CN107880120A

CN107880120A - 一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN107880120A
Application number: CN201711080931.7A
Authority: CN
Inventors: 潘玉; 董剑辉; 陈瑞
Original assignee: Shaanxi Nuweilihua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shaanxi Nuweilihua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2017-11-06
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2037-11-06
Also published as: CN107880120B

Abstract

本发明为一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法，其采用灭活的保藏编号为CGMCC No.13856的猪传染性胃肠炎病毒TGEV‑BD株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。采用本发明方法制备的猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体具有安全、特异性高、治疗效果好、生产成本低等优点，可有效防治猪传染性胃肠炎病毒引起的疾病，具有良好的应用前景。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药、生物技术领域，涉及一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪传染性肠胃炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）属冠状病毒科冠状病毒属，和猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒一样，是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原之一，可引起猪传染性胃肠炎（TGE）疾病的发生。TGE是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水为主要临床特征并对1周龄以内新生仔猪具有高度致死性。TGE目前已在全世界范围内广泛发生，不同年龄和不同品种的猪对本病都易感，1周龄仔猪感染后的死亡率超过90%，给养猪业造成了巨大的经济损失。

卵黄抗体是通过对鸡免疫注射特定的抗原，从卵黄中获得特异性多克隆抗体，从而预防和治疗相应疾病的技术。与使用其他哺乳动物制备的多克隆抗体相比，卵黄抗体制备有着生产成本低、容易操作、产量大等优点。

目前猪传染性肠胃炎疾病主要采用疫苗免疫来预防，也有少量使用卵黄抗体的报道，但两者对于该病的防治效果均不理想，这可能与临床上该病流行毒株的变异有很大关系。本发明以最新分离到的猪传染性胃肠炎病毒流行毒株为免疫抗原，免疫产蛋鸡，收集卵黄抗体，从而为猪传染性胃肠炎疾病的防治提供了一种安全、特异性高、治疗效果好、生产成本低的生物制品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法。

为了达到以上目的，本发明采用灭活的保藏编号为CGMCC No.13856的猪传染性胃肠炎病毒TGEV-BD株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。

所述的猪传染性胃肠炎病毒抗原的制备方法为：将猪传染性胃肠炎病毒液按1%接种在长满单层的ST 细胞上，置于37℃、CO₂培养箱中培养，待85％细胞出现细胞病变时收毒，反复冻融3 次，然后5000rpm 离心5min，除去细胞碎片，收集上清液，所得上清液中的病毒量为≥10^7.5TCID₅₀/ml。

所述的猪传染性胃肠炎病毒灭活方法是使用0.1%浓度的β-丙内酯，4℃条件下放置18h。

所述的猪传染性胃肠炎病毒乳化使用的佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，抗原与佐剂的混合比例为1:1。

所述的免疫蛋鸡的方法是将灭活后的抗原与佐剂按1:1的体积比混合乳化后，免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化疫苗，免疫剂量为1ml/只，于免疫后14d、28d改为弗氏不完全佐剂乳化疫苗进行二免和三免，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后１周开始每日收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中猪传染性胃肠炎病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体的制备。

所述的卵黄抗体纯化方法是将收集的鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS 缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后即为纯化的卵黄抗体。

本发明的猪传染性胃肠炎病毒TGEV-BD株是从河北一发病猪场分离到的目前流行的强毒株，该毒株具有毒力稳定，免疫原性好，毒力强等优点。

本发明的猪传染性胃肠炎病毒TGEV-BD株，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.13856，保藏时间是2017年06月07日。

采用本发明方法制备的猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体具有安全、特异性高、治疗效果好、生产成本低等优点，可有效防治猪传染性胃肠炎病毒引起的疾病，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 猪传染性胃肠炎病毒接种到ST上的病变图片。图中，1为未接种的空白细胞对照，2为接种后的细胞病变。

图2 目的基因PCR 扩增的结果。其中M：Marker DL2000；1：PCR 扩增产物；2：阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 猪传染性胃肠炎病毒TGEV-BD株病毒液的制备

将河北一发病猪场猪传染性胃肠炎阳性小肠病料经过冻融、过滤后，按照10% 的比例接种于常规方法培养的长满单层的ST细胞，37℃吸附1小时，换维持液，37℃温箱培养72h。如此操作盲传至第3代时，出现细胞圆缩、颗粒增加、聚堆、脱落等CPE 现象（图1）。

根据GenBank中传染性胃肠炎病毒N基因序列为模板，用软件Primer5.0设计了一对特异性引物：TGEV-P1：5’-AGACAAACTCGCTATCGCATGG-3’；TGEV-P2：5’-TCTTGTCACATCACCTTTACCTGC-3’，以94℃ 7min，94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 45s，反应35个循环，最后72℃延伸7min。用细胞培养所得到的病毒液经RT-PCR后，扩增N基因目的片段为528bp，结果见图2。

根据现行《中国兽药典》附录对病毒液进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。将得到的第6代猪传染性胃肠炎病毒强毒株命名为TGEV-BD株，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.13856，保藏时间是2017年06月07日。

