BRPI0013357B1 - população de rotavírus humanos atenuados, seu método de produção, rotavírus, bem como composição de vacina e seu método de fabricação - Google Patents

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Abstract

patente de invenção: "vacina". a invenção proporciona uma população de rotavírus atenuados compreendendo uma única variante ou substancialmente uma única variante, a qual é definida por uma seqüência de nucleotídeos codificando pelo menos uma das proteínas virais principais designadas como vp4 e vp7. a invenção particularmente proporciona uma população de rotavírus designada como p43. a invenção adicionalmente proporciona uma nova formulação para uma vacina de rotavírus, a qual está na forma de um comprimido de rápida dissolução para a dissolução imediata quando colocado sobre a língua.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POPULAÇÃO DE ROTAVÍRUS HUMANOS ATENUADOS, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, ROTAVÍRUS, BEM COMO COMPOSIÇÃO DE VACINA E SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO".
Esta invenção refere-se às formulações de vacina, aos métodos para prepará-las e ao seu uso em terapia. Em particular, a presente invenção refere-se às formulações de vacina de rotavírus. A diarréia infecciosa aguda é uma causa principal de doença e morte em muitas áreas do mundo. Nos países em desenvolvimento, o impacto da doença dianréica é terrível. Para a Ásia, a África e a América Latina, foi estimado que existem entre 3-4 bilhões de casos de diarréia a cada ano e, destes casos, cerca de 5-10 milhões resultam em morte (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)). O rotavírus foi reconhecido como uma das causas mais importantes de diarréia grave em bebês e crianças novas (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Terceira Edição, editado por Fields et al., Raven Publishers, Filadélfia, 1996). É estimado que a doença por rotavírus seja responsável por mais de um milhão de mortes anualmente. A doença induzida por rotavírus afeta mais comumente as crianças entre 6 e 24 meses de idade, e o predomínio de pico da doença geralmente ocorre durante os meses mais frios em climas temperados, e no ano inteiro em áreas tropicais. Os rotavírus são tipicamente transmitidos de pessoa para pessoa pela rota fecal-oral, com um período de incubação de cerca de 1 a cerca de 3 dias. Diferente da infecção no grupo de idade de 6 meses a 24 meses, os neonatos são geralmente assintomáticos ou têm somente uma doença branda. Em contraste com a doença grave normalmente encontrada em crianças novas, a maior parte dos adultos está protegida como um resultado de infecção prévia por rotavírus, desse modo a maioria das infecções nos adultos é branda ou assintomática (Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982).
Os rotavírus são geralmente esféricos, e o seu nome é derivado de sua estrutura distinta de capsídio externo e interno ou com cobertura externa dupla. Tipicamente, a estrutura de capsídio com cobertura externa dupla de um rotavírus circunda uma cobertura externa ou núcleo protéico interno que contém o genoma. O genoma de um rotavírus é composto de 11 segmentos de RNA de fita dupla que codificam pelo menos 11 proteínas virais distintas. Duas destas proteínas virais, designadas como VP4 e VP7, estão dispostas sobre o exterior da estrutura de capsídio com cobertura externa dupla. O capsídio interno do rotavírus apresenta uma proteína, a qual é a proteína de rotavírus designada VP6. Ainda não está clara a importância relativa destas três proteínas rotavirais particulares em fazer surgir a resposta imunológica que segue a infecção por rotavírus. Todavia, a proteína VP6 determina o antígeno de grupo e subgrupo, e as proteínas VP4 e VP7 são os determinantes da especificidade do sorotipo. A proteína VP7 é uma glicoproteína de PM 38.000 (PM 34.000 quando não-glicosilada), que é o produto de tradução do segmento genômi-co 7, 8 ou 9, dependendo da cepa. Esta proteína estimula a formação do anticorpo de neutralização principal que segue a infecção por rotavírus. A proteína VP4 é uma proteína não-glicosilada de aproximadamente PM 88.000, que é o produto de tradução do segmento genômico 4. Esta proteína também estimula o anticorpo de neutralização que segue a infecção por rotavírus.
Visto que as proteínas VP4 e VP7 são as proteínas virais contra as quais são dirigidos os anticorpos de neutralização, elas são acreditadas ser candidatas principais para o desenvolvimento de vacinas de rotavírus, proporcionando proteção contra a doença por rotavírus. A infecção natural por rotavírus durante a infância inicial é sabida fazer surgir uma imunidade protetora. Uma vacina de rotavírus vivo, atenuado, é desse modo altamente desejável. De preferência, esta deve ser uma vacina oral, uma vez que esta é a rota natural de infecção do vírus. O desenvolvimento inicial de vacinas para prevenir a infecção por rotavírus começou nos anos 70, após a descoberta do vírus. Inicialmente, as cepas atenuadas de animais e seres humanos foram estudadas e tiveram resultados misturados ou frustrantes. Os esforços mais recentes concentraram-se em rearranjos humanos-animais que têm sido mais bem-sucedidos.
Uma cepa de rotavírus conhecida como 89-12 foi descrita por Ward; ver a Patente US Ng 5.474.773 e Bernstein, D.L. et al., Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. A cepa 89-12 foi isolada de um espécime das fezes, coletado de uma criança de 14 meses com doença natural por rotavírus em 1988. De acordo com a Patente US Ne 5.474.773, o rotavírus humano HRV 89-12 foi então adaptado em cultura por 2 passagens em células do Rim de Macaco Verde Africano (AGMK) primário e 4 passagens em células MA-104 como descritas por Ward em J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Ele foi então purificado em placa 3 vezes em células MA-104 (até a passagem 9) e desenvolvido após 2 passagens adicionais nestas células. Foi feita uma passagem adicional (passagem 12) para a deposição com a ATCC sob o número de acesso ATCC VR 2272. A cepa depositada é conhecida como 89-12C2. O documento de 1998 em Vaccine por Bernstein et al. é referido abaixo como o documento Vaccine (1998). O documento descreve a segurança e a imunogenicidade de um candidato a vacina de rotavírus humano vivo, oralmente administrado. Esta vacina foi obtida da cepa 89-12, atenuada por passagem, sem purificação em placa, 26 vezes em células do AGMK primário e então outras 7 vezes em uma linha de cétulas AGMK estabelecida (33 passagens no total).
Nas partes que se seguem, o material antes mencionado que foi passado em série 26 vezes será referido como P26 e o material que passou em série 33 vezes será referido como P33. Em geral, o rotavírus derivado passando-se n vezes a 89-12 será referido como Pn.
Nos exemplos que se seguem, o material P33 foi passado umas 5 vezes adicionais sobre células Vero. Este é referido como P38.
Os isolados P26 e P33 descritos no documento Vaccine (1998) não foram depositados em uma coleta de cultura, nem eles foram analisados para estabelecer a sua caracterização genética.
Foi agora verificado que a população de P26 descrita na literatura compreende uma mistura de variantes. Esta foi estabelecida por caracterização genética conforme descrito abaixo (ver os exemplos). Ο P26 não é, portanto, uma população confiadamente consistente para passagens adicionais, em particular para a produção de lotes de vacinas. Similarmente, ο P33 compreende uma mistura de variantes e não é confiadamente consistente para a produção de lotes de vacinas.
Foi verificado que o material P26 é uma mistura de pelo menos três variantes de gene para VP4. Ο P33 e ο P38 são similarmente uma mistura de duas variantes. Estas variantes parecem ser antigenicamente diferentes, em termos de epítopos de neutralização, à cepa 89-12C2 depositada na ATCC quando avaliando os títulos de soros de anticorpos de neutralização a partir de crianças vacinadas com P33 contra estas variantes. Isto é ilustrado na Figura 3.
