎疫苗，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒及其应用，可以有效解决因毒株变异导致现有疫苗免疫效果不佳的问题，且制备方法简单，生产成本较低，具有实际应用的价值。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒，所述猪传染性胃肠炎病毒命名为猪传染性胃肠炎病毒TGEV-HuN，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20279，保藏日期为2021年6月2日。
本发明中，所述猪传染性胃肠炎病毒为当前猪传染性胃肠炎病毒的新流行株，毒力强，患病动物致死率高，并且由于毒株的变异，现有的疫苗无法取得有效的防护效果。以此毒株为免疫抗原，制备得到的疫苗可以为猪传染性胃肠炎的预防提供保障。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，所述分离方法包括：
使用病猪粪便制备病毒粗提液，再将所得病毒粗提液接种在细胞中，培养，收集细胞培养液，得到所述猪传染性胃肠炎病毒。
本发明中，所述分离方法操作简单，对工作人员的技术水平要求较低；病毒来源容易获得，分离成本较低，为相关疾病的预防与治疗创造了条件。
优选地，所述病毒粗提液的制备方法包括：
将所述病猪粪便与PBS溶液混合，冷冻融化，震荡后离心，收集上清，即所述的病毒粗提液。
优选地，所述PBS溶液的pH值为7.0～7.8，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8等。
优选地，所述冷冻融化的次数为2～4次，例如可以是2次、3次或4次。
优选地，所述冷冻的温度为-22～-18℃，例如可以是-22℃、-21℃、-20℃、-19℃或-18℃等。
优选地，所述融化的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。
优选地，所述离心的转速为2800～3200rpm，例如可以是2800rpm、2900rpm、3000rpm、3100rpm或3200rpm等。
优选地，所述收集上清后还包括使用过滤器过滤的步骤。
优选地，所述细胞包括ST细胞(Swine testis，猪睾丸细胞)。
优选地，所述接种的剂量为150～300μL，例如可以是150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL、250μL、260μL、270μL、280μL、290μL或300μL等。
优选地，所述培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。
优选地，所述培养的CO2浓度为4％～7％，例如可以是4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或7％等。
优选地，所述收集细胞培养液在细胞病变率不低于80％时进行，例如可以是80％、85％、90％或95％等。
作为优选技术方案，本发明所述猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，包括以下步骤：
(1)将病猪粪便与pH值为7.0～7.8的PBS溶液混合，在-18～-22℃下冷冻，在35～40℃下融化，重复2～4次，震荡后在2800～3200rpm下离心，收集上清，使用过滤器过滤，得到所述病毒粗提液；
(2)将所得病毒粗提液接种在ST细胞中，接种的剂量为150～300μL，在35～40℃、4％～7％的CO2浓度下培养，细胞病变率不低于80％时收集细胞培养液，得到所述猪传染性胃肠炎病毒。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的猪传染性胃肠炎病毒和/或第二方面所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法在制备猪传染性胃肠炎疫苗中的应用。
本发明中，所述猪传染性胃肠炎病毒为当前的新流行毒株，毒力较强，制成相关疫苗具有良好的预防及免疫效果；分离方法简单高效，来源获取容易，成本较低，促进了产品的推广与使用。
第四方面，本发明提供了一种猪传染性胃肠炎疫苗，所述猪传染性胃肠炎疫苗包括水相和油相，所述水相中含有灭活或减毒的第一方面所述的猪传染性胃肠炎病毒。
本发明中，所述猪传染性胃肠炎疫苗中的抗原为猪传染性胃肠炎病毒的新流行毒株，免疫效果好，可以有效解决市面上已有的相关疫苗对变异毒株防护效果较差的问题。
优选地，所述水相中还含有吐温-80。
优选地，所述灭活或减毒的猪传染性胃肠炎病毒与吐温-80的质量比为(23～25):1，例如可以是23:1、24:1或25:1等，优选为24:1。
优选地，所述油相包括白油、司本-80和硬脂酸铝。
