PL205550B1 - Populacja rotawirusa, jego wariant, reasortant i zastosowanie, sposób wytwarzania populacji rotawirusa, kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania oraz preparat szczepionki - Google Patents

Populacja rotawirusa, jego wariant, reasortant i zastosowanie, sposób wytwarzania populacji rotawirusa, kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania oraz preparat szczepionki

Info

Publication number
PL205550B1
PL205550B1 PL354135A PL35413500A PL205550B1 PL 205550 B1 PL205550 B1 PL 205550B1 PL 354135 A PL354135 A PL 354135A PL 35413500 A PL35413500 A PL 35413500A PL 205550 B1 PL205550 B1 PL 205550B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
rotavirus
vaccine composition
antacid
vaccine
virus
Prior art date
Application number
PL354135A
Other languages
English (en)
Other versions
PL354135A1 (pl
Inventor
Brigitte Desiree Alberte Colau
Francoise Denamur
Isabelle Knott
Annick Poliszczak
Georges Thiry
Velde Vincent Vande
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9919468.0A external-priority patent/GB9919468D0/en
Priority claimed from GBGB9927336.9A external-priority patent/GB9927336D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL354135A1 publication Critical patent/PL354135A1/pl
Publication of PL205550B1 publication Critical patent/PL205550B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/0216—Solid or semisolid forms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/0056—Mouth soluble or dispersible forms; Suckable, eatable, chewable coherent forms; Forms rapidly disintegrating in the mouth; Lozenges; Lollipops; Bite capsules; Baked products; Baits or other oral forms for animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2095—Tabletting processes; Dosage units made by direct compression of powders or specially processed granules, by eliminating solvents, by melt-extrusion, by injection molding, by 3D printing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest populacja rotawirusa jego wariant, reasortant i zastosowanie, sposób wytwarzania populacji rotawirusa, kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania oraz preparat szczepionki.
Ostra biegunka zakaźna jest główną przyczyną choroby i śmierci w wielu regionach świata. W krajach rozwijających się wpływ choroby biegunkowej jest wstrząsający. Oszacowano, że w Azji, Afryce i Ameryce Łacińskiej występuje 3-4 miliardów przypadków biegunki rocznie i spośród tych przypadków około 5-10 milionów prowadzi do śmierci (Walsh, J.A. i wsp.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).
Rotawirusy są uważane za jedną z najważniejszych przyczyn ciężkiej biegunki u niemowląt i małych dzieci (Estes, M.K. Rotraviruses and Their Replication in Fields Virology, wyd. 3, red. Fieldsi wsp., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Szacuje się, że choroba związana z rotawirusem jest odpowiedzialna za ponad milion przypadków śmierci rocznie. Choroba indukowana rotawirusem najczęściej dotyczy dzieci pomiędzy 6 a 24 miesiącem życia, ze szczytem przypadków choroby pojawiającym się zazwyczaj podczas chłodniejszych miesięcy klimatów umiarkowanych oraz cały rok na obszarach tropikalnych. Rotawirusy są zazwyczaj przenoszone z osoby na osobę drogą kałowo-oralną a okres inkubacji wynosi od około 1 do około 3 dni. W przeciwieństwie do zakażeń w grupie wiekowej 6 do 24-miesię cy, u noworodków choroba przebiega zazwyczaj bezobjawowo lub bardzo ł agodnie. W przeciwieństwie do poważnej choroby spotykanej zazwyczaj u małych dzieci, większość zakaż eń u dorosłych jest łagodna lub bezobjawowa ze względu na to, że wię kszość dorosłych jest chroniona w wyniku wcześ niejszej infekcji rotawirusem (Offit, P. A. i wsp., Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982).
Rotawirusy są zazwyczaj kuliste, a ich nazwa pochodzi od ich charakterystycznej zewnętrznej i wewnętrznej lub podwójnie osłoniętej struktury kapsydu. Zazwyczaj, podwójnie osłonięta struktura kapsydu rotawirusów otacza wewnętrzną otoczkę białkową lub rdzeń zawierający genom. Genom rotawirusa jest złożony z 11 segmentów dwuniciowego RNA kodującego co najmniej 11 różnych białek wirusowych. Dwa z tych białek wirusowych, oznaczone jako VP4 i VP7, są rozmieszczone na zewnętrznej stronie podwójnie osłoniętej struktury kapsydu. Wewnętrzny kapsyd rotawirusa posiada jedno białko, które jest białkiem rotawirusa oznaczonym jako VP6. Względna istotność tych trzech szczególnych białek rotawirusowych w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej po zakażeniu rotawirusem nie jest jeszcze jasna. Niemniej jednak białko VP6 określa antygen grupy i podgrupy, a białka VP4 i VP7 są determinantami swoistości serotypowej.
Białko VP7 jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej (MW) 38000 (MW 34000 kiedy nie jest glikozylowane), będącą produktem translacji segmentu genomowego 7, 8 lub 9, w zależności od szczepu. Białko to stymuluje tworzenie głównego przeciwciała neutralizującego po zakażeniu rotawirusem. Białko VP4 nie jest glikozylowane, ma MW około 88000 i jest produktem translacji segmentu genomowego 4. Białko to także stymuluje przeciwciało neutralizujące po zakażeniu rotawirusem.
Ponieważ białka VP4 i VP7 są białkami wirusowymi, przeciwko którym skierowane są przeciwciała neutralizujące uważa się je za głównych kandydatów do tworzenia szczepionek rotawirusowych, chroniących przed chorobami rotawirusowymi.
Wiadomo, że naturalna infekcja rotawirusowa we wczesnym dzieciństwie wywołuje ochronną odporność immunologiczną. Zatem bardzo pożądana jest szczepionka z żywego atenuowanego rotawirusa. Korzystnie powinna to być szczepionka doustna ze względu na to, że jest to naturalna droga infekcji wirusem.
Wczesny rozwój szczepionki do zapobiegania zakażeniom rotawirusowym przypada na lata 1970 po odkryciu wirusa. Początkowo badano atenuowane szczepy ze zwierząt albo z ludzi i uzyskano mieszane lub niezadowalające wyniki. Niedawno wysiłki skupiono na ludzko-zwierzęcych reasortantach, co było bardziej udane.
Szczep rotawirusa znany jako 89-12 opisał Ward, patrz patent USA nr 5474773 oraz Bernstein, D.L. i wsp., Vaccine, 16(4), 381-387, 1998. Szczep 89-12 wyizolowano w 1988 z próbki stolca pobranego od 14 miesięcznego dziecka z naturalną chorobą rotawirusową. Zgodnie z patentem USA nr 5474773 ludzki rotawirus HRV 89-12 zaadoptowano do hodowli przez 2 pasaże w pierwotnych komórkach nerki afrykańskiej małpy zielonej (AGMK) oraz 4 pasaże w komórkach MA-104 jak opisał Ward w J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Następnie łysinki oczyszczano 3 razy w komórkach MA-104 (do pasażu 9) i hodowano przez dwa dodatkowe pasaże w tych komórkach. Wykonano doPL 205 550 B1 datkowo jeden pasaż (pasaż 12) celem złożenia w depozycie ATCC pod numerem dostępu ATCC VR 2272. Zdeponowany szczep jest znany jako 89-12C2.
