DE60028390T2

DE60028390T2 - Methoden um rotavirusvarianten zu trennen und lebender attenuierter rotavirus impfstoff

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Publication number: DE60028390T2
Application number: DE60028390T
Authority: DE
Inventors: Desiree Brigitte COLAU; GlaxoSmithKline Francoise DENAMUR; GlaxoSmithKline Isabelle KNOTT; GlaxoSmithKline Annick POLISZCZAK; Care of GlaxoSmithKline Georges THIRY; GlaxoSmithKline Vincent VANDE VELDE
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-08-16
Also published as: NL300233I2; MXPA02001648A; AU767885B2; BRPI0013357B1; NL300233I1; CO5580165A1; KR100695599B1; US7285280B1; LU91251I9; FR06C0018I1; CA2379196A1; WO2001012797A2; PE20010487A1; IL147926A0; IL147926A; US20080063662A1; TWI283270B; JP2003507040A; SI1212084T1; HUP0203335A1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Impfstofformulierungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Therapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Rotavirus-Impfstofformulierungen.
Akute infektiöse Diarrhoe ist eine führende Ursache für Krankheit und Tod in vielen Gebieten der Welt. In Entwicklungsländern ist der Einfluß von diarrhoischer Erkrankung schwindelerregend. Für Asien, Afrika und Lateinamerika wurde geschätzt, daß es zwischen 3 und 4 Milliarden Fälle von Diarrhoe jedes Jahr gibt und unter diesen Fällen ca. 5 bis 10 Millionen zum Tod führen (J.A. Walsh et al.: N. Engl. J. Med., 301:967–974 (1979)).
Rotaviren wurden als eine der wichtigsten Ursachen für schwere Diarrhoe bei Kleinkindern und jungen Kindern erkannt (M.K. Estes, Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, 3. Auflage, herausgegeben von Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Es wird geschätzt, daß Rotavirus-Erkrankung verantwortlich für mehr als eine Million Todesfälle jährlich ist. Rotavirus-induzierte Krankheit betrifft meist Kinder im Alter zwischen 6 und 24 Monaten, und die Spitze des Vorherrschens der Krankheit tritt allgemein während der kühleren Monate in gemäßigten Klimazonen und über das ganze Jahr in tropischen Gebieten auf. Rotaviren werden typischerweise von Mensch zu Mensch durch den fäkal-oralen Weg mit einem Inkubationszeitraum von ca. 1 bis ca. 3 Tagen übertragen. Anders als die Infektion in der Altersgruppe von 6 bis 24 Monaten sind Neugeborene allgemein asymptomatisch oder haben nur eine milde Erkrankung. Im Gegensatz zur schweren Erkrankung, die normalerweise bei jungen Kindern angetroffen wird, sind die meisten Erwachsenen als Ergebnis einer vorhergehenden Rotavirusinfektion geschützt, so daß die meisten Infektionen von Erwachsenen mild oder asymptomatisch sind (P.A. Offit et al., Comp. Ther., 8(8): 21–26, 1982).
Rotaviren sind allgemein kugelförmig, und ihr Name stammt aus ihrer besonderen äußeren und inneren oder doppelschaligen Kapsidstruktur. Typischerweise umgibt die doppelschalige Kapsidstruktur eines Rotavirus eine innere Proteinschale oder einen inneren Proteinkern, die/der das Genom enthält. Das Genom eines Rotavirus ist aus 11 Segmenten von doppelsträngiger RNA zusammengesetzt, die wenigstens 11 unterschiedliche virale Proteine codieren. Zwei dieser viralen Proteine, die als VP4 und VP7 bezeichnet werden, sind auf der Außenseite der doppelschaligen Kapsidstruktur angeordnet. Das innere Kapsid des Rotavirus stellt ein Protein dar, daß das als VP6 bezeichnete Rotavirusprotein ist. Die relative Bedeutung dieser drei besonderen rotaviralen Proteine in der Hervorrufung der Immunreaktion, die einer Rotavirusinfektion folgt, ist noch nicht klar. Dennoch bestimmt das VP6-Protein das Gruppen- und Untergruppenantigen, und VP4- und VP7-Proteine sind die Determinanten der Serotypspezifität.
Das VP7-Protein ist ein 38 000 MG Glykoprotein (34 000 MG, wenn unglykosyliert), daß das Translationsprodukt des genomischen Segments 7, 8 oder 9 ist, abhängig vom Stamm. Diese Protein stimuliert die Bildung des neutralisierenden Hauptantikörpers nach einer Rotavirusinfektion. Das VP4-Protein ist ein unglykosyliertes Protein mit ca. 88 000 MG, das das Translationsprodukt des genomischen Segments 4 ist. Dieses Protein stimuliert auch neutralisierenden Antikörper nach einer Rotavirusinfektion.
Da die VP4- und VP7-Proteine die viralen Proteine sind, gegen die neutralisierende Antikörper gerichtet sind, wird angenommen, daß sie die Spitzenkandidaten für die Entwicklung von Rotavirusimpfstoffen sind, die Schutz gegen Rotaviruserkrankung liefern.
Es ist bekannt, daß eine natürliche Rovatvirusinfektion während der frühen Kindheit eine Schutzimmunität hervorruft. Ein lebend abgeschwächter Rotavirusimpfstoff (abgeschwächter Lebendrotavirusimpfstoff) ist daher hoch wünschenswert. Bevorzugt sollte dieser ein oraler Impfstoff sein, da dies der natürliche Infektionsweg des Virus ist.
Eine frühe Impfstoffentwicklung zur Verhinderung von Rotavirusinfektionen begann in den 1970iger Jahren nach der Entdeckung des Virus. Anfänglich wurden abgeschwächte Stämme aus Tieren und Menschen untersucht und hatten gemischte und enttäuschende Ergebnisse. Neuere Anstrengungen haben sich auf human-tierische Neuordnungen (Reassortanten) gerichtet, die erfolgreicher waren.
Ein als 89-12 bekannter Rotavirusstamm wurde von Ward beschrieben, siehe US-PS 5,474,773 und D.L. Bernstein et al., Vaccine, 16 (4), 381–387, 1998. Der 89-12-Stamm wurde aus einer Exkrementprobe isoliert, die 1988 von einem 14 Monate alten Kind mit natürlicher Rotaviruserkrankung entnommen wurde. Gemäß US-PS 5,474,773 wurde das humane HRV 89-12-Rotavirus dann durch zwei Passagen in primären Zellen aus Grüner Meerkatzenniere ("African Green Monkey Kidney", AGMK) und 4 Passagen in MA-104-Zellen kulturangepaßt, wie beschrieben von Ward, J. Clin. Microbiol. 19, 748–753, 1984. Es wurde dann dreimal in MA-104-Zellen Plaque-gereinigt (bis Passage 9) und nach zwei zusätzlichen Passagen in diesen Zellen kultiviert. Eine zusätzliche Passage (Passage 12) erfolgte zur Hinterlegung bei der ATCC unter der Eingangs-Nr. ATCC VR 2272. Der hinterlegte Stamm ist als 89-12C2 bekannt.
Die Veröffentlichung von Bernstein et al. 1989 in Vaccine wird nachfolgend als die Vaccine (1998)-Veröffentlichung bezeichnet. Die Veröffentlichung beschreibt die Sicherheit und Immunogenität eines oral verabreichten lebenden humanen Rotavirusimpfstoffkandidaten. Dieser Impfstoff wurde aus Stamm 89-12 erhalten, abgeschwächt durch 26-maliges Passagieren ohne Plaquereinigung in primären AGMK-Zellen und weitere 7-mal in einer etablierten AGMK-Zellinie (insgesamt 33 Passagen).
Nachfolgend wird das zuvor genannte Material, das seriell 26-mal passagiert wurde, als P26 bezeichnet, und das Material, das seriell 33-mal passagiert wurde, wird als P33 bezeichnet. Allgemein wird Rotavirus, das durch n-maliges Passagieren von 89-12 abgeleitet wurde, als Pn bezeichnet.
In den nachfolgenden Beispielen wurde das P33-Material weitere 5-mal in Verozellen passagiert. Dies wird als P38 bezeichnet.
Die in der Vaccine (1998)-Veröffentlichung beschriebenen P26- und P33-Isolate wurde nicht in einer Kultursammlung hinterlegt, noch wurden sie analysiert, um ihre genetische Charakterisierung zu ermitteln.
Es wurde jetzt festgestellt, daß die in der Literatur beschriebenen P26-Population eine Mischung von Varianten umfaßt. Dies wurde durch genetische Charakterisierung wie hier nachfolgend beschrieben ermittelt (siehe Beispiele). P26 ist deshalb keine verläßliche konsistente Population für weitere Passagen, insbesondere zur Produktion von Impfstoffchargen. In ähnlicher Weise umfaßt P33 eine Mischung von Varianten und ist nicht verläßlich konsistent für die Produktion von Impfstoffchargen.
Es wurde festgestellt, daß das P26-Material eine Mischung aus wenigstens drei VP4-Genvarianten ist. P33 und P38 sind in ähnlicher Weise eine Mischung aus zwei Varianten. Diese Varianten scheinen in bezug auf neutralisierende Epitope antigenisch unterschiedlich gegenüber dem 89-12C2-Stamm zu sein, der bei der ATCC hinterlegt ist, wenn die neutralisierenden Antikörpertiter von Seren aus Kleinindern, die mit P33 geimpft wurden, gegen diese Varianten ausgewertet werden. Dies wird in 3 veranschaulicht.
Außerdem wurde festgestellt, daß dann, wenn das P33-Material an Kleinkinder verabreicht wird, zwei identifizierte Varianten repliziert und ausgeschieden werden. Unter 100 geimpften Kleinkindern zeigten nur 2 Anzeichen für Gastroenteritis aufgrund von Rotavirusinfektion, während 20 % einer Plazebogruppe infiziert wurden. Diese Befunde legen nahe, daß die identifizierten Varianten mit Schutz vor Rotaviruserkrankung verbunden sind. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Trennung von Rotavirusvarianten und einen aus einem klonierten (homogenen) humanen Rotavirusstamm abgeleiteten verbesserten lebend abgeschwächten Rotavirusimpfstoff bereit.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt eine abgeschwächte Rotaviruspopulation (Isolat) bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine einzelne Variante oder im wesentlichen eine einzelne Variante umfaßt, wobei die Variante durch die Nukleotidsequenz definiert ist, die wenigstens eines der als VP4 und VP7 bezeichneten Hauptvirusproteine codiert.
Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Rotaviruspopulation eine klonierte Variante.
Mit einer Population, die eine einzelne Variante oder im wesentlichen eine einzelne Variante umfaßt, ist eine Rotaviruspopulation gemeint, die nicht mehr als 10 %und bevorzugt weniger als 5 % und am meisten bevorzugt weniger als 1 % einer unterschiedlichen Variante oder unterschiedlicher Varianten enthält. Viruspopulationen können zur Homogenität oder substantiellen Homogenität durch Passagieren in geeigneten Zelltypen oder durch Durchführen einer Reihe aus einem oder mehreren Klonierungsschritten gereinigt werden.
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Population, die eine einzelne Variante umfaßt, geeigneter zur Formulierung einer konsistenten Impfstoffcharge ist. Besondere Varianten, die durch Nukleotidsequenzen definiert sind, die das Hauptvirusprotein codieren, können auch mit gesteigerter Wirksamkeit in der Prävention von Rotavirusinfektion verbunden sein.
In einem bevorzugten Aspekt ist die einzelne oder im wesentlichen einzelne Variante in der Rotaviruspopulation der Erfindung eine Variante, in der das VP4-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens eines der folgenden umfaßt: eine Adeninbase (A) in Position 788, eine Adeninbase (A) in Position 802 und eine Thyminbase (T) in Position 501 ab dem Startcodon.
In einem weiteren Aspekt ist die einzelne oder im wesentlichen einzelne Variante in der Population der Erfindung eine Variante, in der das VP7-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens eines der folgenden umfaßt: ein Thymin (T) in Position 605, ein Adenin (A) in Position 897 oder ein Guanin (G) in Position 897 ab dem Startcodon. Bevorzugt gibt es in Position 897 ein Adenin (A).
In einem bevorzugten Aspekt hat die einzelne Variante in der erfindungsgemäßen Population ein Adenin (A) in Positionen 788 und 802 und ein Thymin (T) in Position 501 ab dem Startcodon in der VP4-Gensequenz.
In einem anderen bevorzugten Aspekt hat die einzelne Variante in der erfindungsgemäßen Population ein Thymin (T) in Position 605 und ein Adenin/Guanin (A/G) in Position 897 ab dem Startcodon in der VP7-Sequenz. Am meisten bevorzugt gibt es in der VP7-Sequenz ein Adenin (A) in Position 897.
In einem besonders bevorzugten Aspekt hat die einzelne Variante in der erfindungsgemäßen Population ein Adenin (A) in Positionen 788 und 802 und ein Thymin (T) in Position 501 ab dem Startcodon in der VP4-Gensequenz und ein Thymin (T) in Position 605 und ein Adenin/Guanin (A/G) in Position 897 ab dem Startcodon in der VP7-Sequenz. Am meisten bevorzugt gibt es in der VP7-Sequenz ein Adenin (A) in Position 897.
In einem anderen Aspekt umfaßt die einzelne Variante eine Nukleotidsequenz, die ein VP4-Protein codiert, worin die Nukleotidsequenz wie in 1 gezeigt ist, und/oder eine Nukleotidsequenz, die ein VP7-Protein codiert, worin die Nukleotidsequenz wie in 2 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Rotaviruspopulation bereit, die eine im wesentlichen einzelne Variante umfaßt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
Passagieren einer Rotaviruszubereitung in einem geeigneten Zelltyp; gegebenenfalls Selektieren von homogener Kultur unter Verwendung der Schritte von entweder:

a) Limit-Dilution; oder
b) individueller Plaqueisolierung; und

Überprüfen auf Gegenwart einer im wesentlichen einzelnen Variante durch Durchführung einer Sequenzbestimmung einer geeigneten Region der VP4- und/oder VP7-Gensequenz.
Die Sequenzbestimmung kann in geeigneter Weise durch eine quantitative oder halbquantitative Hybridisierungstechnik wie Slot-Blot-Hybridisierung oder Plaque-Hybridisierung durchgeführt werden.
Bevorzugt ist die ausgewählte Variante eine Variante, die repliziert oder ausgeschieden wird, wenn die Ausgangsrotaviruszubereitung an einen menschlichen Patienten verabreicht wird, insbesondere an ein Kind.
Die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierende klonierte Viruspopulation kann durch weiteres Passagieren in einer geeigneten Zellinie amplifiziert werden.
Geeignete Zelltypen zum Passagieren der Rotaviruspopulation im obigen Verfahren schließen Zellen aus Grüner Meerkatzenniere (AGMK) ein, die etablierte Zellinien oder primäre AGMK-Zellen sein können. Geeignete AGMK-Zellen schließen zum Beispiel Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) und CV-1 (ATCC CCL-70) ein. Auch geeignet sind die Zellinien MA-104 (Rhesusaffe) und MRC-5 (human – ATCC CCL-171). Vero-Zellen sind besonders bevorzugt für Amplifikationszwecke. Das Passagieren in Vero-Zellen ergibt eine hohe Virusausbeute.
Techniken zur Überprüfung, ob es eine einzelne Variante in einer Viruspopulation gibt, die aus dem Verfahren resultiert, und zur Bestimmung der Natur dieser einzelnen Variante beinhalten standardmäßige Sequenzierungs- oder Hybridisierungsverfahren, die fachbekannt sind und hier nachfolgend beschrieben werden.
In einem bevorzugten Aspekt wird das Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines geeigneten Rotavirus durchgeführt, insbesondere mit einem Rotavirus mit den Eigenschaften des 89-12-Stammes oder eines passagierten Derivats davon.
Eine besonders bevorzugte Population einer einzelnen Variante ist P43, die aus P33 (einem isolierten humanen Rotavirus, 33-mal in Kultur in geeigneten Zelltypen passagiert) durch eine Reihe von Endverdünnungsklonierungsschritten, gefolgt von Passagieren des klonierten Materials in Vero-Zellen zur Amplifikation erhalten wurde.
Eine P43-Population wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Vereinigtes Königreich, am 13. August 1999 unter der Hinterlegungs-Nr. 99081301 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
Obwohl diese angegebene öffentliche Zugänglichkeit das einfachste Verfahren zum Erhalt des humanen Rotavirus P43 ist, ist es nicht ganz unmöglich oder unwahrscheinlich, daß ähnliche oder funktionell im wesentlichen identische Rotaviren durch diese oder andere Verfahren angesichts der Lehren dieser Erfindung hergestellt werden könnten. Solche funktionell im wesentlichen identischen Rotaviren werden als biologisch äquivalent mit dem humanen Rotavirus P43 dieser Erfindung betrachtet und sind deshalb im allgemeinen Umfang der vorliegenden Erfindung. Es versteht sich deshalb, daß die Erfindung Rotaviruspopulationen mit den Eigenschaften der P43-Variante wie hier beschrieben umfaßt.
Es versteht sich auch, daß die Erfindung Materialien umfaßt, die aus dem hinterlegten P43 ECACC 99081301 durch dessen weiteres Verarbeiten abgeleitet werden, wie zum Beispiel durch dessen Vermehren durch weiteres Passagieren, Klonieren oder andere Verfahren unter Verwendung des lebenden Virus oder durch Modifizieren von P43 in beliebiger Weise, einschließlich Gentechnik oder Neuordnungstechniken. Solche Schritte und Techniken sind allgemein fachbekannt.
Aus dem hinterlegten P43 abgeleitete Materialien, die von der Erfindung umfaßt sind, schließen Protein- und genetisches Material ein. Von besonderem Interesse sind neukombinierte Rotaviren, die wenigstens ein Antigen oder wenigstens ein Segment von P43 umfassen, zum Beispiel Neuordnungen, die einen virulenten Stamm des Rotavirus umfassen, in dem eines oder ein Teil eines der 11 Genomsegmente durch das Genomsegment von P43 oder einen Teil davon ersetzt wurde. Spezifisch kann eine Rotavirusneuordnung ("Reassortante"), in der das Segment oder Teilsegment, das für NSP4 codiert, ein P43-Segment ist, nützliche Eigenschaften haben. Neukombinierte Rotavirusen und Techniken zu ihrer Herstellung sind allgemein bekannt (R.H. Foster und A.H. Wagstaff, Tetravalent Rotavirus Vaccine, A Review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155–178, 1998).
Materialien von besonderem Interesse sind die Nachkommenschaft von P43 und immunologisch aktive Derivate von P43. Immunologisch aktive Derivate bezeichnen Materialien, die aus oder mit dem P43-Virus erhalten werden, insbesondere Antigene des Virus, die eine Immunreaktion hervorrufen können, die reaktiv gegen das Rotavirus bei Injektion in ein Wirtstier ist.
Bei der Anpassung des Rotavirus an eine geeignete Zellinie, zum Beispiel Vero-Zellen, kann es notwendig sein, das Virus so zu behandeln, daß eine potentielle Verunreinigung verlorengeht, wie zum Beispiel etwaige zufällige Mittel, die vorhanden sein können und die ansonsten eine Kontamination verursachen würden. Im Fall von etherempfindlichen adventiven Viren kann dies durch Etherbehandlung wie hier nachfolgend beschrieben erfolgen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch den Einschluß einer solchen Etherbehandlung als einen optionalen Schritt im Gesamtverfahren zum Erhalt eines abgeschwächten lebenden Rotavirus oder eines damit formulierten Impfstoffs.
Auch im Umfang der Erfindung sind Gemische von P43 mit anderen Rotavirusvarianten, zum Beispiel anderen klonierten Varianten, oder mit anderen Viren, insbesondere anderen abgeschwächten Viren. Solche Mischungen sind nützlich in den Impfstoffen der Erfindung, die hier nachfolgend beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen lebend abgeschwächten Rotavirusimpfstoff bereit, der eine Population einer im wesentlichen einzelnen Variante umfaßt, vermischt mit einem geeigneten Hilfsstoff oder pharmazeutischen Träger.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Rotavirusimpfstoff ein monovalenter Rotavirusimpfstoff, der einen einzelnen Rotavirusstamm enthält.
Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft in der Bereitstellung eines lebenden Rotavirusimpfstoffs, in dem das lebend abgeschwächte Rotavirus ein humanes Rotavirus ist und keine Intussuszeption verursacht.
Geeignete pharmazeutische Träger zur Verwendung im erfindungsgemäßen Impfstoff schließen diejenigen ein, die als geeignet zur oralen Verabreichung fachbekannt sind, speziell an Kinder. Solcher Träger schließen ohne Beschränkung Kohlehydrate, Polyalkohole, Aminosäuren, Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Hydroxyapatit, Talkum, Titanoxid, Eisenhydroxid, Magnesiumstearat, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, mikrokristalline Cellulose, Gelatine, pflanzliches Pepton, Xanthan, Caraghenan, Gummi arabicum und β-Cyclodextrin ein.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Rotavirusimpfstoffs bereit, zum Beispiel durch Gefriertrocknen des Virus in Gegenwart geeigneter Stabilisatoren oder durch Vermischen des erfindungsgemäßen Virus mit einem geeigneten Hilfsstoff oder pharmazeutischen Träger.
Es kann auch vorteilhaft sein, das Virus der Erfindung in einem Träger auf Lipidbasis wie Virosomen oder Liposomen, in Öl-in-Wasser-Emulsionen oder mit Trägerpartikeln zu formulieren. Alternativ oder zusätzlich können Immunstimulantien wie die für orale Impfstoffe fachbekannten in der Formulierung eingeschlossen werden. Solche Immunstimulantien schließen bakterielle Toxine, insbesondere Choleratoxin (CT) in Form des Holotoxins (ganzes Molekül) oder nur die B-Kette (CTB), und das hitzelabile Enterotoxin von E. coli (LT) ein. Mutierte LTs (mLTs), die sich weniger wahrscheinlich in ihrer aktive Form als das native LT umwandeln, werden in WO 96/06627, WO 93/13202 und US-PS 5,182,109 beschrieben.
Weitere Immunstimulantien, die vorteilhaft eingeschlossen werden können, sind Saponin-Derivate wie QS21 und Monophosphoryllipid A, insbesondere 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL). Gereinigte Saponine als orale Hilfsstoffe werden in WO 98/56415 beschrieben. Saponine und Monophosphoryllipid A können getrennt oder in Kombination eingesetzt werden (z.B. WO 94/00153) und können in Hilfsstoffsystemen zusammen mit anderen Mitteln formuliert werden. 3D-MPL ist ein von Ribi Immunochem, Montana, hergestellter, allgemein bekannter Hilfsstoff, und seine Herstellung wird in GB 2122204 beschrieben.
Eine allgemeine Erörterung von Trägern und Hilfsstoffen zur oralen Immunisierung kann gefunden werden in Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, herausgegeben von Powell und Newman, Plenum Press, New York, 1995.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Impfung von menschlichen Patienten, speziell Kleinkindern, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung an einen Patienten bereit, der dessen bedarf. Bevorzugt wird der abgeschwächte Lebendimpfstoff durch orale Verabreichung verabreicht.
In einem bevorzugten Aspekt wird die Impfstoffzusammensetzung der Erfindung mit einem Antacidum zur Minimierung der Inaktivierung des Impfstoffs durch Säure im Magen formuliert. Geeignete Antacidumkomponenten schießen anorganische Antacida ein, zum Aluminiumhydroxid, Al(OH)₃, und Magnesiumhydroxid, Mg(OH)₂. Kommerziell erhältliche Antacida, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schießen Mylanta (Marke) ein, das Aluminiumhydroxid und Magnesiumhydroxid enthält. Diese sind in Wasser unlöslich und werden als Suspension angeboten.
Aluminiumhydroxid ist eine besonders bevorzugte Komponente einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung, da es nicht nur eine Antacidumwirkung bereitstellen kann, sondern auch eine Hilfsstoffwirkung.
Auch geeignet zur Verwendung als Antacida im Impfstoff der Erfindung sind organische Antacida wie organische Säurecarboxylatsalze. Ein bevorzugtes Antacidum in der Impfstoffzusammensetzung der Erfindung enthält ein organische Säurecarboxylatsalz, bevorzugt ein Salz von Zitronensäure, wie zum Beispiel Natriumcitrat oder Kaliumcitrat.
Ein besonders bevorzugtes Antacidum, das in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung verwendet werden kann, ist das unlösliche anorganische Salz, Calciumcarbonat (CaCO₃). Das Calciumcarbonat kann mit dem Rotavirus assoziieren, und die Rotavirusaktivität wird während der Assoziation mit dem Calciumcarbonat bewahrt.
Zur Verhinderung von Sedimentation von Calciumcarbonat währen des Einfüllschrittes sind bevorzugt viskose Mittel in der Formulierung vorhanden.
Mögliche viskose Mittel, die verwendet werden können, schließen pseudoplastische Exzipienten ein. Eine pseudoplastische Lösung wird als eine Lösung mit einer höheren Viskosität beim Stehen im Vergleich zu ihrer Viskosität unter Rühren definiert. Exzipienten dieses Typs sind natürliche Polymere wie Gummi arabicum, Tragantharz, Agar-Agar, Alginate, Pectine oder halbsynthetische Polymere, zum Beispiel: Carboxymethylcellulose (Tylose C^®), Methylcellulose (Methocel A^®, Visoctrans MC^®, Tylose MH^® und MB^®), Hydroxypropylcellulose (Klucel^®) und Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel R^® und K^®, Viscotrans MPHC^®). Allgemein werden diese pseudoplastischen Exzipienten zusammen mit thixotropen Mitteln verwendet. Alternative viskose Mittel, die verwendet werden können, sind pseudoplastische Exzipienten mit geringer Fließfähigkeit. Diese Polymere führen bei ausreichender Konzentration zu einer strukturellen Fluidanordnung, die zu einer hochviskosen Lösung mit geringer Fließfähigkeit beim Stehen führt. Eine gewisse Energiemenge muß an das System angelegt werden, um Fließen und Transfer zu erlauben. Äußere Energie (Rühren) ist erforderlich, um temporär die strukturelle Fluidanordnung zu zerstören, um eine fluide Lösung zu erhalten. Beispiele für solche Polymere sind Carbopol^® und Xanthangummi.
Thixotrope Exzipienten werden beim Stehen zu einer Gelstruktur, während sie unter Rühren eine fluide Lösung bilden. Beispiele für thixotrope Exzipienten sind Veegum^® (Magnesiumaluminiumsilicat) und Avicel RC^® (ca. 89 % mikrokristalline Cellulose und 11 % Carboxymethylcellulose-Na).
Die Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt bevorzugt ein viskoses Mittel, das aus Xanthangummi oder Stärke ausgewählt ist.
Somit wird die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung bevorzugt mit einer Kombination aus Calciumcarbonat und Xanthangummi formuliert.
Andere Komponenten einer Zusammensetzung, die in der Erfindung verwendet werden, schließen in geeigneter Weise Zucker ein, zum Beispiel Saccharose und/oder Lactose.
Die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung kann zusätzliche Komponenten enthalten, die zum Beispiel Aromen (insbesondere für einen oralen Impfstoff) und Bakteriostatika einschließen.
Unterschiedliche Darreichungen der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen werden erwogen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Impfstoff als flüssige Formulierung verabreicht. Bevorzugt wird die flüssige Formulierung vor der Verabreichung aus wenigstens den folgenden zwei Komponenten rekonstituiert:

i) Viruskomponente,
ii) flüssige Komponente.