优选地，所述白油、司本-80和硬脂酸铝的质量比为(46～50):(1～3):1，例如可以是46:1:1、46:2:1、46:3:1、47:1:1、47:2:1、47:3:1、48:1:1、48:2:1、48:3:1、49:1:1、49:2:1、49:3:1、50:1:1、50:2:1或50:3:1等，优选为48:2:1。
优选地，所述水相和油相的质量比为(0.9～1.1):1，例如可以是0.9:1、1:1或1.1:1等，优选为1:1。
作为优选技术方案，本发明所述的猪传染性胃肠炎疫苗包括水相和油相，所述水相和油相的体积比为(0.9～1.1):1；
其中，所述水相中灭活或减毒的猪传染性胃肠炎病毒与吐温-80的质量比为(23～25):1，所述油相中白油、司本-80和硬脂酸铝的质量比为(46～50):(1～3):1。
第五方面，本发明提供了一种第四方面所述的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，所述制备方法包括：
将猪传染性胃肠炎病毒接种在细胞中培养，收集培养上清，反复冻融后离心，灭活或减毒后与无菌吐温-80混合，制成水相；
将白油、司本-80和硬脂酸铝混合，灭菌后制成油相；
将水相与油相进行乳化，得到所述猪传染性胃肠炎疫苗。
本发明中，所述疫苗的制备方法技术成熟，成功率高，生产效率高，成本低，为产品的推广与使用创造了条件。
优选地，所述接种的剂量为3～7MOI，例如可以是3MOI、4MOI、5MOI、6MOI或7MOI等。
优选地，所述细胞包括ST细胞。
优选地，所述培养的时间为24～72h，例如可以是24h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h或72h等。
优选地，所述收集培养上清在细胞病变率不低于80％时进行，例如可以是80％、85％、90％或95％等。
优选地，所述反复冻融的次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次。
优选地，所述离心的转速为2800～3200rpm，例如可以是2800rpm、2900rpm、3000rpm、3100rpm或3200rpm等。
优选地，所述灭活或减毒前还包括测定TCID50值的步骤。
优选地，所述TCID50值不低于10-6.0，例如可以是1×10-6.0、2×10-6.0、3×10-6.0、4×10-6.0、5×10-6.0、6×10-6.0、7×10-6.0、8×10-6.0或9×10-6.0等。
优选地，所述灭活或减毒的方法包括加入甲醛。
优选地，所述灭菌的方法包括高压蒸汽灭菌。
优选地，所述乳化包括：
在8000～12000rpm下均质乳化，每次2～3min，重复2～5次，均质乳化的转速例如可以是8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm或12000rpm，时间例如可以是2min、2.5min或3min，次数例如可以是2次、3次、4次或5次。
优选地，所述制备方法还包括含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验的步骤。
作为优选技术方案，本发明所述猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将猪传染性胃肠炎病毒按3～7MOI的剂量接种在ST细胞中，培养24～72h，在细胞病变率不低于80％时收集培养上清，反复冻融2～5次后在2800～3200rpm下离心，测定TCID50值不低于10-6.0后，加入甲醛灭活或减毒，与无菌吐温-80混合，制成水相；
(2)将白油、司本-80和硬脂酸铝混合，高压蒸汽灭菌后制成油相；
(3)将水相与油相在8000～12000rpm下均质乳化，每次2～3min，重复2～5次，进行含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验后，得到所述猪传染性胃肠炎疫苗。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)所述猪传染性胃肠炎病毒为当前新流行毒株，毒力较强，TCID50值不低于10-6.33，利用其制备得到的猪传染性胃肠炎疫苗具有良好的免疫效果，可预防猪传染性胃肠炎疾病的爆发，产生了有效的防护效果；
(2)所述猪传染性胃肠炎疫苗具有良好的免疫原性，激发的抗体水平不低于1:256，免疫后的母猪所产的仔猪对猪传染性胃肠炎也具有抵抗能力，保护率高达100％；制备简单，生产效率高，稳定性好，37℃放置7d后，毒价下降仅为10-0.2TCID50，在-20℃下保存1年后疫苗毒价基本保持不变，保存3年后毒价仅下降0.34个滴度，方便运输与储存，成本较低；安全性好，不存在因毒力返祖而形成潜在感染或传播的危害性；预防作用好，克服了因毒株变异导致的疫苗防护能力差的弊端，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例2中猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR鉴定的结果图片，图中，M-标准DNA分子量marker，泳道1～2-病变细胞培养物扩增结果，泳道3-阴性对照扩增结果；