Poniższe odniesienia „artykuł (1998) w Vaccine dotyczą artykułu Bernsteina i wsp. z 1998 opublikowanego w Vaccine. Artykuł ten opisuje bezpieczeństwo i immunogenność kandydata na szczepionkę podawaną doustnie z żywego ludzkiego rotawirusa. Szczepionkę tą uzyskano ze szczepu 89-12, atenuowanego przez pasażowanie bez oczyszczania łysinek 26 razy w pierwotnych komórkach AGMK, a następnie 7 razy w ustalonej linii komórkowej AGMK (w sumie 33 pasa ż e).
Poniżej omówiony wcześniej materiał, który był seryjnie pasażowany 26 razy będzie oznaczony jako P26 a materiał, który był seryjnie pasażowany 33 razy będzie oznaczony jako P33. Ogólnie, rotawirus pochodzący z n- krotnych pasaży szczepu 89-12 będzie oznaczany jako Pn.
W przykł adach które nastę pują materiał P33 pasaż owano dodatkowo 5 razy na komórkach Vero. Oznaczono go jako P38.
Izolaty P26 i P33 opisane w artykule (1998) w Vaccine nie zostały złożone w kolekcji hodowli, ani nie były analizowane w celu ustalenia ich cech genetycznych.
Ujawniono, że populacja P26 opisana w literaturze obejmuje mieszaninę wariantów. Ustalono to przez charakterystykę genetyczną jak opisano poniżej (patrz przykłady). P26 nie jest zatem niezawodną jednorodną populacją do dalszych pasaży, w szczególności do wytwarzania partii szczepionek. Podobnie P33 zawiera mieszaninę wariantów i nie jest niezawodnie jednorodny do produkcji partii szczepionek.
Ujawniono, że materiał P26 jest mieszaniną co najmniej trzech wariantów genu VP4. P33 i P38 są podobnie mieszaniną dwóch wariantów. Wydaje się, że warianty są różne antygenowo w odniesieniu do epitopów neutralizujących, niż szczep 89-12C2 zdeponowany w ATCC, dzięki ocenie mian przeciwciał neutralizujących z surowic pochodzących od dzieci zaszczepionych P33 przeciwko tym wariantom. Pokazano to na Fig. 3.
Ponadto ujawniono, że kiedy materiał P33 jest podawany niemowlętom, replikowane i wydzielane są dwa zidentyfikowane warianty. Ze 100 szczepionych niemowląt jedynie 2 wykazywały sygnały zapalenia żołądka i jelit zależne od infekcji rotawirusem podczas gdy 20% grupy placebo była zainfekowana. Dane te sugerują że zidentyfikowane warianty wiążą się z ochroną przez chorobą rotawirusową. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu rozdzielania wariantów rotawirusów oraz ulepszoną szczepionkę z żywego atenuowanego rotawirusa pochodzącego ze sklonowanego (homogennego) szczepu ludzkiego rotawirusa.
Przedmiotem wynalazku jest populacja (izolat) atenuowanego rotawirusa, charakteryzującą się tym, że obejmuje pojedynczy wariant lub zasadniczo pojedynczy wariant, który jest zdefiniowany przez sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej jedno z głównych białek wirusowych oznaczonych jako VP4 i VP7.
Korzystnie populacja rotawirusa według wynalazku jest wariantem sklonowanym.
Również korzystnie populacja rotawirusa według wynalazku pochodzi z infekcji ludzkim rotawirusem.
Korzystniej populacja rotawirusa według wynalazku replikuje się w i jest wydzielana przez ludzi.
Przez populację obejmującą pojedynczy wariant, lub zasadniczo pojedynczy wariant jest rozumiana populacja, która nie zawiera więcej niż 10%, korzystnie mniej niż 5% i najkorzystniej mniej niż 1% innego wariantu czy wariantów. Populacje wirusowe można oczyścić do homogenności lub zasadniczej homogenności przez pasażowanie na stosownych typach komórek lub przez przeprowadzenie serii jednego lub kilku etapów klonowania.
Korzyścią rozwiązań według wynalazku jest to, że populacja obejmująca pojedynczy wariant jest bardziej stosowna do tworzenia jednorodnej partii szczepionki. Szczególne warianty określone przez sekwencje nukleotydowe kodujące główne białko wirusowe mogą być także związane ze zwiększoną skutecznością w zapobieganiu przed infekcją rotawirusowa.
W jednym aspekcie, zasadniczo pojedynczym wariantem w populacji rotawirusowej wedł ug wynalazku jest wariant, w którym gen VP4 zawiera sekwencję nukleotydową obejmującą co najmniej jedną z następujących zasad: adeninę (A) w pozycji 788, adeninę (A) w pozycji 802 i tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start.
W dalszym aspekcie zasadniczo pojedynczym wariantem w populacji według wynalazku jest wariant, w którym gen VP7 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą co najmniej jedną z następujących zasad: tyminę (T) w pozycji 605, adeninę (A) w pozycji 897 lub guaninę (G) w pozycji 897 od kodonu start. Korzystnie w pozycji 897 występuje adenina (A).
PL 205 550 B1
W korzystnym aspekcie zasadniczo pojedynczy wariant w populacji wedł ug wynalazku posiada adeninę (A) w pozycjach 788 i 802 oraz tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start w sekwencji genu VP4.
W innym korzystnym aspekcie zasadniczo pojedynczy wariant w populacji wedł ug wynalazku posiada tyminę (T) w pozycji 605 oraz adeninę lub guaninę (A/G) w pozycji 897 od kodonu start w sekwencji genu VP7. Najkorzystniej w sekwencji VP7 w pozycji 897 wystę puje adenina (A).
W szczególnie korzystnym aspekcie zasadniczo pojedynczy wariant w populacji wedł ug wynalazku posiada adeninę (A) w pozycjach 788 i 802 oraz tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start w sekwencji genu VP4 i tymin ę (T) w pozycji 605 oraz adeninę (A) w pozycji 897 od kodonu start w sekwencji genu VP7.
Przedmiotem wynalazku jest również rotawirus, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko VP4 przedstawioną na Fig. 1 i/lub sekwencję nukleotydową kodującą białko VP7 przedstawioną na Fig. 2.
Korzystną populację rotawirusa według wynalazku stanowi populacja oznaczona jako P43 i zdeponowana pod numerem dostę pu ECACC 99081301.
Przedmiotem wynalazku jest także wariant rotawirusa oznaczony jako P43 i zdeponowany w ECACC pod numerem dostę pu 99081301, potomstwo rotawirusa i jego pochodne aktywne immunologicznie oraz materiały z nich uzyskane.
Wynalazek dostarcza także reasortanta ludzkiego rotawirusa obejmującego co najmniej jeden antygen albo co najmniej jeden segment wariantu P43 rotawirusa według wynalazku.
Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania populacji rotawirusa obejmującej zasadniczo pojedynczy wariant, który obejmuje:
pasażowanie preparatu rotawirusa na stosownym typie komórek;
ewentualne selekcjonowanie homogennej hodowli przy użyciu etapów spośród:
a) ograniczonego rozcieńczenia, lub
b) izolacji indywidualnych łysinek oraz sprawdzanie pod kątem obecności zasadniczo pojedynczego wariantu przez ustalenie sekwencji odpowiedniego regionu sekwencji genu VP4 i/lub VP7.