Ademais, foi verificado que quando o material P33 é administrado às crianças, duas variantes identificadas são replicadas e excretadas. De 100 crianças vacinadas, somente 2 mostraram sinais de gastroenterite devido à infecção por rotavírus, enquanto que 20% de um grupo de placebo foram infectados. Estas constatações sugerem que as variantes identificadas estão associadas com a proteção da doença por rotavírus. A presente in- i venção proporciona um método de separar as variantes de rotavírus e uma vacina de rotavírus atenuado, vivo, aperfeiçoada, derivada de uma cepa de rotavírus humano clonada (homogênea).
Desse modo, de acordo com um primeiro aspecto, a presente | invenção proporciona uma população (isolada) de rotavírus atenuado, caracterizada pelo fato de que compreende uma única variante ou substancialmente uma única variante, a dita variante definida pela sequência de nu-cleotídeos codificando pelo menos uma das proteínas virais principais designadas como VP4 e VP7.
De preferência, a população de rotavírus de acordo com a invenção é uma variante clonada.
Por uma população compreendendo uma única variante, ou substancial mente uma única variante, é significado uma população de rotavírus que não contém mais do que 10%, e preferivelmente menos do que 5% e mais preferivelmente menos do que 1% de uma variante, ou variantes, diferente. As populações de vírus podem ser purificadas até a homogenei- dade ou a homogeneidade substancial por passagem sobre tipos adequados de células ou por efetuação de uma série de uma ou mais etapas de clonagem.
Uma vantagem da invenção é que uma população compreendendo uma única variante é mais adequada para a formulação de um lote de vacina consistente. As variantes particulares definidas pelas seqüências de nucleotídeos codificando a proteína viral principal podem também estar associadas com a eficácia aumentada na prevenção de infecção por rotaví-rus.
Em um aspecto preferido, a variante única ou substancialmente única na população de rotavírus da invenção é uma variante na qual o gene para VP4 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma das seguintes: uma base de adenina (A) na posição 788, uma base de adenina (A) na posição 802 e uma base de timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação.
Em um aspecto adicional, a variante única ou substancialmente única na população da invenção é uma variante em que o gene para VP7 compreende uma seqüência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma das seguintes: uma timina (T) na posição 605, uma adenina (A) na posição 897, ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do códon de iniciação. De preferência, na posição 897 há uma adenina (A).
Em um aspecto preferido, a variante única na população de acordo com a invenção tem uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação na seqüência de gene para VP4.
Em um outro aspecto preferido, a variante única na população de acordo com a invenção tem uma timina (T) na posição 605 e uma adeni-na/guanina (A/G) na posição 897 a partir do códon de iniciação na seqüência de VP7. Mais preferivelmente, na seqüência de VP7 há uma adenina (A) na posição 897.
Em um aspecto particularmente preferido, a variante única na população de acordo com a invenção tem uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do códon de iniciação na sequência de gene para VP4, e uma timina (T) na posição 605 e uma adeni-na/guanina (A/G) na posição 897 a partir do códon de iniciação na seqüência de VP7. Mais preferivelmente, na seqüência de VP7 há uma adenina (A) na posição 897.
Em um outro aspecto, a variante única compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína VP4, em que a seqüência de nucleotídeos é como mostrada na SEQ ID N° 1, e/ou uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína VP7, em que a seqüência de nucleotídeos é como mostrada na SEQ ID N° 2. A presente invenção também proporciona um método de produzir uma população de rotavírus compreendendo uma variante substancialmente única, o método compreendendo: passar uma preparação de rotavírus sobre um tipo adequado de célula; selecionar opcionalmente uma cultura homogênea usando as etapas de: a) diluição com limite; ou b) isolamento de placa individual; e checar quanto à presença de uma variante substancialmente única por realização de uma determinação de seqüência de uma região apropriada da seqüência de gene para VP4 e/ou VP7. A determinação de seqüência pode adequadamente ser realizada por uma técnica de hibridização quantitativa ou semiquantitativa, tal como a hibridização por manchas de rastros ou a hibridização de placas.
De preferência, a variante selecionada é uma variante que é replicada e excretada quando a preparação de rotavírus de partida é administrada a um paciente humano, em particular uma criança. A população de vírus clonada resultante, que resulta do método de acordo com a invenção, pode ser amplificada por passagem adicional sobre uma linha de células adequada.
Os tipos adequados de células para a passagem da população de rotavírus no método acima descrito incluem as células do rim do macaco verde africano (AGMK), que podem ser linhas de células estabelecidas ou células do AGMK primário. As linhas de células do AGMK adequadas incluem, por exemplo, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) e CV-1 {ATCC CCL-70). Também adequadas sãos as linhas de células MA-104 (macaco rhesus) e MRC-5 (humanas - ATCC CCL-171). As células Vero são particularmente preferidas para propósitos de amplificação. A passagem sobre as células Vero dá um alto rendimento de vírus.
As técnicas para checar se há uma única variante em uma população de vírus resultante do método, e para determinar a natureza desta única variante, envolvem os procedimentos padrão de seqüenciamento ou de hibridização, conhecidos na técnica e são descritos aqui abaixo.
Em um aspecto preferido, o método da invenção é realizado usando um rotavírus apropriado, particularmente o rotavírus tendo as características da cepa 89-12 ou de um seu derivado que passou.
Uma população de variante única particularmente preferida é o P43, que foi obtida a partir de P33 (um rotavírus humano isolado que passa 33 vezes na cultura sobre tipos apropriados de células) por uma série de etapas de clonagem de diluição final, seguida por passagem do material clonado sobre células Vero para a amplificação.
Uma população P43 foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Labora-tory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, em 13 de agosto de 1999, sob o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado de Budapeste.
Embora esta disponibilidade pública indicada seja o método mais simples de obter o rotavírus humano P43, não é totalmente impossível ou improvável que rotavírus similares e funcional e substancialmente idênticos possam ser produzidos por estes ou outros métodos em vista dos ensinamentos desta invenção. Tais rotavírus funcional e substancialmente idênticos são considerados ser biologicamente equivalentes ao rotavírus humano P43 desta invenção e, portanto, estão dentro do escopo geral da pre- sente invenção. Será, portanto, entendido que a invenção inclui as populações de rotavírus tendo as características da variante de P43 como descrita aqui.
Também será entendido que a invenção inclui os materiais derivados a partir do P43 depositado, ECACC 99081301, por sujeição dele a processamento adicional, tal como por sua propagação por passagem, clonagem, ou outros procedimentos adicionais usando o vírus vivo, ou por modificação do P43 neste modo, incluindo por técnicas de engenharia genética ou técnicas de rearranjo. Tais etapas e práticas são bastante conhecidas na técnica.
Os materiais derivados de P43 depositado que são cobertos pela invenção incluem a proteína e o material genético. De interesse particular são os rotavírus de rearranjo que compreendem pelo menos um antí-geno ou pelo menos um segmento de P43, por exemplo os rearranjos que compreendem uma cepa virulenta de rotavírus em que um, ou parte de um, dos 11 segmentos de genoma foi substituído pelo segmento, ou parte do mesmo, de genoma de P43. Especificamente, um rearranjo de rotavírus, no qual o segmento ou segmento parcial codificando para NSP4 é um segmento ou segmento parcial de P43, pode ter propriedades úteis. Os rotavírus de rearranjo e as técnicas para prepará-los são bastante conhecidos (Foster, R. H. e Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavírus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).
Os materiais de interesse particular são a progênie de P43 e os derivados imunologicamente ativos de P43. Derivados imunologicamente ativos significam materiais obtidos a partir do, ou com o, vírus P43, particu-larmente os antígenos do vírus, os quais são capazes de fazer surgir uma resposta imunoiógica que é reativa contra o Rotavírus quando injetados em um animal hospedeiro.
