CN114796473A - 猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；2)将放大培养的ST全悬浮细胞中进行发酵培养，当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰酶的无血清培养基将细胞稀释至4～5×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓度为20～30μg/ml，按照MOI为0.0005～0.001接入猪德尔塔冠状病毒；3)当细胞密度下降至0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养物；4)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片和灭活处理；5)将灭活检验合格的病毒液与药学上可接受的佐剂按照一定比例混合乳化，定量分装，即为疫苗。本发明的方法工艺简单、生产成本低、使用人工少、病毒效价高。

Description

猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和预防兽医领域，具体涉及猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗 的制备方法和应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)为δ冠状病毒属，是近年 来新发现的一种猪冠状病毒，可引起猪，特别是哺乳仔猪严重腹泻、脱水及呕吐 的高度接触性传染病，具有高致死率。现在已扩散到世界各地，造成养猪业的重 大经济损失，引起了全球关注。但是，目前国内外均没有上市销售的PDCoV疫 苗，且大部分疫苗均为贴壁细胞生产，不易放大、工艺复杂、人工需求多、生产 成本高。因此研制一种免疫效果好、安全可靠、容易放大、生产成本低猪德尔塔 冠状病毒疫苗具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供猪德尔塔冠状病毒灭活疫 苗的制备方法和应用。
因此，一方面，本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备方法， 所述方法包括以下步骤：
1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；
2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行 发酵培养，当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰酶的无血清培养基将细胞 稀释至4～5×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓度为30～60μg/ml，按照 MOI为0.0005～0.001接入猪德尔塔冠状病毒；
3)继续发酵培养，每6个小时取样进行细胞计数，当细胞密度下降至 0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养物；
4)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为猪德尔塔冠状病 毒液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用；
5)将4)中获得的猪德尔塔冠状病毒液进行灭活处理；
6)将5)中的灭活后检验合格的病毒液与药学上可接受的佐剂按照一定比 例混合乳化，定量分装，即为制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗。
优选地，本发明所述的无血清培养基为CD ST 258。
优选地，本发明所述步骤2)中ST全悬浮细胞在生物反应器中发酵培养时 的条件为溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm。
优选地，本发明所述步骤2)中当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰 酶的无血清培养基将细胞稀释至4×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓 度为40μg/ml。
优选地，本发明所述步骤2)中按照MOI为0.001接入猪德尔塔冠状病毒。
优选地，本发明所述步骤4)中无菌条件下去除细胞碎片为两级过滤，其中 第一级过滤为过20μm滤膜，第二级过滤为过1.5μm滤膜。
优选地，本发明所述步骤4)中的病毒含量不低于107.5TCID50/ml。
优选地，本发明所述步骤5)中灭活处理方法为：于病毒液中加入终浓度0.5‰ β-丙内酯溶液，搅拌30分钟，将含0.5‰β-丙内酯溶液的病毒液输入至另一灭活 容器中，置2～8℃下灭活24小时，期间保持低速搅拌；灭活后的病毒液置37℃ 搅拌2小时，随后置2～8℃保存待用。
优选地，本发明所述步骤6)中药学上可接受的佐剂为GEL 01佐剂，所述 灭活检验合格的病毒液与GEL 01佐剂的质量比为8:2。
另一方面，本发明还提供了一种所述的方法在猪德尔塔冠状病毒培养和生产 中的应用。
