BR112014026407B1

BR112014026407B1 - formulação de vacina líquida

Info

Publication number: BR112014026407B1
Application number: BR112014026407-4A
Authority: BR
Inventors: Krishna Mohan Vadrevu; Sai Devarajulu Prasad
Original assignee: Bharat Biotech International Limited
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2020-12-22
Also published as: EP2945650A1; JP6126684B2; RU2643929C2; WO2013160913A1; CN104507495A; US20150098967A1; JP2015514750A; EP2945650B1; BR112014026407A2; CN110227152A; US10568957B2; RU2014146772A

Abstract

FORMULAÇÃO DE VACINA LÍQUIDA A invenção provê composições novas de vacina contra rotavirus compreendendo antígenos do rotavírus, estabilizadores e tampões. Os tampões na invenção são pré-misturados nas composições de vacina contra rotavírus para neutralizar o pH altamente acídico do estômago sem a necessidade de administração separada de um antiácido antes da administração da vacina. As composições de vacina com tampões da invenção são formulações de vacina contra rotavírus líquidas estáveis para administração oral.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A invenção se refere a novas composições de vacina contra rotavírus e ao processo para preparação destas. Mais particularmente, a invenção se refere a novas composições de vacina contra rotavírus que compreendem antígenos do rotavírus, estabilizadores e novos tampões. Os tampões são pré-misturados nas composições de vacina contra rotavírus da invenção. As composições de vacina da invenção são formulações líquidas estáveis de vacina contra rotavírus para administração oral.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] O rotavírus é a causa mais comum do mundo de diarreia grave com desidratação. A cada ano, mais de meio milhão de crianças com menos de 5 anos de idade morrem em razão de diarreia decorrente do rotavírus. Mais de 80% dessas mortes relacionadas ao rotavírus ocorre em países em desenvolvimento da África Subsariana e do Sul da Ásia. Além disso, o rotavírus é responsável por 25 a 50% de todas as hospitalizações em razão de diarreia nos países desenvolvidos e em desenvolvimento e por 23 milhões de atendimentos ambulatoriais por ano de crianças pequenas. Quase toda criança com cerca de 5 anos de idade é infectada pelo rotavírus. Em razão da enorme carga global de doença por rotavírus, o desenvolvimento de vacinas contra esse patógeno tem sido prioridade nas últimas três décadas. Duas vacinas vivas contra rotavírus por administração oral disponíveis no mercado são a RotaTeq® (Merck and Co., Inc., PA, EUA e Sanofi Pasteur MSD SNC, Lyon, França) e a Rotarix® (GSK Biologicals, Rixensart, Bélgica). Em abril e outubro de 2009, o Grupo de Assessoria Estratégica de Especialistas em Imunização (SAGE) da OMS revisou dados adicionais de eficácia de populações diferentes na África e Ásia e de estudos de pós-licenciatura na América, estendendo a recomendação de vacinação para todas as regiões do mundo.

[003] O cápside do rotavírus é composto de três camadas proteicas concêntricas. A camada externa, compreendendo VP7 e VP4, se perde durante a entrada do vírus na célula hospedeira. Os isolados do campo de rotavírus podem ser adaptados ao crescimento de titulação alta em cultura de tecido por tratamento com tripsina e pela suplementação do meio de cultura com tripsina, que divide o VP4 em dois fragmentos, VP8* e VP5*. O fato de inibidores de protease reduzirem a replicação do rotavírus in vitro e in vivo é conhecido. Quando associada a partículas de camada tripla (TLPs), a tripsina fica inativa e não é acessível a inibidores de protease, como a aprotinina. Quando a camada externa é solubilizada por agentes quelantes do cálcio, VP5*, VP8* e VP7 são liberados, e a tripsina associada é ativada, permitindo a divisão das proteínas de cápside viral, bem como de outras proteínas exógenas. É demonstrado que a adição de inibidores da tripsina reduz significativamente a síntese de mRNA viral e de proteínas virais nas células e apresenta um efeito inibidor principal se presente no momento da entrada do vírus na célula. Isso indica que a incorporação de tripsina nas partículas de rotavírus pode aumentar sua infectividade.

[004] A infectividade é aumentada pelo tratamento com tripsina. A tripsina converte uma fração não infecciosa do vírus em vírus infeccioso ao permitir a desintegração dessa fração na célula infectada. Foi demonstrado que a tripsina divide um polipeptídeo estrutural de rotavírus bovino de 88.000 daltons, gerando produtos de divisão de 67.000 e 20.000 daltons. A ativação do rotavírus com tripsina (origem suína) é estabelecida, e a adição de tripsina no meio pós-infecção também foi realizada para obtenção de resultados excelentes. Porém, a origem da tripsina é suína, isto é, de porcos. Foi demonstrado que a tripsina oriunda de origem suína pode conter outros vírus contaminantes, como o circovírus suíno 1 e 2, o que não é desejável. Traços de outros poluentes de risco, como bifenilas policloradas (PCBs), também podem ser encontrados quando a tripsina suína é utilizada para crescimento do rotavírus. Portanto, é essencial que a tripsina de origem animal seja evitada no bioprocesso de cultura de rotavírus na maior extensão possível.Além disso, como produtos relacionados a suínos também são uma barreira para determinadas crenças religiosas, particularmente nas regiões islâmicas, vacinas totalmente livres de origem suína serão mais benéficas e úteis. Estudos de desenvolvimento de processo foram iniciados para introdução do uso de tripsina recombinante, que é uma etapa nova no bioprocesso para eliminar o risco de PCB e de outras fontes animais nas formulações da vacina. A tripsina recombinante não apresenta componente animal (ACF), é altamente específica para atividade, não apresenta quimotripsina contaminante, não apresenta agentes adventícios de origem animal e é segura para consumo humano.

[005] Wyeth teve o privilégio de lançar no mercado uma vacina comercial contra rotavírus em 1998-99. A composição do Rotashield de Wyeth incluiu antígeno do rotavírus vivo tetravalente recombinante humano-macaco, sacarose, glutamato monossódico, monofosfato de potássio, difosfato de potássio, soro fetal bovino e sulfato de neomicina em crescimento em meio de anfotericina B em linhagens celulares diploides de doença de rhesus fetal. Entretanto, em razão de problemas relacionados à intussuscepção e de efeitos adversos associados após a administração da vacina, Wyeth retirou do mercado suas formulações comerciais de vacina contra o rotavírus. Vacinas atuais, incluindo uma que compreende um sorotipo humano monovalente - P1A[8]G1 (Rotarix) e outra que compreende cinco recombinantes humano-bovino - G1, G2, G3, G4 e P1A[8] (RotaTeq), demonstraram eficácia e segurança gerais em estudos clínicos. Embora tenha havido progresso considerável com a associação de intussuscepção a vacinas contra rotavírus, ainda há questões importantes a serem respondidas. Já foi observado e provado que as vacinas contra rotavírus disponíveis apresentam, em geral, eficácia baixa quando testadas em países em desenvolvimento, o que levou a questões sobre a possível efetividade de qualquer vacina viva oral contra rotavírus com essas definições no futuro. (Bresee JS, Glass RI, Ivanoff B, Gentsch J. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine 1999;17: 2207-22). Em países ricos, poucas crianças morrem em razão do rotavírus, enquanto que, globalmente, a maior parte das crianças que morre a cada ano em razão de infecção por rotavírus reside em países de baixa renda. Estudos de vacinas contra rotavírus em países de baixa renda demonstraram eficácia moderada, ao contrário de países ricos, apesar dos programas de vacinação.Uma combinação de fatores pode ser atribuída a tais resultados moderados das vacinas contra rotavírus nos países em desenvolvimento, incluindo acesso limitado ao atendimento à saúde (hidratação), infra-estrutura inapropriada, custos altos de transporte das vacinas, características particulares na maneira de administração da vacina, especificidade de abrangência sorotípica, junto a uma grande prevalência de desnutrição. As pesquisas atuais nessa área precisam de estudo adicional de vacinas contra rotavírus em países de baixa renda e precisam identificar novas maneiras de aprimorar o desempenho da vacina. Mais particularmente, a estabilidade das formulações de vacina contra rotavírus deve ser aprimorada para reduzir o alto custo e a demora do transporte e das instalações de armazenamento nesses países de baixa renda. Embora as patentes anteriores disponíveis no campo de vacinas contra infecção por rotavírus forneçam dados experimentais para estabilidade das formulações de vacina contra rotavírus, implicações práticas sobre o status atual da técnica refletem obstáculos de estabilidade após o primeiro ano da data de fabricação da vacina. Portanto, estudos de estabilidade eficaz devem ser demonstrados para formulações de vacina contra rotavírus por pelo menos 24 meses de armazenamento para garantir os programas de vacinação mundiais nos países menos desenvolvidos ou de baixa renda, nos quais a luta contra o rotavírus pode ser considerada como estando ainda em seu estágio inicial.