将猪传染性胃肠炎病毒液按1%接种在长满单层的ST细胞上，置于37℃，CO₂培养箱中培养，待85％细胞出现细胞病变时收毒，反复冻融3次，然后5000rpm 离心5min，除去细胞碎片，收集上清液，所得上清液中的病毒量为≥10^7.5TCID₅₀/ml。-20℃保存备用。

实施例2 猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗制备

取上述猪传染性胃肠炎病毒液，按照0.1%浓度加入β-丙内酯，混合均匀后在4℃条件下放置18h，取出后放置在37℃条件下2h失活，之后分别按照1:1的体积比加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，用三通注射器进行乳化，分别制备成含有弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗，4℃保存备用。

实施例3 卵黄抗体制备

取20周龄产蛋母鸡，采用胸部肌肉分点注射，首次使用弗氏完全佐剂乳化的疫苗，免疫剂量为1ml/只，于免疫后14d、28d 使用弗氏不完全佐剂乳化的疫苗分别进行二免和三免，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后１周开始每日收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中猪传染性胃肠炎病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液。

将收集的鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS 缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后即为纯化的卵黄抗体，经测定纯化后的卵黄抗体抗体效价不小于1:512。

实施例4 临床治疗效果试验

对临床猪场中疑似猪传染性胃肠炎感染，经过棉拭子采集粪便用RT-PCR检测为阳性的病猪进行确诊，取发病猪40头，随群饲养，并随机分为4组，每组10头，第1组使用本发明制备的卵黄抗体，第2组使用哈尔滨维科生物技术开发公司的猪传染性胃肠炎（经典株）、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗（批号：2015109）制备的卵黄抗体，第3组使用福州大北农生物技术有限公司的猪传染性胃肠炎（流行株）、猪流行性腹泻二联活疫苗（批号：2015004）制备的卵黄抗体，第4组使用生理盐水。其中第1、2、3组每头每次肌肉注射卵黄抗体2ml，每天2次，连用3日；第4组按同样方法肌肉注射生理盐水。分别观察使用卵黄抗体后7日内的治愈和死亡情况。

表1 不同卵黄抗体临床治疗效果比较

组别

第1天

第2天

第3天

第4天

第5天

第6天

第7天

死亡率

1

0/10

1/10

10%

2

0/10

1/10

2/10

4/10

5/10

50%

3

0/10

1/10

3/10

30%

4

3/10

5/10

8/10

9/10

90%

注：表中x/y表示每日发病死亡头数/每组总头数

从表1中可以看出，在猪群发病并被确诊为猪传染性胃肠炎感染后，使用本发明制备的卵黄抗体，死亡率仅为10%，明显低于其它两治疗组的50%和30%，而对照组的死亡率为90%，由此可见，本发明制备的卵黄抗体对临床上猪传染性胃肠炎感染有很好的治疗效果，治疗效果高达90%，远远高于市场上的其它经典或流行毒株制备的卵黄抗体。

实施例5 临床预防效果试验

在进行上述试验的猪场中，取未发病的同窝或同群易感猪40头，随群饲养，分组方式与实施例4中的完全相同，并用相同方式对试验组和对照组分别肌肉注射卵黄抗体和生理盐水，观察使用卵黄抗体7日内的治愈和死亡情况。

表2 不同卵黄抗体临床预防效果比较

级别

第1天

第2天

第3天

第4天

第5天

第6天

第7天

死亡率

1

0/10

0%

2

0/10

1/10

2/10

3/10

30%

3

0/10

1/10

2/10

20%

4

0/10

2/10

5/10

7/10

70%

注：表中x/y表示每日发病死亡头数/每组总头数

从表2中可以看出，在发生猪传染性胃肠炎感染的猪群中，对未发病的同窝或同群易感猪使用本发明制备的卵黄抗体，死亡率为0%，明显低于其它两组的30%和20%，对照组的死亡率为70%。由此可见，本发明制备的卵黄抗体对临床上猪传染性胃肠炎感染发生后同窝或同群易感猪有很好的预防效果，且预防效果为100%，远远高于市场上的其它经典或流行毒株制备的卵黄抗体。

Claims

1.一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，采用灭活的保藏编号为CGMCC No.13856的猪传染性胃肠炎病毒TGEV-BD株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒抗原的制备方法为：将猪传染性胃肠炎病毒液按1%接种在长满单层的ST 细胞上，置于37℃、CO₂培养箱中培养，待85％细胞出现细胞病变时收毒，反复冻融3次，然后5000rpm 离心5min，除去细胞碎片，收集上清液，所得上清液中的病毒量为≥ 10^7.5TCID₅₀/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒灭活方法是使用0.1%浓度的β-丙内酯，4℃条件下放置18h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒乳化使用的佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，抗原与佐剂混合的体积比例为1:1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的免疫蛋鸡的方法是将灭活后的抗原与佐剂按1:1 的体积比混合乳化后，免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化疫苗，免疫剂量为1ml/只，于免疫后14d、28d 改为弗氏不完全佐剂乳化疫苗进行二免和三免，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后1周开始每日收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中猪传染性胃肠炎病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体的制备。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体纯化方法是将收集的鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的0.01M，pH7.2 的PBS 缓冲液和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm 滤膜过滤后即为纯化的卵黄抗体。

7.权利要求1~6所述方法获得的卵黄抗体在制备用于治疗和预防猪传染性胃肠炎的药物中的应用。