CN113929775A - 用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法 - Google Patents

用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法，所述方法包括：将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒分别超滤浓缩后经BEI灭活，获得猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原和猪丁型冠状病毒抗原，并按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)混匀，后与佐剂混匀，获得油包水型疫苗，免疫商品蛋鸡，收集所产鸡蛋；清洗并分离收集蛋黄液，后在所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体。所述蛋黄抗体对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价均不低于1:1000；一剂多防多治、可防可治，应用范围广。

Description

用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻是猪的常见的急性、接触性肠道传染病，各年龄段猪群均可感染，以呕吐和腹泻为主要症状，日龄越小的仔猪发病后死亡率越高，最高可达100％，其病原分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒。猪丁型冠状病毒感染可引起仔猪呕吐、严重腹泻、食欲下降等症状，严重影响猪群的生长发育。此三种疾病可造成猪场严重的经济损失，除加强饲养管理外，常用的预防方法为疫苗免疫，可选的市售疫苗种类很多，免疫母猪保护仔猪或免疫仔猪等防疫方案也不尽相同。仔猪腹泻治疗方案多为加强护理、对症用药。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒感染是仔猪阶段常见的腹泻性疾病，可引起仔猪死亡或生产性能下降。生猪生产中会用到多种疫苗进行防疫，一旦发病，主要以对症治疗为主，无特效药品。
兽用生物制品中常用的治疗性抗体多为蛋黄抗体。蛋黄抗体是将抗原制成疫苗免疫产蛋鸡，采集针对该病具有中和能力的蛋黄，经过适当处理，接种易感动物，用于预防或治疗该病。然而现有技术中尚没有效价高的用于预防和/或治疗猪所述3种常见的腹泻性疾病的蛋黄抗体。
因此，急需开发一种效价高的用于预防和/或治疗猪所述常见腹泻性疾病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法，制备的蛋黄抗体对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价，结果分别为1:1218、1:1218、1:1024；一剂多防、一剂多治、可防可治，应用范围广。
在本发明的第一方面，提供了一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，所述方法包括：
将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒分别超滤浓缩后经BEI灭活，获得猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原和猪丁型冠状病毒抗原；
将所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)混匀获得复合抗原液；后将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗；
将所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡，收集所产鸡蛋；
清洗所述鸡蛋并分离收集蛋黄液，后在所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体。
进一步地，所述BEI的终浓度为4～6mM。
进一步地，所述将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗，包括：
将以重量份数计的95～97份所述复合抗原液与3～5份灭菌吐温-80溶解混匀，获得水相；
将以重量份数计的93～95份注射用白油与5～7份司本-80混匀，加热条件下边加边搅拌至透明为止，并高压灭菌，获得油相；
将所述水相与所述油相以体积比为1：(1.5～2.5)混匀并乳化，获得油包水型疫苗。
进一步地，所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡的次数为4～5次。
进一步地，所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原的体积比为1：1：1。
进一步地，每2周抽样检测所述收集的所产鸡蛋的蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价，中和抗体效价均≥1：512时收集蛋黄液。
进一步地，所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体，包括：
将所述蛋黄液稀释和灭活，获得灭活蛋黄液；
将所述灭活蛋黄液加入5～7倍体积pH为4.5～5.5的酸化水进行酸化，后进行第一固液分离，获得第一液体；
将所述第一液体灭活后，进行第二固液分离，获得第二液体；
将所述第二液体依次进行浓缩、过滤除菌和灭活，获得蛋黄抗体。