作为本领域的技术人员应当清楚，本发明虽然使用两级过滤去除细胞碎片 时，使用的是20μm滤膜+1.5μm滤膜的组合，但是，还可以使用20μm滤膜+2μm 滤膜的组合、20μm滤膜+1.2μm滤膜的组合、20μm滤膜+1.0μm滤膜的组合、20μm 滤膜+0.45μm滤膜的组合、20μm滤膜+0.22μm滤膜、10μm滤膜+1.5μm滤膜的 组合等等；当然，去除细胞碎片时，还可以使用连续离心的方法去除。
作为本领域的技术人员应当清楚，本发明虽然选择了β-丙内酯来灭活病毒 液，但是，还可以使用甲醛等常规的灭活剂对制备的病毒液进行灭活。
作为本领域的技术人员应当清楚，本发明虽然选择了GEL 01作为本疫苗的 佐剂，但是，本发明制备的病毒液还可以使用其他的佐剂制备疫苗，如ISA 201 VG、ISA 28VG、铝胶佐剂等等。
本发明公开的制备猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的方法以及灭活疫苗具有以 下优点：1)本发明第一个使用ST全悬浮细胞实现了猪德尔塔冠状病毒全悬浮 无血清生产工艺，该工艺适用于大规模工业化生产(本发明做到了200L生物反 应器培养)，工艺简单、生产成本低、使用人工少、病毒效价高(≥107.5TCID50/ml)； 2)本发明的工艺接毒量低(按照MOI为0.001接毒，毒种为107.5TCID50/ml时， 实际体积比(种毒:细胞)约为1:10000)，大规模生产时，种毒需要量少，容易 操作；3)本发明的灭活疫苗使用水性佐剂GEL 01，该疫苗相对于市场上使用较 多的油乳剂疫苗，具有安全性好、容易配制、免疫效果好的优点。
附图说明
图1ST全悬浮细胞培养后图片(稀释6倍计数时拍照)。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领 域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只 是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方 法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：ST全悬浮细胞逐级放大培养
1.1 ST全悬浮细胞复苏：从液氮罐中取出ST全悬浮细胞冻存管，立即放入 37℃水浴，轻晃冻存管使液体尽快融化。将细胞悬浮液1000r/min离心5分钟。 弃去上清液，每支冻存管用20ml无血清培养基(CD ST 258，购自甘肃健顺生物 科技有限公司)悬浮细胞于125ml摇瓶，置37℃130r/min、含5％CO2摇床培养； 每日进行细胞计数(图1)，当细胞密度达4～6×106个/ml时，按接种密度为1×106个/ml进行传代扩大培养，接入500ml摇瓶中，约100ml。
1.2 ST全悬浮细胞放大：将500ml摇瓶置37℃130r/min、含5％CO2摇床培 养；每日进行细胞计数，当细胞密度达4～6×106个/ml时，按接种密度为1×106个/ml进行传代扩大培养，接入3L摇瓶中，约500ml。将3L摇瓶置37℃130r/min、 含5％CO2摇床培养；每日进行细胞计数，当细胞密度达4～6×106个/ml时，按接 种密度为1×106个/ml接入5L生物反应器中进行发酵培养，约2.5L，控制反应器 参数为：溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm。每日进行细胞计数，当细 胞密度达4～6×106个/ml时，按接种密度为1×106个/ml接入15L生物反应器中进 行发酵培养，约10L，控制反应器参数为：溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌 80～100rpm。每日进行细胞计数，当细胞密度达4～6×106个/ml时，按接种密度为 1×106个/ml接入200L生物反应器中进行发酵培养，约50L，控制反应器参数为： 溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm。每日进行细胞计数，当细胞密度达 4～6×106个/ml时，补充无血清培养基至100L，控制反应器参数为：溶氧40～50％、 pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm。
实施例2：猪德尔塔冠状病毒ST全悬浮细胞培养工艺条件的筛选
2.1接毒细胞密度、接毒剂量和收毒时细胞密度摸索
试验方法：当细胞长至6×106个/ml以上时，用含有胰酶的无血清培养基将 细胞密度调整为3×106个/ml、4×106个/ml、5.0×106个/ml三种细胞密度，调整后 胰酶终浓度均为40μg/ml。分别按MOI为0.0005、0.001、0.005接入猪德尔塔冠 状病毒(来源于江苏省农业科学院，GenBank:KU665558.1)，37℃130r/min含 5％CO2摇床培养。每6个小时取样进行细胞计数，分别于细胞密度为1～1.5×106个/ml、0.5～1×106个/ml和0.1～0.5×106个/ml取样进行病毒含量测定和无菌检验， 筛选病毒培养最佳工艺条件。
试验结果：在细胞密度为4～5×106个/ml，MOI为0.0005～0.001接毒剂量条 件下，于细胞密度为0.5～1×106个/ml取样的病毒含量均高于其它取样点，病毒 含量均≥107.5TCID50/ml。结果如表1。为节约使用细胞，确定最优培养增殖条件： 接毒时细胞密度为4×106个/ml，MOI为0.001，收获时间为细胞密度下降至 0.5～1.0×106个/ml时，病毒滴度为107.5TCID50/ml以上。