Na adaptação do rotavírus a uma linha apropriada de células, por exemplo as células Vero, pode ser necessário tratar o vírus de modo a livrar-se de qualquer contaminante potencial, tal como os agentes estranhos que possam estar presentes e os quais, de outra forma, causariam contami- nação. No caso de vírus estranhos sensíveis ao éter, isto pode ser feito por tratamento com éter, conforme descrito aqui abaixo. A presente invenção também refere-se à inclusão de tal tratamento com éter como uma etapa opcional no procedimento global para obter um rotavírus vivo, atenuado, ou vacina formulada com o mesmo.
Também dentro do escopo da invenção estão as misturas de P43 com outras variantes de rotavírus, por exemplo outras variantes clona-das, ou com outros vírus, em particular outros vírus atenuados. Tais misturas são úteis nas vacinas da invenção, as quais são descritas abaixo. A presente invenção também proporciona uma vacina de rotavírus atenuado, vivo, a qual compreende uma população de variante substancialmente única, misturada com um adjuvante adequado ou um veículo farmacêutico.
De preferência, a vacina de rotavírus de acordo com a invenção é uma vacina de rotavírus monovalente contendo uma única cepa de rotavírus. A presente invenção é particularmente vantajosa em proporcionar uma vacina de rotavírus vivo, na qual o rotavírus vivo atenuado é um rotavírus humano e não causa intussuscepção.
Os veículos farmacêuticos adequados, para uso na vacina de acordo com a invenção, incluem aqueles conhecidos na técnica como sendo adequados para a administração oral, especialmente às crianças. Tais veículos incluem e não estão limitados aos carboidratos, poliálcoois, aminoáci-dos, hidróxido de alumínio, hidróxido de magnésio, hidroxiapatita, talco, oxido de titânio, hidróxido de ferro, estearato de magnésio, carboximetilcelulo-se, hidroxipropilmetilcelulose, celulose microcristalina, gelatina, peptona vegetal, gomas, xantana, carragenina, β-ciclodextrina. A invenção também proporciona um processo para a preparação de uma vacina de rotavírus, por exemplo através de secagem por congelamento do vírus na presença de estabilizadores adequados ou através de mistura do vírus de acordo com a invenção com um adjuvante adequado ou veículo farmacêutico.
Pode também ser vantajoso formular o vírus da invenção em veículos à base de lipídios, tais como os virossomos ou os lipossomos, em emulsões de óleo em água ou com partículas de veículo. Alternativamente, ou além disso, podem ser incluídos estimuladores imunológicos na formulação, tais como aqueles conhecidos na técnica para vacinas orais. Tais estimuladores imunológicos incluem as toxinas bacterianas, particularmente a toxina da cólera (CT) na forma da holotoxina (molécula inteira) ou da cadeia B somente (CTB) e a enterotoxina instável ao calor de E. coli (LT). As LTs mutadas (mLTs), que são menos prováveis de converterem-se em sua forma ativa do que a LT nativa, são descritas em WO 96/06627, WO 93/13202 e US 5.182.109.
Os estimuladores imunológicos adicionais que podem vantajosamente ser incluídos são os derivados de saponina, tais como o QS21 e o monofosforil lipídio A, em particular o monofosforil lipídio A 3-des-O-acilado (3D-MPL). As saponinas purificadas como adjuvantes orais são descritas em WO 98/56415. As saponinas e o monofosforil lipídio A podem ser empregados separadamente ou em combinação (por exemplo, WO 94/00153) e podem ser formulados em sistemas de adjuvantes juntamente com outros agentes. O 3D-MPL é um adjuvante bastante conhecido, fabricado por Ribi Immunochem, Montana, e a sua fabricação é descrita em GB 2122204.
Uma discussão geral de veículos e adjuvantes para a imunização oral pode ser encontrada em Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell e Newman, Píenum Press, Nova York, 1995. A invenção também proporciona um método para vacinar pacientes humanos, especialmente as crianças, por administração a um paciente estando necessitado do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição de vacina de acordo com a invenção. De preferência, a vacina atenuada viva é administrada por administração oral.
Em um aspecto preferido, a composição de vacina da invenção é formulada com um antiácido para minimizar a inativação da vacina por ácido no estômago. Os componentes de antiácido adequados incluem os antiácidos inorgânicos, por exemplo, o hidróxido de alumínio AI(OH)3 e o hidróxido de magnésio Mg(OH)2. Os antiácidos comercialmente disponíveis que são adequados para uso na invenção incluem o MyJanta (marca registrada), o quaf contém hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio. Estes são insolúveis em água e são dados em suspensão. O hidróxido de alumínio é um componente particularmente preferido de uma composição de vacina de acordo com a invenção, visto que pode proporcionar não somente um efeito de antiácido, como também um efeito de adjuvante.
Também adequados para uso como antiácidos na vacina da invenção são os antiácidos orgânicos, tais como os sais de carboxilato de ácido orgânico. Um antiácido preferido na composição de vacina da invenção contém um sal de carboxilato de ácido orgânico, preferivelmente um sal de ácido cítrico, tal como o citrato de sódio ou o citrato de potássio.
Um antiácido particularmente preferido, que pode ser usado na composição de vacina da presente invenção, é o sal inorgânico insolúvel, carbonato de cálcio (CaC03). O carbonato de cálcio é capaz de associar-se com o rotavírus e a atividade do rotavírus é mantida durante a associação com o carbonato de cálcio.
Para impedir a sedimentação de carbonato de cálcio durante a etapa de enchimento, os agentes viscosos estão preferivelmente presentes na formulação.
Os agentes viscosos possíveis que podem ser usados incluem os excipientes pseudoplásticos. Uma solução pseudoplástica é definida como uma solução tendo maior viscosidade no repouso comparada a sua viscosidade sob agitação. Os excipientes deste tipo são os polímeros naturais, tais como a goma arábica, a goma adraganta, ágar-ágar, os alginatos, as pectinas ou os polímeros semi-sintéticos, por exemplo: a carboximetilce-lulose (Tyloses C®), a metilcelulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® e MB®), a hidroxipropilcelulose (Klucels®), e a hidroxipropilmetilcelulose (Methocels E® e K®, Viscontrans MPHC®). Em geral, estes excipientes pseudoplásticos são usados juntos com agentes tixotrópicos. Os agentes viscosos alternativos que podem ser usados são os excipientes pseudoplásticos com baixa capacidade de escoamento. Estes polímeros, em uma concentração suficiente, dão surgimento a um arranjo fluido estrutural, resultando em uma solução de alta viscosidade tendo baixa capacidade de escoamento no repouso. Uma certa quantidade de energia necessita ser dada ao sistema para permitir o escoamento e a transferência. As energias externas (agitação) são necessitadas para destruir temporariamente o arranjo fluido estrutural a fim de obter uma solução fluida. Os exemplos de tais polímeros são Carbopols® e goma xantana.
Os excipientes tixotrópicos tornam-se uma estrutura de gel no repouso, ao passo que sob agitação eles formam uma solução fluida. Os exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (Silicato de magnésio-alumínio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcristalina e 11% de Carboximetilcelulose Na). A composição de vacina da presente invenção preferivelmente compreende um agente viscoso selecionado de goma xantana ou amido.
Desse modo, a composição de vacina da presente invenção é preferivelmente formulada com uma combinação de carbonato de cálcio e goma xantana.