In dieser Ausführungsform sind die Viruskomponente und die flüssige Komponente normalerweise in getrennten Behältern vorhanden, die zweckmäßig separate Kompartimente eines einzelnen Gefäßes oder separate Gefäße sein können, die in einer solchen Weise verbunden werden können, daß die fertige Impfstoffzusammensetzung ohne Kontakt mit Luft rekonstituiert wird.
Vor der Rekonstituierung kann das Virus in trockener Form oder flüssiger Form sein. Bevorzugt ist die Viruskomponente lyophilisiert. Lyophilisiertes Virus ist stabiler als Virus in wäßriger Lösung. Das lyophilisierte Virus kann in geeigneter Weise unter Verwendung einer flüssigen Antacidumzusammensetzung rekonstituiert werden, um eine flüssige Impfstofformulierung herzustellen. Alternativ kann das lyophilisierte Virus mit Wasser oder wäßriger Lösung rekonstituiert werden, wobei in diesem Fall die lyophilisierte Viruszusammensetzung bevorzugt eine Antacidumkomponente enthält.
Bevorzugt umfaßt die Impfstofforumlierung eine Viruskomponente, die mit Calciumcarbonat und Xanthangummi in einem Kompartiment oder Gefäß formuliert ist, und diese wird mit Wasser oder wäßriger Lösung, das/die im zweiten Kompartiment oder Gefäß vorhanden ist, rekonstituiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Impfstoffzusammensetzung eine feste Formulierung, bevorzugt ein lyophilisierter Kuchen, der geeignet zur unmittelbaren Auflösung beim Geben in den Mund ist. Lyophilisierte Formulierungen können zweckmäßig in Form von Tabletten in einer pharmazeutischen Blisterpackung bereitgestellt werden.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen Rotavirusimpfstoff in Form einer sich schnell auflösenden Tablette zur oralen Verabreichung bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die einen lebend abgeschwächten Rotavirusstamm umfaßt, insbesondere einen humanen Rotavirusstamm, worin die Zusammensetzung ein lyophilisierter Feststoff ist, der zur unmittelbaren Auflösung beim Geben in den Mund fähig ist.
Bevorzugt löst sich die erfindungsgemäße schnell auflösende Tablette im Mund des Patienten ausreichend schnell auf, um das Schlucken der nichtaufgelösten Tablette zu verhindern. Dieser Ansatz ist besonders vorteilhaft für pädiatrische Rotavirusimpfstoffe.
Bevorzugt ist das Virus ein lebend abgeschwächtes humanes Rotavirus, das mit einem anorganischen Antacidum wie Calciumcarbonat und einem viskosen Mittel wie Xanthangummi formuliert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer lyophilisierten Formulierung, in der die Viruskomponente ein beliebiger Rotavirusstamm ist, der mit Calciumcarbonat und Xanthangummi formuliert ist.
Impfstoffe der Erfindung können durch bekannte Techniken unter Verwendung einer geeigneten Menge von Lebendvirus formuliert und verabreicht werden, um einen wirksamen Schutz gegen Rotavirusinfektion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen bereitzustellen. Eine geeignete Menge von Lebendvirus wird normalerweise zwischen 10⁴ und 10⁷ ffu pro Dosis sein. Eine typische Dosis von Impfstoff kann 10⁵–10⁶ ffu pro Dosis umfassen und kann in mehreren Dosen über einen Zeitraum verabreicht werden, zum Beispiel in zwei Dosen, die in einem zweimonatigen Intervall verabreicht werden. Vorzüge können jedoch durch mehr als zwei Dosen erhalten werden, zum Beispiel mit einem Schema mit drei oder vier Dosen, insbesondere in Entwicklungsländern. Das Intervall zwischen Dosen kann mehr oder weniger als zwei Monate lang sein. Eine optimale Menge von Lebendvirus für eine Einzeldosis oder für ein Mehrfachdosisschema und die optimale Zeit für die Dosen können durch Standardstudien sichergestellt werden, die die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen in Patienten involvieren.
Der Impfstoff der Erfindung kann auch andere geeignete Lebendviren zum Schutz gegen andere Krankheiten umfassen, zum Beispiel Poliovirus. Alternativ können andere Viruslebendimpfstoffe zur oralen Verabreichung in einer separaten Dosis, aber zur gleichen Gelegenheit wie die erfindungsgemäßen Rotavirusimpfstoffzusammensetzung gegeben werden.
Figurenlegende für 3
Seren aus zwölf 4 bis 6 Monate alten Kleinkindern, die mit dem P33-Material wie in der Vaccine (1998)-Veröffentlichung beschrieben geimpft wurden, wurden auf Neutralisierung von P33, P38, P43 und 89-12C2 getestet.
Der Bereich der Neutralisierungstiter aller untersuchten Seren ist ähnlich für P33, P38 und P43. Die statistische Analyse zeigt keinen signifikanten Unterschied in den Gesamtneutralisierungstitern gegen alle drei Viren. Dies legt nahe, daß die Konformations- und Nicht-Konformationsneutralisationsepitope von P33, P38 und P43 gleich gut durch die Anti-P33-Seren von mit P33 geimpften Kleinkindern erkannt werden. Diese Beobachtung legt indirekt nahe, daß die in diesem In-vitro-Test gezeigten Neutralisierungsepitope zwischen P33, P38 und P43 nicht verändert waren.
Der Bereich der Neutralisierungstiter von P89-12C2 unterscheidet sich jedoch signifikant von P33, P38 und P43. Diese Beobachtung legt nahe, daß die Konformations- und Nicht-Konformationsneutralisationsepitope von P33, P38 und P43 nicht gleich gut durch die Anti-P33-Seren von mit P33 geimpften Kleinkindern erkannt werden. Diese Beobachtung legt indirekt nahe, daß die in diesem In-vitro-Test gezeigten Neutralisierungsepitope zwischen 89-12C2 und P33, P38 und P43 verändert waren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiele
Beispiel 1: Demonstration, daß Stamm 89-12 bei Passage 26 (P26) eine Mischung von Varianten ist
Sequenzierung von VP4- und VP7-Genen aus unterschiedlichen Passagechargen
Die Sequenzierung von VP4- und VP7-Genen aus Passage P26 (primäre AGMK-Zellen), Passage P33 (etablierte (im Gegensatz zu primärer) AGMK-Zellinie), Passage P41 und Passage P43 wurde durchgeführt. Gesamt-RNA-Extraktion wurde revers transkribiert und durch PCR in einem Schlauch/einem Schritt amplifiziert.
Die Primer Rota 5 bis und Rota 29 bis amplifizierten das gesamte VP4-Gen, und die Primer Rota 1 und Rota 2 bis amplifizierten das gesamte VP7-Gen. Das PCR-Material wurde unter Verwendung unterschiedlicher Primer sequenziert (siehe Tabelle 1).
Die Sequenz der Passage P26 unterschied sich von der Sequenz der Passage P33 durch drei Basen (in Positionen 501, 788 und 802 bp ab dem Startcodon) in VP4 und durch drei Basen in VP7 (108, 605 und 897 bp ab dem Startcodon).
Die Sequenzabtastungen der Passage P26 von VP4 und VP7 zeigen in mutierten Positionen die Gegenwart der Sequenz der Passage P33 als Hintergrund. Somit ist ersichtlich, daß Passage P26 eine Mischung aus wenigstens zwei Varianten ist.
Die Sequenzabtastungen der Passage P33 scheinen homogen in VP4 und heterogen für VP7 zu sein (siehe Tabelle 2).
Passage P38 (abgeleitet aus Passage 33) wurde 5-mal in Vero-Zellen passagiert und zeigte den gleichen Satz von VP4- und VP7-Sequenzen wie Passage P33 (AGMK-Zellinie). Somit gab es keine Hauptveränderung der Populationen zwischen P33 und P38.
Tabelle 1: Für RT-PCR und Sequenzierung verwendete Oligonukleotide
Tabelle 2: In der Hybridisierung verwendete Oligonukleotide