在本发明的第二方面，本发明提供了采用所述方法制备获得的用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体制剂，包括所述的蛋黄抗体。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法，本发明实施例中制备的蛋黄抗体对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价，结果分别为1:1218、1:1218、1:1024；一剂多防、一剂多治、可防可治，应用范围广。根据具体情况注射或口服给药方式，使用方法灵活。特别是1-3日龄口服给药，预防仔猪发病，使易感期、死亡高风险期的仔猪获得有效保护。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明提供的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法，总体思路如下：
现有技术中，禽用蛋黄抗体的制备工艺中使用的疫苗抗原均以甲醛作为灭活剂，抗体效价会达到最高。
然而本申请的将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒分别超滤浓缩后经甲醛灭活，获得猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原和猪丁型冠状病毒抗原的效价不高。
本申请发明人对此分析：甲醛作为灭活剂在禽用灭活疫苗中普遍使用，是基于其具有的以下优势。首先，其灭活效果确实；其次，甲醛可灭活鸡胚生产抗原中引入的少量细菌，提高疫苗安全性；再者，禽类对甲醛有一定的耐受性，产生的副反应在可接受的范围内。甲醛作为灭活剂也存在不足，甲醛作用于病毒蛋白，使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，病原体蛋白的抗原性会遭到破坏，有效免疫抗原会发生较大的损失，以此制备疫苗免疫鸡，抗体效价低。如果以产生更高抗体为评价标准，可能存在比甲醛更优的灭活剂。烷化剂类灭活剂，烷化微生物DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋链交联及干扰酶系统和核蛋白作用，从而破坏核酸代谢、合成，导致病毒核酸芯子破坏而达到灭活目的。因此，这类灭活剂能破坏病毒核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而又不损害其蛋白衣壳，得以保留其保护性抗原，故是制备灭活病毒疫苗较好的灭活剂(引自徐守振《动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展》)。
本申请通过实验发现，将甲醛替换为BEI灭活抗原制备的疫苗2次免疫后蛋黄抗体效价：甲醛灭活抗原制备的疫苗2次免疫后蛋黄抗体效价≈2，即抗原灭活剂由甲醛换为BEI后，获得的蛋黄抗体效价提高约1倍。
根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，如图1所示，所述方法包括：
S1、将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒分别超滤浓缩后经BEI灭活，获得猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原和猪丁型冠状病毒抗原；
S2、将所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)混匀获得复合抗原液；后将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗；
S3、将所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡，收集所产鸡蛋；
S4、清洗所述鸡蛋并分离收集蛋黄液，后在所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体。
本发明中，BEI灭活抗原提高蛋黄抗体效价，所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)会使疫苗在免疫商品蛋鸡后产生的针对三种病毒的抗体的中和效价相近，便于制备抗体制剂时确定最适的稀释或浓缩倍数，体积比优选为1：1：1，若体积比不在所述范围内针对三种病毒的抗体的中和效价不整齐，需要按最低的中和效价确定稀释或浓缩倍数，对另外两个高的病毒中和效价抗体是一种浪费。
作为一种优选的实施方式，所述超滤浓缩的倍数为3～10倍。
作为一种优选的实施方式，所述BEI的终浓度为4～6mM。所述BEI的终浓度若小于4mM需延长灭活时长；若所述BEI的终浓度大于6mM需增加试剂成本；
作为一种优选的实施方式，所述将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗，包括：
将以重量份数计的95～97份所述复合抗原液与3～5份灭菌吐温-80溶解混匀，获得水相；
将以重量份数计的93～95份注射用白油与5～7份司本-80混匀，加热条件下边加边搅拌至透明为止，并高压灭菌，获得油相；
将所述水相与所述油相以体积比为1：(1.5～2.5)混匀并乳化，获得油包水型疫苗。
上述技术方案中，所述水相的制备中采用95～97份所述复合抗原液与3～5份灭菌吐温-80，该重量比有利于疫苗剂型成立；所述油相的制备中采用93～95份注射用白油与5～7份司本-80混匀，该重量比有利于疫苗剂型成立；最后所述水相与所述油相以体积比为1：(1.5～2.5)可使疫苗剂型成立、使疫苗黏度适中、使成本较高的抗原用量适中、使制备的疫苗免疫鸡后能够产生较高的抗体效价。
作为一种优选的实施方式，所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡的次数为4～5次。现有技术中禽用蛋黄抗体的制备工艺中疫苗免疫商品蛋鸡2～3次，抗体效价会达到最高，然而本申请发明人通过实验发现与现有技术不同的是，免疫4～5次提高蛋黄抗体效价，经分析可能原因为：病毒感染本宿主(靶动物)会引起本宿主产生强烈的免疫反应，快速产生针对病毒的抗体；病毒感染非本宿主(非靶动物)产生的免疫反应弱，产生的抗体效价低、时间晚，甚至不产生抗体。与活病毒感染产生抗体的情形类似，灭活疫苗免疫非靶动物产生的免疫反应弱。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒的天然宿主并非是鸡，因此，鸡接种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒疫苗2～3次后产生的抗体效价并未达到峰值，增加疫苗免疫次数抗体效价有继续升高的可能。