Os outros componentes de uma composição usada na invenção adequadamente incluem os açúcares, por exemplo a sacarose e/ou a lacto-se. A composição de vacina de acordo com a invenção pode conter componentes adicionais, incluindo, por exemplo, os aromatizantes (particularmente para uma vacina oral) e os agentes bacterioestáticos. São consideradas diferentes apresentações da composição de vacina de acordo com a invenção.
Em uma modalidade preferida, a vacina é administrada como uma formulação líquida. De preferência, a formulação líquida é reconstituída antes da administração a partir pelo menos dos seguintes dois componentes: i) componente de vírus ii) componente de líquido.
Nesta modalidade, o componente de vírus e o componente de líquido estão normalmente presentes em recipientes separados, os quais podem convenientemente ser compartimentos separados de um único vaso, ou vasos separados, os quais podem ser conectados em um modo tal que a composição de vacina final seja reconstituída, sem expô-la ao ar.
Antes da reconstituição, o vírus pode estar em uma forma seca ou em uma forma líquida. De preferência, o componente de vírus é liofiliza-do. O vírus liofilizado é mais estável do que o vírus em uma solução aquosa. O vírus liofilizado pode ser adequadamente reconstituído usando uma composição de antiácido líquida para produzir uma formulação de vacina líquida. Alternativamente, o vírus liofilizado pode ser reconstituído com água ou solução aquosa, em cujo caso a composição de vírus liofilizado preferivelmente contém um componente de antiácido.
De preferência, a formulação de vacina compreende um componente de vírus formulado com carbonato de cálcio e goma xantana em um compartimento ou vaso, e este é reconstituído com água ou solução aquosa presente no segundo compartimento ou vaso.
Em uma outra modalidade preferida, a composição de vacina é uma formulação sólida, preferivelmente uma torta liofilizada que é adequada para a dissolução imediata quando colocada na boca. As formulações liofili-zadas podem convenientemente ser proporcionadas na forma de comprimidos em um envoltório de vesícula farmacêutico.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma vacina de rotavírus na forma de um comprimido de dissolução rápida para a administração oral.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo uma cepa de rotavírus atenuado, vivo, em particular uma cepa de rotavírus humano, em que a composição é um sólido liofilizado capaz de dissolução imediata quando colocado na boca.
De preferência, o comprimido de dissolução rápida de acordo com a invenção dissolve-se na boca do paciente suficientemente rápido para impedir a deglutição do comprimido não-dissolvido. Esta abordagem é partícularmente vantajosa para vacinas de rotavírus pediátricas.
De preferência, o vírus é um rotavírus humano atenuado, vivo, o qual é formulado com um antiácido inorgânico, tal como o carbonato de cálcio, e um agente viscoso, tal como a goma xantana.
Um aspecto adicional da presente invenção é proporcionar uma formulação liofilizada, em que o componente de vírus é qualquer cepa de rotavírus que seja formulada com carbonato de cálcio e goma xantana.
As vacinas da invenção podem ser formuladas e administradas por técnicas conhecidas, usando uma quantidade adequada do vírus vivo para proporcionar uma proteção eficaz contra a infecção por rotavírus, sem os efeitos colaterais adversos significativos em vacinas típicas. Uma quantidade adequada do vírus vivo normalmente será entre 104 e 107 ffu por dose. Uma dose típica de vacina pode compreender 105 - 106 ffu por dose e pode ser dada em diversas doses durante um período de tempo, por exemplo em duas doses dadas com um intervalo de dois meses. Os benefícios podem, entretanto, ser obtidos por se ter mais do que 2 doses, por exemplo, um regime de 3 ou 4 doses, particularmente em países em desenvolvimento. O intervalo entre as doses pode ser mais ou menos do que dois meses de duração. Uma quantidade ideal do vírus vivo para uma única dose ou para um regime de doses múltiplas, e a escolha do momento ideal para as doses, pode ser verificada por estudos padrão envolvendo a observação dos títulos de anticorpos e outras respostas nos pacientes. A vacina da invenção pode também compreender outros vírus vivos adequados, para a proteção contra outras doenças, por exemplo o poliovírus. Alternativamente, outras vacinas de vírus vivos adequadas, para a administração oral, podem ser dadas em uma dose separada, porém na mesma ocasião que a composição de vacina de rotavírus de acordo com a invenção.
Legenda de Figura para a Figura 3 Os soros de doze crianças com 4 a 6 meses de idade, vacinadas com o material P33 conforme descrito no documento Vaccine (1998), foram testados quanto à neutralização de P33, P38, P43 e 89-12C2. A faixa de títulos de neutralização de todos os soros testados é similar para ο P33, ο P38 e ο P43. A análise estatística não mostra nenhuma diferença significativa nos títulos de neutralização globais contra todos os três vírus. Isto sugere que os epítopos de neutralização conformacionais e não-conformacionais de P33, P38 e P43 são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 das crianças vacinadas com P33. Esta observação indiretamente sugere que os epítopos de neutralização revelados neste ensaio in vitro não foram alterados entre P33, P38 e P43. A faixa de títulos de neutralização de P89-12C2, entretanto, significativamente difere de P33, P38 e P43. Esta observação sugere que os epítopos de neutralização conformacionais e não-conformacionais de P33, P38 e P43 não são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 das crianças vacinadas com P33. Esta observação indiretamente sugere que os epítopos de neutralização revelados neste ensaio in vitro foram alterados entre 89-12 C2 e P33, P38 e P43.
Os exemplos que se seguem ilustram a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Demonstração que a cepa 89-12 na passagem 26 (P2Q) é uma mistura de variantes Seoüenciamento de genes oara VP4 e VP7 a partir de diferentes grupos de passagem Foi efetuado o seqüenciamento de genes para VP4 e VP7 a partir da passagem P26 (células do AGMK primário), da passagem P33 (linha de células do AGMK estabelecidas (em oposição ao primário)), da passagem P41 e da passagem P43. A extração de RNA total foi transcrita reversa e amplificada através de PCR em um tubo/uma etapa.
Os iniciadores Rota 5bis e Rota 29bis amplificaram o gene para VP4 inteiro e os iniciadores Rota 1 e Rota 2bis amplificaram o gene para VP7 inteiro. O material da PCR foi seqüenciado usando iniciadores diferentes (ver a Tabela 1). A seqüência da passagem P26 diferiu da seqüência da passagem P33 em 3 bases (nas posições 501, 788 e 802 bp a partir do códon de iniciação) em VP4 e em três bases em VP7 (108, 605 e 897 bp a partir do códon de iniciação).
As varreduras da seqüência da passagem P26 de VP4 e VP7 mostram nas posições mutadas a presença da seqüência da passagem P33 como um fundo. Desse modo, pode ser visto que a passagem P26 é uma mistura de pelo menos 2 variantes.
As varreduras da seqüência da passagem P33 parecem homogêneas em VP4 e heterogêneas para VP7 (ver a Tabela 2). A passagem P38 (derivada da passagem 33) foi passada 5 vezes sobre células Vero e mostrou o mesmo grupo de seqüências de VP4 e VP7 que a passagem P33 (linha de células do AGMK). Desse modo, não houve nenhuma alteração principal nas populações entre P33 e P38. TABELA 1: Oligonucleotídeos usados para RT-PCR e seqüenciamento TABELA 1: Continuação TABELA 2: Oligonucleotídeos usados na hibridização As bases mostradas no tipo em negrito na Tabela 2 são os sítios de variação de seqüência específica em VP4 e VP7. TABELA 3: Variação de sequência dos genes para VP4 e VP7 3.1 N.B. Em um segundo clone a partir dos 3 clones que foram desenvolvidos até o nível de grupo de produção, o nucleotídeo da posição de 897 bp de VP7 é a G, em vez da A, como no clone selecionado de P43. Isto resulta em uma metionina no lugar de uma isoleucina na sequência de ami-noácidos. As variantes correspondendo tanto ao clone de P43 selecionado quanto ao clone no qual há uma G em VP7 a 897 bp a partir do códon de iniciação, foram excretadas nas fezes das crianças que tinham sido vacinadas com o material P33.