Die in Tabelle 2 fettgeschrieben gezeigten Basen sind die Orte von spezifischer Sequenzvariation in VP4 und VP7.
Tabelle 3: Sequenzvariation der VP4- und VP7-Gene 3.1
Anmerkung: In einem zweiten Klon aus den 3 Klonen, die bis zur Produktionscharge entwickelt wurden, ist das Nukleotid von Position 897 bp in VP7 G anstelle von A wie im ausgewählten P43-Klon. Dies führt zu einem Methionin anstelle von Isoleucin in der Aminosäuresequenz. Varianten, die sowohl dem ausgewählten P43-Klon als auch dem Klon entsprechen, in dem es ein G in VP7 bei 897 bp ab dem Startcodon gibt, wurden in den Exkrementen von Kleinkindern ausgeschieden, die mit dem P33-Material geimpft worden waren.
Wenn es zwei alternative Basen in einer besonderen Position gibt, stellt in Tabelle 3.1 die erste der zwei diejenige Base dar, die in einer Hauptpopulation erscheint, und die zweite ist diejenige Base, die in einer Minderpopulation erscheint. Populationen der Haupt- und Mindervariante werden durch die Stärke des Signals in der Sequenzierung beurteilt.
3.2
Tabelle 3.2 zeigt die Aminosäureveränderungen, die aus den Nukleotidunterschieden zwischen den Varianten resultieren.
Tabelle 4
Slot-Blot-Hybridisierung
Die Veränderung der Populationen zwischen Passagen P26 bis P33 in AGMK-Zellen wurde weiter durch Slot-Blot-Hybridisierung bestätigt. Die durch RT/PCR erzeugten VP4- und VP7-Genfragmente wurden mit für jede Variante spezifischen Oligonukleotidsonden hybridisiert (siehe Tabelle 3.1 und 3.2). Im Gegensatz zu P26, das mit Rota 16, Rota 35 und Rota 36 hybridisierte und nicht mit Rota 15, hybridisierte das VP4-PCR-Fragment des P33-Materials in Positionen 788 und 802 nur mit Rota 16 und nicht mit Rota 15 oder Rota 35 oder Rota 36. Diese Ergebnisse ermittelten die Gegenwart von wenigstens drei Varianten in P26 (siehe Tabelle 4).
Für das VP7-PCR-Fragment des P33-Materials hybridisierte Position 897 mit Rota 41 und Rota 42. Diese Ergebnisse ermittelten die Gegenwart von wenigstens zwei Varianten im P33-Material.
Beispiel 2: Isolierung und Charakterisierung des P43-Klons
Zur Isolierung von P33-Komponente als homogene Viruspopulation wurden drei Endpunktsverdünnungen von P33/AGMK in Vero-Zellen durchgeführt, und das resultierende Virus wurde zur Infektion von Vero-Zellen verwendet.
Positive Vertiefungen wurden unter Verwendung zwei Kriterien ausgewählt: das von der größten Anzahl von Herden gezeigte Wachstum, das in den Vertiefungen detektiert wird, und die meisten isolierten positiven Vertiefungen auf den Platten, wie dies klassisch erfolgt. Nach drei Endverdünnungspassagen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden 10 positive Vertiefungen erfolgreich in Vero-Zellen amplifiziert und auf ihre Ausbeute ausgewertet.
Auf Basis der Ausbeute wurden drei Klone auf das Passagenniveau der Produktionscharge entwickelt. Es wurde gezeigt, daß die Immunerkennung durch polyklonale Antikörper ähnlich sowohl zwischen den drei Klonen als auch zwischen den Klonen und P33 war. Die Homogenität der Klone wurde durch Slot-Blot-Hybridisierung bewertet. Die Endselektion eines einzelnen Klons beruhte auf Ausbeute und Sequenz.
Der ausgewählte Klon wurde durch aufeinanderfolgende Passagen in Vero-Zellen zur Erzeugung eines Originalkeims, eines Arbeitskeims und schließlich von Produktionschargen amplifiziert.
Der ausgewählte Klon wurde genetisch in unterschiedlichen Passageniveaus durch Sequenzieren von VP4 und VP7 (Identität) und durch spezifische Slot-Blot-Hybridisierung von VP4 und VP7 (Homogenität) der PCR-amplifizierten Materialien charakterisiert. Die Sequenz der VP4- und VP7-Gene des P43-Materials sind in 1 bzw. 2 angegeben und sind identisch mit P41.
Homogenität des ausgewählten Klons wurde durch eine selektive Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden bewertet, die Nukleotidveränderungen in VP4- und/oder VP7-Regionen für jede Variante unterscheiden, die während der Sequenzierung von P26/primärem AGMK identifiziert wurde (siehe Tabelle 4).
Das VP4-Fragment hybridisierte mit Rota 16 und nicht mit Rota 15, Rota 35 oder Rota 36.
Das VP7-Fragment hybridisierte mit Rota 41 und nicht mit Rota 42.
Diese Ergebnisse bestätigten, daß P43 eine homogene Population ist.
Beispiel 3: Entfernung von potentiellem adventivem Virus
Ether wurde zu P33 (in AGMK kultiviert) auf eine Endkonzentration von 20 % für 1 h gegeben. Ether wurde dann mit N₂ für 35 min ausgetrieben. Kein Einfluß auf den Titer von P33-Keim wurde beobachtet.
Beispiel 4: Formulierung eines abgeschwächten Lebendimpfstoffs
Die oben beschriebenen Produktionschargen werden zur oralen Verabreichung an Kleinkinder durch das folgende Verfahren formuliert.
1. Lyophilisiertes Virus
Standardtechniken werden zur Herstellung von Virusdosen verwendet. Eingefrorener gereinigter Virusbulk wird aufgetaut und mit geeigneter Mediumzusammensetzung, in diesem Fall Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, bis auf eine gewünschte Standardviruskonzentration, in diesem Fall 10^6,2 ffu/ml, verdünnt. Das verdünnte Virus wird dann weiter mit Lyophilisierungsstabilisator (Saccharose 4 %, Dextran 8 %, Sorbit 6 %, Aminosäure 4 %) bis zum Zielvirustiter, in diesem Fall 10^5,6 ffu/Dosis, verdünnt. 0,5 ml-Teilmengen von stabilisierter Viruszusammensetzung werden aseptisch in 3 ml-Fläschchen überführt. Jedes Fläschchen wird dann teilweise mit einem Gummistopfen verschlossen, die Probe wird im Vakuum gefriergetrocknet, das Fläschchen wird dann vollständig verschlossen, und ein Aluminiumdeckel wird auf das Fläschchen auf gequetscht, um den Stopfen zu fixieren.
Zur Verwendung wird das Virus unter Verwendung eines der folgenden Antacidum-Rekonstituierungsmittel rekonstituiert:
(a) Citrat-Rekonstituierungsmittel
Natriumcitrat wird in Wasser gelöst, durch Filtration sterilisiert und aseptisch in Rekonstituierungsbehälter in 1,5 ml-Mengen mit einer Konzentration von 544 mg Na₃Citrat·2H₂O pro 1,5 ml-Dosis überführt. Die Rekonstituierungsmittelbehälter können zum Beispiel 3 ml-Fläschchen oder 4 ml-Fläschchen oder 2 ml-Spritzen oder elastische Weichkunststoffkapseln zur oralen Verabreichung sein. Als Alternative zum Aufbewahren steriler Komponenten unter sterilen Bedingungen kann der fertige Behälter autoklaviert werden.
(b) Al(OH)₃-Rekonstituierungsmittel
Eine aseptische Aluminiumhydroxid-Suspension (Mylanta – Marke) wird aseptisch in sterilem Wasser verdünnt, aseptisch auf Rekonstituierungsbehälter (zum Beispiel 2 ml-Spritzen oder elastische Weichkunststoffkapseln) in 2 ml-Mengen übertragen, die jeweils 48 mg Al(OH)₃ enthalten. Eine Alternative zur Verwendung von sterilen Komponenten unter sterilen Bedingungen ist die γ-Bestrahlung der Aluminiumhydroxid-Suspension (bevorzugt in einer verdünnten Stufe).
Standardbestandteile werden eingeschlossen, um das Absetzen der Suspension zu verhindern. Solche Standardbestandteile schließen zum Beispiel Magnesiumstearat, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, mikrokristalline Cellulose und Siliconpolymere ein. Bakteriostatika, zum Beispiel Butylparaben, Propylparaben oder andere Standard bakteriostatika, die in Lebensmitteln verwendet werden, und Aromen können auch eingeschlossen werden.
