CN116218763A - 一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种针对所筛选的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV‑AQ株的培养用的猪睾丸传代细胞ST细胞系，以及建立的猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法。所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST‑WL的保藏编号为CCTCC NO：C2021214；所述的猪流行性腹泻病毒PEDV‑AQ株的保藏编号为CCTCC NO:V202164。本发明利用驯化得到一株增殖能力强、细胞密度高、适应全悬浮培养的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST‑W细胞系L，实现了对猪流行性腹泻病毒PEDV‑AQ株的全悬浮细胞培养，得到的病毒滴度高，均≥10^9.0TCIE₅₀/ml，明显高于ST细胞贴壁培养的病毒滴度。而且，通过在培养过程中添加聚凝胺，能显著缩短病毒液的收获时间，且病毒滴度也明显提高，从而有利于提高生产效率和批间稳定性，降低生产成本。

Description

一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法

技术领域

本发明属于兽用疫苗细胞培养技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法。

技术背景

动物细胞大规模培养技术是目前疫苗工业自动化生产工艺的研究主力。悬浮培养标志着细胞大规模培养技术的开始。动物细胞培养生产病毒是病毒疫苗生产过程中常用的方法。目前常用的全悬浮培养细胞有Vero、MDCK、ST、PK-15、BHK-21、Mark-145、LMH等，用于培养口蹄疫病毒、禽流感病毒、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪传染性胃肠炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，俗称“蓝耳病”)等。全悬浮细胞培养降低了使用含牛血清培养基培养带来的高生产成本，也减少了血清中蛋白遗留物或遗留的未知外源病毒对病毒疫苗质量产生的影响。

ST细胞为猪睾丸细胞(swine testis)，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养。驯化为稳定的全悬浮培养型细胞，需保持表达特性不发生变化，细胞的增殖能力、活力及生产能力均能够满足工业大规模生产的需要。在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力、满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其无血清悬浮生长的特性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对所筛选的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-AQ株培养用的猪睾丸传代细胞ST细胞系，以及建立的猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法。

本发明首先提供一种猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL，已于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021214。

本发明所提供的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL用于培养猪流行性腹泻病毒；

所述的病毒株，为猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202164。

本发明再一个方面还提供一种猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法，包括如下步骤：

1)制备悬浮细胞培养基

将DMEM和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合均匀，然后添加浒苔提取物和染料木素，至其终浓度分别为10g/L和0.5g/L；

2)取生长良好的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL株，按细胞密度0.8×10⁶cells/ml接入生物反应器中，补加悬浮细胞培养基至最高培养体积，培养条件为60r/min、温度37℃、溶氧30～50％、pH6.8～7.2；

(3)当ST-WL细胞在反应器中的细胞密度达到5×10⁶～18×10⁶cells/ml，且细胞状态稳定时，调整反应器中细胞密度至2×10⁶～6×10⁶cells/ml，按照MOI感染数10^-6接种猪流行性腹泻病毒种毒，同时向培养基中添加聚凝胺，至其终浓度为1μg/ml，反应器控制条件为：37℃，pH7.2，溶氧40％，搅拌速度60r/min；培养68～72h，收获细胞培养液；

(4)将收获的细胞培养液反复冻融2次后，再经过滤澄清去除细胞碎片，得猪流行性腹泻病毒液。

本发明利用驯化得到一株增殖能力强、细胞密度高、适应全悬浮培养的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL细胞系，实现了对猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株的全悬浮细胞培养，得到的病毒滴度高，均≥10^9.0TCIE₅₀/ml，明显高于ST细胞贴壁培养的病毒滴度。而且，通过在培养过程中添加聚凝胺，能显著缩短病毒液的收获时间，且病毒滴度也明显提高，从而有利于提高生产效率和批间稳定性，降低生产成本。

附图说明

图1为ST-WL细胞的悬浮培养状态图；

图2为ST-WL细胞在生物反应器中生长曲线；

图3为接毒后ST-WL细胞状态图。

具体实施方式

申请人筛选获得了一株抗原蛋白基因发生了变异的猪流行性腹泻病毒变异病毒PEDV-AQ株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202164。