[006] O rotavírus é um vírus ácido-lábil com uma meia-vida de menos de 12 minutos em pH de 2,0. É rapidamente inativado em tal pH acídico. As vacinas contra rotavírus têm o intuito de serem administradas às crianças por via oral, situação na qual o antígeno na vacina contra rotavírus tem mas probabilidade de ser inativado pelo ácido gástrico do estômago. Assim, para evitar a inativação do vírus pelo ácido gástrico, antiácidos ou tampões devem ser administrados antes ou em combinação com a vacinação oral contra rotavírus.

[007] Com a patente dos EUA número 6616931, a Merck, pioneira no domínio de vacinas contra rotavírus, reivindicou uma composição de vacina contra rotavírus compreendendo uma formulação de Vacina líquida contra rotavírus compreendendo uma cepa de rotavírus:(1 X 105 a 1000 X 105 pfu/ml), um açúcar selecionado do grupo compreendendo: sacarose, lactose [1% a 70% p/v], manitol, sorbitol, dextrose, fucose, trealose, ácido poliaspártico ou ácido N- acetilneuramínico, hexafosfato de inositol (ácido fítico) e ácido siálico, um fosfato [0,01 M a 2 M] selecionado do grupo compreendendo monofosfato, polifosfato, açúcares fosforilados e um carboxilato [0,05 M a 2 M] selecionado do grupo compreendendo succinato (0,05 M), citrato (0,07 M), fumarato, tartarato, maleato, lactato, albumina sérica humana recombinante (0,5 a 1,25 %) e polissorbato (0,1 a 2%) para formulações líquidas e liofilizadas. No caso da formulação liofilizada, surfactante não iônico selecionado do grupo compreendendo polissorbatos, polissorbato80 (0,00 a 0,1%) é reivindicado. Citrato e fosfato nas faixas de 0,05 M a 2 M e 0,01 M a 2 M foram utilizados como agentes de tamponamento para equilibrar o teor acídico do ácido gástrico do estômago na formulação do rotavírus. A vacina comercializada “Rotateq” da Merck inclui 5 cepas de rotavírus vivo (G1, G2, G3, G4 e P1), sacarose, citrato de sódio, fosfato de sódio monobásico monohidratado, hidróxido de sódio, polissobarto 80 e soro fetal bovino. Essa vacina contra rotavírus comercialmente disponível reflete a composição de seu pedido de patente dos EUA 6616931. A vacina Rotateq foi disponibilizada em uma solução líquida de 2 ml para administração oral de 5 rotavírus vivos recombinantes humano-bovino contendo um mínimo de 2,0 - 2,8 x 106 unidades infecciosas (UI) por dose recombinante, dependendo do sorotipo e, no máximo, 116 x 106 UI por dose agregada.

[008] Entretanto, a patente US6616931 (WO2002/011540) também cita que a liofilização das vacinas contra rotavírus pode resultar em perda do título viral. Isso pode gerar resultados inapropriados, e a potência da formulação da vacina liofilizada também ficará sujeita a ser reduzida abaixo dos níveis exigidos, resultando em imunização ineficaz. Reconhece também que a reconstituição anterior de uma formulação liofilizada está sujeita à perda de potência em temperaturas ambientes. Agentes de tamponamento para formulações líquidas revelados nessa patente incluem citrato, fosfato, succinato, bicarbonatos e em combinações de outros carboxilatos, como fumarato, tartarato, lactato e maleato. Além disso, a concentração de fosfato é indicada para ser mantida abaixo de 0,35 M para evitar precipitação da formulação da vacina viral.O uso de bicarbonatos para estabilização da formulação da vacina viral também é expressamente desencorajado, uma vez que é indicado como sendo desfavorável para a estabilidade da formulação. Ainda, exemplos de trabalho de vários componentes de tamponamento, exceto citratos, succinatos e fosfatos, não estão presentes na especificação. Portanto, parece existir necessidade de novos componentes de tamponamento para estabilidade aprimorada da vacina contra rotavírus e formulações líquidas de tamponamento.

[009] Seguindo a Merck, a Glaxo Smithkline também arquivou e reivindicou a patente dos EUA número 7285280 sobre formulação de vacina contra rotavírus. A patente US7285280 reivindica uma composição de vacina viva contra rotavírus atenuada formulada com um antiácido orgânico, citrato de sódio, ou antiácido inorgânico, hidróxido de alumínio ou carbonato de cálcio e goma xantana para administração oral. A formulação da vacina é liofilizada com carbonato de cálcio, presente como o antiácido, para ser reconstituída com solução aquosa antes da administração. Alternativamente, essa patente também reivindica uma formulação de vacina como um comprimido de rápida dissolução em forma liofilizada para ser diretamente colocado na língua de uma criança, em que o antígeno do rotavírus, o antiácido e a goma xantana estão presentes no comprimido. Da mesma maneira, a prescrição de produto correspondente da US7285280 do “Rotarix” comercialmente disponível, da GSK, é uma vacina liofilizada que precisa ser reconstituída antes da administração pela adição do diluente fornecido separadamente com a vacina. A “Rotarix powder and solvent for oral suspension” contém a cepa RIX4414 de rotavírus humano vivo atenuado produzida em células Vero, com, no mínimo, 106,0 CCID50, 9 mg de sacarose e 13,5 mg de sorbitol, dextran, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), aminoácidos no pó liofilizado, enquanto o solvente de reconstituição inclui gama xantana, carbonato de cálcio e água estéril. A dose de vacina depois da reconstituição é de 1 ml, e duas doses separadas devem ser administradas com intervalo de, pelo menos, 4 semanas entre a primeira e a segunda dose. Embora uma formulação de dosagem de 1 ml tenha sido disponibilizada, ela não é disponível como uma formulação líquida única totalmente estável em termos práticos. A formulação de vacina Rotarix é liofilizada uma vez e é acompanhada de um aplicador oral separado contendo o diluente e um frasco de vidro contendo o antígeno de vacina liofilizada em pó, junto a um adaptador de transferência separado. Uma sequência de 10 etapas separadas deve ser cronologicamente seguida para garantir a reconstituição apropriada. Essa reconstituição da vacina pela mistura da vacina e do diluente apresenta suas desvantagens. A administração dessa vacina passa por um processo tedioso de, primeiramente, conectar o adaptador de transferência ao frasco de vidro contendo o antígeno de vacina em pó e, depois, conectar o adaptador de transferência ao aplicador oral, misturar o antígeno de vacina e o diluente apropriadamente, garantindo a turvação da solução reconstituída, remover o adaptador de transferência e administrar a vacina. Todas essas etapas exigem técnicas operatórias eficientes do indivíduo/profissional da saúde administrando a vacina à criança/paciente. Portanto, ainda é desejável ter uma formulação líquida única com volumes de dose apropriados de formulação de vacina contra rotavírus.