作为一种具体的实施方式，所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体，包括：
将所述蛋黄液稀释和灭活，获得灭活蛋黄液；
将所述灭活蛋黄液加入5～7倍体积pH为4.5～5.5的酸化水进行酸化，后进行第一固液分离，获得第一液体；
将所述第一液体灭活后，进行第二固液分离，获得第二液体；
将所述第二液体依次进行浓缩、过滤除菌和灭活，获得蛋黄抗体。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种采用所述方法制备获得的用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体制剂，包括所述的蛋黄抗体。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法与应用效果进行详细说明。
实验例1、不同灭活剂灭活抗原制备疫苗免疫实验鸡，蛋黄抗体效价比较
1、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒抗原的制备
1)甲醛灭活猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒抗原
猪传染性胃肠炎抗原的制备：用ST细胞培养猪传染性胃肠炎病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度0.1％的甲醛溶液37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪流行性腹泻抗原的制备：用Vero细胞培养猪流行性腹泻病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度0.1％的甲醛溶液37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪丁型冠状病毒抗原的制备：用PK15细胞培养猪丁型冠状病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度0.1％的甲醛溶液37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
2)二乙烯亚胺(BEI)灭活猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒抗原
猪传染性胃肠炎抗原的制备：用ST细胞培养猪传染性胃肠炎病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺(BEI)37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪流行性腹泻抗原的制备：用Vero细胞培养猪流行性腹泻病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪丁型冠状病毒抗原的制备：用PK15细胞培养猪丁型冠状病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
2、疫苗的制备
甲醛灭活的抗原和BEI灭活的抗原分别按下述方法制备水相，在分别制成疫苗，简称甲醛灭活疫苗、BEI灭活疫苗。
制备水相：猪传染性胃肠炎抗原:猪流行性腹泻抗原:猪丁型冠状病毒抗原＝1:1:1的比例混合，作为抗原；取抗原液96份，向抗原液中加入灭菌吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
制备油相：取注射用白油94份，向射用白油中加司本-80 6份混合，加热条件下边加边搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相与油相1:2混合，在剪切机中以10000转/分钟乳化10分钟，制备成油包水型疫苗。
3、免疫
甲醛灭活疫苗、BEI灭活疫苗分别免疫50周龄的商品蛋鸡，颈部皮下注射，0.5ml/只；首免后2周胸部肌肉注射加强免疫(二次免疫)，剂量同首次免疫；收集二免后14日所产鸡蛋用以制备蛋黄抗体。
4、检测蛋黄中和抗体效价
1)随机选取10枚鸡蛋，将蛋黄混合；
2)氯仿法提取蛋黄抗体：1ml蛋黄加1ml生理盐水混合均匀，再加4ml氯仿，充分混匀，室温静置1小时，5000rpm 30min离心，上清即为提取获得的蛋黄抗体；此蛋黄抗体为原蛋黄样品做了2倍稀释。
3)检测蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪传染性胃肠炎病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100(原倍，不做稀释)、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的ST细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种ST细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种ST细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常ST细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
