CN116966290B - 猪流行性腹泻灭活疫苗制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻灭活疫苗制备方法及其应用，属于兽用生物制品领域。本发明要解决的技术问题是：如何有效的预防猪流行性腹泻病毒所引起的猪腹泻。为解决该技术问题，本发明提供一种猪流行性腹泻灭活疫苗及其制备方法，所述疫苗包含灭活的猪流行性腹泻病毒。本发明所提供的疫苗能够有效预防由猪流行性腹泻病毒引起的猪腹泻。

Description

猪流行性腹泻灭活疫苗制备方法及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，涉及兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻灭活疫苗制备方法及其应用。

背景技术

猪腹泻是一种常见的影响猪生长最明显的多因素疾病，其发病率和死亡率高而造成巨大经济损失。引起仔猪腹泻的重要病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒等。

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)感染引起的猪的一种急性肠道传染病。在我国多发生在每年12月份至翌年1～2月，夏季也有发病的报道。各种年龄的猪都能感染发病。哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，尤以哺乳猪受害最为严重，母猪发病率变动很大，约为15～90％。主要的临床症状为粪便稀薄、水样腹泻，偶见呕吐。症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重。一周龄内新生仔猪发生腹泻后3～4天，呈现严重脱水而死亡，严重时死亡率可达50％以上。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻大约一周，并逐渐恢复正常。

针对猪流行性腹泻的防控主要是商品化的疫苗，目前国内外有多款针对猪流行性腹泻的疫苗。疫苗主要分为灭活疫苗和活疫苗，且多以猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联疫苗为主，也有猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒三联活疫苗和猪流行性腹泻灭活疫苗。其中猪流行性腹泻疫苗毒株主要为CV777疫苗毒株为主，也有AJ1102-R株、SCSZ-1株、ZJ08株、XJ-DB2株等地方变异毒株。

本研究组从2013年开始，对浙江周边的24个地区的腹泻进行病原学调查发现，造成仔猪腹泻的主要为猪流行性腹泻病毒(183/282＝64.89％)，且以变异毒株为主。因此，需要开发一种变异毒株的疫苗以用于猪流行性腹泻的防控。

发明内容

本申请要解决的技术问题是：如何有效的预防猪流行性腹泻病毒所引起的猪腹泻。

为解决该技术问题，本申请提供了一种猪流行性腹泻灭活疫苗及其制备方法。

一方面，本发明一方面提供了一种猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1)使用ST全悬浮细胞培养猪传猪流行性腹泻病毒ZJ/15株，获得病毒的培养液；

S2)将S1)制备的病毒的培养液灭活，获得灭活的病毒的培养液；使用除菌PBS缓冲液将灭活的病毒液稀释至107.0TCID50/ml，作为抗原液；

S3)将S2)制备的抗原液与佐剂按质量比为1:1的比例混合乳化，获得猪流行性腹泻灭活疫苗。

优选地，本发明所述的步骤S1)中使用ST全悬浮细胞培养猪传猪流行性腹泻病毒ZJ/15株包括以下步骤：

1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；

2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，当细胞密度达4～6×106个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×106个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，培养48～54小时收获细胞培养物；

3)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。

优选地，本发明所述的ST全悬浮细胞是在中国典型培养物保藏中心保藏的ST全悬浮细胞，其保藏编号为：CCTCC NO:C2023179。

优选地，本发明所述猪流行性腹泻病毒ZJ/15株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201624。