[010] Subsequentemente, a patente dos EUA da GSK 8192747 reivindica uma formulação de rotavírus oral líquida compreendendo antígeno do rotavírus vivo atenuado, um açúcar (35% a 70% p/p) selecionado a partir de sacarose, manitol, maltose, dextrose, lactose e trealose (40%-70%), um carboxilato que é adipato de sódio (50 mM a 2 M restrito a 100 mM a 1 M, adicionalmente restrito a 400 a 700 mM) e um ácido carboxílico, ácido adípico, junto a íons de cálcio, em que a composição apresenta uma capacidade antiácida de pelo menos 12 minutos. Os carboxilatos que demonstraram ter capacidade de tamponamento nessa patente incluem, entre outros, citratos, acetados, malonatos, malatos, glutamatos, fumaratos, lactobionatos, maleatos, glucoronatos, galactoronatos, galactaratos e tartaratos, junto a ácido correspondente e sal de hidróxido de sódio. Além disso, as formulações descritas nessa patente podem incluir certos componentes antiácidos comercialmente disponíveis, bem como, preferivelmente, hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; outros antiácidos insolúveis em água mencionados são carbonato de magnésio, carbonato de alumínio, fosfato de alumínio, mistura de hidróxido de alumínio e carbonato de magnésio, alumínio, hidrocarboneto de magnésio, hidróxido de alumínio-carbonato de magnésio-sorbitol-manitol, hidroxila- alumínio-sódio-carbonato, dihidroxila de alumínio, carbonato de potássio. Embora uma lista de antiácidos tenha sido mencionada nessa patente, a estabilidade de uma formulação de vacina com um antiácido particular deve ser estabelecida.Ainda, a ação antiácida do vírus vivo, enquanto presente como um componente da formulação da vacina com outro antígeno de vacina e outros estabilizadores/conservantes ou excipiente, também é questionável. Antiácidos comercialmente disponíveis misturados com formulações de vacina podem fazer com que o antígeno de vacina coagule e forme massas espessas da formulação líquida. Ainda, nas formulações de vacina líquida, o antiácido permanece como uma suspensão, e não é aconselhável incluí-lo na formulação da vacina. A especificação de produto da vacina comercialmente disponível Rotarix de próxima geração da GSK provê uma formulação de vacina líquida, “Rotarix oral suspension in pre-filled oral applicator” contendo a cepa RIX4414 de rotavírus humano vivo atenuado, com no mínimo 106,0CCID50,produzido em células Vero, 1073 mg de sacarose, adipato dissódico, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e água estéril em uma forma farmacêutica de 1,5 ml para administração oral.

[011] A Bharat Biotech International Limited tem propriedade sobre a patente 242868 na Índia (publicação PCT WO2007/132480), que também revela uma formulação de vacina contra rotavírus exclusiva, que é estável a 2°-8 °C utilizando tampões citrato-fosfato nas faixas de 100 mM a 150 mM e 310 mM a 400 mM, respectivamente, junto a seus outros componentes distintos da formulação.Essa patente envolve administração separada de citrato-bicarbonato ao indivíduo antes da administração da vacina.De acordo com essa patente, citrato-carbonato não é incluída na própria formulação.A presente invenção supera essa desvantagem, em que o uso do sistema de tampão citrato-bicarbonato presente na formulação da vacina, junto ao antígeno do rotavírus, foi comprovado como retendo a capacidade de tamponamento sem afetar a estabilidade da vacina da formulação. A publicação PCT da Bharat Biotech WO2011/07363 reivindicou e revelou subsequentemente um novo bioprocesso para pré-condicionamento com albumina sérica humana durante propagação celular em hospedeiro infectado por vírus, fornecendo características melhores de estabilidade da vacina.

[012] Como mencionado acima, nas formulações de vacina contra rotavírus, um componente de tamponamento particular é necessário para combater o ácido gástrico no estômago.Embora as formulações de vacina contra rotavírus comerciais iniciais da GSK incluíssem antiácido, a versão comercial mais recente da vacina contra rotavírus da GSK foi alterada de antiácidos para tampões. De maneira simples, poderia ser declarado que um antiácido é conhecido por neutralizar o pH do ambiente acídico do estômago, enquanto um tampão retém o pH da formulação da vacina no ambiente altamente acídico do estômago. É sempre vantajoso misturar tampões em uma formulação que pode proteger o antígeno da vacina contra o ácido gástrico do estômago e manter a estabilidade da vacina.

[013] Uma lista de componentes de tamponamento ou antiácidos foi mencionada na técnica anterior para neutralizar o ácido gástrico, o mais preferido sendo tempões citrato-fosfato. A técnica anterior reconhece alguns problemas do uso de tampões citrato-fosfato nas formulações da vacina. Eles são os componentes mais fisiológicos dos tampões comuns e imitam determinados componentes de fluidos extracelulares, embora apresentem várias possíveis desvantagens. Por exemplo, os fosfatos inibem muitas reações enzimáticas, incluindo segmentação de DNA por enzimas de restrição, ligação de DNA e transformação bacteriana. Os fosfatos apresentam mais probabilidade de contaminação por micro-organismos e tendem a precipitar durante a fixação. A família de patente 931 dos EUA da Merck desencoraja o uso de fosfatos como tampões acima de um certo limite de 0,35 M para evitar precipitação de sais de fosfato nas formulações da vacina. A patente dos EUA da GSK797 menciona expressamente que, preferivelmente, as formulações de vacina contra rotavírus não apresentam fosfatos. Citrato de sódio foi utilizado pela GSK em sua patente dos EUA 280 como antiácido inorgânico. Entretanto, o uso de citratos pela GSK em sua patente dos EUA subsequente 797 como tampão parece totalmente retirado. A patente dos EUA 797 reivindica carboxilatos que sejam expressamente derivados de um ácido dicarboxílico. Tampões citrato são derivados de ácido cítrico. O ácido cítrico apresenta três grupos funcionais de carboxila.Os tampões citratos são preparados pela mistura de ácido cítrico e, preferivelmente, citrato de sódio para obtenção do pH desejado. Portanto, tampões citrato são tampões preparados a partir de ácidos tricarboxílicos.

[014] Também fica evidente a partir das patentes acima que as vacinas contra rotavírus exigem antiácidos ou tampões para neutralizar o ambiente altamente acídico do estômago. Os tampões são importantes porque o antígeno do rotavírus suspenso em uma solução não deve passar por perda de potência e deve interagir de maneira favorável com os outros excipientes para otimizar a eficácia da vacina. Eles são essenciais para a eficácia e estabilidade das vacinas, uma vez que aumento ou redução acentuados do pH da solução pode causar desnaturação do antígeno vivo de proteína/rotavírus na vacina. O tampão a ser utilizado com a formulação da vacina exige o cumprimento de critérios, que incluem custos baixos e fácil preparação, além de resistência à oxidação para permanecer estável. Também é importante escolher um tampão que não seja tóxico à preparação. Um sistema de tamponamento apropriado não deve reduzir o título da vacina de antígeno e deve funcionar como um componente potencial para combater o ambiente altamente acídico dentro do paciente ao qual a vacina será administrada. Os tampões passaram a ser parte integrante das vacinas contra rotavírus, uma vez que era necessário reter o pH da formulação da vacina no pH altamente acídico do estômago; também deveria ser garantido que o título da vacina não fosse desviado abaixo de seus níveis imunogênicos. Os tampões como outro componente das formulações de vacina contra rotavírus com a intenção de neutralizar o ambiente acídico do estômago exigem definição da estabilidade das formulações da vacina para seu uso a longo prazo. Possibilidade de uso de outros carboxilatos como tampões pode ter sido referenciada na técnica anterior, ainda que combinações absolutas e específicas desses tampões com antígeno e outros excipientes de estabilização da formulação da vacina contra rotavírus precisem ser estabelecidas. A combinação específica de tampões apropriados com antígeno em uma frasco único não deve mostrar formação de precipitados e deve mostrar estabilidade a longo prazo. Apesar de uma lista extensa de muitos componentes possíveis de tamponamento ser mencionada nas técnicas anteriores da Merck e da GSK, uma composição biológica não pode ser aceita com meras suposições e possibilidades, quando a técnica anterior não foi ??apoiado por dados experimentais. Citratos, fosfatos e, até certa extensão, succinatos foram experimentalmente demonstrados na técnica anterior como os tampões mais amplamente aceitáveis nas vacinas.