2. Lyophilisiertes Virus mit Al(OH)₃ in flüssiger Formulierung
Standardtechniken werden zur Herstellung von Virusdosen verwendet. Gefrorener gereinigter Virusbulk wird aufgetaut und mit geeigneter Mediumzusammensetzung, in diesem Fall Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, bis auf eine gewünschte Standardviruskonzentration, in diesem Fall 10^6,2 ffu/ml, verdünnt. Aluminiumhydroxid-Suspension wird zum Erreichen einer Endmenge von 48 mg/Dosis hinzugegeben, und die Viruszusammensetzung wird mit Lyophilisierungsstabilisator (Saccharose 4 %, Dextran 8 %, Sorbit 6 %, Aminosäure 4 %) bis zum Zielvirustiter, in diesem Fall 10^5,6 ffu/Dosis, verdünnt. 0,5 ml-Teilmengen von stabilisierter Viruszusammensetzung werden aseptisch auf 3 ml-Fläschchen übertragen. Die Lyophilisierung und der Verschluß der Fläschchen wird dann wie in Teil 1 beschrieben durchgeführt.
3. Lyophilisiertes Virus mit Al(OH)₃ zur Blisterdarreichung
Standardtechniken werden zur Herstellung von Virusdosen verwendet. Gefrorener gereinigter Virusbulk wird aufgetaut und mit geeigneter Mediumzusammensetzung, in diesem Fall Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, bis zu einer gewünschten Standardviruskonzentration, in diesem Fall 10^6,2 ffu/ml, verdünnt. Aluminiumhydroxid-Suspension wird zum Erreichen einer Endmenge von 48 mg/Dosis hinzugegeben, und die Viruszusammensetzung wird mit Lyophilisierungsstabilisator, der Saccharose, Dextran oder Aminosäure 4 % oder Gelatine oder pflanzliches Pepton oder Xanthan sein kann, bis zum Zielvirustiter von 10^5,6 ffu/Dosis verdünnt. Ein aseptischer Befüllungsvorgang wird eingesetzt, um Dosen von 0,5 ml oder bevorzugt weniger in Blistervertiefungen zu übertragen. Die Zusammensetzung wird lyophilisiert, und die Blistervertiefungen werden durch thermisches Versiegeln versiegelt.
Gegebenenfalls werden Standardbestandteile zum Verhindern des Absetzens der Aluminiumhydroxid-Suspension eingeschlossen. Solche Standardbestandteile schließen zum Beispiel Magnesiumstearat, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, mikrokristalline Cellulose und Siliconpolymere ein. Aromen können auch eingeschlossen werden.
Beispiel 5: Virale Rotavirus-Titration für verschiedene Formulierungen 5.1: Vergleich zwischen Formulierungen auf Lactose- und Saccharosebasis:
P43-Rotavirus wurde entweder mit Saccharose oder mit Lactose wie in der obigen Tabelle gezeigt formuliert. Die virale Titration vor der Lyophilisierung ist der Virustiter in der fertigen formulierten Flüssigkeit (die Saccharose, Dextran, Sorbit und Aminosäuren enthält) und ohne den Lyophilisierungsschritt.
Gute Ergebnisse sind diejenigen, in denen eine Abnahme von < 0,5 log im Lyophilisierungsschritt und eine Abnahme von < 0,5 log während 1 Woche bei 37°C (beschleunigter Stabilitätstest) erreicht werden.
Die Genauigkeit der viralen Titration ist etwa +/– 0,2 log.
Die Ergebnisse zeigen, daß Saccharose anstelle von Lactose verwendet werden kann.
5.2: Wirkung von Arginin und Ersatz von Sorbit durch Maltit:
Die Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von Arginin (das dafür bekannt ist, die Stabilität des Virus während der Lyophilisierung zu verbessern, und auch ein basisches Medium liefert, um die Magensäure auszugleichen) den Virustiter aufrechterhält.
Sorbit neigt dazu, die Glasübergangstemperatur des lyophilisierten Kuchens in einem zu hohen Grad zu verringern. Dies kann durch Verwendung von Maltit anstelle von Sorbit wie oben gezeigt ausgeräumt werden, und der Virustiter wird noch aufrechterhalten.
5.3: Verschiedene Formulierungszusammensetzungen
Dieses Experiment zeigt, daß eine Anzahl von Formulierungen möglich ist.
5.4: Assoziation zwischen Rotavirus und Al(OH)₃-Antacidum:
Al(OH)₃ wird als Antacidum verwendet. Dies zeigt, daß Rotavirus mit dem unlöslichen anorganischen Salz (Al(OH)₃) assoziiert ist, da es zusammen mit dem Al(OH)₃ auszentrifugierte (Abnahme der Virusaktivität im Überstand).
5.5: Auflösung von Al(OH)₃-Antacidum durch Natriumcitrat vor viraler Titration
Wenn Rotavirus mit dem Al(OH)₃ assoziiert ist, ist es möglich, alles zu lyophilisieren (einschließlich Al(OH)₃). Nach der Lyophilisierung ist es möglich, daß Rotavirus durch Auflösen von Al(OH)₃ in Natriumcitrat zu gewinnen. Dieser Schritt beschädigt nicht das Rotavirus und bewahrt seine Aktivität nach diesem Auflösungsschritt.
5.6: Infektiosität von Rotavirus nach Freisetzung aus der Al(OH)₃-Rotavirus-Assoziation:
Der Mechanismus der Virusfreisetzung (durch Auflösung des Trägers) kann sehr wohl in vivo erfolgen. Tatsächlich wird Aluminiumhydroxid unterhalb pH 6 vollständig löslich, und somit wird Rotavirus im Magen freigesetzt werden. Al(OH)₃ + 3H⁺ → Al³⁺ (wasserlöslich) + 3 H₂O
Im Magen werden Al³⁺-Ionen nicht absorbiert (J.J. Powell, R. Jugdaohsingh und R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal tract, Proceedings of the Nutrition Society (1999) 58, 147–153). Im Darm werden aufgrund der pH-Zunahme unlösliche Formen von Aluminium (Al(OH)₃ oder AlPO₄) ausgefällt und auf dem natürlichen Weg eliminiert. Es ist unbekannt, ob die neugebildete Al(OH)₃- (oder AlPO4-) Ausfällung in der Lage ist, mit freiem Rotavirus erneut zu assoziieren. Dies führt zur Frage der Infektiosität der Al(OH)₃-Rotavirus-Assoziation selbst.
Die Freisetzung von Rotavirus aus der Al(OH)₃-Rotavirus-Assoziation durch andere Mechanismen ist auch möglich. Zum Beispiel wechselwirkt Lysin mit der viralen Adsorption an Al(OH)₃. Andere Anionen wie Borat, Sulfat, Carbonat und Phosphat sind dafür bekannt, spezifisch an Aluminiumhydroxid adsorbiert zu werden, wodurch es theoretisch möglich sein sollte, Rotavirus (durch Konkurrenz um den Adsorptionsort) aus der Al(OH)₃-Rotavirus-Assoziation zu verdrängen.
Somit kann Rotavirus aus der Rotavirus-Al(OH)₃-Assoziation freigesetzt werden, und das freigesetzte Rotavirus bleibt aktiv. Diese Freisetzung kann entweder durch Auflösen von Al(OH)₃ (durch HCl im Magen oder durch Na₃-Citrat in vitro) oder durch Verdrängen von Rotavirus durch eine basische Aminosäure (Lysin) erfolgen.
5.7: Infektiosität der Al(OH)₃-Rotavirus-Assoziation
Eine Einzeldosis von lyophilisiertem Rotavirus wurde mit Wasser rekonstituiert und in zwei Teile unterteilt. Der erste Teil, als Referenz betrachtet, erhielt ein zusätzliches Volumen Wasser. Der zweite Teil erhielt 24 ml Al(OH)₃, suspendiert in 0,240 ml Wasser (vorklinische titrale Titrationen).
Wenn Al(OH)₃ zugegen ist, ist Rotavirus aktiv, und der virale Titrationswert ist höher im Vergleich zur Referenzprobe.
Dieses Experiment wurde ohne Unterteilen der lyophilisierten Dosis und durch Zugabe von 12 mg Al(OH)₃ oder 24 mg Al(OH)₃ wiederholt.
Hier war die Referenzprobe die mit einem Citrat-Bicarbonat-Puffer rekonstituierte. Somit ist der virale Titer erneut höher in Gegenwart von Al(OH)₃.
Wie im obigen Beispiel assoziiert Rotavirus mit den Al(OH)₃-Partikeln, da das Virus durch Zentrifugieren verworfen werden kann. DRVC003A46 ist ein lyophilisiertes formuliertes Rotavirus (Saccharose: 2 %, Dextran: 4 %, Sorbit: 3 %, Aminosäuren: 2 %).