优选地，本发明所述佐剂为双向佐剂，所述双向佐剂为含有1μg/ml的蜂胶黄酮的ISA 201佐剂。

再一方面，本发明还提供了一种猪流行性腹泻灭活疫苗，所述猪流行性腹泻灭活疫苗的活性成分为使用所述的ST全悬浮细胞制备的猪流行性腹泻病毒ZJ/15株。

再一方面，本发明还提供了一种所述的ST全悬浮细胞在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

本申请开发的疫苗具有以下特点：猪流行性腹泻病毒ZJ/15株为中国主要流行毒株之一，对野毒具有良好的保护力；使用ST全悬浮细胞实现无血清全悬浮生产、抗原含量高、批次间稳定；使用双向佐剂，安全性好；诱导中和抗体能力强，免疫效果好。同时，本申请为猪相关病毒性腹泻的防治提供了实验依据和解决方案。本申请还掌握猪流行性腹泻病毒全悬浮无血清发酵罐培养工艺、疫苗配制和免疫效果评价等相关技术，为进一步探究该病的病原学及防控奠定了基础。另外，本发明在ISA 201佐剂的基础上增加了蜂胶黄酮，进一步提高了该佐剂在猪流行腹泻灭活疫苗中的免疫效果，且用量很小(1μg/ml)。

需要说明的是，虽然本发明在实施例中使用猪流行性腹泻病毒ZJ/15株制备的是猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，但是，在猪流行性腹泻病毒ZJ/15株的基础上，本领域的技术人员可以通过连续传代导致猪流行性腹泻病毒ZJ/15株致弱，从而实现猪流行性腹泻病毒活疫苗的研制。因此，本发明的猪流行性腹泻病毒ZJ/15株在既可以用于制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，也可以用于制备猪流行性腹泻病毒活疫苗。

同样的，本发明的ST全悬浮细胞既可以用于猪流行性腹泻病毒ZJ/15株的生产，也可以用于其他猪流行性腹泻病毒的生产，如本申请人分离的猪流行性腹泻病毒JSCZ1601株(未保藏，其具体基因组序列参见GenBank:KY070587)也可以用本发明的ST全悬浮细胞进行培养生产。

需要说明的是，本发明申请单位之一“新昌县天姥实验室”为浙江大学与浙江省绍兴市新昌县共建的研究中心，其中本发明所用的“猪流行性腹泻病毒ZJ/15株”为本发明人之一的浙江大学李肖梁老师分离鉴定并保藏(保藏信息见本发明的保藏说明)，并于2016申请专利(专利申请号为201610547327.X)。本申请为三家申请单位合作研发的技术成果之一。因此，在本申请中，“猪流行性腹泻病毒ZJ/15株”是经过协议约定合法合规使用，没有知识产权纠纷和来源问题。

保藏说明

附图说明

无。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中无血清培养基购自甘肃健顺生物科技有限公司。

实施例1、猪流行性腹泻病毒ZJ/15株的分离与鉴定

猪流行性腹泻病毒ZJ15XS0101株(缩写为PEDVZJ/15株)由本研究组(浙江大学团队)分离鉴定，并于2016年申请专利并获得专利权，具体请见CN 106011084 B。

实施例2、猪流行性腹泻病毒ZJ/15株全悬浮培养条件的确定

2.1 ST全悬浮细胞复苏

从液氮罐中取出ST全悬浮细胞冻存管，立即放入37℃水浴，轻晃冻存管使液体尽快融化。将细胞悬浮液1000r/min离心5分钟。弃去上清液，每支冻存管用20ml培养基悬浮细胞于125ml三角瓶，置37℃、130r/min、含5％CO₂摇床培养；每日进行细胞计数，当细胞密度达4～6×10⁶个/ml时，按接种密度为1×10⁶个/ml进行扩大培养。

2.2 ST全悬浮细胞摇瓶培养工艺条件的筛选

当细胞长至4～6×10⁶个/ml时，用不同胰酶浓度(40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml)的无血清培养基将细胞密度调整为1.25×10⁶个/ml、2.5×10⁶个/ml、5.0×10⁶个/ml三种细胞密度。分别按MOI为0.005、0.01、0.05接毒，37℃、130r/min含5％CO₂摇床培养。每日进行细胞计数和活力测定，分别于36、42、48、54和60小时取样，冻融1次进行病毒含量测定和无菌检验，筛选病毒培养最佳工艺条件。