该病毒株是从2020年江西省某规模化猪场的腹泻病死仔猪的部分肠道组织及内容物中筛选获得的，该养殖场之前已经使用了猪流行性腹泻病毒商品化疫苗进行了免疫。

对筛选的PEDV-AQ株的S蛋白序列进行氨基酸同源性进化树分析，发现该分离株与猪流行性腹泻病毒CV777经典株的S蛋白序列同源性最高，为99.6％。比对结果显示：与CV777株相比，该分离毒株S蛋白COE中和表位发生如下突变：第159位氨基酸由V突变为F，第169位氨基酸由V突变为I，第264位氨基酸由L突变为T，第265位氨基酸由L突变为A，第266位氨基酸由H突变为F，第285位氨基酸由R突变为K。

与市售PEDV灭活疫苗相比，PEDV-AQ株灭活疫苗对流行毒株的攻击具有更好的保护性能。PEDV-AQ株灭活疫苗免疫的母猪生产的仔猪在攻毒后全部获得保护，而市售PEDV灭活疫苗对流行毒株的攻击保护率仅为2/5。

但使用目前市售的ST贴壁细胞(编号为CVCC NO.CL27中国兽医药品监察所)对PEDV-AQ株的培养效果并不好，达不到制备疫苗的浓度。因此，通过驯化筛选，获得了能够高效培养PEDV-AQ株的细胞系。

说明书实施例中涉及的主要生物材料和设备如下：

ST贴壁细胞种子：编号为CVCC NO.CL27，购买于中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心。

DMEM、OptiMEM细胞培养基：为GIBCO商品化培养基。

浒苔提取物：为试剂级，上海西宝生物。

染料木素：为试剂级，Sigma。

聚凝胺：为试剂级，北京索莱宝商品化试剂。

Corning摇瓶；北京六一振荡器；松下二氧化碳培养箱；苏州苏净二级生物安全柜。

生物反应器：广东齐志生物工程设备有限公司3L、14L搅拌式生物反应器。为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于全悬浮培养细胞的生物反应器。

以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：ST细胞贴壁培养猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株

1、取ST贴壁细胞，加入含10％(v/v)新生牛血清的DMEM培养液于T75细胞培养方瓶中，37℃，5.0％ CO₂培养箱中培养，待细胞生长致密度为100％后，完全弃去培养液，按照体积比1％比例加入猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株病毒液，补充细胞维持液，37℃，5.0％ CO₂培养箱中培养。接毒后，每日观察细胞病变，当细胞病变为80％以上停止培养，冻融3次收获细胞培养物，获得猪流行性腹泻病毒液。取样进行病毒含量TCID₅₀检测。

2、猪流行性腹泻病毒液TCID₅₀检测方法如下：

采用Vero细胞进行病毒滴度的测定：用96孔细胞培养板培养Vero细胞，取上述生产获得的猪流行性腹泻病毒液用不加血清的DMEM培养基进行10倍梯度系列稀释至10^-10，分别取10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 4个稀释度分别接种到上述96孔Vero细胞培养板，每孔100ul，每个稀释度接种8孔，同时设置阴性细胞对照孔。置37℃，5％ CO2培养箱中培养，4天观察细胞感染病毒情况，根据孔板内细胞的病变情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。经过检验所收获的猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株病毒液效价仅为10^8.0TCID₅₀/ml。

由于ST贴壁细胞(编号为CVCC NO.CL27中国兽医药品监察所)对猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株的培养效果并不好，达不到制备疫苗的浓度。因此，本发明通过进一步驯化筛选，获得能够高效培养猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株的无血清全悬浮培养型ST细胞系。

实施例2：无血清全悬浮培养型ST细胞的驯化筛选

1、培养基制备

贴壁细胞培养基：将DMEM和OPtiMEM培养基按1：1体积比混合均匀；

悬浮细胞培养基：将DMEM和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合均匀，然后添加浒苔提取物和染料木素，至其终浓度分别为10g/L和0.5-2.5g/L；

2、取ST贴壁细胞种子，加入7ml添加了8％(v/v)新生牛血清的贴壁细胞培养基于T25培养瓶中，37℃，5.0％ CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90％以上后，完全弃去培养液，用0.25％EDTA-胰酶消化分散，分别用添加了8％(v/v)、3％、1％新生牛血清的贴壁细胞培养基依次传代培养3代，细胞边缘清晰，形态扁平，生长正常可用于驯化；