图2为本发明实施例2中猪传染性胃肠炎病毒的序列同源比对进化分析结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
猪传染性胃肠炎病毒于2014年从湖南省郴州市发病猪场仔猪肠内容物中分离得到，现命名为猪传染性胃肠炎病毒TGEV-HuN，于2021年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.20279。
ST细胞来自衡阳师范学院。
MEM购自北京清大天一科技有限公司。
FBS购自Gibico公司。
RNA提取试剂盒和DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。
反转录试剂盒购自Invitrogen公司。
切胶纯化试剂盒购自Thermo Fisher。
实施例1
本实施例分离猪传染性胃肠炎病毒，分离步骤如下：
(1)收集病猪粪便200μL置于无菌EP管中，与1mL pH为7.4的PBS溶液混合，在-20℃下冷冻，在37℃下融化，重复3次，震荡15s后在3000rpm下离心2min，收集上清，使用0.22μm过滤器过滤，得到所述病毒粗提液，在-70℃下保存备用；
(2)铺满单层的ST细胞按1:4比例进行细胞传代，吹打细胞分散后，分装至细胞培养瓶中，每瓶补充含5％FBS的MEM 15mL；
(3)将所得病毒粗提液接种在ST细胞中，接种的剂量为200μL，在37℃、5％的CO2浓度下培养，细胞病变率不低于80％时收集细胞培养液，得到所述猪传染性胃肠炎病毒。
经过上述方法，成功分离得到1株猪传染性胃肠炎病毒，对其进行RT-PCR鉴定、基因遗传进化分析及TCID50的测定。
实施例2
本实施例对实施例1分离得到的猪传染性胃肠炎病毒进行RT-PCR鉴定、基因遗传进化分析及TCID50测定。
RT-PCR鉴定
取病变的细胞培养物，用RNA提取试剂盒按照说明书操作提取RNA，并将RNA按照反转录试剂盒说明书进行操作反转为cDNA，同时使用正常细胞进行相同的操作作为阴性对照。以获得的cDNA作为模板进行扩增，对S1基因进行扩增，扩增使用的引物序列如SEQ IDNo.1～2所示。
SEQ ID No.1：ACTAAGCTTTTAGCTTACATCACATGGCGTTACAG；
SEQ ID No.2：ACTGGATCCATGAAAAAATTATTTGTGGTTTTGG。
扩增体系如下：
扩增程序如下：
预变性：95℃，4min；
循环扩增：98℃，10s；60℃，30s；68℃，5min；循环35次；
延伸：68℃，7min。
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。有图可知，成功扩增出目的片段，扩增条带大小与预期相符，证明分离得到的病毒确实为猪传染性胃肠炎病毒。
基因遗传进化分析
将扩增产物使用切胶纯化试剂盒进行纯化，送交华大基因测序鉴定。使用DNAStar和Mega对测定序列进行分析，并与GenBank中的TGEV参考序列进行比对分析并绘制进化树，结果如图2所示。由图可知，本发明分离得到的猪传染性胃肠炎病毒与已有毒株在序列上存在一定的差异，不属于已有的毒株，是一株新的流行毒株。
TCID50测定
用无血清MEM将病毒液进行10倍梯度稀释，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10这10个稀释度。将ST细胞接种至48孔板中，细胞密度为80％时，接种病毒稀释液，每个稀释度接种5孔，同时作空白对照。置与37℃、5％CO2培养箱中培养24～72h，每隔12h观察一次细胞病变情况，记录各稀释度的病变孔数，以Reed-Mueeh法计算TCID50，结果如表1所示。
表1
经计算，所述猪传染性胃肠炎病毒的TCID50值为10-6.33，毒力较强，感染致死率高。
实施例3
基于实施例2的RT-PCT鉴定、基因遗传进化分析及TCID50测定结果，确认分离得到的病毒为猪传染性胃肠炎病毒的新流行毒株，命名为猪传染性胃肠炎病毒TGEV-HuN，将其于2021年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.20279。
实施例4
本实施例使用实施例1分离得到的猪传染性胃肠炎病毒制备猪传染性胃肠炎灭活疫苗，所述猪传染性胃肠炎疫苗包括水相和油相，所述水相和油相的体积比为1:1；
其中，所述水相中灭活的猪传染性胃肠炎病毒与吐温-80的质量比为24:1，所述油相中白油、司本-80和硬脂酸铝的质量比为48:2:1。
所述疫苗的制备步骤如下：
(1)将病毒含量≥10-6.0TCID50/0.2mL的猪传染性胃肠炎病毒按5MOI的剂量接种在细胞密度为80％的ST细胞中，添加适量含5％FBS的MEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养24～72h，在细胞病变率不低于80％时收集培养上清，反复冻融3次后在3000rpm下离心10min，测定TCID50值不低于10-6.0后，加入终浓度为0.2％的甲醛灭活，与无菌吐温-80混合，制成水相；