病毒含量测定：将毒种用含5μg/ml胰酶的DMEM培养液作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，分别接种长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，同时设置8孔正常细胞对照。每日观察，记录细胞病变(CPE)孔数，观察至96小时。按Reed-Müench法计算TCID₅₀。

结果显示：不同接毒量的猪流行性腹泻病毒ZJ/15株接种不同生长密度ST全悬浮细胞培养。在胰酶浓度为50～60μg/ml，细胞密度为2.5×10⁶～5×10⁶个/ml，MOI为0.005～0.01接毒剂量条件下，于48、54小时时间点取样的病毒含量均高于其它时间点，病毒含量为10^7.0～10^8.0TCID₅₀/ml。结果如表1。

为节约使用细胞，确定最优培养增殖条件：胰酶浓度50～60μg/ml，细胞密度2.5×10⁶个/ml，MOI为0.005～0.01，收获时间为48～54h，病毒滴度为10^7.5TCID₅₀/ml以上。

表1不同培养条件检测结果

2.3 ST全悬浮细胞15L反应器培养工艺条件的筛选

按照摸索的摇瓶工艺，进行15L生物反应器的放大，当细胞密度达4～6×10⁶个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×10⁶个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒。分别按温度37℃、pH7.0、7.2、7.4；DO 30％、40％、50％转速60r/min、80r/min、100r/min等参数进行培养。每日进行细胞计数和活力测定，培养48～54小时收毒，进行病毒含量测定和无菌检验，筛选病毒培养最佳工艺条件。

不同培养参数的猪流行性腹泻病毒ZJ/15株接种15L生物反应器进行培养。当细胞密度达4～6×10⁶个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×10⁶个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，当参数设置为：pH 7.2、DO 40～50％、温度37℃、转速80～100r/min培养48～54小时收毒，病毒含量均高于其它参数，病毒含量为≥10^7.5TCID₅₀/ml，结果如表2所示。

根据以上结果，确定最优培养增殖条件：当细胞密度达4～6×10⁶个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×10⁶个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，每日观察记录细胞密度，培养48～54小时进行收毒。

将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。

表2病毒最佳培养条件筛选结果

2.4 ST全悬浮细胞200L反应器培养工艺条件的验证

按照摸索的15L生物反应器上的接收毒工艺，在200L反应器中按照相同培养条件繁殖3批病毒液，每批约100L，三批病毒过柱澄清后含量分别为10^7.67TCID₅₀/ml、10^7.80TCID₅₀/ml、10^7.80TCID₅₀/ml。说明按照此摸索的工艺能完成工艺放大培养，且工艺稳定。

病毒过柱澄清：为方便工业化生产，我们选择过滤的方式去除细胞碎片(也有使用连续离心的方式去除，但连续离心设备昂贵，操作不方便，时间长，工业化生产成本高)，我们选择两级过滤，第一级过滤为过20μm滤膜，以去除大的细胞和碎片；第二级过滤为过1.5μm滤膜，以去除小的细胞碎片。过滤过程中均需要保证在无菌的条件的进行，因病毒液过0.22μm滤膜损失极大，也很容易堵塞，导致无法操作或成本奇高。整套过滤设备均为商品化采购，如thermofisher或默克或国产设备等均可满足需求。过滤后的滤液即为病毒液。

实施例3、疫苗制备

3.1病毒液灭活和检验

灭活：向检验合格的猪流行性腹泻病毒液(实施例2制备)中加入终浓度0.5‰β-丙内酯溶液，搅拌30分钟，将含0.5‰β-丙内酯溶液的病毒液输入至另一灭活容器中，置2～8℃下灭活24小时。灭活后的病毒液置37℃搅拌2小时，随后置2～8℃保存。

灭活检验：将灭活病毒液用含5.0μg/ml胰酶的DMEM培养液做10倍稀释，接种生长致密度85％～95％的Vero细胞25cm²方瓶3瓶，每瓶1.0ml。37℃吸附1小时，弃接种液，加含5.0μg/ml胰酶的DMEM培养液。同时设不接种的Vero细胞作对照。置37℃培养5日，观察细胞病变。冻融1次收获细胞培养液，再按上述方法盲传2代，灭活病毒液和对照细胞均应无细胞病变产生。