4)检测蛋黄对猪流行性腹泻病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪流行性腹泻病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的Vero细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常Vero细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
5)检测蛋黄对猪丁型冠状病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪丁型冠状病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶、1％胰液素的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的PK1细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常PK1细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第3天(接种后72小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
6)中和效价测定结果
经检测，甲醛灭活疫苗免疫鸡获得的蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价分别为1:6、1:8、1:5；BEI灭活疫苗免疫鸡获得的蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价分别为1:23、1:19、1:27。
表1
Figure BDA0003321285450000081
市售禽用全病毒灭活疫苗(包括用于制备禽用蛋黄抗体的禽用全病毒灭活疫苗)均使用甲醛作为抗原的灭活剂。BEI灭活抗原制备的疫苗2次免疫后蛋黄抗体效价÷甲醛灭活抗原制备的疫苗2次免疫后蛋黄抗体效价≈2，即抗原灭活剂由甲醛换为BEI后，获得的蛋黄抗体效价提高约1倍。
实验例2、不同免疫程序免疫实验鸡，蛋黄抗体效价比较
1、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒抗原的制备
猪传染性胃肠炎抗原的制备：用ST细胞培养猪传染性胃肠炎病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺(BEI)37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪流行性腹泻抗原的制备：用Vero细胞培养猪流行性腹泻病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪丁型冠状病毒抗原的制备：用PK15细胞培养猪丁型冠状病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
2、疫苗的制备
制备水相：猪传染性胃肠炎抗原:猪流行性腹泻抗原:猪丁型冠状病毒抗原＝1:1:1的比例混合，作为抗原；取抗原液96份，向抗原液中加入灭菌吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
制备油相：取注射用白油94份，向射用白油中加司本-80 6份混合，加热条件下边加边搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相与油相1:2混合，在剪切机中以10000转/分钟乳化10分钟，制备成油包水型疫苗。
3、免疫
疫苗免疫50周龄的商品蛋鸡，颈部皮下注射，0.5ml/只；首免后2周胸部肌肉注射加强免疫(二次免疫)，剂量同首次免疫；二次免疫后3周腿部肌肉注射加强免疫(三次免疫)，剂量同首次免疫；三次免疫后3周腿部肌肉注射加强免疫(四次免疫)，剂量同首次免疫；四次免疫后3周腿部肌肉注射加强免疫(五次免疫)，剂量同首次免疫；分别收集二、三、四、五免后14日所产鸡蛋用以制备蛋黄抗体。
4、检测蛋黄中和抗体效价
1)随机选取10枚鸡蛋，将蛋黄混合；
2)氯仿法提取蛋黄抗体：1ml蛋黄加1ml生理盐水混合均匀，再加4ml氯仿，充分混匀，室温静置1小时，5000rpm 30min离心，上清即为提取获得的蛋黄抗体；此蛋黄抗体为原蛋黄样品做了2倍稀释。
3)检测蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、…、1:2048。选择其中适宜稀释度的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪传染性胃肠炎病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100(原倍，不做稀释)、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的ST细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种ST细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种ST细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常ST细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
4)检测蛋黄对猪流行性腹泻病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、…、1:2048。选择其中适宜稀释度的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪流行性腹泻病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的Vero细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常Vero细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