Ustalanie sekwencji można odpowiednio przeprowadzić za pomocą techniki hybrydyzacji ilościowej lub pół-ilościowej, takiej jak hybrydyzacja typu „slot blot lub hybrydyzacja łysinkowa.
Wyselekcjonowany wariant jest wariantem ulegającym replikacji i wydalaniu po podaniu wyjściowego preparatu rotawirusa człowiekowi, w szczególności dziecku.
Uzyskaną sklonowaną populację wirusa, otrzymaną dzięki sposobowi według wynalazku można dalej pasażować na stosownej linii komórkowej.
Stosowne typy komórek do pasażowania populacji rotawirusa w powyższym sposobie obejmują korzystnie komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej (AGMK), które mogą być ustalonymi liniami komórek lub pierwotnymi komórkami AGMK. Stosowne linie komórek AGMK obejmują przykładowo Vero (ATCC CCL-81), (DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) oraz CV-1 (ATCC CCL-70). Stosowne są także linie komórek MA-104 (rezusa) oraz MRC-5 (ludzka-ATCC CCL-171). Szczególnie korzystne dla celów amplifikacji są komórki Vero. Pasażowanie na komórkach Vero daje wysoką wydajność wirusa.
Techniki sprawdzania czy w populacji wirusowej uzyskanej tym sposobem znajduje się pojedynczy wariant oraz określania natury pojedynczego wariantu wymagają procedur standardowego sekwencjonowania lub hybrydyzacji znanych specjalistom i opisanych poniżej.
W korzystnym aspekcie sposób według wynalazku przeprowadza się przy użyciu odpowiedniego rotawirusa, szczególnie rotawirusa posiadającego charakterystykę szczepu 89-12 lub jego pasażowanych pochodnych.
Również korzystnie sposób według wynalazku obejmuje dodatkowy etap działania eterem w celu usunięcia wrażliwych na eter czynników zanieczyszczających.
Szczególnie korzystną populacją pojedynczego wariantu jest P43, uzyskany z P33 (wyizolowany ludzki rotawirus pasażowany 33 razy w hodowli odpowiednich typów komórek) przez etapy klonowania z serią rozcieńczeń końcowych, a następnie pasażowanie sklonowanego materiału na komórkach Vero do amplifikacji.
Populacja P43 została zdeponowana w European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied
PL 205 550 B1
Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Wielka Brytania 13 sierpnia 1999 pod numerem depozytu 99081301, zgodnie z zasadami traktatu budapeszteńskiego.
Chociaż ten ogólnie dostępny sposób jest najprostszym sposobem uzyskania ludzkiego rotawirusa P43, nie jest całkowicie niemożliwe lub nieprawdopodobne, że podobne i funkcjonalnie zasadniczo identyczne rotawirusy można by wytwarzać tymi czy innymi sposobami biorąc pod uwagę ujawnione niniejszym informacje. Takie funkcjonalnie zasadniczo identyczne rotawirusy uważane są za biologiczny odpowiednik ludzkiego rotawirusa P43 według wynalazku, a zatem mieszczą się w ogólnym zakresie niniejszego wynalazku. Powinno być jasne, że wynalazek obejmuje populacje rotawirusowe posiadające charakterystykę wariantu P43, jak niniejszym opisano.
Powinno także być jasne, że wynalazek obejmuje materiały pochodzące ze zdeponowanego P43 ECACC 99081301, który został użyty do dalszych procesów, takich jak namnażanie w dodatkowych pasażach, klonowanie czy inne procedury z użyciem żywego wirusa lub modyfikowanie P43 dowolną drogą włączając techniki inżynierii genetycznej czy techniki reasortowania. Takie etapy i techniki są dobrze znane specjalistom.
Materiały pochodzące ze zdeponowanego P43 objęte wynalazkiem obejmują białko i materiał genetyczny. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są reasortanty rotawirusów, które obejmują co najmniej jeden antygen lub przynajmniej jeden segment P43, przykładowo, reasortanty, które obejmują wirulentne szczepy rotawirusa, w których jeden lub część jednego z 11 segmentów genomowych została zamieniona przez genomowy segment z P43 czy jego część. Konkretnie, przydatne właściwości może mieć reasortant rotawirusa, w którym segment lub częściowy segment kodujący NSP4 jest segmentem P43 lub częściowym segmentem. Reasortanty rotawirusów oraz techniki ich wytwarzania są dobrze znane specjalistom (Foster, R.H. i Wagstaff, AJ. Tetrawalent Rotavirus Vaccine, artykuł przeglądowy. AIDS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998).
Materiałem stanowiącym przedmiot szczególnego zainteresowania jest potomstwo P43 oraz aktywne immunologicznie pochodne P43. Immunologicznie aktywne pochodne oznaczają materiały uzyskane z wirusa P43 lub z wirusem P43, w szczególności antygeny wirusa, które są zdolne do wywoływania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko Rotawirusowi, kiedy jest wstrzyknięty do zwierzęcego gospodarza.
Przy adoptowaniu rotawirusa do odpowiedniej linii komórkowej, przykładowo, komórek Vero może być konieczne traktowanie wirusa tak, aby pozbyć się możliwych zanieczyszczeń takich jak czynniki adenowirusa, które mogą być obecne i mogą dawać zanieczyszczenie. W przypadku wrażliwych na eter przypadkowych wirusów, można to zrobić przez działanie eterem jak opisano poniżej. Niniejszy wynalazek dotyczy także włączenia takiego działania eterem jako fakultatywnego etapu w ogólnej procedurze uzyskiwania atenuowanych ż ywych rotawirusów i szczepionki z nich tworzonej.
Również do zakresu wynalazku należą mieszaniny P43 z innymi wariantami rotawirusów, przykładowo innych sklonowanych wirusów, lub innych wirusów w szczególności wirusów atenuowanych. Mieszaniny takie są przydatne w szczepionkach według wynalazku, które są opisane poniżej.
Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycję szczepionki z żywego atenuowanego rotawirusa, która obejmuje populację zasadniczo pojedynczego wariantu według wynalazku zmieszaną ze stosownym adiuwantem lub nośnikiem farmaceutycznym.
Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku jest przystosowana do podawania doustnego.
Szczepionka rotawirusowa według wynalazku może być monowalencyjną szczepionką rotawirusowa zawierającą pojedynczy szczep rotawirusa.
Niniejszy wynalazek ma szczególną zaletę we wprowadzaniu szczepionki z żywego rotawirusa, w której ż ywy atenuowany rotawirus jest rotawirusem ludzkim i nie wywoł uje wgł obienia.
Stosowne nośniki farmaceutyczne do zastosowania w kompozycji szczepionki według wynalazku obejmują te znane specjalistom stosowane przy podawaniu doustnym, w szczególności u niemowląt. Nośniki takie obejmują lecz nie wyłącznie, węglowodany, alkohole wielowodorotlenowe, aminokwasy, wodorotlenek glinu, wodorotlenek magnezu, hydroksyapatyt, talk, tlenek tytanu, wodorotlenek żelaza, stearynian magnezu, karboksymetylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, mikrokrystaliczną celulozę, żelatynę, pepton roślinny, gumę ksantanową karagenan, gumę arabską β-cyklodekstrynę.
Wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania kompozycji szczepionki rotawirusa przez zmieszanie wirusa według wynalazku ze stosownym adiuwantem lub nośnikiem farmaceutycznym
PL 205 550 B1 z wytworzeniem kompozycji wedł ug wynalazku. Proces otrzymywania szczepionki moż e obejmować liofilizację wirusa w obecności stosownych stabilizatorów.
Możliwe jest także przygotowanie wirusa według wynalazku w nośnikach opartych na lipidach, takich jak wirosomy czy liposomy lub w emulsjach olej w wodzie czy w cząstkach nośnikowych. Alternatywnie lub dodatkowo do preparatu mogą być włączone immunostymulatory, takie jak znane specjalistom dla szczepionek doustnych. Immunostymulatory takie obejmują toksyny bakteryjne, w szczególności toksynę cholery (CT) w postaci holotoksyny (cała cząsteczka) lub w postaci tylko łańcucha B (CTB) i nietrwałą w wyższej temperaturze enterotoksynę z E. coli (LT). Zmutowane LT (mLT), które z mniejszym prawdopodobieństwem przekształcają się w postać aktywną niż natywna LT opisano w WO 96/06627, WO 93/13202 i US 5182109.
Dalsze immunostymulatory, które można korzystnie włączyć obejmują pochodne saponiny takie jak QS21 oraz monofosforyl lipidu A, w szczególności 3-de-O-acetylowany monofosforyl lipidu A (3D-MPL). Oczyszczone saponiny jako adiuwanty doustne opisano w WO 98/56415. Saponiny i monofosforyl lipidu A można wykorzystać oddzielnie lub w kombinacji (np. WO 94/00153) oraz preparować w systemach adiuwantów wraz z innymi czynnikami. 3D-MPL jest dobrze znanym adiuwantem produkowanym przez Ribi Immunochem, Montana a jego produkcję opisano w GB 2122204.
Ogólną dyskusję na temat nośników i adiuwantów do immunizacji doustnej można znaleźć w Vaccine Design, The subunit and Adjuwant Approach, wyd. przez Powell i Newman, Plenum Press, Nowy Jork, 1995.
Niniejszym opisano także sposób szczepienia ludzi, w szczególności niemowląt przez podawanie potrzebującemu osobnikowi kompozycji szczepionki według wynalazku. Korzystnie podawana jest doustnie żywa szczepionka atenuowana.
W korzystnym aspekcie kompozycja szczepionki według wynalazku jest wytworzona ze środkiem zobojętniającym kwasy w celu zminimalizowania inaktywacji szczepionki przez kwasy żołądka. Stosowne środki zobojętniające kwasy obejmują nieorganiczne środki zobojętniające kwasy, przykładowo, wodorotlenek glinu Al(OH)3 oraz wodorotlenek magnezu Mg(OH)2. Handlowo dostępne środki zobojętniające kwasy stosowne do użycia według wynalazku obejmują Mylanta (znak towarowy) zawierający wodorotlenek glinu i wodorotlenek magnezu. Są one nierozpuszczalne w wodzie i podawane w zawiesinie.
Korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku środek zobojętniający kwasy obejmuje nieorganiczny środek zobojętniający kwasy, korzystniej wodorotlenek glinu albo węglan wapnia.
Wodorotlenek glinu jest szczególnie korzystnym składnikiem kompozycji szczepionki według wynalazku jako, że jest on nie tylko środkiem zobojętniającym kwasy ale także adiuwantem.
Ponadto korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku środek zobojętniający kwasy obejmuje organiczny środek zobojętniający kwasy. Organiczne środki zobojętniające kwasy obejmują karboksylowe sole kwasów organicznych. Korzystny środek zobojętniający kwasy w kompozycji szczepionki według wynalazku zawiera karboksylową sól kwasu organicznego, korzystnie sól kwasu cytrynowego, taką jak cytrynian sodu lub cytrynian potasu.
Węglan wapnia (CaCO3) będący nierozpuszczalną solą nieorganiczną jest szczególnie korzystnym środkiem zobojętniającym kwasy, który można użyć w kompozycji szczepionki według wynalazku. Węglan wapnia wiąże się z rotawirusami, których aktywność jest zachowana podczas wiązania z wę glanem wapnia.
Aby zapobiec sedymentacji węglanu wapnia podczas etapu wypełniania, korzystne jest jeśli w preparacie obecne są czynniki zwię kszają ce lepkość.
Czynniki zwiększające lepkość obejmują zaróbki pseudoplastyczne. Roztwór pseudoplastyczny jest zdefiniowany jako roztwór posiadający wyższą lepkość w spoczynku w porównaniu z lepkością w czasie mieszania. Zaróbki tego typu są naturalnymi polimerami, takimi jak guma arabska, guma adragantowa, agar-agar, alginiany, pektyny lub pół-syntetycznymi polimerami przykładowo karboksymetyloceluloza (Tyloses C®), metyloceluloza (Methocels A®, Viscotrans ®, Tylose MH® i MB®), hydroksypropyloceluloza (Klucels®) oraz hydroksypropylometyloceluloza (Methocels E® i K®, Viscontrans MPHC®). Zasadniczo, zaróbki pseudoplastyczne stosowane są wraz z czynnikami tiksotropowymi. Alternatywnie czynniki zwiększające lepkość, które można użyć są pseudoplastycznymi zaróbkami o niskiej zdolności przepływowej. Polimery takie, w dostatecznym stężeniu, pomagają strukturalnemu uporządkowaniu cieczy w wyniku czego, tworzony jest roztwór o wysokiej lepkości, posiadający niską zdolność przepływową w stanie spoczynku. Trzeba dostarczyć pewnej ilości energii do systemu aby umożliwić przepływ i przeniesienie. Dostarczenie zewnętrznych energii (mieszanie) jest potrzebne
PL 205 550 B1 do zniszczenia czasowego strukturalnego uporządkowania cieczy w celu uzyskania roztworu. Przykładem takich polimerów są Carbopol® i guma ksantanowa.
Zaróbki tiksotropowe przyjmują w stanie spoczynku strukturę żelu, a podczas mieszania tworzą roztwór płynny. Przykładami zarobek tiksotropowych są: Veegum® (krzemian magnezowo-glinowy) oraz Avicel RC® (około 89% celulozy mikrokrystalicznej i 11% karboksymetylocelulozy Na).
Szczególnie korzystnym czynnikiem zwiększającym lepkość w kompozycji szczepionki według wynalazku jest guma ksantanowa.
Kompozycja szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie jest wytworzona jako kombinacja węglanu wapnia i gumy ksantanowej.
Inne składniki stosownie w kompozycji szczepionki według wynalazku obejmują cukry przykładowo sacharozę i/lub laktozę.
Kompozycja szczepionki według wynalazku może zawierać dodatkowe składniki włączając, przykładowo, składniki zapachowe (szczególnie dla szczepionek doustnych) oraz czynniki bakteriostatyczne.
Uwidocznione są różne postaci wykonania kompozycji szczepionki według wynalazku.
W jednym wykonaniu, szczepionka jest podawana w postaci ciekłego preparatu. Preparat ciekły jest odtwarzany przed podaniem z co najmniej dwóch składników:
i) składnika wirusowego ii) składnika ciekłego.