表1病毒培养最佳工艺条件筛选结果
Figure BDA0003629023830000041
Figure BDA0003629023830000051
2.2胰酶使用浓度摸索
试验方法：当细胞长至6×106个/ml以上时，用含有胰酶的无血清培养基将 细胞密度调整为4×106个/ml，调整后胰酶终浓度分别为20μg/ml、30μg/ml、 40μg/ml、50μg/ml和60μg/ml。分别按MOI为0.001接入猪德尔塔冠状病毒(来 源于江苏省农业科学院兽医研究所)，37℃130r/min含5％CO2摇床培养。每6 个小时取样进行细胞计数，于细胞密度为0.5～1×106个/ml取样进行病毒含量测 定和无菌检验，筛选病毒培养最佳工艺条件。
试验结果：结果显示，在胰酶终浓度为30～60μg/ml时，病毒含量没有显著 性差异，均保持在107.5～107.6TCID50/ml(如表2)，而在20μg/ml时，病毒含量 为107.33TCID50/ml。因此，为确保病毒培养的稳定性，确定培养病毒时的胰酶终 浓度为40μg/ml。
表2不同胰酶浓度时病毒含量
Figure BDA0003629023830000052
2.3病毒含量测定：将病毒用含7.5μg/ml胰酶的DMEM培养液作10倍系列 稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度，分别接种长成良好单层的LLC-PK1 细胞(购自ATCC细胞库，美国)96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每 孔100μl。置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察72～96小时，记录细胞病变 (CPE)孔数。按Reed-Müench法计算TCID50
综合上述摸索的条件，确定猪德尔塔冠状病毒在ST全悬浮细胞中的合适的 培养工艺为：当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰酶的无血清培养基将细 胞稀释至4～5×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓度为30～60μg/ml，按 照MOI为0.0005～0.001接入猪德尔塔冠状病毒，每6个小时取样进行细胞计数， 当细胞密度下降至0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养物。确定猪德尔塔冠状病毒 在ST全悬浮细胞中的最佳的培养工艺为：当细胞长至6×106个/ml以上时，使用 含胰酶的无血清培养基将细胞稀释至4×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶 终浓度为40μg/ml，按照MOI为0.001接入猪德尔塔冠状病毒，每6个小时取样 进行细胞计数，当细胞密度下降至0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养物。
实施例3：猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备
3.1猪德尔塔冠状病毒培养液的生产：按照实施例1的方法逐步放大ST全 悬浮细胞至200L生物反应器中进行发酵培养，培养体积为100L，当细胞长至 6×106个/ml以上时，按照实施例2确定的最优工艺接入猪德尔塔冠状病毒。具 体为：当细胞密度为6×106个/ml时，补充6L胰酶(原始浓度为1mg/ml)、44L 无血清培养基、19ml猪德尔塔冠状病毒(原始毒价为107.50TCID50/ml)，继续发 酵培养，控制反应器参数为：溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm；每6 个小时取样进行细胞计数，当细胞密度下降至0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养 物。
3.2猪德尔塔冠状病毒培养液细胞碎片的去除：为方便工业化生产，我们选 择过滤的方式去除细胞碎片(也有使用连续离心的方式去除，但连续离心设备昂 贵，操作不方便，时间长，工业化生产成本高)，我们选择两级过滤，第一级过 滤为过20μm滤膜，以去除大的细胞和碎片；第二级过滤为过1.5μm滤膜，以去 除小的细胞碎片。过滤过程中均需要保证在无菌的条件的进行，因病毒液过 0.22μm滤膜损失极大，也很容易堵塞，导致无法操作或成本奇高。整套过滤设 备均为商品化采购，如thermofisher或默克或国产设备等均可满足需求。过滤后 的滤液即为猪德尔塔冠状病毒液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于 -15℃以下保存待用，如果短期储存，可置于2～8℃保存，一般为一周。