3、将步骤2所获得的ST贴壁细胞分别用添加了5％(v/v)、3％(v/v)和1％(v/v)新生牛血清的贴壁细胞培养基依次培养3代，按1：3体积比分瓶，培养条件为37℃、5％CO₂，得到低血清贴壁培养型ST细胞；

4、取长满单层低血清贴壁培养型ST细胞，用0.25％EDTA-胰酶消化分散，进行细胞计数和活率检测，用添加1％(v/v)新生牛血清的悬浮细胞培养基将细胞密度调整为至1×10⁶cells/ml，37℃，5％CO₂，130r/min摇床培养；

5、当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，800r/min离心，用添加1％(v/v)新生牛血清的悬浮细胞培养基按1∶2体积比分瓶培养，进行细胞计数和活率检测；至细胞密度达到3×10⁶cells/ml时，800r/min离心，按1∶3体积比分瓶培养；再按细胞密度为1×10⁶/ml比例分瓶培养，连续传3代；得到低血清全悬浮培养型ST细胞；

6、取处于对数生长期的低血清全悬浮培养型ST细胞，用无血清的悬浮细胞培养基直接稀释到密度1×10⁶cells/ml，培养条件为37℃，5％CO₂，130r/min摇床培养，进行细胞计数和活率检测，继续传代3代，再用无血清的悬浮细胞培养基直接稀释至密度1.2×10⁶cells/ml，培养条件为37℃，5％CO₂，130r/min摇床培养，进行细胞计数和活率检测，继续传代3-5代，活率>95％，细胞稳定生长；即驯化得到无血清全悬浮培养型ST细胞。

同时，以不添加浒苔提取物和染料木素的常规悬浮细胞培养基(DMEM和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合均匀)作为对照组。

7、无血清全悬浮培养型ST细胞的生长特性

按1×10⁶cells/ml的比例分别将上述驯化得到的无血清全悬浮培养型ST细胞进行接种培养，培养条件为37℃、5％CO₂和130r/min摇床培养，每24h取样观察计数，用台盼蓝染色法检测细胞密度，计算细胞活率。

实验结果显示，与对照组相比，本发明通过调整悬浮细胞培养基中染料木素的添加量驯化筛选到的ST细胞中，有些ST细胞的生长性能得到显著提升，在相同培养时间内细胞数量和活率显著高于对照组，也有一些ST细胞的生长性能没有显著变化，甚至略有降低。最终申请人筛选出3株细胞密度和活率均显著高于对照组的无血清全悬浮培养型ST细胞，分别命名为ST-WH、ST-WL、ST-WM，其细胞密度和活率见表1。

表1无血清全悬浮培养型ST细胞的密度和活率表

从表1的数据可知，本发明驯化得到的3株无血清全悬浮培养型ST细胞活率均在95％以上，并保持较快的生长速率。其中，ST-WL细胞在相同培养时间内细胞数量和活率最高。

实施例3无血清全悬浮培养型ST细胞的检定

1、根据《中华人民共和国兽药典》三部2015年版附录“生产用细胞标准”进行检定。

(1)无菌检验：

将实施例2驯化得到的无血清全悬浮培养型ST细胞ST-WH、ST-WL、ST-WM培养的上清液分别接种到硫乙醇酸盐培养基、胰酪大豆胨培养基中培养。结果显示均为阴性。

(2)支原体检验：

将实施例2驯化得到的无血清全悬浮培养型ST细胞ST-WH、ST-WL、ST-WM冻融一次的上清液分别接种到支原体液体培养基和支原体固体培养基中培养。结果显示均为阴性。

(3)外源病毒检验：

将实施例2驯化得到的无血清全悬浮培养型ST细胞ST-WH、ST-WL、ST-WM冻融一次的上清液接种到Vero细胞和ST细胞培养，细胞未出现病变；荧光抗体法检查牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪细小病毒(PPV)为阴性；红细胞吸附试验为阴性。

实施例4无血清全悬浮培养型ST细胞的扩大培养

1、分别取冻存的ST-WH、ST-WL、ST-WM细胞，加25～30ml无血清的悬浮细胞培养基进行复苏，培养条件为130r/min、37℃、5％CO₂摇床培养；

2、当摇瓶培养的ST-WH、ST-WL、ST-WM细胞生长至2～3×10⁶cells/ml以上时，用无血清的悬浮细胞培养基将细胞稀释至密度为1×10⁶cells/ml，培养条件为130r/min、37℃、5％CO₂摇床培养72h；