[015] Os tampões são conhecidos por agirem em sistemas de combinação. Cada sistema de combinação de tampão é específico em relação a suas próprias propriedades físico- químicas e sua própria capacidade de tamponamento A seleção de um sistema de combinação de tampão particular em uma solução particular depende do tipo de composição. A presente invenção se refere a composições de vacina contra rotavírus que incluem vírus atenuado vivo e uma ampla faixa de outros componentes de formulação, como um ou mais açúcares e proteínas parcialmente hidrolisadas junto a outros possíveis componentes de estabilização. Os componentes interagem de várias maneiras um com o outro, e portanto, a seleção de um sistema de combinação de tampão particular que se adeque ao tipo de uma formulação particular, retendo sua atividade funcional, deve ser identificada. De modo contrário aos possíveis tampões meramente citados na técnica anterior, novos sistemas de combinação de tampão que não foram citados na técnica anterior e sua função na estabilização das formulações de vacina contra rotavírus foram apresentados em detalhes na presente invenção, sendo que a principal característica é a estabilidade mínima de 2 anos.

[016] Portanto, novas composições de vacina com novos sistemas de combinação de tampão foram inventadas para formulações de vacina contra rotavírus, que são adicionalmente seguras e eficazes para garantir a eficácia máxima da vacina contra rotavírus, ao mesmo tempo sendo estáveis para períodos de tempo comparativamente maiores para efetuar melhor transporte das vacinas contra rotavírus em todo o mundo. A presente invenção propõe o uso de novos sistemas de combinação de tampão que não foram mencionados na técnica anterior para preparações de vacina contra rotavírus capazes de serem prontamente ingeridas e assimiladas pelo corpo humano sem comprometer o título viral e, ao mesmo tempo, altamente estáveis. Superando as limitações existentes associadas às formulações de vacina contra rotavírus com tais formulações ideais de vacina e tampão, descritas aqui, esta invenção será de grande vantagem para a vacinação mundial contra infecções por rotavírus.

[017] Formulações de vacina liofilizada apresentam estabilidade estendida, mas implicam maiores custos de fabricação.A logística envolvida no caso de vacinas liofilizadas também reduz as chances de tornar as vacinas contra rotavírus disponíveis em áreas remotas do mundo.Instalações de transporte sofisticadas para frascos liofilizados aumenta o problema de logística e dos custos altos das vacinas. Portanto, os inventores da presente invenção demonstraram experimentalmente formulações líquidas de vacina contra rotavírus com novos tampões alternados em uma faixa de volumes de dose incluindo formulações de 1 ml até formulações de 2,5 ml para um período estendido de até 2 anos.Este é um avanço considerável sobre o estado atual da técnica disponível para formulações de vacina contra rotavírus. Formulações de vacina contra rotavírus estáveis de até 2 anos em temperatura refrigerada facilitarão o transporte das vacinas com custos muitos menores, mantendo o título viral na formulação para aumentar a imunogenicidade exigida.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[018] O objetivo primário da invenção é o desenvolvimento de uma formulação de vacina para profilaxia e tratamento de infecções por rotavírus em humanos.

[019] Outro objetivo da invenção é prover uma composição de vacina contra rotavírus com novos tampões alternados apropriados para prover estabilidade ao antígeno do rotavírus na composição da vacina.

[020] Um objetivo adicional da invenção é prover uma composição de vacina contra rotavírus com novos tampões alternados que retenham o pH da composição da vacina contra rotavírus no pH do estômago altamente acídico durante administração da vacina.

[021] Outro objetivo da invenção é prover uma composição de vacina contra rotavírus estável com estabilizadores e tampões para administração oral sem a exigência de pré-administração de antiácido.

[022] Um objetivo adicional da invenção é prover uma composição de vacina contra rotavírus estável que permitira estabilidade a longo prazo do antígeno do rotavírus sem perda da potência da vacina por até 2 anos, no mínimo.

[023] Ainda, outro objetivo da invenção é prover um método de adaptação do rotavírus na presença de tripsina recombinante para preparação de uma nova composição de vacina contra rotavírus que não possa ser contaminada por fontes animais e que não contenha outra origem animal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[024] Figura 1: resultados do ensaio de Baby Rossete Rice de várias formulações para estudar a capacidade de tamponamento das formulações.

[025] Figura 2: estabilidade das formulações da vacina contra rotavírus a 2-8 oC com tampões citrato-fosfato.

[026] Figura 3: estabilidade das formulações da vacina contra rotavírus a 25 oC com tampões citrato-fosfato.

[027] Figura 4: estabilidade das formulações da vacina contra rotavírus a 37 oC com tampões citrato-fosfato.

[028] Figura 5: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando tampões citrato-bicarbonato a 2 o - 8 oC.

[029] Figura 6: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando tampões citrato-bicarbonato a 25 oC.

[030] Figura 7: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando tampões carbonato-bicarbonato a 2 - 8 oC.

[031] Figura 8: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando tampões carbonato-bicarbonato a 25 oC.

[032] Figura 9: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando tampões carbonato-hidróxido de magnésio a 2-8 oC e 25 oC.

[033] Figura 10: estudos de estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus utilizando mistura de tampões a 2-8 oC.

[034] Figura 11. Estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus a 25 oC com mistura de tampões à base de amônio.

[035] Figura 12. Estabilidade de formulações de vacina contra rotavírus a 37 oC com mistura de tampões à base de amônio.

[036] Figura 13: efeitos de tampões diferente sobre formulações de ORV em título de log vs. tempo.

[037] Figura 14: efeitos de tampões diferente sobre formulações de ORV em título de perda de log vs. tempo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES:

[038] FFU/ml: medição da concentração do vírus vivo em uma determinada quantidade de fluido/cepa. Isso é medido pela propagação de uma quantidade conhecida do fluido viral sobre uma camada de células cultivadas que são infectadas pelo vírus e pela contagem do número da área na cultura que parecem infectadas.

[039] Título alvo: cada dose humana única de vacina contra rotavírus deve conter, no mínimo,105,5 ffu/dose para aumentar a imunogenicidade da vacina, até o término da vida útil da vacina; isso é referenciado como título alvo.

[040] A carga viral exigida é adicionada com base em título bruto, e o título alvo da formulação tem volume como base. Títulos brutos de rotavírus estão ao redor de 107,5 por dose, enquanto os títulos de formulação foram definidos ao redor de106,0 ou 105,5 por dose, exceto por alguns lotes que também foram formulados ao redor de título de 104,0 para verificar o efeito do título da vacina sobre a estabilidade para uma determinada composição. Todos os componentes são, por fim, expressos em termos de porcentagem de peso/volume.

[041] O título alvo comum foi de cerca de 106,0 no momento de preparação da vacina; o objetivo foi alcançar uma formulação de vacina com um título de no mínimo 105,0, depois de permitir perda de título de 0,5 log (com uma margem de erro de cálculo de título de cerca de +/- 0,30), depois de 2 anos de armazenamento a 2-8 oC. Qualquer composição que mostre uma perda de título maior que 0,3 em comparação ao título de dia zero a 2-8 oC é considerada como exibindo sinais de instabilidade. Obviamente, as perdas de título são altas a 25 oC e 37 oC como uma função do tempo de armazenamento, mas tais resultados são utilizados somente para fins de teste.