5)检测蛋黄对猪丁型冠状病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:2、1:4、…、1:2048。选择其中适宜稀释度的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪丁型冠状病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶、1％胰液素的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的PK1细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常PK1细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第3天(接种后72小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
6)中和效价测定结果
经检测，2、3、4、5次免疫后14日蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价见下表。
表2
Figure BDA0003321285450000111
由表2可知，蛋黄抗体效价：4次免疫≈5次免疫＞3次免疫的＞2次免疫，说明有蛋黄抗体效价在4免后达到峰值，不同于禽苗的2、3次免疫即达到峰值的情况。
实施例1、用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体、制剂及其制备方法
由实验例1和实验例2，确定猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒蛋黄抗体的制备工艺中使用的疫苗抗原以BEI作为灭活剂，疫苗免疫商品蛋鸡4-5次，抗体效价会达到最高。以此工艺制备的蛋黄抗体的效价比常规禽用蛋黄抗体制备工艺制备的效价高约10倍。具体操作步骤为：
1、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒抗原的制备
猪传染性胃肠炎抗原的制备：用ST细胞培养猪传染性胃肠炎病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺(BEI)37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪流行性腹泻抗原的制备：用Vero细胞培养猪流行性腹泻病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
猪丁型冠状病毒抗原的制备：用PK15细胞培养猪丁型冠状病毒，当出现80％细胞病变时，收集细胞培养上清超滤浓缩至原培养体积1/6，终浓度5mM的二乙烯亚胺37℃灭活24h，无菌检验、灭活检验合格后备用；
2、疫苗的制备
制备水相：猪传染性胃肠炎抗原:猪流行性腹泻抗原:猪丁型冠状病毒抗原＝1:1:1的比例混合，作为抗原；取抗原液96份，向抗原液中加入灭菌吐温-80 4份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。
制备油相：取注射用白油94份，向射用白油中加司本-80 6份混合，加热条件下边加边搅拌至透明为止，高压灭菌备用。
水相与油相1:2混合，在剪切机中以10000转/分钟乳化10分钟，制备成油包水型疫苗。
3、免疫
疫苗免疫8周龄的商品蛋鸡，颈部皮下注射，0.5ml/只；首免后2周胸部肌肉注射加强免疫(二次免疫)，剂量同首次免疫；二次免疫后3周腿部肌肉注射加强免疫(三次免疫)，剂量同首次免疫；16周龄时颈部皮下注射加强免疫(四次免疫)，剂量同首次免疫；收集四免后所产鸡蛋用以制备蛋黄抗体。
4、检测蛋黄中和抗体效价
1)随机选取10枚鸡蛋，将蛋黄混合；
2)氯仿法提取蛋黄抗体：1ml蛋黄加1ml生理盐水混合均匀，再加4ml氯仿，充分混匀，室温静置1小时，5000rpm 30min离心，上清即为提取获得的蛋黄抗体；此蛋黄抗体为原蛋黄样品做了2倍稀释。
3)检测蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪传染性胃肠炎病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100(原倍，不做稀释)、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的ST细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种ST细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种ST细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常ST细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
4)检测蛋黄对猪流行性腹泻病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪流行性腹泻病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的Vero细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种Vero细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常Vero细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第5天(接种后120小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