W wykonaniu tym, skł adnik wirusowy oraz skł adnik ciekł y są zazwyczaj obecne w oddzielnych pojemnikach, które dla wygody mogą być oddzielnymi przedziałami pojedynczego naczynia lub mogą być oddzielnymi naczyniami, które można połączyć w taki sposób, że końcowa kompozycja szczepionki jest odtwarzana bez eksponowania jej na powietrze.
Przed odtworzeniem, wirus może występować w postaci suchej lub ciekłej. Korzystnie w kompozycji według wynalazku składnik wirusowy jest zliofilizowany. Zliofilizowany wirus jest bardziej stabilny niż wirus w roztworze wodnym. Zliofilizowany wirus może być stosownie odtworzony przy użyciu ciekłego środka zobojętniającego kwasy w celu wytworzenia ciekłego preparatu szczepionki. Alternatywnie zliofilizowany wirus może być odtworzony za pomocą wody lub roztworu wodnego, w którym to przypadku zliofilizowana kompozycja wirusowa korzystnie zawiera środek zobojętniający kwasy. Korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku żywy atenuowany wirus oraz środek zobojętniający kwasy znajdują się w dwóch oddzielnych pojemnikach do sformułowania ciekłej kompozycji szczepionki przed podaniem. Ponadto korzystnie w kompozycji według wynalazku żywy atenuowany wirus oraz środek zobojętniający kwasy znajdują się w tym samym pojemniku tworząc zliofilizowaną kompozycję szczepionki do odtworzenia roztworem wodnym przed podaniem.
Preparat szczepionki może obejmować składnik wirusowy wytworzony z węglanem wapnia i gumą ksantanową w jednym przedziale lub naczyniu i jest odtwarzany przy pomocy wody lub roztworu wodnego obecnego w drugim przedziale lub naczyniu. Korzystnie w kompozycji według wynalazku żywy atenuowany wirus jest sformułowany z węglanem wapnia i gumą ksantanową oraz odtwarzany roztworem wodnym.
W innym wykonaniu, kompozycja szczepionki jest preparatem stałym, korzystnie zliofilizowaną bryłą która jest stosowna do natychmiastowego rozpuszczenia po włożeniu do ust. Zliofilizowane preparaty można klasycznie dostarczać w postaci tabletek w farmaceutycznym opakowaniu listkowym. Korzystnie żywy atenuowany wirus jest sformułowany w kompozycji szczepionki według wynalazku ze środkiem zobojętniającym kwasy i zliofilizowany w opakowaniu listkowym.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza szczepionkę rotawirusa w postaci szybko rozpuszczającej się tabletki do podawania doustnego.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycję obejmującą żywy szczep atenuowanego rotawirusa, w szczególności szczep ludzkiego rotawirusa, przy czym kompozycja jest stałym liofilizatem zdolnym do natychmiastowego rozpuszczenia po umieszczeniu w ustach.
Szybko rozpuszczająca się tabletka według wynalazku rozpuszcza się w ustach osobnika wystarczająco szybko, uniemożliwiając pęcznienie nierozpuszczonej tabletki. Jest to szczególnie korzystne w rotawirusowych szczepionkach dla dzieci.
Korzystnie, wirus jest żywym atenuowanym rotawirusem ludzkim, w preparacie z nieorganicznym środkiem zobojętniającym kwasy, takim jak węglan wapnia oraz czynnikiem zwiększającym lepkość takim, jak guma ksantanowa.
PL 205 550 B1
W dalszym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zliofilizowany preparat, przy czym składnik wirusowy jest szczepem rotawirusa przygotowanym wraz z węglanem wapnia i gumą ksantanową.
Szczepionki według wynalazku można wytwarzać i podawać znanymi technikami, używając stosowną ilość żywego wirusa dostarczającą skuteczną ochronę przed infekcją rotawirusem bez znaczących przeciwnych skutków ubocznych w typowych szczepieniach. Stosowna ilość żywego wirusa będzie normalnie wynosiła pomiędzy 104 a 107 ffu na dawkę. Typowa dawka szczepionki może zawierać 105-106 ffu na dawkę i może być podawana w kilku dawkach przez pewien okres czasu, przykładowo, w dwóch dawkach podawanych w odstępach dwumiesięcznych. Korzyść można niemniej jednak uzyskać otrzymując więcej niż 2 dawki, przykładowo, w trybie 3 lub 4 dawek, w szczególności w krajach rozwijających się. Odstęp pomiędzy dawkami może wynosić około dwóch miesięcy. Optymalna ilość żywego wirusa dla pojedynczej dawki lub dla trybu dawkowania wielokrotnego oraz optymalna regulacja czasu podawania dawek będzie ustalona dzięki standardowym badaniom wymagającym obserwacji mian przeciwciał czy innych odpowiedzi osobnika.
Szczepionka według wynalazku może także obejmować inne stosowne żywe wirusy dla ochrony przed innymi chorobami, przykładowo wirusa polio. Alternatywnie inne stosowne szczepionki z żywych wirusów do podawania doustnego moż na podawać w oddzielnej dawce lecz przy tej samej okazji co kompozycja szczepionki rotawirusa według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie atenuowanego ludzkiego rotawirusa do wytwarzania szczepionki według wynalazku do zapobiegania infekcji rotawirusem u człowieka oraz preparat szczepionki według wynalazku do zastosowania w medycynie.
Legenda do Figury 3
Surowice z dwunastu 4 do 6 miesięcznych niemowlaków zaszczepionych materiałem P33, jak opisano w artykule (1998) w Vaccine testowano, pod kątem neutralizowania P33, P38, P43 i 89-12C2.
Zakres mian neutralizacyjnych wszystkich badanych surowic jest podobny dla P33, P38 i P43. Analiza statystyczna nie pokazuje znaczących różnic w całkowitych mianach neutralizacyjnych przeciwko wszystkim trzem wirusom. Sugeruje to, że komformacyjne i niekonformacyjne epitopy neutralizacyjne z P33, P38 i P43 są równie dobrze rozpoznawane przez surowice anty-P33 niemowląt zaszczepionych P33. Obserwacja ta sugeruje pośrednio, że epitopy neutralizacyjne ujawnione w tych badaniach in vitro nie posiadały różnic pomiędzy P33, P38 i P43.
Zakres mian neutralizacyjnych dla P89-12C2 jednakże różni się zasadniczo od P33, P38 i P43. Obserwacja ta sugeruje, że komformacyjne i niekonformacyjne epitopy neutralizacyjne z P33, P38 i P43 nie są równie dobrze rozpoznawane przez surowice anty-P33 niemowlą t zaszczepionych P33. Obserwacja ta sugeruje pośrednio, że epitopy neutralizacyjne ujawnione w tych badaniach in vitro były zmienione pomiędzy 89-12C2 a P33, P38 iP43.