[042] O volume de dose total exemplificado nas várias faixas de formulação de 0,5 ml A 2,0 ml apresenta formulações que consideram o fato de que a vacina é capaz de ser facilmente absorvida pela criança. Os excipientes (açúcares) são dissolvidos na(s) solução(ões) de tampão desejada(s), uma vez que é prática comum nas preparações biológicas, enquanto os estabilizadores [(albumina sérica humana (HSA) / Lactoalbumina hidrolisada (LAH)] são compostos de soluções aquosas (em água para injeção), e todas as soluções são filtradas de maneira estéril. Ambas as soluções são preparadas com base em peso/volume. Enquanto vacina + tampão seja conhecido com 2,5 ml como volume total, com base em estudos de neutralização de ácido, volumes menores de tampão também foram testados. Isso também foi comprovado com informações disponíveis do domínio público sobre vacinas contra rotavírus comerciais.

[043] Conforme necessário, realizações detalhadas da presente invenção são reveladas aqui com a ajuda de exemplos; entretanto; deve ser compreendido que as realizações reveladas são meramente exemplos da invenção, que pode ser realizada de várias maneiras. Portanto, detalhes estruturais e funcionais específicos revelados aqui não devem ser interpretados como limitantes, mas como meramente uma base das reivindicações e como base representativa de ensinamento para um técnico no assunto para aplicação da presente invenção em praticamente qualquer estrutura apropriadamente detalhada. Ainda, os termos e as expressões utilizados aqui não devem ser limitantes, mas devem prover uma descrição compreensível da invenção.

[044] Exemplo 1: método de adaptação do rotavírus na presença de tripsina recombinante.

[045] Estudos de escala pequena foram realizados utilizando T flasks e CF1 (Cell Factory 1) , com escalação de até CF40 para estudar a infectividade e os resultados comparativos do rotavírus em células Vero. Cepa viral (VH) de fluido pós-infecção por ml em termos de resultados de cepa foi observada a cada 48 horas. Três conjuntos de experimentos foram realizados utilizando T Flasks e linhagens celulares, e a média dos três experimentos foi considerada; os resultados são mostrados na tabela abaixo.

[046] Tabela 1: resultado de cepa viral obtida a cada 38 horas após infecção na presença de tripsina recombinante e tripsina (origem animal).

[047] Assim, é evidente a partir dos experimentos que a tripsina recombinante gerou resultados comparativamente melhores que a tripsina suína, uma vez que a tripsina suína contém quimotripsina como impureza e não contém possíveis riscos associados a PCV 1 e 2, junto a PCBs.

[048] Exemplo 2: capacidade de tamponamento de vários tampões novos e vacina com formulações de tamponamento.

[049] Um tampão ideal pode ser selecionado pela medição da capacidade de tamponamento de um tampão particular. A capacidade de tamponamento é medida como a quantidade de tampão que manteria o pH em condições neutras de uma determina formulação, em ambientes altamente acídicos. Normalmente, quanto mais próximo o pH de tamponamento estiver do pKa, maior será a capacidade de tamponamento. A capacidade de tamponamento de vários tampões foi testada utilizando 34 mEq de ácido clorídrico. Os resultados de capacidade de tamponamento foram utilizados como base para incluir tais tampões nas formulações de vacina. A capacidade de tamponamento dos tampões e das formulações de vacina foi realizada utilizando 34 mEq de ácido clorídrico e o ensaio de Baby Rosette Rice estabelecido realizado na técnica anterior.

[050] Exemplo 2.1: capacidade de tamponamento dos vários tampões:

[051] Em seguida, os novos tampões foram verificados em relação a suas capacidades de tamponamento que podem ser incluídas nas formulações da vacina contra rotavírus:

[052] Tabela 2 (a): capacidade de tamponamento de outros tampões que podem ser utilizados como possíveis formulações de vacina+tampão com vacinas virais.

[053] Conclusões: sistemas de combinação de tampão carbonato-hidróxido de magnésio, carbonato-bicarbonato e citrato-bicarbonato são tampões potentes e, adição de 20 ml de ácido clorídrico concentrado (HCl), o pH foi reduzido para cerca de 6,5 a 7,0 em relação ao pH original. Tampão lactato de sódio e citrato de 0,05 M e tampões bicarbonatos de 0,1 M B são moderados, em que o pH alcança 5,5 a 6,0 após adição de 20 ml de HCl. Todos os tampões acima mencionados são capazes de neutralizar 5 ml de HCl quando o pH está na faixa de 9,0 a cerca de 7,0. Uma vez que o volume de suco gástrico é de aproximadamente 3,0 ml a 5,0 ml, todos esses tampões podem ser utilizados como tampões para reter o pH da vacina no estômago. Quando esse tampões são utilizados para formulação, em razão da presença de outros excipientes junto aos tampões, 1 ml de vacina é capaz de neutralizar 5 ml de ácido, mas com pH de cerca de 6,0, em vez de 7,0. Um pH de 6,0 não desestabilizará o antígeno viral e, assim, esses tampões podem ser adicionados a formulações de vacina oral.

[054] Além dos novos tampões acima mencionados, mistura de tampões à base de acetato de amônio foram verificados quanto à capacidade de tamponamento. Sistemas de combinação de mistura de tampão à base de acetato de amônio não foram mencionados na literatura da técnica anterior em relação a formulações de vacina contra rotavírus. A capacidade de tamponamento de tal mistura de tampões à base de amônio foi avaliada. Mistura de tampões com sais de amônio (acetato de amônio + bicarbonato de amônio + ortofosfato de di-amônio de 0,5 M) foi verificada para confirmar sua capacidade de tamponamento Para 0,5 ml de ácido clorídrico concentrado, mistura de tampão foi adicionada de 0,5 ml a 2 ml, e o pH foi verificado.

[055] Tabela 2(c); capacidade de tamponamento de mistura de tampão com sais de amônio

[056] Fica evidente a partir da tabela acima que, mesmo após adição de ácido clorídrico concentrado em 0,5 ml de tampão, o tampão é capaz de reter o pH de 7,25, o que indica que esses tampões com amônio são potentes e podem resistir a alterações de pH depois da adição de ácido concentrado e, quando o tampão é adicionado progressivamente de 0,5 ml a 2,0 ml, o pH aumenta na faixa de 7,7 a 8,0.

[057] Exemplo 2.2: capacidade de tamponamento de várias formulações de vacina e tampões:

[058] Em nossos esforços para desenvolver uma vacina e composições de tamponamento estáveis, uma grande quantidade de formulação foi preparada com vários tampões em uma ampla faixa de concentração. Alguns fatores de orientação foram aplicados no desenvolvimento de tais composições:

[059] - Capacidade de neutralização de ácido ou capacidade de tamponamento do tampão escolhido.

[060] - Volume de tampão deve ser menor que 2,0 ml para o sistema de ácido prescrito.

[061] - Estabilidade do tampão + combinação de vacina contra vírus.

[062] Para tais estudos, as composições de vacina líquida pura sem tampão, que demonstraram ser estáveis a 2-8 oC, serviram como base para a composição. Novamente, as composições que mostram um título menor que 0,5 log ou cujo título final é maior que 105,50 são consideradas composições estáveis.

[063] 2.2.1. Capacidade de tamponamento utilizando 34 mEq de HCl de várias formulações de vacina com tampão citrato-bicarbonato, carbonato-bicarbonato e citrato- fosfato também foi testada e fornecida na tabela abaixo.

[064] Tabela 2 (b) : capacidade de tamponamento de várias formulações de rotavírus com tampões.