3.3猪德尔塔冠状病毒液的灭活：于病毒液中加入终浓度0.5‰β-丙内酯溶 液，搅拌30分钟，将含0.5‰β-丙内酯溶液的病毒液输入至另一灭活容器中，置 2～8℃下灭活24小时，期间保持低速搅拌；灭活后的病毒液置37℃搅拌2小时， 随后置2～8℃保存待用，一般保存1～2个月。本研究采用β-丙内酯作为灭活剂的 优点在于，β-丙内酯在37℃搅拌2小时即可完全分解，没有残留。当然，也可以 采用常用的甲醛进行灭活。灭活后按照《中国兽医典》附录方法进行灭活检验， 灭活检验合格的即可配制疫苗。其中灭活检验简述为：取灭活后的抗原做无菌检 测及将灭活液按1％体积比接种于贴壁的LLC-PK1细胞，36h后收获并反复冻融 2～3次，将收获的冻融物按以上方法接种LLC-PK1细胞，如此反复盲传2代， 细胞应无病变，判定灭活完全。
3.4猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗配制：本发明使用水性佐剂GEL 01(购自 法国赛彼克公司)来配制疫苗，具体为：取除菌GEL 01佐剂与灭活检验合格的 猪德尔塔冠状病毒液按照2:8质量比混合于乳化缸内，低速搅拌30分钟(一般 为200～500rpm)，定量分装，即为制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗。
实施例4：猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的应用
4.1安全性检验：用3～5日龄健康易感仔猪(猪德尔塔冠状病毒抗原抗体双 阴性的仔猪)5头，每头颈部肌肉接种实施例3制备的疫苗2ml，观察14日。结 果显示，与接种前相比，所以仔猪温度正常，精神、食欲等无明显变化，接种部 位无溃烂等异常；判定安全检验合格。
4.2效力检验：用3～5日龄健康易感仔猪(猪德尔塔冠状病毒抗原抗体双阴 性的仔猪)10头，随机分成免疫组、对照组，每组5头，其中免疫组各仔猪颈 部肌肉注射1ml实施例3制备的疫苗，在免疫后21日采血，采集血清检测血清 中和抗体；采集完血清后，免疫组和对照组均以10ml(含107.00TCID50/ml)/头 病毒液口服攻毒，连续观察7日。结果显示，免疫组在免疫后21日中和抗体均 很高(见表3)，且攻毒后，免疫组100％保护(5头仔猪均没有发生腹泻)，对 照组100发病(5头仔猪全部发生腹泻)。
表3中和抗体检测结果
组别 免疫前 免疫后21日
免疫组 5头均≤1:4 1:57,1:32,1:64,1:80,1:64
对照组 5头均≤1:4 5头均≤1:4
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)ST全悬浮细胞在无血清培养基中的逐级放大培养；
2)将放大培养的ST全悬浮细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰酶的无血清培养基将细胞稀释至4～5×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓度为30～60μg/ml，按照MOI为0.0005～0.001接入猪德尔塔冠状病毒；
3)继续发酵培养，每6个小时取样进行细胞计数，当细胞密度下降至0.5～1.0×106个/ml时收获细胞培养物；
4)将收获的细胞培养物在无菌条件下去除细胞碎片，即为猪德尔塔冠状病毒液，取样进行病毒含量和无菌检验，将病毒液置于-15℃以下保存待用；
5)将4)中获得的猪德尔塔冠状病毒液进行灭活处理；
6)将5)中的灭活后检验合格的病毒液与药学上可接受的佐剂按照一定比例混合乳化，定量分装，即为制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无血清培养基为CD ST258。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中ST全悬浮细胞在生物反应器中发酵培养时的条件为溶氧40～50％、pH 7.0～7.2、搅拌80～100rpm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中当细胞长至6×106个/ml以上时，使用含胰酶的无血清培养基将细胞稀释至4×106个/ml，此时无血清培养基中的胰酶终浓度为40μg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中按照MOI为0.001接入猪德尔塔冠状病毒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中无菌条件下去除细胞碎片为两级过滤，其中第一级过滤为过20μm滤膜，第二级过滤为过1.5μm滤膜。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中的病毒含量不低于107.5TCID50/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中灭活处理方法为：于病毒液中加入终浓度0.5‰β-丙内酯溶液，搅拌30分钟，将含0.5‰β-丙内酯溶液的病毒液输入至另一灭活容器中，置2～8℃下灭活24小时，期间保持低速搅拌；灭活后的病毒液置37℃搅拌2小时，随后置2～8℃保存待用。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中药学上可接受的佐剂为GEL01佐剂，所述灭活检验合格的病毒液与GEL 01佐剂的质量比为8:2。
10.一种如权利要求1～9任一权利要求所述的方法在猪德尔塔冠状病毒培养和生产中的应用。
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