(2)将白油、司本-80和硬脂酸铝混合，高压蒸汽灭菌后制成油相；
(3)将水相与油相在10000rpm下均质乳化，每次3min，重复3次，进行含量测定，无菌检验、支原体检验和外源病毒检验均符合《中华人民共和国兽药典》后，得到所述猪传染性胃肠炎疫苗。
本发明所述猪传染性胃肠炎疫苗以猪传染性胃肠炎病毒新流行毒株作为免疫抗原，免疫作用强，防护效果好；制备简单，生产效率高，成本低，具有应用于生产实际中的价值。
实施例5
本实施例对实施例4制备的猪传染性胃肠炎疫苗进行检测，包括稳定性检测、免疫原性检测和对免疫动物所产后代的保护效果检测。
稳定性检测
将制备的猪传染性胃肠炎疫苗于37℃放置7d，测定TCID50数值作为衡量毒价变化的标准，测定方法与实施例2中的相同。结果显示在37℃放置7d后，毒价下降10-0.2TCID50，表明疫苗在室温下可以维持稳定至少7d。
将制备的猪传染性胃肠炎疫苗放置在-20℃冰箱，分别于0个月、12个月、24个月、36个月测定毒价变化。结果显示在上述时间点，疫苗中病毒含量分别为10-6.50、10-6.50、10-6.28和10-6.16TCID50，即在-20℃下保存1年，疫苗毒价基本保持不变，保存3年后毒价仅下降0.34个滴度，疫苗稳定性很好，运输及储存均较为方便。
免疫原性检测
取7日龄TGEV抗体阴性仔猪9头，随机分为3组，每组3头，分别接种本发明疫苗、传统毒株疫苗和生理盐水，肌肉接种于仔猪，免疫14d后测定抗体效价，比较不同疫苗免疫猪的抗体水平，抗体检测方法采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)，具体检测方法参照标准实验流程，检测结果如表2所示。
表2
| 接种物 | 本发明疫苗 | 传统毒株疫苗 | 生理盐水 |
| 抗体水平 | 1:256 | 1:64 | <1:4 |
由表2可以看出，与传统毒株的疫苗相比，本发明制备的疫苗的免疫效果更好，激发的抗体的水平更高，甚至可达到传统毒株疫苗的4倍或以上，预防效果更好，应用价值更高。
对免疫动物所产后代的保护效果检测
取妊娠60d母猪6头，随机分为3组，每组2头，A组肌肉注射本发明疫苗1份/头，B组肌肉注射1份/头的传统毒株疫苗，A、B两组均间隔14d以同样的方法进行二次免疫，另两头猪作为对照不进行免疫，二次免疫后检测母猪的抗体水平，检测方法与免疫原性检测中相同。每头母猪所产仔猪在7日龄时随机挑选3头，采用TGEV-NY株滤过病料强毒进行灌服攻毒，观察仔猪的临床症状，确定攻毒保护力情况。对结果进行统计，如表3所示。
表3
| 接种物 | 本发明疫苗 | 传统毒株疫苗 | 对照组 |
| 母猪抗体水平 | 1:256 | 1:64 | <1:4 |
| 仔猪保护率(％) | 100 | 66.7 | 0 |
由表3可以看出，与接种传统毒株的疫苗相比，接种本发明制备的猪传染性胃肠炎疫苗的母猪的抗体产生水平更高，并且免疫母猪所产仔猪具有抵御强毒的能力，保护率高达100％，而传统毒株疫苗保护率仅为66.7％，未免疫的对照组母猪所产仔猪攻毒后全部发病死亡，这说明本发明制备的猪传染性胃肠炎疫苗具有更强的预防效果，并且克服了传统毒株疫苗因毒株变异导致的疫苗防护能力差的弊端，应用价值更高。
综上所述，本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒，其为猪传染性胃肠炎病毒的新流行毒株，传染性强，致死率高；制成的猪传染性胃肠炎疫苗具有良好的稳定性，免疫原性远高于传统毒株，并且免疫母猪所产仔猪对猪传染性胃肠炎病毒也具有良好的抵御能力，容易制备，生产成本较低，具有应用于生产实际中的价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州格雷特生物科技有限公司
<120> 一种猪传染性胃肠炎病毒及其应用
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actaagcttt tagcttacat cacatggcgt tacag 35
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actggatcca tgaaaaaatt atttgtggtt ttgg 34
Claims (10)
1.一种猪传染性胃肠炎病毒，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒命名为猪传染性胃肠炎病毒TGEV-HuN，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20279，保藏日期为2021年6月2日。