5)检测蛋黄对猪丁型冠状病毒的中和抗体效价
被检样品：用DMEM无血清培养基将蛋黄作2倍倍比稀释，使其稀释度依次为1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048。将倍比稀释的蛋黄分别与100TCID50/0.1ml的猪丁型冠状病毒等体积混合，37℃中和1小时。
复测病毒：将100TCID50/0.1ml病毒液用含10μg/ml胰酶、1％胰液素的DMEM(维持液)做10倍系列稀释，即100、10-1、10-2、10-3稀释病毒液待用。
96孔板中长成单层的PK1细胞，弃去细胞生长液(含8％血清的DMEM)，各孔加入0.1mlDMEM无血清培养基，弃去。各稀释度被检样品接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.2ml/孔；37℃孵育1小时，弃去，加入维持液0.1ml/孔；各稀释度的复测病毒接种PK1细胞，6孔/稀释度，0.1ml/孔；同时设置正常PK1细胞对照6孔，加入维持液，0.1ml/孔。
第3天(接种后72小时)判定结果。复测病毒为30～300TCID50/0.1ml，正常细胞对照健活，试验成立。以被检样品细胞病变(CPE)结果，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。所得抗体效价乘2即为原蛋黄样品的抗体效价。
6)中和效价测定结果
经检测，蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价分别为1:1448、1:1722、1:1552。
5、制备蛋黄抗体
4免后鸡蛋50枚用于制备蛋黄抗体。
1)清洗鸡蛋：将鸡蛋浸入42℃0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。筛选出蛋壳污染严重的，用消毒水冲洗干净，再浸泡消毒1次。
2)分离蛋黄：蛋黄分离器分离蛋黄，蛋黄蛋清分离到两个不同的玻璃烧杯中。蛋黄表面蛋清、蛋黄系带尽量分离干净。
3)稀释蛋黄：充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状。加入等体积灭菌注射用水，搅拌均匀。
4)灭活1：水浴锅63℃加热灭活30分钟后，冷却至室温。
5)酸化：原蛋黄6倍体积pH为5.0的酸化水(用盐酸将pH值调为5.0的注射用水)，降温至4℃，将灭活1的蛋黄液加入其中，边加边搅拌，4℃静置过夜。
6)离心：用低温离心机7000转/分钟离心15分钟，收取上清。
7)灭活2：上清回复至室温(25℃)，在上清液中加入终浓度为0.3％的正辛酸，搅拌均匀，室温(25℃)放置5小时。
8)离心：用7000转/分钟离心15分钟，收取上清。
9)浓缩：超滤浓缩8倍。
10)过滤：用0.45μm滤器过滤澄清，再经孔径为0.22μm滤器过滤除菌。
11)灭活3：加入终浓度为0.2％甲醛溶液于上述溶液中，充分搅拌均匀，室温放置24小时，期间振摇6次。
6、蛋黄抗体检测
1)无菌检测
制备的蛋黄抗体接种TG、TSB、GA、GP无菌检验用培养基，培养7日均无菌生长。
2)效价检测
按4的3)、4)、5)方法检测制备的蛋黄抗体对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价，结果分别为1:1218、1:1218、1:1024。
应用例1、预防试验
1、实验方法：
健康易感的初生仔猪(无猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病母源抗体和病原体的母猪所产)21头，随机分为7组，每组3头。
3个预防攻毒组：1日龄出生仔猪口服蛋黄抗体，1ml/头；2日龄、3日龄时分别口服1ml/头的实施例1制备得到的蛋黄抗体。5日龄时分别口服猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒，10LD/ml，1ml/头；猪丁型冠状病毒，10ID/ml，1ml/头。
3个攻毒对照组：5日龄时分别口服猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒，10LD/ml，1ml/头；猪丁型冠状病毒，10ID/ml，1ml/头。
1个不攻毒组：不口服实施例1制备得到的蛋黄抗体、不口服猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病病毒。与预防攻毒组和攻毒对照组隔离饲养。
2、实验结果：
3个预防攻毒组：猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丁型冠状病毒实验组均为0/3发病，0/3死亡。
3个攻毒对照组：猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻实验组均为3/3发病，3/3死亡；猪丁型冠状病组为3/3发病、0/3死亡。
1个不攻毒组：为0/3发病，0/3死亡。
表3
Figure BDA0003321285450000151
注：攻毒列“/”表示未攻毒；预防列“/”表示未免疫
应用例2、治疗试验
1、实验方法：
健康易感的初生仔猪(无猪丁型冠状病母源抗体和病原体的母猪所产)11头，随机分为4组。组1、组2、组3，每组3头；组4，2头(见下表)。
组1：5日龄时口服猪丁型冠状病毒，10ID/ml，1ml/头。
组2：5日龄时口服猪丁型冠状病毒，10ID/ml，1ml/头。6日龄时(口服猪丁型冠状病病毒后1日)肌肉注射实施例1制备得到的蛋黄抗体，1ml/头，口服蛋黄抗体，2ml/头。如出现腹泻、呕吐，按上述给药剂量1-3日。
组3：5日龄时口服猪丁型冠状病毒，10ID/ml，1ml/头。发现腹泻、呕吐等发病症状后，肌肉注射蛋黄抗体，1ml/头，口服蛋黄抗体，2ml/头，每日1次。根据临床症状上述给药剂量给药1-3日。
组4：不攻毒、不治疗。与攻毒组隔离饲养。
2、实验结果：