Na Tabela 3.1, onde existem duas bases alternadas em uma posição particular, a primeira das duas representa a base que aparece em uma população principal e a segunda é a base que aparece em uma população secundária. As populações de variantes principais e secundárias são julgadas pela intensidade do sinal no seqüenciamento. 3.2 A Tabela 3.2 mostra as mudanças dos aminoácidos resultantes das diferenças de nucleotídeos entre as variantes. TABELA 4 Hibridizacão por manchas de rastros A alteração nas populações entre as passagens P26 a P33 sobre as células do AGMK foi adicionalmente confirmada através de hibridiza-ção por manchas de rastros. A VP4 e os fragmentos de gene para VP7 gerados por RT/PCR foram hibridizados com sondas de oligonucleotídeos específicas para cada variante (ver as Tabelas 3.1 e 3.2). Em contraste com P26, que hibridizou com Rota 16, Rota 35 e Rota 36 e não com Rota 15, o zou somente com Rota 16 e não com qualquer um de Rota 15 ou Rota 35 ou Rota 36. Estes resultados estabeleceram a presença de pelo menos 3 variantes em P26 (ver a Tabela 4).
Para o fragmento de VP7 da PCR do material P33, a posição 897 hibridizou com Rota 41 e Rota 42. Estes resultados estabeleceram a presença de pelo menos duas variantes no material P33.
Exemplo 2: Isolamento e caracterização do clone de P43 Para isolar os componentes de P33 como uma população de vírus homogênea, foram efetuadas três diluições pontuais finais de P33/AGMK sobre células Vero e o vírus resultante foi usado para infectar as células Vero.
As cavidades positivas foram selecionadas usando dois critérios: o crescimento demonstrado pelo maior número de focos detectados nas cavidades e as cavidades positivas mais isolada sobre as placas, conforme é feito classicamente. Após 3 passagens em diluição final nas placas de micro-título com 96 cavidades, 10 cavidades positivas foram amplificadas sucessivamente sobre células Vero e avaliadas quanto ao seu rendimento.
Com base no rendimento, três clones foram desenvolvidos até o nível de passagem de grupo de produção. O reconhecimento imunológico por anticorpos policlonais foi mostrado ser similar tanto entre os três clones quanto entre os clones e P33. A homogeneidade dos clones foi avaliada por hibridização por manchas de rastros. A seleção final de um único clone foi baseada no rendimento e na seqüência. O clone selecionado foi amplificado por passagens sucessivas sobre células Vero, para gerar uma Semente principal, uma Semente de trabalho e finalmente os grupos de produção. O clone selecionado foi geneticamente caracterizado em diferentes níveis de passagem por seqüenciamento de VP4 e VP7 (identidade) e através de hibridização por manchas de rastros específica da VP4 e VP7 (homogeneidade) dos materiais amplificados por PCR. A seqüência dos genes para VP4 e VP7 do material P43 são dadas nas SEQ ID N° 1 e 2, respectivamente, e são idênticas à P41. vamente, e são idênticas à P41. A homogeneidade do clone selecionado foi avaliada por uma hibridização seletiva, usando sondas de oligonucleotídeos descriminando as mudanças de nucleotídeos nas regiões de VP4 e/ou VP7 para cada variante identificada durante o seqüenciamento de P26/AGMK primário (ver a Tabela 4). O fragmento de VP4 hibridizou com Rota 16 e não com Rota 15, Rota 35 ou Rota 36. O fragmento de VP7 hibridizou com Rota 41 e não com Rota 42.
Estes resultados confirmaram que P43 é uma população homogênea.
Exemplo 3: Remoção do vírus adventício potencial O éter foi adicionado à P33 (crescimento em AGMK) até uma concentração final de 20%, por 1 h. O éter foi então borbulhado fora com N2 por 35 min. Nenhum impacto sobre o título da semente de P33 foi observado.
Exemplo 4: Formulação de uma vacina atenuada viva Os grupos de produção descritos acima são formulados para a administração oral a crianças pelo método que se segue. 1. Vírus liofilizado As técnicas padrão são usadas para preparar as doses de vírus. A massa viral purificada congelada é descongelada e diluída com uma composição de meio apropriada, neste caso o Meto de Eagle modificado de Dulbecco, até uma concentração viral de padrão desejado, neste caso 106’2 ffu/ml. O vírus diluído é então adicionalmente diluído com estabilizador de liofilização (4% de sacarose, 8% de dextrana, 6% de sorbitol, 4% de amino-ácido) até o título-alvo viral, neste caso 105,6 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 ml de composição de vírus estabilizado são transferidas de forma asséptica para frascos pequenos de 3 ml. Cada frasco pequeno é então parcialmente fechado com uma rolha de borracha, a amostra é seca por congelamento sob um vácuo, o frasco pequeno é então completamente fechado e uma tampa de alumínio é fechada no local em torno do frasco pequeno para manter a rolha no lugar.
Para uso, o vírus é reconstituído usando um dos seguintes re-constituintes de antiácido: (a) Reconstituinte de citrato O citrato de sódio é dissolvido em água, esterilizado por filtração e transferido de forma asséptica para recipientes de reconstituintes, em quantidades de 1,5 ml, em uma concentração de 544 mg de Na3Citrato.2H20 por dose de 1,5 ml. Os recipientes de reconstituintes podem ser, por exemplo, frascos pequenos de 3 ml, ou frascos pequenos de 4 ml, ou seringas de 2 ml, ou cápsulas capazes de compressão, plásticas, moles, para a administração oral. Como uma alternativa para manter os componentes estéreis sob condições estéreis, o recipiente final pode ser esterilizado em autoclave. (bt Reconstituinte de ΑΚΟΗΪ3 Uma suspensão asséptica de hidróxido de alumínio (Mylanta -marca registrada) é diluída de forma asséptica em água estéril, transferida de forma asséptica para recipientes de reconstituintes {por exemplo, seringas de 2 ml, ou cápsulas capazes de compressão, plásticas, moles) em quantidades de 2 ml cada contendo 48 mg de Al(OH)3. Uma alternativa ao uso de componentes estéreis sob condições estéreis é irradiar γ a suspensão de hidróxido de alumínio {preferivelmente em um estágio diluído). São incluídos ingredientes padrão para impedir que a suspensão sedimente. Tais ingredientes padrão incluem, por exemplo, o estearato de magnésio, a carboximetilcelulose, a hidroxipropilmetilcelulose, a celulose microcristalina, e os polímeros de silicone. Os agentes bacteriostáticos, por exemplo, o butilparaben, o propilparaben ou outros agentes bacteriostáticos padrão usados em alimento, e os aromatizantes, podem também ser incluídos. 2. Vírus liofilizado com AlfOHt.g na formulação líquida São usadas técnicas padrão para preparar as doses de vírus. A massa viral purificada, congelada, é descongelada e diluída com uma composição de meio apropriada, neste caso o Meio de Eagle modificado da Dulbecco, até uma concentração viral padrão desejada, neste caso 106,2ffu/ml. A suspensão de hidróxido de alumínio é adicionada para atingir uma quantidade final de 48 mg/dose e a composição de vírus é diluída com estabilizador de liofilização, (sacarose 4%, dextrana 8%, sorbitol 6%, ami-noácido 4%) até o títutlo-alvo viral, neste caso 105,6 ffu/dose. 0,5 mL de alíquotas de composição de vírus estabilizada são assepticamente transferidas a frascos de 3 mL. A liofilização e o fechamento dos frascos são realizados como descrito na parte 1. 3. Vírus liofilizado com AKOHLi para apresentação com blister Técnicas padrão são usadas para preparar doses virais. Volume viral, purificado e congelado é derretido e diluído com composição de meio apropriada, neste caso Meio de Eagle modificado da Dulbecco até concentração viral padrão desejada, neste caso 106,2 ffu/dose. Suspensão de hidróxido de alumínio é adicionada para atingir uma quantidade final de 48 mg/dose e a composição de vírus é diluída com estabilizador de liofilização o qual pode ser a sacarose, a dextrana ou aminoácido a 4%, ou a gelatina, ou a peptona vegetal, ou a xantana, até o título-alvo viral de 105’6 ffu/dose. Uma operação de enchimento asséptico é empregada para transferir as doses de 0,5 ml ou preferivelmente menos para as cavidades da vesícula. A composição é liofilizada, e as cavidades da vesícula são vedadas por vedação térmica.