2.一种权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括：
使用病猪粪便制备病毒粗提液，再将所得病毒粗提液接种在细胞中，培养，收集细胞培养液，得到所述猪传染性胃肠炎病毒。
3.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，其特征在于，所述病毒粗提液的制备方法包括：
将所述病猪粪便与PBS溶液混合，冷冻融化，震荡后离心，收集上清，即所述的病毒粗提液；
优选地，所述PBS溶液的pH值为7.0～7.8；
优选地，所述冷冻融化的次数为2～4次；
优选地，所述冷冻的温度为-22～-18℃；
优选地，所述融化的温度为35～40℃；
优选地，所述离心的转速为2800～3200rpm；
优选地，所述收集上清后还包括使用过滤器过滤的步骤。
4.根据权利要求2或3所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，其特征在于，所述细胞包括ST细胞；
优选地，所述接种的剂量为150～300μL；
优选地，所述培养的温度为35～40℃；
优选地，所述培养的CO2浓度为4％～7％；
优选地，所述收集细胞培养液在细胞病变率不低于80％时进行。
5.根据权利要求2～4任一项所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括：
(1)将病猪粪便与pH值为7.0～7.8的PBS溶液混合，在-18～-22℃下冷冻，在35～40℃下融化，重复2～4次，震荡后在2800～3200rpm下离心，收集上清，使用过滤器过滤，得到所述病毒粗提液；
(2)将所得病毒粗提液接种在ST细胞中，接种的剂量为150～300μL，在35～40℃、4％～7％的CO2浓度下培养，细胞病变率不低于80％时收集细胞培养液，得到所述猪传染性胃肠炎病毒。
6.权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒和/或权利要求2～5任一项所述的猪传染性胃肠炎病毒的分离方法在制备猪传染性胃肠炎疫苗中的应用。
7.一种猪传染性胃肠炎疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎疫苗包括水相和油相，所述水相中含有灭活或减毒的权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒；
优选地，所述水相中还含有吐温-80；
优选地，所述灭活或减毒的猪传染性胃肠炎病毒与吐温-80的质量比为(23～25):1，优选为24:1。
8.根据权利要求7所述的猪传染性胃肠炎疫苗，其特征在于，所述油相包括白油、司本-80和硬脂酸铝；
优选地，所述白油、司本-80和硬脂酸铝的质量比为(46～50):(1～3):1，优选为48:2:1；
优选地，所述水相和油相的质量比为(0.9～1.1):1，优选为1:1。
9.一种权利要求7或8所述的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将猪传染性胃肠炎病毒接种在细胞中培养，收集培养上清，反复冻融后离心，灭活或减毒后与无菌吐温-80混合，制成水相；
将白油、司本-80和硬脂酸铝混合，灭菌后制成油相；
将水相与油相进行乳化，得到所述猪传染性胃肠炎疫苗；
优选地，所述接种的剂量为3～7MOI；
优选地，所述细胞包括ST细胞；
优选地，所述培养的时间为24～72h；
优选地，所述收集培养上清在细胞病变率不低于80％时进行；
优选地，所述反复冻融的次数为2～5次；
优选地，所述离心的转速为2800～3200rpm；
优选地，所述灭活或减毒前还包括测定TCID50值的步骤；
优选地，所述TCID50值不低于10-6.0；
优选地，所述灭活或减毒的方法包括加入甲醛；
优选地，所述灭菌的方法包括高压蒸汽灭菌；
优选地，所述乳化包括：
在8000～12000rpm下均质乳化，每次2～3min，重复2～5次；
优选地，所述制备方法还包括含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验的步骤。
10.根据权利要求9所述的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将猪传染性胃肠炎病毒按3～7MOI的剂量接种在ST细胞中，培养24～72h，在细胞病变率不低于80％时收集培养上清，反复冻融2～5次后在2800～3200rpm下离心，测定TCID50值不低于10-6.0后，加入甲醛灭活或减毒，与无菌吐温-80混合，制成水相；
(2)将白油、司本-80和硬脂酸铝混合，高压蒸汽灭菌后制成油相；
(3)将水相与油相在8000～12000rpm下均质乳化，每次2～3min，重复2～5次，进行含量测定、无菌检验、支原体检验和外源病毒检验后，得到所述猪传染性胃肠炎疫苗。
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