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Wykazanie, że szczep 89-12 w 26 pasażu (P26) jest mieszaniną wariantów
Sekwencjonowanie genów VP4 i VP7 z różnych serii pasaży
Przeprowadzono sekwencjonowanie genów VP4 i VP7 z pasażu 26 (pierwotne komórki AGMK), pasażu P33 (ustalona (jako przeciwstawna do pierwotnych) linia komórek AGMK), pasażu P41 i pasażu P43. Wyizolowany całkowity RNA poddawano odwrotnej transkrypcji i amplifikowano za pomocą reakcji PCR w jednej probówce/jeden etap
Za pomocą starterów Rota 5bis i Rota 29bis amplifikowano cały gen VP4 a starterów Rota 1 i Rota 2bis amplifikowano cały gen VP7. Materiał po PCR zsekwencjonowano stosując różne startery (patrz tabela 1).
Sekwencja dla pasażu P26 różni się od sekwencji dla pasażu P33 trzema zasadami (w pozycjach 501, 788 i 802 bp od kodonu start) w VP4 oraz trzema zasadami w VP7 (108, 605 i 897 bp od kodonu start).
Odczyty sekwencji dla pasażu 26 z VP4 i VP7 wykazują w zmutowanych pozycjach obecność sekwencji dla pasażu P33 jako tło. Zatem widoczne jest, że P26 jest mieszaniną co najmniej 2 wariantów.
Odczyty sekwencji dla pasażu P33 wydają się homogenne w VP4 oraz heterogenne dla VP7 (patrz tabela 2).
Pasaż P38 (pochodzący z pasażu 33) pasażowany 5 razy w komórkach Vero wykazywał ten sam zestaw sekwencji dla VP4 i VP7, co pasaż P33 (linia komórek AGMK). Zatem nie było ważnych zmian w populacjach pomiędzy P33 i P38.
PL 205 550 B1
T a b e l a 1: Oligonukleotydy stosowane do reakcji RT-PCR i sekwencjonowania
nazwa sekwencja pozycja
VP7 Rota 1 GGC TTT AM AGA GAG AAT TTC CGT CTG G -49 to -22
Rota 1 bis GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A -16 to 10
Rota 2bis GGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAG 1014-988
Rota 7 CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 266-287
Rota 12 TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC 372-394
Rota 46 GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT AGT GG 651-682
Rota 18 CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC 682-651
VP4 Rota 5 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A 2-23
Rota 6 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 878-859
Rota 5bis TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A 2-23
Rota 6bis ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG 878-856
Rota 25 GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG 268-296
Rota 26 CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC 296-268
Rota 27bis TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G 721-745
Rota 28 TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG 753-727
Rota 31 GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G 1048-1070
Rota 32 CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C 1070-1048
Rota 45 TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG 1205-1227
Rota 53 CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA 1227-1205
Rota 54 GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA 1465-1487
Rota 55 TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC 1487-1465
Rota 40 CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G 1703-1727
Rota 39 CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G 1727-1703
Rota 33 CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G 2008-2032
Rota 34 CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G 2032-2008
Rota 29bis AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G 2335-2311
T a b e l a 2: oligonukleotydy stosowane w hybrydyzacji
nazwa sekwencja pozycja
VP7 Rota 41 AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA TC 882-913
Rota 42 AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC 882-913
VP4 Rota 15 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783
Rota 16 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783
Rota 35 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783
Rota 36 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783
PL 205 550 B1
Zasady przedstawione pogrubioną czcionką w tabeli 2 są miejscami specyficznej zmiany sekwencji w VP4 i VP7.
T a b e l a 3: zmiany sekwencji w genach VP4 i VP7
3.1
VP4 VP7
501 bp 167 aa 788 bp 263 aa 802 bp 268 aa 108 bp 36 aa 605 bp 202 aa 897 bp 299 aa
P26 (AGMK) A G/A G/A A C/T A
P33 (AGMK) T A A G /A T/C A/G
P38 (VERO) T A A A/G T G/A
P43 (VERO) T A A A T A
W drugim klonie z 3 klonów, które wytworzono na poziomie partii produkcyjnej, nukleotydem w pozycji 897 bp z VP7 jest G raczej niż A jak w wyselekcjonowanym klonie P43. W wyniku tego powstaje metionina na miejscu izoleucyny w sekwencji aminokwasowej. W kale niemowląt zaszczepionych materiałem P33 wydzielane były warianty odpowiadające zarówno wyselekcjonowanemu klonowi P43 jak klonowi, w którym w VP7 występuje G w pozycji 897 bp przed kodonem start.
W Tabeli 3.1 występują dwie alternatywne zasady w okreś lonej pozycji, pierwsza z dwóch przedstawia zasadę, która pojawia się w większości populacji a druga jest zasadą która pojawia się w mniejszości populacji. Warianty z większości i mniejszości populacji są oceniane na podstawie siły sygnału w sekwencjonowaniu.
3.2
VP4 VP7
501 bp 167 aa 788 bp 263 aa 802 bp 268 aa 108 bp 36 aa 605 bp 202 aa 897 bp 299 aa
P26 (AGMK) Leu Gly/Glu Gly/Arg Arg Thr/Met Ile
P33 (AGMK) Phe Glu Arg Arg/Arg Met/Thr Ile/Met
P38 (VERO) Phe Glu Arg Arg/Arg Met Met/Ile
P43 (VERO) Phe Glu Arg Arg Met Ile
W Tabeli 3.2 przedstawiono zmiany aminokwasów wynikają ce z róż nic nukleotydowych pomię dzy wariantami.
T a b e l a 4
VP4 (pozycje 788-802) VP7 (pozycja 897)
G-G A-A A-G G-A A G
Probes Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42
Passages
P26 - + + + nd nd
P33 - + - - + + +
P38 - + - - + ++
P43 - + - - + -
PL 205 550 B1
Hybrydyzacja typu „slot blot
Zmiany w populacji pomiędzy pasażami P26 do P33 w komórkach AGMK można dodatkowo potwierdzić stosując hybrydyzację typu „slot blot. Fragmenty genów VP4 i VP7 wytworzone przez RT/PCR hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi specyficznymi dla każdego wariantu (patrz Tabeli 3.1 i 3.2). Dla kontrastu z P26, który hybrydyzował z Rota 16, Rota 35 i Rota 36 i nie hybrydyzował z Rota 15, fragment PCR VP4 z materiału P33, w pozycjach 788 i 802 hybrydyzował jedynie z Rota 16 i nie hybrydyzował ani z Rota 15 ani Rota 35 ani Rota 36. Wyniki te wskazują na obecność przynajmniej 3 wariantów w P26 (patrz tabela 4).
Fragment PCR VP7 z materiału P33, w pozycji 897 hybrydyzował z Rota 41 i Rota 42. Wyniki te wskazują na obecność przynajmniej 2 wariantów w materiale P33.
P r z y k ł a d 2: Izolacja i charakterystyka klonu P43
W celu wyizolowania składników P33 jako populację homogennego wirusa, przeprowadzono trzy rozcieńczenia końcowe P33/AGMK na komórkach Vero i uzyskane wirusy użyto do infekowania komórek Vero.
Studzienki pozytywne selekcjonowano stosując dwa kryteria, używane klasycznie: wzrost wykazywany przez największą liczbę ognisk wykrywany w studzienkach oraz najbardziej izolowane studzienki na płytkach. Po 3 rozcieńczeniach końcowych pasaży w 96 studzienkowych płytkach mikrotitracyjnych, 10 pozytywnych studzienek amplifikowano kolejno na komórkach Vero i szacowano ich wydajność.