[065] 2.2.2. Ensaio de Baby Rossette Rice: uma vez que a vacina contra rotavírus é administrada oralmente, ela será exposta à acidez gástrica, em que o pH é de cerca de 1,8 a 2,0; por isso, o antígeno do rotavírus será inativado. Para evitar essa possível inativação de vírus, os tampões utilizados nas formulações retêm a formulação em níveis neutros de pH. A inativação do rotavírus ocorre com pH de 2,0 ou 3,0; mas, com pH de 4,0, não há inativação ou há inativação mínima. A capacidade de tamponamento de uma determinada formulação é definida como o tempo medido para manter o pH da formulação acima de 4,0 e é avaliada pelo ensaio de Baby Rossette Rice, que é um método validado e mencionado na técnica anterior.

[066] Procedimento para ensaio de BRR : em uma proveta de 50 ml, água para injeção é adicionada à formulação para um volume final de 10 ml. A proveta foi colocada em banho-maria e a temperatura foi mantida a 37 oC. O pH inicial da solução foi medido e registrado. Depois, 4,0 ml de ácido clorídrico a 0,1N foi adicionado à proveta contendo o volume final de formulação de 10 ml. Ao mesmo tempo, a bomba para adição de 0,5 ml/minuto de HCl a 0,1N utilizando bomba peristáltica foi ligada. Os valores de pH, junto ao tempo, foram registrados por minuto, até retenção de pH de 4,0 ou acima. Interrupção do relógio e da bomba. (Referência: Geigy scientific Tables,Volume 1.1981 addition, Página 126). Várias formulações de vacina contra rotavírus com novos sistemas de combinação de tampão foram verificadas quanto à capacidade de tamponamento (os respectivos componentes dos detalhes da formulação foram mencionados quando aplicável). Os resultados de capacidade de tamponamento são mencionados na tabela abaixo.

[067] Tabela 2(d): resultados de ensaio de BRR de novas formulações de tampão e formulações de referência (figura 1)

[068] Tampão citrato-bicarbonato é tampão citrato trissódico de 0,03 M e bicarbonato de sódio de 0,3 M.

[069] O exemplo de formulação BV-8 contém mistura de tampão de sacarose de 40,0% p/v, trealose de 0,5% p/v, lactose de 5,0% p/v, lactoalbumina hidrolisada de 0,5 % p/v, rHSA de 0,08% p/v, ortofosfato de hidrogênio de di- amônio de 0,5 M, acetato de amônio e bicarbonato de amônio junto ao antígeno do rotavírus 116E de um volume de dose de 1 ml.

[070] O exemplo de formulação BV-9 contém mistura de tampão de sacarose de 30,0% p/v, trealose de 2% p/v, lactose de 5,0% p/v, lactoalbumina hidrolisada de 1 % p/v, rHSA de 0,08% p/v, ortofosfato de hidrogênio de di- amônio de 0,5 M, acetato de amônio e bicarbonato de amônio junto ao antígeno do rotavírus 116E de um volume de dose de 1,5 ml.

[071] CPB é tampão citrato trissódico de 0,35 M e potássio- fosfato de 0,05 M.

[072] O exemplo de formulação BV-10 contém tampão de sacarose de 40,0% p/v, trealose de -0,5% p/v, lactoalbumina hidrolisada de -0,5 % p/v, rHSA de -0,35% p/v, potássio-fosfato de 0,05 M e citrato trissódico de 0,35 M junto ao antígeno do rotavírus 116E, até um volume de dose de 2,0 ml.

[073] O exemplo de formulação BV-11 contém tampão de sacarose de 40,0% p/v, trealose de -0,5% p/v, lactoalbumina hidrolisada de 0,5 % p/v, rHSA de -0,35% p/v e potássio-fosfato de 1,1 M até um volume de dose de 2,0 ml.

[074] Conclusões:2,5 ml de citrato-bicarbonato também foram medidos separadamente, que foram administrados às crianças separadamente antes da administração da vacina de acordo com práticas anteriores que mantinham pH de 4 e acima por cerca de 12 minutos. Os exemplos de formulação BV-8 e BV- 9 de BBIL são os lotes de mistura de tampão à base de amônio e são capazes de neutralizar e manter o pH acima de 4,0 por cerca de 15 minutos.

[075] Alguns exemplos de formulação BV-10 incluem sistema de combinação de tampão preparado, em que a concentração de citrato é elevada para 0,35 M e o fosfato é reduzido para 0,05 M e verificado para capacidade de tamponamento utilizando 2.0 ml como volume de dose. A capacidade de tamponamento foi observada e identificada como sendo de 12 minutos. Essa formulação também é capaz de neutralizar ácido o suficiente e mostra boa capacidade de tamponamento. Portanto, nesse tampão, citrato de 0,35 M foi considerado.

[076] Exemplo 3: estabilidade das formulações de vacina contra rotavírus com novos tampões

[077] Entre os novos tampões, alguns dos tampões mais vantajosos que mostraram melhor estabilidade em comparação aos outros incluem sistema de tampão carbonato- bicarbonato, tampão carbonato -hidróxido de magnésio , sistema de tampão citrato-bicarbonato e uma mistura de tampão com sais de amônio. A estabilidade final das vacinas com esses novos tampões junto às formulações finais de vacina contra rotavírus e aos processos de fabricação foi calculada.

[078] Os experimentos incluem incorporação de íons de zinco para maior estabilidade das formulações finais de vacina contra rotavírus. Íons de zinco foram observados como capazes de aumentar a estabilidade da vacina pela interação com a composição de uma maneira que é conhecida na técnica. A patente de Inge Erk et.al Journal of Virology, Vol. 77, No. 6 Mar. 2003, p. 3595-3601 demonstra que as proteínas de cápside principais dos trímeros de VP6 do rotavírus apresentam papel significativo para alcançar a flexibilidade viral na presença de íons de zinco com um determinado pH e uma determinada temperatura. As novas formulações da vacina contra rotavírus incluem, portanto, íons de zinco para obter estabilidade aprimorada do antígeno do rotavírus nas formulações finais.

[079] A cepa de rotavírus humano 116E é naturalmente atenuada (recombinante humano-bovino). Estudos de estabilidade das formulações finais com o antígeno do rotavírus foram realizados em várias faixas de temperatura Várias formulações de vacina foram submetidas a temperaturas de 2° a 8 °C e 25 °C. Observações do título da vacina foram obtidas em termos de FFU/dose (unidades de formação de foco), obtidas em intervalos regulares com base nos protocolos. Uma queda máxima na faixa de perda de 0,3 log do título da vacina foi considerada para ser mantida como uma formulação de vacina contra rotavírus estável com os novos sistemas de tampão a 2-8 oC. Como explicado anteriormente, o título viral da vacina é medido como uma função do tempo de armazenamento para avaliar a estabilidade da formulação. Para cada caso, como descrito nos exemplos abaixo, foi observado que, após 24 meses de armazenamento, a 2-8 oC, a formulação da vacina foi demonstrada como sendo estável (com perda mínima ou nenhuma perda considerando a barra de erro). Entretanto, em temperatura ambiente, um máximo de perda de 1,5 log no título da vacina foi observado para um período de seis meses. Tal perda no título da vacina conclui a estabilidade da vacina a 25 oC por seis meses.

[080] Exemplo 3.1: estabilidade das formulações de rotavírus com combinações de tampão citrato-fosfato.

[081] O exemplo de formulação BV-10 contém tampão de sacarose de 40,0% p/v, trealose de -0,5% p/v, lactoalbumina hidrolisada de -0,5 % p/v, rHSA de -0,35% p/v, potássio-fosfato de 0,05 M e citrato trissódico de 0,35 M junto ao antígeno do rotavírus 116E, até um volume de dose de 2,0 ml.