Opcionalmente são incluídos ingredientes padrão para impedir que a suspensão de hidróxido de alumínio sedimente. Tais ingredientes padrão incluem, por exemplo, o estearato de magnésio, a carboximetilcelulose, a hidroxipropifmetilcelulose, a celulose microcristalina, e os polímeros de silicone. Os aromatizantes podem também ser incluídos.
Exemplo 5: Titulação viral de rotavíms para diversas formulações 5.1: Comparação entre as formulações à base de lactose e de sacarose O rotavírus P43 foi formulado com sacarose ou com lactose, conforme mostrado na tabela acima. A titulação viral antes da liofilização é o título viral no líquido formulado completado (contendo sacarose, dextrana, sorbitol, aminoácidos) e sem a etapa de liofilização.
Os bons resultados são aqueles nos quais uma diminuição de <0,5 log na etapa de liofilização e uma diminuição de <0,5 log durante a "1 semana a 37°C" (teste da estabilidade acelerada) são obtidas. A precisão da titulação viral é aproximadamente + ou - 0,2 log. Os resultados indicam que a sacarose pode ser usada em vez da lactose. 5.2. Efeito da arqinina e da substituição do sorbitol pelo maltitol: Os resultados demonstram que a adição de arginina (que é sabida aperfeiçoar a estabilidade do vírus durante a liofilização e também proporciona um meio básico a fim de compensar a acidez do estômago) mantém o título viral. O sorbitol tende a diminuir a temperatura de transição vítrea da torta liofilizada em um grau muito grande. Isto pode ser superado por utilização de maltitol em vez de sorbitol, conforme mostrado acima, e o título viral é ainda mantido. 5.3: Diversas composições de formulação Esta experiência demonstra que são possíveis diversas formulações.
5.4: Associação entre o Rotavírus e o antiácido AlfOHW O AI(OH)3 é usado como um antiácido. Isto mostra que o Rotavírus está associado com o sal inorgânico insolúvel (AI(OH)3), visto que ele centrifugou juntamente com o AI(OH)3 (diminuição da atividade viral no so-brenadante). 5.5: Dissolução do antiácido AI(OH)3 pelo Citrato de Sódio antes da titulação viral Quando o Rotavírus está associado com o AI(OH)3, é possível liofilizar tudo (incluindo o AI(OH)3), Após a liofilização, é possível recuperar o Rotavírus por dissolução do AI(OH)3 em Citrato de Sódio. Esta etapa não danifica o Rotavírus e conserva a sua atividade após esta etapa de dissolução. 5.6: Infecciosidade do Rotavírus após a liberação da associação de AKQHk. Rotavírus: O mecanismo de liberação do vírus (por dissolução do veículo) pode ocorrer muito bem in vivo. Na verdade, abaixo de pH 6, o hidróxido de alumínio torna-se completamente solúvel, e, desse modo, o Rotavírus será liberado no estômago. AI(OH)3 + 3 H+ “> ΑΓ++ (solúvel em água) + 3 H20 No estômago, os íons Al+++ não são absorvidos (J.J. Powell, R. Jugdaohsingh e R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153).
No intestino, devido ao aumento do pH, as formas insolúveis do alumínio são precipitadas (AI(OH)3 ou AIP04), e eliminadas pelo modo natural. Não é sabido se o precipitado de AI(OH)3 (ou AIP04) recentemente formado será capaz de associar-se novamente com o Rotavírus livre. Isto faz surgir a questão da infecciosidade da associação de AI(OH)3. Rota- vírus propriamente dita. A liberação do Rotavírus da associação de AI(OH)3.Rotavírus por outros mecanismos é também possível. A lisina, por exemplo, interfere com a adsorção viral sobre o AI(OH)3. Outros ânions como o borato, o sulfato, o carbonato e o fosfato são sabidos serem especificamente adsorvidos sobre o hidróxido de alumínio, desse modo, teoricamente, deve ser possível remover (por competição pelo local de adsorção) o Rotavírus da associação de AI(OH)3.Rotavírus. DRVC003A46 + 12 mg de AI{OH)3 em 0,120 ml + 65 mg de Lisina 1,380 ml de H20 + 30 min a T. Ambiente + Centrifugação 8000 rpm a 10 min Culot Sobrenadante + dissolução em Citrato abaixo da detecção 3,8 Desse modo, o Rotavírus pode ser liberado da associação de Rotavírus - AI(OH)3 e o Rotavírus liberado permanece ativo.
Esta liberação pode ser feita por dissolução do AI(OH)3 (por HCI) no estômago, ou por Na3Citrato in vitro) ou por remoção do Rotavírus por um aminoácido básico (lisina). 5.7: Infecciosidade da associação de AKQHWRotavírus Uma única dose de Rotavírus íiofilizado foi reconstituída com água e dividida em duas partes. A primeira parte, considerada como a referência, recebeu um volume adicional de água. A segunda parte recebeu 24 mg de AI(OH)3 suspensos em 0,240 ml de água (Titulações virais pré-clínicas). DRVC003A46 + 1,5 ml de H20 0,750 ml 0,750 ml + + 0,240 ml 24 ml H20 Al{OH}3 em 0,240 mi 1 hora 1 hora 5,55 6,22 Quando o AI(OH)3 estiver presente, o Rotavírus está ativo e o valor da titulação viral é maior em comparação com a amostra de referência.
Esta experiência foi repetida sem dividir a dose liofilizada, e por adição de 12 mg de AI(OH)3 ou 24 mg de AI(OH)3.
Aqui, a amostra de referência foi a reconstituída com um tampão de Citrato-Bicarbonato. Desse modo, o título viral é novamente maior na presença de AI(OH)3. DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46 + + + 1,5 ml de 12 ml de 24 mg de tampão WL AI(OH)3 AI(OH)3 em 0,120 ml em 0,240 ml + + 1,380 ml de H20 1,260 ml de H20 5,34 6,24 6,05 5,32 5,95 6,26 Como no exemplo acima, o Rotavírus associa-se com as partículas de AI(OH)3, uma vez que o vírus pode ser descartado por centrifuga-ção. O DRVC003A46 é um Rotavírus formulado, liofilizado (Sacarose: 2%; Dextrana: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2%). DRVC003A46 DRVC003A46 + + 12 mg de AI(OH)3 24 mg de AI(OH)3 em 0,120 ml em 0,240 ml + + 1,380 ml de H20 1,260 ml de H20 + + Centrifugação Centrifugação 8000 rpm a 10 min 8000 rpm a 10 min Culot Sobrena- Culot Sobrena- + dante + dante 1,5 ml 1,5 ml SDSAA SDSAA 5,78 < 1,44 5,92 < 1,44 5,96 < 1,44 6,11 <1,44 SDSAA = 2% de Sacarose, 4% de Dextrana, 3% de Sorbitol, 2% de Amino-ácido.