W oparciu o wydajność, wytworzono trzy klony do pasażu na poziomie partii produkcyjnej. Rozpoznawanie immunologiczne przez przeciwciała poliklonalne było podobne zarówno pomiędzy trzema klonami jak pomiędzy tymi klonami a P33.
Homogenność klonów oszacowano przez hybrydyzację typu „slot blot. Końcową selekcję pojedynczego klonu oparto na wydajności i sekwencji.
Wyselekcjonowany klon amplifikowano przez kolejne pasażowania na komórkach Vero w celu wytworzenia głównego źródła klonu, źródła pracującego oraz końcowej partii produkcyjnej.
Wyselekcjonowany klon scharakteryzowano genetycznie na poziomach różnych pasaży przez sekwencjonowanie VP4 i VP7 (identyczność) oraz przez specyficzną hybrydyzację typu „slot blot dla VP4 i VP7 (homogenność) z materiałów zamplifikowanych przy użyciu PCR. Sekwencje genów VP4 i VP7 z materiału P43 przedstawiono odpowiednio na Fig. 1 i 2 i są identyczne z P41.
Homogenność wyselekcjonowanego klonu oszacowano przez selektywną hybrydyzację przy użyciu sond oligonukleotydowych rozróżniających zmiany nukleotydowe w regionach VP4 i/lub VP7 dla każdego wariantu zidentyfikowanego podczas sekwencjonowania P26/pierwotne AGMK (patrz tabela 4).
Fragment VP4 hybrydyzuje z Rota 16 i nie hybrydyzuje z Rota 15, Rota 35 czy Rota 36.
Fragment VP7 hybrydyzuje z Rota 41 i nie hybrydyzuje z Rota 42.
Wyniki te potwierdzają że P43 jest populacją homogenną.
P r z y k ł a d 3: Usunięcie przypadkowego adenowirusa
Do P33 (na AGMK) dodawano na 1 godz. eter do końcowego stężenia 20%. Następnie eter wydzielano w postaci pęcherzyków przy pomocy N2 przez 35 min. Nie obserwowano wpływu na miano P33.
P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie żywej szczepionki atenuowanej
Opisane powyżej partie produkcyjne do doustnego podawania niemowlakom wytwarzane są za pomocą sposobów przedstawionych poniżej.
1. Wirus zliofilizowany
Do wytwarzania dawek wirusa stosowane są standardowe techniki. Zamrożona oczyszczona masa wirusowa jest rozmrażana i rozcieńczana w odpowiedniej pożywce, w tym przypadku pożywka zmodyfikowana Dulbecco, do uzyskania żądanego standardowego stężenia wirusa, w tym przypadku
106,2 ffu/ml. Rozcieńczony wirus jest następnie dalej rozcieńczany stabilizatorem liofilizacyjnym (sacharoza 4%, dekstran 8%, sorbitol 6%, aminokwasy 4%) do uzyskania miana wirusa, w tym przypadku 105,6 ffu/dawkę. Porcje po 0,5 ml kompozycji stabilizowanego wirusa aseptycznie przenoszone są do 3 ml fiolek. Nastę pnie każdą fiolkę zamyka się gumowym korkiem, próbki liofilizuje w próżni, następnie fiolki są całkowicie zamykane i zaciskane aluminiowym kapslem wokół fiolki aby utrzymać korek na miejscu.
W celu użycia, wirusa odtwarza się stosując następujące regeneracyjne ś rodki zobojętniające kwasy:
(a) cytrynianowy środek regeneracyjny
PL 205 550 B1
Cytrynian sodu jest rozpuszczany w wodzie, sterylizowany przez filtrowanie i aseptycznie przenoszony do naczynek do odtwarzania w 1,5 ml porcjach w stężeniu 544 mg Na3cytrynianu.2H2O na 1,5 ml dawkę. Naczynkami do odtwarzania mogą być przykładowo 3 ml fiolki lub 4 ml fiolki lub 2 ml strzykawki lub miękkie plastykowe zgniatane kapsułki przy podawaniu doustnym. Zamiast utrzymywania sterylnych składników w sterylnych warunkach naczynko końcowe można autoklawować.
(b) Al(OH)3 jako środek regeneracyjny
Aseptyczna zawiesina wodorotlenku glinu (Mylanta - znak towarowy) jest aseptycznie rozcieńczana w sterylnej wodzie, aseptycznie przenoszona do naczynek do odtwarzania (przykładowo 2 ml strzykawek lub miękkich plastykowych zgniatanych kapsułek) w 2 ml porcjach zawierających 48 mg Al(OH)3. Alternatywą do stosowania sterylnych składników w sterylnych warunkach jest naświetlanie zawiesiny wodorotlenku glinu promieniowaniem γ (korzystnie w fazie rozcieńczenia).
Dołączane są standardowe składniki chroniące zawiesinę przed zestaleniem. Takie standardowe składniki obejmują przykładowo stearynian magnezu, karboksymetylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, mikrokrystaliczną celulozę oraz polimery krzemowe. Dołączane są czynniki bakteriostatyczne przykładowo butyloparaben, propyloparaben i inne standardowe czynniki bakteriostatyczne stosowane w żywności oraz środki zapachowe.
2. Zliofilizowany wirus z Al(OH)3 w ciekłym preparacie
Do wytwarzania dawek wirusa stosowane są standardowe techniki. Zamrożona oczyszczona masa wirusowa jest rozmrażana i rozcieńczana w odpowiedniej pożywce, w tym przypadku pożywka zmodyfikowana Dulbecco, do uzyskania żądanego standardowego stężenia wirusa, w tym przypadku
106,2 ffu/ml. Zawiesina wodorotlenku glinu jest dodawana do końcowej ilości 48 mg/dawkę i kompozycja wirusa jest rozcieńczana stabilizatorem liofilizacyjnym (sacharoza 4%, dekstran 8%, sorbitol 6%, aminokwasy 4%) do uzyskania miana wirusa, w tym przypadku 105,6 ffu/dawkę. Porcje po 0,5 ml kompozycji stabilizowanego wirusa są aseptycznie przenoszone do 3 ml fiolek. Następnie przeprowadzana jest liofilizacja oraz zamykanie fiolek jak opisano w części 1.
3. Zliofilizowany wirus z Al(OH)3 do plastykowego opakowania na tabletki
Do wytwarzania dawek wirusa stosowane są standardowe techniki. Zamrożona oczyszczona masa wirusowa jest rozmrażana i rozcieńczana w odpowiedniej pożywce, w tym przypadku pożywka zmodyfikowana Dulbecco, do uzyskania żądanego standardowego stężenia wirusa, w tym przypadku
106,2 ffu/ml. Zawiesina wodorotlenku glinu jest dodawana do końcowej ilości 48 mg/dawkę i kompozycja wirusa jest rozcieńczana stabilizatorem liofilizacyjnym, którym może być sacharoza, dekstran lub aminokwasy czy żelatyna lub pepton roślinny czy ksantan do uzyskania miana wirusa wynoszącego 105,6 ffu/dawkę. Wykonuje się aseptyczne napełnianie jam plastykowych opakowań na tabletki porcjami po 0,5 ml lub korzystnie mniejszymi. Kompozycja jest liofilizowana a jamy plastykowych opakowań na tabletki są termicznie zaklejane.