[082] O exemplo de formulação BV-11 contém tampão de sacarose de 40,0% p/v, trealose de -0,5% p/v, lactoalbumina hidrolisada de 0,5 % p/v, rHSA de -0,35% p/v e potássio-fosfato de 1,1 M até um volume de dose de 2,0 ml.

[083] Os dados de estabilidade de BV-10 E BV-11 são fornecidos abaixo:

[084] Tabela 3(a): estabilidade a 2-8 oC de BV-10 e BV-11 (figura 2).

[085] Tabela 3(b): estabilidade a 25 oC de BV-10 e BV-11 (figura 3).

[086] Tabela 3(c): estabilidade a 37 oC de BV-10 e BV-11 (figura 4).

[087] Exemplo 3.2: formulações de vacina com tampão citrato de 0,03 M e tampão bicarbonato de 0,3 M (tampão CB).

[088] Citrato trissódico desidratado (peso molecular 294,1 gm) até uma quantidade de 9,6 gm e bicarbonato de sódio anídrico (peso molecular de 84,01 gm) até uma quantidade de 25,6 gm foram adicionados sequencialmente a 500 ml em um frasco de vidro estéril de modo a alcançar 0,032 M de citrato e 0,3 M de bicarbonato . Os componentes foram dissolvidos completamente e o volume foi ajustado para 1 litro com WFI (água para injeção). O pH foi verificado e mantido em um nível entre 8,2 e 8,4. O recipiente de tampão foi, então, transferido para um vaso de pressão de aço inoxidável (SS) de 2L e conectado com filtro. A solução foi filtrada através de filtro de 0,2μ sob cabine de segurança biológica pelo uso de ar comprimido. O tampão foi coletada em outro frasco estéril e o frasco foi rotulado e armazenado a 2-8 oC para uso futuro.

[089] As formulações foram feitas utilizando esse sistema de combinação de tampão citrato-bicarbonato, (0,032 M e 0,3 M, respectivamente), preparado incluindo antígeno do rotavírus 116E a 106 ffu/dose e outros estabilizadores e componentes, como mencionados abaixo, em volumes de dose, como mencionados na seguinte tabela, correspondendo a cada formulação (identificada por número exclusivo de formulação, conforme apropriado, divididas pela Bharat Biotech International Limited nas tabelas), e a estabilidade da formulação da vacina a 2° a 8 °C e a 25 °C foi testada em vários intervalos de tempo, até aproximadamente 2 anos; os resultados são fornecidos nos gráficos anexados (Figuras 5 e 6).

[090] Tabela 3(d): formulações de vacina contra rotavírus com tampões CB.

[091] Tabela 3 (e) . : estabilidade da vacina contra rotavírus a 2-8 oC com tampão CB (Figura 1)

[092] Tabela 3(f): estabilidade da vacina contra rotavírus a 25 oC com tampão CB (Figura 2)

[093] Exemplo 3.3: formulações de vacina com tampão(ões) de carbonato e bicarbonato (0,2 M e 0,1 M) (Tampão CAB).

[094] Um dos outros sistemas de tampão apropriados para uso para preparações de vacina que serão ingeridas e assimiladas pelo corpo humano é o sistema de tampão carbonato-bicarbonato. Isso ocorre porque esse sistema de tampão é responsável por cerca de 80% de tamponamento extracelular e está presente no plasma na forma de uma combinação de ácido carbônico (H2CO3) e bicarbonato (HCO3 - ) para manter um pH entre 7,35-7,45. Esse sistema é altamente útil para uso em um ambiente orgânico, uma vez que atende às necessidades de não inibição da ação enzimática, faixa de pH alcalino útil, simplicidade e estabilidade razoavelmente boa. Esse sistema de combinação de tampão não foi relatado na técnica anterior, particularmente com molaridades de bicarbonato menores que 0,15 M.

[095] Exemplo 5.1: tampão carbonato-bicarbonato de 0,2 M:

[096] Carbonato de sódio anídrico (peso molecular 105,99 gm) até uma quantidade de 1,69 gm e bicarbonato de sódio anídrico (peso molecular de 84,01 gm) até uma quantidade de 15,4 gm foram adicionados sequencialmente a 500 ml em um frasco de vidro estéril de modo a alcançar 0,2 M de carbonato e 0,2 M de bicarbonato . Os componentes foram dissolvidos completamente e o volume foi ajustado para 1 litro com WFI (água para injeção). O pH foi verificado e mantido em um nível entre 9,2 e 9,5. O recipiente de tampão foi, então, transferido para um vaso de pressão de aço inoxidável de 2L e conectado com filtro. A solução foi filtrada através de filtro de 0,2μ sob cabine de segurança biológica pelo uso de ar comprimido. O tampão foi coletada em outro frasco estéril e o frasco foi rotulado e armazenado a 2-8 oC para uso futuro.

[097] Exemplo 5.2: tampão carbonato-bicarbonato de 0,1 M

[098] Carbonato de sódio anídrico (peso molecular 105,99) até uma quantidade de 0,53 gm e bicarbonato de sódio anídrico (peso molecular 84,01) até uma quantidade de 7,98 gm foram adicionados sequencialmente a 500 ml em um frasco de vidro estéril de modo a alcançar 0,1 M de carbonato e 0,1 M de bicarbonato . Os componentes foram dissolvidos completamente e o volume foi ajustado para 1 litro com WFI (água para injeção). O pH foi verificado e mantido em um nível entre 9,2 e 9,5. O recipiente de tampão foi, então, transferido para um vaso de pressão de aço inoxidável de 2L e conectado com filtro. A solução foi filtrada através de filtro de 0,2μ sob cabine de segurança biológica pelo uso de ar comprimido. O tampão foi coletada em outro frasco estéril e o frasco foi rotulado e armazenado a 2-8 oC para uso futuro.

[099] Formulações foram feitas utilizando esse sistema de combinação de tampão carbonato-bicarbonato de 0,2 M e esse sistema de combinação de tampão carbonato- bicarbonato de 0,1 M, preparadas incluindo antígeno do rotavírus 116E a 106 ffu/dose e outros estabilizadores e componentes, como mencionado abaixo, em volumes de dose, como mencionado na seguinte tabela, correspondendo a cada formulação (identificada por números exclusivos de formulação como mencionados na Tabela 3(g)), e a estabilidade da formulação da vacina a 2° a 8 °C e 25 °C foi testada em vários intervalos de tempo, até aproximadamente 2 anos; os resultados são fornecidos no gráfico anexado (Figuras 7 e 8).

[0100] Tabela 3(g): formulações de vacina contra rotavírus com tampões CAB.

[0101] Tabela 3(h): estabilidade da formulação da vacina contra rotavírus a 2-8 oC com tampões CAB (Figura3).

[0102] Estabilidade a 25 oC

[0103] Tabela 3(i): Estabilidade da formulação da vacina contra rotavírus a 25 oC com tampões CAB (Figura 4)

[0104] Exemplo 3.4: formulações da vacina com tampão carbonato-hidróxido de magnésio de 0,1 M (Tampão MHC)

[0105] Carbonato-hidróxido de magnésio dihidratado (peso molecular de 314,98 gm) foi sequencialmente adicionado a 500 ml de água para injeção em um frasco de vidro estéril de maneira a alcançar 0,1 M de carbonato- hidróxido de magnésio. Os componentes foram agitados para homogeneidade, uma vez que esse sal é insolúvel em água. A suspensão foi feita para um volume de 1 litro com água para injeção dissolvida completamente e o volume foi ajustado para 1 litro com WFI (água para injeção). O pH foi verificado e mantido em um nível entre 10 e 10,5. A solução foi esterilizada por autoclave a 121 oC por 30 minutos. O tampão foi coletada em outro frasco estéril e o frasco foi rotulado e armazenado a 2-8 oC para uso futuro.