4、重复步骤(3)3～5次；

5、分别用无血清悬浮细胞培养基将细胞稀释至0.8×10⁶cells/ml，之后补加无血清的悬浮细胞培养基至最高培养体积，培养条件为60r/min、温度37℃、溶氧30～50％、pH6.8～7.2。每24h取样观察计数，用台盼蓝染色法检测细胞密度，计算活率。具体结果见表2。

表2:ST细胞在3L生物反应器中细胞培养结果表

从表2的结果可知，本发明驯化得到的3株无血清全悬浮培养型ST细胞接种至生物反应器内，细胞能保持较快的生长速率，细胞活率均保持在95％以上。其中，ST-WL细胞的细胞活率最高，96h时细胞密度最高，达18.9×10⁶cells/ml。

申请人将ST-WL细胞命名为猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL，并于2021年08月05日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2021214。

ST-WL细胞悬浮培养时显微镜下的细胞形态如图1所示；生长曲线如图2所述。

实施例5猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株的全悬浮细胞培养方法

取生长良好的悬浮培养的ST-WL细胞，按细胞密度0.8×10⁶cells/ml接入生物反应器中，补加无血清的悬浮细胞培养基至最高培养体积，培养条件为60r/min、温度37℃、溶氧40％、pH7.2。当全悬浮培养的ST-WL细胞在反应器中的细胞密度达到8×10⁶cells/ml，且细胞状态稳定时，调整反应器中细胞密度至6×10⁶cells/ml，按照MOI感染数10^-6接种猪流行性腹泻病毒PEDV-AQ株种毒，同时向培养基中添加聚凝胺，至其终浓度为1ug/ml，反应器控制条件为：37℃，pH7.2，溶氧40％，搅拌速度60r/min；培养56h，出现60-70％细胞病变(见图3)，收获细胞物。将收获的细胞物反复冻融2次后，再经过滤澄清去除细胞碎片，得猪流行性腹泻病毒液。取样进行病毒含量TCID₅₀检测。

同时设置对比例，操作步骤同上，唯一的区别是不添加聚凝胺，将得到的猪流行性腹泻病毒液进行病毒含量TCID₅₀检测。

采用Vero细胞进行病毒滴度的测定：用96孔细胞培养板培养Vero细胞，取上述生产获得的猪流行性腹泻病毒液用不加血清的DMEM培养基进行10倍梯度系列稀释至10^-10，分别取10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 4个稀释度分别接种到上述96孔Vero细胞培养板，每孔100ul，每个稀释度接种8孔，同时设置阴性细胞对照孔。置37℃，5％ CO2培养箱中培养，4天观察细胞感染病毒情况，根据孔板内细胞的病变情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，具体结果见表3。

表3TCID₅₀检测结果表

从表3的数据可知，本发明利用ST-WL细胞生产的猪流行性腹泻病毒滴度高，均≥10^9.0TCIE₅₀/ml。而且，与对比例相比，通过在生产过程中添加聚凝胺，能显著缩短病毒液的收获时间，且病毒滴度也明显提高，从而有利于提高生产效率和批间稳定性，降低生产成本，取得了意料不到的技术效果。提高了生产效率的同事，能显著提高。

以上所述内容仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种猪睾丸传代细胞系悬浮适应株，其特征在于，所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株的保藏编号为CCTCC NO：C2021214。

2.权利要求1所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株在培养猪流行性腹泻病毒中的应用。

3.一种猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株来培养猪流行性腹泻病毒。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒的保藏编号为CCTCC NO:V202164。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养方法，其中培养基为DMEM培养基和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合获得的培养基。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养方法，其中培养基中添加有浒苔提取物和染料木素。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的浒苔提取物和染料木素的添加终浓度分别为10g/L和0.5g/L。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养方法，在猪睾丸传代细胞密度为2×10⁶～6×10⁶cells/ml时接种猪流行性腹泻病毒。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在接种猪流行性腹泻病毒种毒时向培养基中添加聚凝胺。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中聚凝胺添加终浓度为1μg/ml。

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