经检验，三种病毒液均灭活彻底。

3.2配苗

配苗前使用除菌PBS溶液将灭活好的病毒液10^7.0TCID₅₀/ml；将稀释好的病毒液与除菌双向佐剂(含1μg/ml蜂胶黄酮的ISA201佐剂，其中蜂胶黄酮可商品化采购或自制，自制可参考CN 102935091 A的实施例1～3)按照1:1的比例(质量比)混合于乳化缸内，低速搅拌30分钟。定量分装，分装时随时搅拌，使其混合均匀，加盖密封。置2～8℃保存备用。

按此配制方法，连续配制2批疫苗，每批疫苗5L，定量分装为50ml/瓶。同时使用上述方法，使用不含蜂胶黄酮的ISA201佐剂配制一批疫苗。

对上述三批疫苗进性状、黏度、稳定性和无菌进行检测，结果显示，三批疫苗性状均为均匀乳剂、黏度均小于30cP(25.3cP、26.2cP、24.5cP)、稳定性均很好(3000rpm离心10分钟无析出和分层)均无菌。说明三批疫苗物理性状均检验合格。

实施例4、安全性试验

每批疫苗用3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)5头，接种前观察2日，每日上午定时测定体温，取平均值作基础体温。各颈部肌肉接种2.0ml疫苗，接种后每日上午定时测定体温。观察14日，每日观察精神、食欲及接种部位反应等。

结果显示(表3)，三批疫苗免疫后，试验猪均未见精神、食欲和体温明显异常，接种部位无明显肿胀、溃烂。因此，三批疫苗安全试验全部合格。

表3安全性检验结果

实施例5、效力试验

中和抗体测定：用3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)5头，各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，接种21日后，连同对照猪5头一并采血，分离血清，测定猪流行性腹泻病毒中和抗体。结果显示，免疫组病毒的中和抗体均≥1:32(如表4所示)，对照组均≤1:4。说明，该疫苗的具有良好的免疫效果，免疫后均能产生较高的中和抗体，且第一批和第二批疫苗的中和抗体相对第三批要高，说明增加蜂胶黄酮对疫苗的免疫效果具有良好的促进作用。

表4中和抗体检测结果

疫苗批号	临床表现
		第一批	1:64、1:80、1:64、1:57、1:64
第二批	1:64、1:50、1:47、1:57、1:64
		第三批(不含蜂胶黄酮)	1:32、1:40、1:36、1:36、1:50
对照组	1:4、＜1:4、＜1:4、1:4、1:4

免疫攻毒：每批疫苗颈部肌肉注射3～5日龄健康易感仔猪5头，每头1ml，间隔2周后以同等剂量加强免疫一次，在免疫后21日，所有试验猪以4.0ml病毒液(含10^5.0TCID₅₀/ml)口服攻毒，连续观察10日。结果显示，攻毒后，免疫组均4/5或以上保护(第一批和第二批均5/5保护，第三批4/5保护)，对照组均5/5发病。

综合以上结果，三批疫苗效力试验均合格，且第一批和第二批疫苗相对第三批要好，说明增加蜂胶黄酮对疫苗的免疫效果具有良好的促进作用。

实施例6、与现有市场疫苗比较试验

6.1物理性状比较

用一批疫苗和国内某厂家同类疫苗(因试验时间段市场上暂无单独灭活疫苗，故本研究选择猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗作为对照疫苗进行研究)分别进行疫苗的性状、无菌、黏度和稳定性检验，各项检测均合格(表5所示)。