组1：口服猪丁型冠状病毒后1头2日时出现腹泻、1头3日时出现腹泻，病程2-3日，后逐渐恢复食欲，实验猪与组4相比明显消瘦。
组2：实验期间未出现腹泻、呕吐等临床症状。
组3：口服猪丁型冠状病毒后1头2日时出现呕吐及腹泻、1头2日时出现腹泻、1头2日时出现腹泻。使用蛋黄抗体后1-2日无呕吐和腹泻症状。
组4：未出现临床症状。
表4
Figure BDA0003321285450000161
注：攻毒列“/”表示未攻毒；治疗列“/”表示未治疗；病程列“/”表示未发病
应用例3、治疗试验
1、实验方法：
健康易感的初生仔猪(无猪流行性腹泻母源抗体和病原体的母猪所产)8头，随机分为4组。组1、组2，每组3头；组3，2头。
组1：5日龄时口服猪流行性腹泻病毒，分别为10LD/ml，1ml/头。
组2：5日龄时口服猪流行性腹泻病毒，分别为10LD/ml，1ml/头。发现腹泻等发病症状后，肌肉注射实施例1制备得到的蛋黄抗体，1ml/头，口服蛋黄抗体，2ml/头，每日1次。根据临床症状上述给药剂量给药3-5日。
组3：不攻毒、不治疗。与攻毒组隔离饲养。
2、实验结果：
组1：口服猪流行性腹泻病毒后3头1日时出现腹泻，分别于2-3日死亡。
组2：口服猪流行性腹泻病毒后3头1日时出现呕吐及腹泻，使用蛋黄抗体后1日腹泻症状减轻，2-5日逐渐康复。
组3：未出现临床症状。
表5
组别 攻毒 治疗 死亡/总数
1 猪流行性腹泻病毒 / 3/3
2 猪流行性腹泻病毒 发病后注射、口服蛋黄抗体 0/3
3 / / 0/2
注：攻毒列“/”表示未攻毒；治疗列“/”表示未治疗
应用例4、治疗试验
1)实验方法：
健康易感的初生仔猪(无猪传染性胃肠炎母源抗体和病原体的母猪所产)8头，随机分为4组。组1、组2，每组3头；组3，2头(见下表)。
组1：5日龄时口服猪传染性胃肠炎病毒，分别为10LD/ml，1ml/头。
组2：5日龄时口服猪传染性胃肠炎病毒，分别为10LD/ml，1ml/头。发现腹泻等发病症状后，肌肉注射实施例1制备得到的蛋黄抗体，1ml/头，口服蛋黄抗体，2ml/头，每日1次。根据临床症状上述给药剂量给药3-5日。
组3：不攻毒、不治疗。与攻毒组隔离饲养。
2)实验结果：
组1：口服猪传染性胃肠炎病毒后3头1日时出现腹泻，分别于2-3日死亡。
组2：口服猪传染性胃肠炎病毒后3头1日时出现呕吐及腹泻，使用蛋黄抗体后1日腹泻症状减轻，2-5日逐渐康复。
组3：未出现临床症状。
表6
组别 攻毒 治疗 死亡/总数
1 猪传染性胃肠炎病毒 / 3/3
2 猪传染性胃肠炎病毒 发病后注射、口服蛋黄抗体 0/3
3 / / 0/2
注：攻毒列“/”表示未攻毒；治疗列“/”表示未治疗
由应用例1-4的表3-表6的数据可知，实施例1制备的蛋黄抗体使用效果好。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒分别超滤浓缩后经BEI灭活，获得猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原和猪丁型冠状病毒抗原；
将所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原按体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)混匀获得复合抗原液；后将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗；
将所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡，收集所产鸡蛋；
清洗所述鸡蛋并分离收集蛋黄液，后在所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述BEI的终浓度为4～6mM。
3.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述将所述复合抗原液与佐剂混匀，获得油包水型疫苗，包括：
将以重量份数计的95～97份所述复合抗原液与3～5份灭菌吐温-80溶解混匀，获得水相；
将以重量份数计的93～95份注射用白油与5～7份司本-80混匀，加热条件下边加边搅拌至透明为止，并高压灭菌，获得油相；
将所述水相与所述油相以体积比为1：(1.5～2.5)混匀并乳化，获得油包水型疫苗。
4.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述油包水型疫苗免疫商品蛋鸡的次数为4～5次。
5.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒抗原、所述猪流行性腹泻病毒抗原和所述猪丁型冠状病毒抗原的体积比为1：1：1。
6.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，每2周抽样检测所述收集的所产鸡蛋的蛋黄对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒的中和抗体效价，中和抗体效价均≥1：512时收集蛋黄液。
7.根据权利要求1所述的一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，所述蛋黄液中提取获得蛋黄抗体，包括：
将所述蛋黄液稀释和灭活，获得灭活蛋黄液；
将所述灭活蛋黄液加入5～7倍体积pH为4.5～5.5的酸化水进行酸化，后进行第一固液分离，获得第一液体；
将所述第一液体灭活后，进行第二固液分离，获得第二液体；
将所述第二液体依次进行浓缩、过滤除菌和灭活，获得蛋黄抗体。
8.一种采用权利要求1-7任一所述方法制备获得的用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体。
9.一种用于预防和/或治疗猪腹泻病的蛋黄抗体制剂，其特征在于，包括权利要求8所述的蛋黄抗体。
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