SDSAA = Saccharose 2 %; Dextran 4 %, Sorbit 3 %, Aminosäure 2 %

Gemäß der am Überstand durchgeführten viralen Titration scheint die zur Adsorption von Rotavirus erforderliche Al(OH)₃-Menge gering zu sein (beginnend mit einer lyophilisierten Dosis (5,7 log) unter Heraufsetzung der viralen Titration):
Die zur Adsorption von Rotavirus an Al(OH)₃ erforderliche Zeit scheint kurz zu sein: Eine Dosis von lyophilisiertem Rotavirus wurde in Gegenwart von 24 mg Al(OH)₃ rekonstituiert und nach 0, 15, 60 min und 24 Stunden zentrifugiert. Der "Sockel" wurde in SDSAA vor der viralen Titration resuspendiert:
5.8: Unter Verwendung von CaCO₃ als Antacidum
Zur Vermeidung von Aluminium im Impfstoff wurde das Antacidum Al(OH)₃ durch ein anderes unlösliches anorganisches Salz ersetzt: CaCO₃ (Calciumcarbonat). Die mit CaCO₃ beobachteten Phänomene sind parallel zu den für Al(OH)₃ beschriebenen:

– Assoziation von Rotavirus mit dem anorganischen Salz;
– Bewahrung von Rotavirusaktivität bei Assoziation mit dem anorganischen Salz;
– Möglichkeit der Freisetzung von Rotavirus aus der Assoziation durch Auflösung der anorganischen Base durch eine Säure;
– Möglichkeit der Mitlyophilisierung des Antacidums und des Rotavirus.