结果显示，相对对照疫苗，本研究疫苗与对照疫苗基本相当。

表5两批疫苗各项检验结果

疫苗	外观	剂型	稳定性	黏度	无菌检验
						第一批	淡粉红色均匀乳剂	水包油包水	0.0ml	24.5cP	无菌生长
同类疫苗	淡粉红色均匀乳剂	水包油包水	0.0ml	29.8cP	无菌生长

6.2安全性比较

本疫苗以2.0ml/头颈部肌肉注射3～5日龄健康易感仔猪(猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒三种病毒的抗原抗体均为阴性)，对照疫苗以2.0ml/头颈部肌肉注射3～5日龄健康易感仔猪，观察14日，两种疫苗安全试验合格(表6所示)。

虽然两个疫苗检验均合格，但对照疫苗有一头猪在免疫后有轻微反应，本研究疫苗免疫后均无反应。因此，本研究疫苗相对市场疫苗在安全性方面基本相当或相对要好。

表6两批疫苗安全试验结果

6.3效力试验

本研究疫苗和同类疫苗用3～5日龄健康易感仔猪15头，随机分成3组，每组5头，其中本研究疫苗免疫组各仔猪颈部肌肉注射1.0ml，对照疫苗免疫组各仔猪颈部肌肉注射1.0ml；免疫后21日，采集血清检测PEDV中和抗体效价。血清采集后，每头口服PEDV(ZJ/15株)细胞毒4.0ml(病毒含量为10^5.0TCID₅₀/ml)；攻毒后均观察10日。

结果显示，本研究疫苗免疫组PEDV中和抗体效价较同类疫苗要高，本研究疫苗5/5中和抗体≥1:32。对照疫苗4/5中和抗体≥1:32；PEDV攻毒后，本研究疫苗5/5保护，同类制品4/5保护，对照组均5/5发病。详见表7。说明本研究疫苗在效力方面与同类疫苗相当或者更好。

表7免疫攻毒及效价检测结果汇总表

分组	中和抗体	保护率
			第一批	1:64、1:50、1:64、1:64、1:57	5/5
同类疫苗	1:32、1:47、1:8、1:32、1:36	4/5(加粗为未保护)
			对照组	5/5≤1:4	0/5

综合以上结果，本研究疫苗相对市场疫苗，在安全性方面和效力方面均要好。因此，本研究疫苗具有良好的安全性和有效性，适合市场大范围应用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (3)

1.一种猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1)使用ST全悬浮细胞培养猪传猪流行性腹泻病毒ZJ/15株，获得病毒的培养液；

S2)将S1)制备的病毒的培养液灭活，获得灭活的病毒的培养液；使用除菌PBS缓冲液将灭活的病毒液稀释至10^7.0TCID₅₀/ml，作为抗原液；

S3)将S2)制备的抗原液与佐剂按质量比为1:1的比例混合乳化，获得猪流行性腹泻灭活疫苗；

所述的步骤S1)中使用ST全悬浮细胞培养猪传猪流行性腹泻病毒ZJ/15株包括以下步骤：

1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；

2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，当细胞密度达4～6×10⁶个/ml时，使用含终浓度为50～60μg/ml胰酶的无血清培养基稀释至2.5×10⁶个/ml，按照MOI为0.005～0.01接入种毒，设置培养参数：pH值为7.2、DO值为40～50％、温度为37℃、转速为80～100r/min，培养48～54小时收获细胞培养物；

3)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为病毒的培养液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用。

所述的ST全悬浮细胞是在中国典型培养物保藏中心保藏的ST全悬浮细胞，其保藏编号为：CCTCC NO：C2023179；

所述猪流行性腹泻病毒ZJ/15株是在中国典型培养物保藏中心保藏的猪流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201624；

所述佐剂为双向佐剂，所述双向佐剂为含有1μg/ml的蜂胶黄酮的ISA 201佐剂。

2.一种猪流行性腹泻灭活疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻灭活疫苗的活性成分为使用权利要求1所述的ST全悬浮细胞制备的猪流行性腹泻病毒ZJ/15株。

3.一种如权利要求1所述的ST全悬浮细胞在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。