[0106] Formulações utilizando esse sistema de combinação de tampão carbonato-hidróxido de magnésio de 0,1 M foram preparadas incluindo antígeno do rotavírus 116E a 106 ffu/dose e outros estabilizadores e componentes, como mencionado abaixo, em volumes de dose, como mencionado na seguinte tabela, correspondendo a cada formulação (identificada por números exclusivos de formulação como mencionados na Tabela 3(j)), e a estabilidade da formulação da vacina a 2° a 8 °C e 25 °C foi testada em vários intervalos de tempo, até aproximadamente 2 anos; os resultados são fornecidos no gráfico anexado (Figura 9).

[0107] Tabela 3(j): formulações de vacina contra rotavírus com tampões MHC.

[0108] Estabilidade a 2-8 oC e 25 oC

[0109] Tabela 3(k): estabilidade da formulação da vacina contra rotavírus a 2-8 oC e 25 oC com tampões MHC (Fig.5).

[0110] Exemplo 3.5: formulações da vacina com mistura de tampão de 0,5 M com sais de amônio (Mistura de tampão)

[0111] Ortofosfato de hidrogênio de di-amônio (peso molecular 132,06 gm) até uma quantidade de 66,03 gm, acetato de amônio (peso molecular 77,08 gm) até uma quantidade de 38,54 gm e bicarbonato de amônio (peso molecular 79,02 gm) até uma quantidade de 39,51 foram adicionados a 500 ml de água para injeção em frasco de vidro estéril de maneira a alcançar 0,5 M da mistura de tampão com os sais de amônio. Os componentes foram dissolvidos completamente e o volume foi ajustado para 1 litro com WFI (água para injeção). O pH foi verificado e mantido em um nível entre 7,6 e 7,8. O recipiente de tampão foi, então, transferido para um vaso de pressão de aço inoxidável de 2L e conectado com filtro. A solução foi filtrada através de filtro de 0,2μ sob cabine de segurança biológica pelo uso de ar comprimido. O tampão foi coletada em outro frasco estéril e o frasco foi rotulado e armazenado a 2-8 oC para uso futuro.

[0112] Formulações utilizando esse sistema de combinação de mistura de tampão de 0,5 M foram preparadas incluindo antígeno do rotavírus 116E a 106 ffu/dose e outros estabilizadores e componentes, como mencionado abaixo, em volumes de dose, como mencionado correspondendo a cada formulação (identificada por números exclusivos de formulação como mencionados na Tabela 3(l)), e a estabilidade da formulação da vacina a 2° a 8 °C foi testada em vários intervalos de tempo durante um período de 1 ano; os resultados são fornecidos no gráfico anexado (Figuras 10 a 13).

[0113] Tabela 3(l).: formulações da vacina contra rotavírus com mistura de tampão (acetato de amônio + bicarbonato de amônio + ortofosfato de di-amônio) de 0,5 M

[0114] Estabilidade a 2-8 oC

[0115] Estabilidade de BV 9 e BV 10 a 2-8 grausC

[0116] Tabela 3(m): estabilidade da formulação da vacina contra rotavírus a 2-8 oC com mistura de tampão (Figura 6)

[0117] Exemplo 4: valores de pH dos tampões e das formulações da vacina antes e depois do período de estabilidade das formulações

[0118] Também é importante verificar o pH dos tampões utilizados em formulações diferentes e os valores de pH correspondentes enquanto os tampões estiverem presentes nas formulações finais da vacina. Isso serve para verificar as faixas de pH determinadas da formulação final da vacina durante e depois do período de armazenamento da vacina. Os dados são apresentados abaixo. Os sistemas com base em bicarbonato estão acima de pH 8, o que está acima do pH de tampão fisiológico. Entretanto, a vacina é estável mesmo após 2 anos a 2-8 graus C e após o período de estabilidade.

[0119] Tabela 3(n): pH do tampão e pH da vacina antes e após formulações no dia 0 e em 24 meses.

[0120] Além disso, experimentos foram realizados com componentes fixos de formulação com mudança dos vários tampões, e a estabilidade das formulações da vacina foi estudada durante períodos prolongados. As figuras correspondentes 13 e 14 mostram a estabilidade da vacina comparativa com vários tampões novos e componentes fixos de formulação que incluem sacarose de 40% p/v, trealose de 0,5% p/v, LAH de 1% p/v, rHSA de 0,35% p/v e antígeno do rotavírus 116E.

REFERÊNCIAS:

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[0123] 3. Patente dos EUA 6403098 (Merck) e patente dos EUA 6616931 (Merck).

[0124] 4. Inge Erk et.al Journal of Virology, Vol. 77, No. 6 Mar. 2003, p. 3595-3601.

[0125] 5.http://www.ou.edu/research/electron/bmz 5364/buffers.html acesso em 10/02/2012.

[0126] 6.http://nature.berkeley.edu/soilmicro/me thods/phosphate%20buffer.pdf acesso em 10/02/2012.

[0127] 7. Guidelines to assure the quality, safety and efficacy of live attenuated rotavirus vaccines (oral) WHO Technical Report Series No 941, 2007.

[0128] 8. Harry B. Greenberg, Mary K. Estes, Rotaviruses: From Pathogenesis to Vaccination, doi:10,1053/j.gastro.2009,02.076. (Gastroenterology 2009).

[0129] 8. Penelope H. Dennehy, Rotavirus Vaccines: an Overview,Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2008, Vol.21, No. 1, p. 198-208.

[0130] 9. Bresee JS, Glass RI, Ivanoff B, Gentsch J. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine 1999;17:2207-22.

[0131] 10. (Ref:Geigy scientific Tables,Volume 1.1981 addition, Page 126).

Claims

1. FORMULAÇÃO DE VACINA LÍQUIDA, caracterizada por compreender: i. antígeno do rotavírus 116E presente em uma faixa de concentração entre 104,5 a 105,5 ffu/dose; ii. sistema de combinação de tampão, em que o dito sistema de tampão de combinação é selecionado a partir de tampão de combinação de carbonato-bicarbonato, tampão de combinação de carbonato-hidróxido de magnésio e um sistema de tampão de combinação misto; iii. combinação de açúcares, em que a combinação de açúcar compreende sacarose, lactose e trealose, em que a sacarose está presente em uma faixa de concentração entre 20 a 75% peso/volume (p/v), a lactose está presente em uma faixa de concentração de até 10% p/v e a trealose está presente em uma faixa de concentração de até 1% p/v; iv. albumina sérica humana recombinante presente em uma faixa de concentração de até 0,4% p/v; v. Lactoalbumina hidrolisada de proteína parcialmente hidrolisada presente em uma faixa de concentração de até 10% p/v, em que a dita formulação de vacina é estável por pelo menos dois anos a 2-8°C e seis meses a 25°C; em que a referida formulação está presente em um volume de dose de 0,5 mL a 1,5 mL.

2. FORMULAÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema de combinação de tampão ser um sistema tampão de carbonato de sódio 0,1 M - 0,2 M e bicarbonato de sódio 0,1 M - 0,2 M.

3. FORMULAÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema de combinação de tampão ser um sistema de tampão de carbonato-bicarbonato, em que o carbonato-bicarbonato está presente em uma faixa de concentração entre 0,01 M e 0,5 M.

4. FORMULAÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema de combinação de tampão ser um sistema de tampão de carbonato-hidróxido de magnésio, em que o sistema de combinação de tampão carbonato- hidróxido de magnésio está presente em uma faixa entre 0,01 M e 0,5 M.

5. FORMULAÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sistema de combinação de tampão misto ser um sistema de tampão misto compreendendo acetato de amônio; bicarbonato de amônio e ortofosfato de di- amônio, em que o dito tampão misto está presente em uma faixa de concentração entre 0,01 M e 2 M.

6. FORMULAÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pH da formulação estar entre 7 a 8,5.