CaCO₃- und Rotavirus-Assoziation
In einem ersten Versuch wurde lyophilisierte Testverbindung (viraler Titer 5,7) mit einer Suspension von CaCO₃ in Wasser (50 mg in 1,5 ml) rekonstituiert und dann zentrifugiert und der virale Titer des Überstands mit dem Sockel verglichen.
Dies zeigt, daß mehr als 90 % des Rotavirus mit CaCO₃ assoziiert ist. Auch wenn das Virus assoziiert war, war es möglich, die Titration durchzuführen und die ursprünglichen viralen Mengen zu gewinnen. Auch sind virale Titer geringfügig höher als die ohne CaCO₃ erhaltenen.
Höhe der CaCO₃- und Rotavirus-Assoziation
Lyophilisiertes Rotavirus wurde mit einer CaCO₃-Suspension in Wasser (1,5 ml) rekonstituiert.

10 mg
50 mg
100 mg

Somit ist ersichtlich mehr CaCO₃ und mehr Virus assoziiert, und weniger wird im Überstand gefunden. Jedoch wird die Gesamtdosis nicht vollständig zurückgewonnen (erwartet insgesamt zumindest 5,3 oder sogar 5,8 wie früher erhalten – siehe oben).
CaCO₃-Schutz von Rotavirus während Baby-Rossett-Rice-Antacidumtitration
Unter Verwendung von 10 Dosen von lyophilisiertem Rotavirus (DRVC003A46) und 50 mg CaCO₃ wurden zwei Typen von Baby-Rossett-Rice-Titration durchgeführt:
In einer klassischen Rossett-Rice-Titration wird das Antacidum mit Rotavirus vermischt und HCl in dieses Medium gegossen.
Im "inversen" Baby-Rossett-Rice ist die Situation umgekehrt:
Antacidum wird in die HCl-Menge getropft (wie es in vivo erfolgt).
Somit ist in diesem In-vitro-Experiment Calciumcarbonat in der Lage, ca. 20 % des Rotavirus vor der Gegenwart von HCl zu schützen, während Aluminiumhydroxid dies nicht kann.
5.9. Lyophilisierung von Rotavirus in Gegenwart von CaCO₃-Antacidum:
Dies ist eine "einteilige" Lyophilisierung von Rotavirus und Antacidum (CaCO₃) zusammen im gleichen Fläschchen. Zur Verhinderung von Sedimentation von CaCO₃ während des Einfüllschrittes sind viskose Mittel erforderlich. Beispiele für solche viskosen Mittel schließen Xanthangummi und Stärke ein. Die Rotavirusaktivität wird selbst in Gegenwart von Xanthangummi und Stärke aufrechterhalten.
5.10: Lyophilisierte Tabletten zur schnellen Zersetzung beim Geben in den Mund:
Die folgenden Formulierungen zeigen das "Lyoc"-Konzept, d.h. eine schnelle Auflösung des lyophilisierten Kuchens im Mund.
Im "Lyoc-Konzept" können sowohl Xanthan als auch Stärke verwendet werden (was die schnellen Auflösungseigenschaften des lyophilisierten Kuchens bewahrt).
Beispiel 6: Verwendung von Calciumcarbonat als Antacidum für die Rotavirusimpfstoffzusammensetzung
Wenn eine Suspension von CaCO₃ in Wasser als Antacidum für Rotavirus verwendet wird, besteht ein Problem darin, daß sich die Calciumcarbonat-Partikel schnell absetzen, wenn sie in Wasser gegeben werden, da sich der Wert der Pulverdichte 2,6 nähert und die durchschnittliche Partikelgröße 30 μm beträgt. Die Sedimentation kann verlangsamt werden durch

(1) Erhöhen der Dichte des umgebenden Mediums,
(2) Erhöhen der Viskosität des umgebenden Mediums,
(3) Reduzieren der Partikelgröße,
(4) Abhalten der Partikel voneinander.

6.1.: Erhöhen der Dichte des umgebenden Mediums:
Wenn die CaCO₃-Wasser-Suspension (bei Geben in die Spritze) auf den lyophilisierten Kuchen (der 2 % Saccharose, 4 % Dextran, 3 % Sorbit und 2 % Aminosäuren enthält) gegeben wird, wird die Dichte des umgebenden Mediums erhöht, aber die Geschwindigkeit der CaCO₃-Sedimentation unterscheidet sich nicht sehr von der derjenigen der CaCO₃-Wasser-Suspension.
6.2.: Erhöhung der Viskosität des umgebenden Mediums: Pseudoplastische Exzipienten
Eine pseudoplastische Lösung wird als eine Lösung mit einer höheren Viskosität beim Stehen im Vergleich zu ihrer Viskosität unter Rühren definiert. Gewöhnliche Exzipienten dieses Typs sind:
Natürliche Polymere, beispielsweise Gummi arabicum, Tragacanthharz, Agar-Agar, Alginate, Pectine.
Halbsynthetische Polymere, zum Beispiel Carboxymethylcellulose (Tylose C^®), Methylcellulose (Methocel A^®, Viscotrans MC^®, Tylose MH^® und MB^®), Hydroxypropylcellulose (Klucel^®), Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel E^® und K^®, Viscotrans MPHC^®).
Allgemein werden diese pseudoplastischen Exzipienten zusammen mit thixotropen Mitteln verwendet.
Pseudoplastische Exzipienten mit geringer Fließfähigkeit
Diese Polymere führen bei ausreichender Konzentration zu einer strukturellen Fluidanordnung, die zu einer hochviskosen Lösung mit geringer Fließfähigkeit beim Stehen führt. Eine gewisse Energiemenge muß an das System angelegt werden, um Fluß und Bewegung zu erlauben. Äußere Energien (Rühren) sind zur temporären Zerstörung der strukturellen Fluidanordnung erforderlich, um eine fluide Lösung zu erhalten. Beispiele für solche Polymere sind Carbopole^® und Xanthangummi.
Thixotrope Exzipienten
Mit diesen Exzipienten wird beim Stehen eine Gelstruktur erhalten; während unter Rühren eine fluide Lösung erhalten wird.
Beispiele für thixotrope Exzipienten sind: Veegum^® (Magnesiumaluminiumsilicat) und Avicel RC^® (ca. 89 % mikrokristalline Cellulose und 11 % Carboxymethylcellulose-Na).
6.3 Reduzieren der Partikelgröße
Eine Reduktion der CaCO₃-Partikelgröße führte zu einer Abnahme der Antacidumkapazität der Verbindung.
6.4 Abhalten der Partikel voneinander
Dies ist der Fall bei Veegum^® und Avicel^®, bei denen unlösliche Partikel, die kleiner als die CaCO₃-Partikel sind (ca. 1 μm), zwischen CaCO₃-Partikel plaziert werden, um die Aggregation zu verhindern.
Beispiel 7: Produktgestaltung
Die folgenden Schemata zeigen Beispiele für mögliche Produktgestaltungen.
7.1 CaCO₃ in der Spritze
Mit bereits klinischen Chargen von Rotavirus in lyophilisierten Fläschchen kann das Antacidum in die in der Spritze enthaltene Rekonstituierungsflüssigkeit plaziert werden.
In dieser Produktdarreichung muß die Sedimentation von CaCO₃ nicht nur während der Einfüllschritte, sondern auch während der gesamten Haltbarkeitsdauer des Produkts (wenigstens 2 Jahre) unter Kontrolle sein.
7.2 CaCO₃ im lyophilisierten Fläschchen
7.3 Lyophilisierung in einem Blister
In diesem Fall werden Rotavirus, CaCO₃ und Xanthangummi zusammen direkt im Blister lyophilisiert.
Beispiel 8: Lyophilisierung unterschiedlicher Stämme von Rotavirus
Die Stämme DS-1, P und VA70 werden als humane Rotavirus-Referenzstämme für Serotyp G2, G3 bzw. G4 auf Seite 1361 von "Fields", Raven Press 1990, zweite Auflage, beschrieben.
In diesem Experiment wurden unterschiedliche Rotavirusstämme lyophilisiert. Für alle wurde sowohl der virale Titer während der Lyophilisierung aufrechterhalten als auch wurde eine beschleunigte Stabilität (eine Woche bei 37°C) gezeigt.
Beispiel 9: Sicherheitsstudie der Phase I in Erwachsenen für eine orale Verabreichung des Rotavirusimpfstoffs
Eine Studie der Phase I wurde zur Bewertung der Sicherheit und Reaktogenität einer einzelnen oralen Dosis von 1060 ffu des P43-Impfstoffs in gesunden Erwachsenen im Alter von 18 bis 45 Jahren durchgeführt.
Der klinische Versuch war doppelblind und randomisiert. Er war plazebokontrolliert und abgeschlossen. Die Studie wurde in einem einzelnen Zentrum in Belgien durchgeführt.
Studienpopulation
Insgesamt 33 Probanden, 11 in der Plazebogruppe und 22 in der Impfstoffgruppe, wurden aufgenommen, und alle beendeten die Studie. Alle Freiwilligen waren Weiße. Ihr mittleres Alter zum Zeitpunkt der Impfung betrug 35,3 Jahre bei einem Bereich von 18 bis 44 Jahren. Der Versuch begann im Januar und lief für etwas mehr als einen Monat.
Material Impfstoff
Klinische Chargen von P43-Impfstoff wurden gemäß Guter Herstellungspraxis hergestellt, gereinigt, formuliert und lyophilisiert. Die Chargen wurden durch Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung freigegeben. Jedes Fläschchen mit Impfstoff enthielt die folgenden Komponenten. Aktiver Bestandteil:

P43-Stamm Min. 105 8 ffu

Exzipienten, Stabilisatoren:

Saccharose 9 mg

Dextran 18 mg

Sorbit 13,5 mg

Aminosäuren 9 mg
Plazebo
Fläschchen mit Plazebo wurden hergestellt und freigegeben. Jedes Fläschchen mit Plazebo enthielt die folgenden Komponenten: Exzipienten, Stabilisatoren:

Saccharose 9 mg

Dextran 18 mg

Sorbit 13,5 mg

Aminosäuren 9 mg
Verdünnungsmittel
Wasser zur Injektion wurde als Verdünnungsmittel zum Rekonstituieren von Impfstoff und Plazebo verwendet.
Verabreichung
Ca. 10 bis 15 Minuten vor der Verabreichung des Impfstoffs oder des Plazebos erhielten die Probanden beider Gruppen 10 ml Mylanta^® oral.
Mylanta^® ist ein zugelassenes Antacidum. Das Antacidum erhöht den pH des Magens und verhindert die Inaktivierung des Rotavirus während seiner Passage durch den Magen.
Zur Herstellung des Impfstoffs wurden zwei Fläschchen von lyophilisiertem P43, die 105 8 ffu pro Fläschchen enthielten, mit 1,5 ml Verdünnungswasser zur Injektion rekonstituiert. Dies erreichte einen berechneten viralen Titer von 10^6,1 ffu pro Dosis. Der rekonstituierte Impfstoff wurde unmittelbar als einzelne orale Dosis verabreicht.
Zur Herstellung des Plazebos wurden zwei Fläschchen von lyophilisiertem Plazebo mit 1,5 ml Wasser zur Injektion rekonstituiert und oral als Einzeldosis verabreicht.
Sicherheit und Reaktogenität
Die folgenden Kriterien zur Sicherheit und Reaktogenität trafen zu:
Verlangte allgemeine Symptome waren Fieber, Diarrhoe, Erbrechen, Übelkeit, Bauchschmerz und Appetitverlust. Sie wurden während 8 Tagen nach der Verabreichung aufgezeichnet. Unverlangte Symptome wurden während 30 Tagen nach der Verabreichung aufgezeichnet. Ernsthafte nachteilige Ereignisse wurden während des gesamten Studienzeitraums aufgezeichnet. Diarrhoeproben wurden während 8 Tagen nach der Verabreichung gesammelt.
Die Ergebnisse waren: keine verlangten Symptome, keine unverlangten und keine ernsthaften nachteiligen Ereignisse wurde während der jeweiligen Beobachtungszeiträume berichtet.
Keine Fälle von Diarrhoe wurden berichtet.
Schlußfolgerungen
Der P43-Impfstoff von SB Biologicals war sicher relativ zum Plazebo bei oraler Verabreichung in doppelblinder Weise als Einzeldosis mit der Dosis von 10^6,1 ffu an gesunde erwachsene Freiwillige im Alter von 18 bis 44.
Seqenzprotokoll

Claims

Abgeschwächte humane Rotaviruspopulation, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine einzelne Variante oder im wesentlichen eine einzelne Variante umfaßt, wobei die Variante durch eine Nukleotidsequenz definiert ist, die wenigstens eines der als VP4 und VP7 bezeichneten Hauptvirusproteine codiert.
Rotaviruspopulation gemäß Anspruch 1, die ein klonierter Stamm ist.
Rotaviruspopulation gemäß Anspruch 1 oder 2, die aus einer humanen Rotavirusinfektion stammt.
Rotaviruspopulation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, die sich in Menschen vermehrt und durch Menschen ausgeschieden wird.
Rotaviruspopulation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die im wesentlichen einzelne Variante eine Variante, ist, in der das VP4-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens eines der folgenden umfaßt: eine Adeninbase (A) in Position 788, eine Adeninbase (A) in Position 802 und eine Thyminbase (T) in Position 501 ab dem Startcodon.
Rotaviruspopulation gemäß Anspruch 5, worin das VP4-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die eine Adeninbase (A) in Positionen 788 und 802 und eine Thyminbase (T) in Position 501 ab dem Startcodon umfaßt.
Rotaviruspopulation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die im wesentlichen einzelne Variante eine Variante ist, worin das VP7-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens eines der folgenden umfaßt: ein Thymin (T) in Position 605, ein Adenin (A) in Position 897 und ein Guanin (G) in Position 897 ab dem Startcodon.
Rotaviruspopulation gemäß Anspruch 7, worin das VP7-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Thymin (T) in Position 605 und ein Adenin (A) oder ein Guanin (G) in Position 897 ab dem Startcodon umfaßt.
Rotaviruspopulation gemäß Ansprüchen 5 bis 8, worin das VP4-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Adenin (A) in Positionen 788 und 802 und ein Thymin (T) in Position 501 ab dem Startcodon umfaßt; und das VP7-Gen eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Thymin (T) in Position 605 und ein Adenin (A) in Position 897 ab dem Startcodon umfaßt.
Rotavirus, das eine Nukleotidsequenz, die ein VP4-Protein codiert, worin die Nukleotidsequenz wie in 1 gezeigt ist, und/oder eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein VP7-Protein codiert, worin die Nukleotidsequenz wie in 2 gezeigt ist.
Rotaviruspopulation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die als P43 bezeichnet und unter der Eingangsnummer ECACC 99081301 hinterlegt ist.
Rotavirusvariante, die als P43 bezeichnet und bei ECACC unter der Eingangsnummer 99081301 hinterlegt ist, Rotavirus-Nachkommenschaft und immunologisch aktive Derivate davon und daraus erhaltene Materialien.
Humane Rotavirus-Reassortante, die wenigstens ein Antigen oder wenigstens ein Segment der Rotavirusvariante P43 gemäß Anspruch 11 oder 12 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer gereinigten humanen Rotaviruspopulation, die eine im wesentlichen einzelne Variante umfaßt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Passagieren einer Rotaviruszubereitung in einer geeigneten Zellinie; gegebenenfalls Selektieren von homogener Kultur unter Verwendung der Schritte von entweder Limit-Dilution-Verfahren oder individueller Plaqueisolierung; und Überprüfen auf Gegenwart einer im wesentlichen einzelnen Variante durch Sequenzieren einer geeigneten Region der VP4- und/oder VP7-Gensequenz.
Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die Rotaviruszubereitung in AGMK-Zellen passagiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, worin die Rotaviruszubereitung die Eigenschaften eines 89-12-Stamms oder eines Derivats davon hat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, das den zusätzlichen Schritt der Etherbehandlung zur Entfernung von adventiven etherempfindlichen kontaminierenden Mitteln umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, die ein lebend abgeschwächtes Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfaßt, vermischt mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 18, die zur oralen Verabreichung angepaßt ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 19, worin das lebend abgeschwächte Virus mit einer Antacidumzusammensetzung formuliert ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin die Antacidumzusammensetzung ein organisches Antacidum umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 21, worin das Antacidum Natriumcitrat ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin die Antacidumzusammensetzung ein anorganisches Antacidum umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 23, worin das Antacidum Aluminiumhydroxid ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 23, worin das Antacidum Calciumcarbonat ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 25, die ferner ein viskoses Mittel umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 26, worin das viskose Mittel Xanthangummi ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, worin das lebend abgeschwächte Virus mit Calciumcarbonat und Xanthangummi formuliert und mit wäßriger Lösung rekonstituiert ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 28, worin das lebend abgeschwächte Virus mit der Antacidumzusammensetzung formuliert und in einer Blisterpackung lyophilisiert ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 29, worin das Virus in lyophilisierter Form ist.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 30, worin das lebend abgeschwächte Virus und die Antacidumzusammensetzung in separaten Behältern zur Formulierung als Lebendimpfstoffzusammensetzung vor der Verabreichung vorhanden sind.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 30, worin das lebend abgeschwächte Virus und die Antacidumzusammensetzung im gleichen Behälter zur Formulierung als lyophilisierte Impfstoffzusammensetzung zur Rekonstituierung mit wäßriger Lösung vor der Verabreichung vorhanden sind.
Verfahren zur Herstellung eines Rotavirusimpfstoffs gemäß einem der Ansprüche 18 bis 32, umfassend das Vermischen eines abgeschwächten humanen Rotavirus mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff.
Verwendung eines abgeschwächten humanen Rotavirus in der Herstellung eines Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 18 bis 32 zur Prävention von Rotavirusinfektion in einem humanen Patienten.
Impfstofformulierung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 32 zur Verwendung in der Medizin.