De acordo com a titulação viral realizada sobre o sobrenadante, a quantidade de Al(OH)3 necessitada para adsorver o Rotavírus parece ser baixa (começando com uma titulação viral de escalonamento de 5,7 log de dose liofilizada): O tempo necessitado para adsorver o Rotavírus sobre o AI(OH)3 parece ser curto: Uma dose de Rotavírus liofilizado foi reconstituída na presença de 24 mg de AI(OH)3, e centrifugada após 0, 15, 60 min e 24 horas. Os "cu-lots” foram suspensos novamente em SDSAA, antes da titulação viral: 5.8: Usando o CaCO-^ como antiácido A fim de evitar o alumínio na vacina, o antiácido AI{OH)3 foi substituído por um outro sal inorgânico insolúvel: o CaC03 (carbonato de cálcio).
Os fenômenos observados com o CaC03 são paralelos àqueles descritos para o Al(OH)3: - Associação do Rotavírus com o sal inorgânico; - Conservação da atividade do Rotavírus quando associado com o sal inorgânico; - Possibilidade de liberação do Rotavírus da associação por dissolução da base inorgânica por um ácido; - Possibilidade de liofilização em conjunto do antiácido e o Rotavírus. Associação do CaCOg e o Rotavírus Em um primeiro ensaio, o Rotavírus liofilizado {título viral 5,7) foi reconstituído com uma suspensão de CaC03 em água (50 mg em 1,5 ml); e então centrifugado, e o título viral do sobrenadante comparado ao culot. DRVC003A46 DRVC003A46 + + 50 mg de CaC03 50 mg de CaC03 em em 1,5 ml de H20 1,5 ml de H20 + + Cenírífugação Centrifugação 8000 rpm a 10 min 8000 rpm a 10 min Culot Sobrena- Culot Sobrena- + dante + dante 1,5 ml 1,5 ml de SDSAA Citrato de Na 5,83 4,46 5,88 4,33 Isto indica que mais do que 90% do Rotavírus está associado com o CaCOs.
Também, quando o vírus estava associado, foi possível realizar a titulação e recuperar as quantidades virais originais.
Também, os títulos virais são ligeiramente maiores do que aqueles obtidos sem o CaC03. DRVC003A46 DRVC003A46 + + 1,5 ml de H20 1,5 ml de + Tampão W.L.
Centrifugação 8000 rpm a 10 min "Culot" Sobrena- dante 4,99 5,03 5,35 Quantidade de associação de CaCQg e Rotavírus O Rotavírus liofilizado foi reconstituído com uma suspensão de CaC03 em água (1,5 ml): 10 mg 50 mg 100 mg e então centrifugado, e o título viral do sobrenadante comparado com o culot.
Assim, claramente, mais CaC03 e mais vírus estão associados, e menos é encontrado no sobrenadante. Entretanto, a dose inteira não é completamente recuperada (esperou-se um total de 5,3 pelo menos ou mesmo 5,8 conforme obtido antes - ver acima).
Proteção do Rotavírus pelo CaCQ3 durante a titulação de antiácido Babv Rossett-Rice Usando 10 doses de Rotavírus liofilizado (DRVC003A46) e 50 mg de CaC03, foram efetuados dois tipos de titulação baby Rossett-Rice: Em uma titulação Rossett-Rice clássica, o antiácido é misturado com o Rotavírus e o HOI é vertido neste meio.
Na baby Rossett-Rice "inversa11, a situação é o inverso: o antiácido é gotejado na combinação de HCI (como ocorre in vivo).
Desse modo, nesta experiência in vitro, o carbonato de cálcio é capaz de proteger cerca de 20% do Rotavírus da presença de HCI, ao passo que o hidróxido de alumínio não é capaz. 5.9: Liofilizacão do Rotavírus na presença do antiácido CaCC%: Isto é o "tudo em um" - liofilização do Rotavírus e o antiácido (CaC03) juntos no mesmo frasco pequeno. Para impedir a sedimentação do CaC03 durante a etapa de enchimento, são necessitados agentes viscosos. Os exemplos de tais agentes viscosos incluem a goma Xantana e o Amido. A atividade do Rotavírus é mantida, mesmo na presença de goma Xantana e Amido. 5.10 Comprimidos liofilizados para a rápida desintegração guando colocados na boca: As formulações que se seguem demonstram o conceito "lyoc". Ou seja, a rápida dissolução da torta liofilizada na boca.
No "conceito de lyoc", tanto a Xantana quanto o Amido podem ser usados (mantendo as propriedades de rápida dissolução da torta liofilizada). Exemplo 6: Uso do Carbonato de Cálcio como o antiácido para a composição de vacina de Rotavírus Quando uma suspensão de CaC03 em água for usada como o antiácido para o Rotavírus, há um problema que as partículas de carbonato de cálcio sedimentam-se rapidamente quando colocadas em água, uma vez que o valor da densidade do pó aproxima-se a 2,6 e o tamanho de partícula médio é 30 μηπ.
Esta sedimentação pode ser reduzida por 1 aumento da densidade do meio circundante 2 aumento da viscosidade do meio circundante 3 redução do tamanho das partículas 4 afastamento das partículas umas das outras 6.1: Aumento da densidade do meio circundante: Quando a suspensão de CaC03-Água (quando colocada na seringa) for colocada sobre a torta liofilizada (contendo 2% de sacarose, 4% de dextrana; 3% de sorbitol; 2% de aminoácidos), a densidade do meio circundante é aumentada, porém a velocidade de sedimentação do CaC03 não é muito diferente da suspensão de CaC03-Água. 6.2: Aumento da viscosidade do meio circundante: Excipientes oseudoplásticos Uma solução pseudoplástica é definida como uma solução tendo maior viscosidade no repouso em comparação com a sua viscosidade sob agitação.
Os excipientes usuais deste tipo são: os polímeros naturais, por exemplo: a goma arábica a goma de adragante o ágar-ágar os alginatos as pectinas os polímeros semi-sintéticos, por exemplo: a carboximetilcelulose (Tyloses C®) a metilcelulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® e MB®) a hidroxipropilcelulose (Klucels®) a hídroxipropilmetilcelulose (Methocels E® e K®, Viscontrans MPHC®) Em geral, estes excipientes pseudoplásticos são usados juntos com agentes tixotrópicos.
Excipientes pseudoplásticos com capacidade de escoamento baixa Estes polímeros, em uma concentração suficiente, dão surgimento a um arranjo fluido estrutural que resulta em uma solução de alta viscosidade tendo baixa capacidade de escoamento no repouso. Uma certa quantidade de energia necessita ser dada ao sistema para permitir o escoamento e a transferência.
As energias externas (agitação) são necessitadas para destruir temporariamente o arranjo fluido estrutural, a fim de obter uma solução fluida.
Os exemplos de tais polímeros são os Carbopols® e a goma Xantana.
Excipientes tixotrópicos Com estes excipientes, no repouso, é obtida uma estrutura de gel; ao passo que, sob agitação, é obtida uma solução fluida.
Os exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (Silicato de magnésio-alumínio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcrista-lína e 11% de Carboximetilcelulose Na). 6.3 Redução do tamanho das partículas Uma redução no tamanho das partículas de CaC03 resultou em uma diminuição na capacidade antiácida do composto. 6.4 Afastamento das partículas umas das outras Este é o caso no Veegum® e no Avicel®, para os quais as partículas insolúveis menores (cerca de 1 μηπ) do que as partículas de CaC03 são colocadas entre as partículas de CaC03, a fim de impedir a agregação. Exemplo 7: Projeto do produto Os esquemas que se seguem demonstram os exemplos de pos- síveis projetos de produto. 7.1 CaCQg na seringa Já tendo as bateladas clínicas de Rotavírus em frascos pequenos liofilizados, o antiácido pode ser colocado no líquido reconstituinte contido na seringa.
Seringa com 1.3 ml de CaC03 (60 mg/ml) Agulha Rotavírus Liofilizado Nesta apresentação do produto, a sedimentação do CaC03 deve estar sob controle não somente durante as etapas de enchimento, como também durante a vida de prateleira completa do produto (pelo menos 2 anos) 7.2 CaCQ3 no frasco pequeno liofilizado Seringa com 1.3 ml de Água Agulha Rotavírus em frasco liofilizado + CaC03 (60 mg) Xantana______________ 7.3 Liofilização em uma vesícula Neste caso, o Rotavírus, o CaC03 e a goma Xantana são liofili-zados juntos, diretamente na vesícula.
Exemplo 8: Liofilização de cepa de Rotavírus diferente As cepas DS-1, P e VA70 são descritas como cepas de referência de Rotavírus humano para o serótipo G2, G3 e G4, respectivamente, na página 1361 de "Fields" Raven press 1990, segunda edição.
Nesta experiência, foram liofilizadas diferentes cepas de Rotavírus.
Para todas, ambos os títulos virais foram mantidos durante a liofilização e foi mostrada uma estabilidade acelerada (uma semana a 37° C).
Exemplo 9: Estudo de Fase I de segurança em adultos de uma administração oral da vacina de Rotavírus.
Um estudo de Fase I foi realizado para avaliar a segurança e a reatogenicidade de uma única dose oral de 106,0 ffu da vacina de P43 em adultos saudáveis, com idade de 18 a 45 anos. O ensaio clínico foi duplo-cego e aleatorizado. Ele era controlado por placebo e auto-suficiente. O estudo foi efetuado em um único centro na Bélgica.
População de Estudo Um total de 33 pacientes, 11 no grupo do placebo e 22 no grupo da vacina, foi inscrito e todos completaram o estudo. Todos os voluntários eram brancos. A sua idade média, na ocasião da vacina, era 35,3 anos, com uma faixa de 18 a 44 anos. O ensaio começou em janeiro e seguiu por aproximadamente um mês.
Material Vacina Os lotes clínicos de vacina de P43 foram produzidos, purificados, formulados e liofilizados de acordo com Good Manufacturing Practices. Os lotes foram liberados pelo Controle de Qualidade e Prova de Qualidade. Cada frasco pequeno de vacina continha os seguintes componentes: Ingrediente ativo: Cepa de P43 Mín. 105'8 ffu Excipientes, estabilizadores: Sacarose 9 mg Dextrana 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg Placebo Os frascos pequenos de placebo foram preparados e liberados. Cada frasco pequeno de placebo continha os seguintes componentes: Excipientes, estabilizadores: Sacarose 9 mg Dextrana 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg Diluente A água para a injeção foi usada como o diluente para reconstituir a vacina e o placebo.
Administração Aproximadamente 10 a 15 minutos antes da administração da vacina ou do placebo, os pacientes de ambos os grupos receberam 10 ml de Mylanta® oralmente. O Mylanta® é um antiácido registrado. O antiácido aumenta o pH do estômago e evita a inativação do rotavírus durante a sua passagem através do estômago.
Para preparar a vacina, dois frascos pequenos de P43 liofílizado contendo 10 5,8 ffu por frasco pequeno foram reconstituídos com 1,5 ml de água diluente para a injeção. Isto atingiu um título viral calculado de 106’1 ffu por dose. A vacina reconstituída foi administrada prontamente como uma única dose oral.
Para preparar o placebo, dois frascos pequenos de placebo lio-filizado foram reconstituídos com 1,5 ml de água para a injeção e administrados oralmente como uma única dose.
Segurança e Reatoaenicidade Aplicaram-se os seguintes critérios de segurança e reatogenici- dade: Os sintomas gerais solicitados eram febre, diarréia, vômito, náusea, dor abdominal e perda de apetite. Eles foram registrados durante oito dias após a administração.
Os sintomas não solicitados foram registrados durante 30 dias após a administração.
As ocorrências adversas sérias foram registradas durante o período inteiro de estudo.
As amostras de diarréia eram para ser coletadas durante oito dias após a administração.
Os resultados foram: Nenhum sintoma solicitado, nenhum não solicitado e nenhuma ocorrência adversa séria foram registrados durante os períodos respectivos de observação.
Nenhum caso de diarréia foi registrado.
REIVINDICAÇÕES

Claims (24)

1. População de rotavírus humanos atenuados, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante única, a dita variante sendo definida por uma sequência de nucleotídeos codificando ambas as proteínas virais principais designadas como VP4 e VP7, e em que a dita população é designada como P43 depositada sob o número de acesso ECACC 99081301.
2. População de rotavírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma cepa clonada.
3. População de rotavírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é derivada de uma infecção por rotavírus humano.
4. População de rotavírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que se replica em e é excretada por seres humanos.
5. Rotavírus, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína VP4 em que a sequência de nucleotídeos é como mostrada na SEQ ID N° 1, e uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína VP7 em que a sequência de nucleotídeos é como mostrada na SEQ ID N° 2.
6. Método de produzir uma população de rotavírus humanos purificados compreendendo uma variante única, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: passar uma preparação de rotavírus sobre uma linha de célula adequada; selecionar opcionalmente uma cultura homogênea usando as etapas de: diluição com limite; ou isolamento de placa individual; e checar quanto à presença de uma variante única por sequenci-amento de uma região apropriada da sequência de gene para VP4 e/ou VP7.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a preparação de rotavírus é passada sobre células do AGMK.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa adicional de tratamento com éter para remover os agentes contaminantes sensíveis ao éter.
9. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus atenuado vivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, misturado com um veículo ou adjuvante farmacêutico adequado.
10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é adaptada para a administração oral.
11. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o vírus atenuado vivo é formulado com uma composição de antiácido.
12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de antiácido compreende um antiácido orgânico.
13. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o antiácido é citrato de sódio.
14. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição de antiácido compreende um antiácido inorgânico.
15. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antiácido é hidróxido de alumínio.
16. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o antiácido é carbonato de cálcio.
17. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente viscoso.
18. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o agente viscoso é goma xantana.
19. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o vírus atenuado vivo é formulado com carbonato de cálcio e goma xantana e reconstituído com solução aquosa.
20. Composição de vacina de acordo com qualquer uma da reivindicação 11 a 19, caracterizada pelo fato de que o vírus atenuado vivo é formulado com a composição de antiácido e liofilizado em um envoltório de vesícula.
21. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 20, caracterizada pelo fato de que o vírus está na forma liofilizada.
22. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o vírus atenuado vivo e a composição de antiácido estão presentes em recipientes separados para a formulação como uma composição de vacina líquida antes da administração.
23. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o vírus atenuado vivo e a composição de antiácido estão presentes no mesmo recipiente para a formulação como uma composição de vacina liofilizada a ser reconstituída com a solução aquosa antes da administração.
24. Método de fabricação de uma vacina de rotavírus, como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende misturar um rotavírus humano atenuado com um antiácido e um agente viscoso.
BRPI0013357A 1999-08-17 2000-08-15 população de rotavírus humanos atenuados, seu método de produção, rotavírus, bem como composição de vacina e seu método de fabricação BRPI0013357B8 (pt)

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