Ewentualnie dołączane są standardowe składniki chroniące zawiesinę wodorotlenku glinu przed zestaleniem. Takie standardowe składniki obejmują przykładowo stearynian magnezu, karboksymetylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, mikrokrystaliczną celulozę oraz polimery krzemowe. Mogą być także dołączone środki zapachowe.
P r z y k ł a d 5: Wirusowe miareczkowanie rotawirusa dla różnych preparatów
5.1: Porównanie pomiędzy preparatami opartymi na laktozie i sacharozie:
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa przed liofilizacją Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
98G06/01 Laktoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 105,22 104,67
98G06/03 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 105,28 104,92
PL 205 550 B1
Jak pokazano w tabeli powyżej rotawirus P43 był wytwarzany zarówno z sacharozą jak laktozą. Miano wirusowe przed liofilizacją jest mianem wirusowym w kompletnym ciekłym preparacie (zawierającym sacharozę, dekstran, sorbitol i aminokwasy) bez etapu liofilizacji.
Dobrymi wynikami są te, w których uzyskuje się obniżenie <0,5 log w etapie liofilizacji oraz obniżenie <0,5 log podczas, jednego tygodnia w 37°C (test przyspieszonej stabilności).
Dokładność miareczkowania wirusowego wynosi około + lub 0,2 log.
Wyniki wskazują na to, że zamiast laktozy może być użyta sacharoza.
5.2: Wpływ argininy oraz zamiany sorbitolu na maltitol:
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa w czasie = zero po liofilizacji Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
98L16/01 Laktoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CO Ύ O CO Ύ O
98L16/02 Laktoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% Arginina: 3% co Ύ O 104,9
98L16/04 Laktoza: 2% Dekstran: 4% Maltitol: 3% Aminokwasy: 2% Arginina: 3% 104,7 105
Wyniki pokazują, że dodanie argininy (o której wiadomo, że polepsza stabilność wirusa podczas liofilizacji a także dostarcza zasadowego podłoża w celu kompensacji kwaśności żołądkowej) utrzymuje miano wirusa.
Sorbitol w zbyt wysokim stopniu przyczynia się do obniżenia temperatury zeszklenia zliofilizowanej bryły. Jak pokazano można to obejść przez użycie maltitolu zamiast sorbitolu z zachowaniem miana wirusa.
5.3: Różne kompozycje preparatów
Doświadczenie to pokazuje, że możliwe są liczne preparaty.
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa przed liofilizacją Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
99C11/01 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 105,24 105,07
99C11/02 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Maltitol: 3% Aminokwasy: 2% 105,09 104,92
99C11/04 Dekstran: 4% Maltitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,89 105,06
PL 205 550 B1 ciąg dalszy
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa w czasie = zero po liofilizacji Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
99C17/01 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy:2% 105,40 105,41
99C17/02 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 1,5% Aminokwasy: 2% 105,30 104,93
99C17/03 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Aminokwasy: 2% 105,31 105,24
99C17/04 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Maltitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,42 104,45
99C17/05 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Maltitol: 1,5% Aminokwasy: 2% 104,39 10,440
99C17/06 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% 105,44 10+97
99C17/07 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 1,5% 105,11 104,89
5.4: Wiązanie pomiędzy rotawirusem a Al(OH)3 jako środkiem zobojętniającym kwasy:
Rotawirus Al(OH)3 H2O Czas kontaktowania w temp. pokojowej Wirowanie Miano wirusa w supernatancie w ffu/ml Miano wirusa w peletach w ffu/ml
105,6 ffu/ml 48 mg w 0,240 ml 0,76 ml 30 min. 8000 rpm, 10 min. 103,66
105,6 ffu/ml 0,48 mg w 0,240 ml 0,76 ml 30 min. 8000 rpm, 10 min. 104,41
105,6 ffu/ml 1 ml 30 min. 8000 rpm, 10 min. 105,68
Rotawirus w liofilizowanej bryle 12 mg w 0,120 ml 1,380 ml 30 min. 8000 rpm, 10 min. Poniżej detekcji 104,7
Jako środek zobojętniający kwasy użyty jest Al(OH)3. Pokazano, że Rotawirus jest związany z nierozpuszczalną solą nieorganiczną (Al(OH)3) ponieważ zwirowuje się wraz z Al(OH)3 (zmniejszona aktywność wirusowa w supernatancie).
5.5: Rozpuszczanie środka zobojętniającego kwasy Al(OH)3 przez cytrynian sodu przed miareczkowaniem wirusa
PL 205 550 B1
Próbka wirusowa Rozpuszczanie Warunki Miana wirusa ffu/ml
99B10/06 preparat ciekły przed liofilizacją 105,43 1,5 ml cytrynian Na3 24 godz. w temperaturze pokojowej 105,11
99B10/06: zliofilizowany 105,43 1,5 ml cytrynian Na3 24 godz. w temperaturze pokojowej 104,53
Kiedy Rotawirus jest związany z Al(OH)3 możliwe jest zliofilizowanie wszystkiego (włączając Al(OH)3). Po liofilizacji, możliwe jest odzyskanie Rotawirusa przez rozpuszczenie Al(OH)3 w cytrynianie sodu. Etap ten nie niszczy Rotawirusa i pozostaje on aktywny po tym etapie rozpuszczania.
5.6: Infekcyjność Rotawirusa po uwolnieniu z asocjacji Al(OH)3-Rotawirus
Mechanizm uwalniania wirusa (przez rozpuszczenie nośnika) może z powodzeniem pojawić się in vivo. Rzeczywiście poniżej pH 6 wodorotlenek glinu staje się całkowicie rozpuszczalny a zatem Rotawirus będzie uwalniany w żołądku.
Al(OH)3 + 3 H+----> Al+++ (rozpuszczalny w wodzie) + 3H2O
W żołądku jony Al+++ nie są adsorbowane (J.J. Powell, R.Jugdaohsingh i R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption In the gastrointestinal track, Proceedings of Nutrition Society (1999),
58, 147-153).
W jelitach ze względu na wzrost pH, nierozpuszczalna forma glinu jest wytrącana (Al(OH)3 lub AlPO4) i usuwana naturalną drogą.
Nie wiadomo czy nowo utworzony precypitat Al(OH)3 (lub AlPO4) będzie w stanie ponownie związać wolne Rotawirusy. Rodzi to pytanie o infekcyjność samej asocjacji Al(OH)3-Rotawirus.
Możliwe jest uwolnienie Rotawirusa z asocjacji Al(OH)3-Rotawirus przy użyciu innych mechanizmów. Przykładowo lizyna zaburza adsorpcję wirusa na Al(OH)3. Znane są także inne aniony jak boranowy, siarczanowy, węglanowy czy fosforanowy, które specyficznie adsorbują się na wodorotlenku glinu a zatem teoretycznie mogłyby usuwać (przez współzawodnictwo o miejsce adsorpcji) Rotawirusa z asocjacji Al(OH)3-Rotawirus.
Zatem Rotawirus może być uwalniany z asocjacji Al(OH)3-Rotawirusa i uwolniony Rotawirus pozostaje aktywny.
Uwolnienie można przeprowadzić albo przez rozpuszczenie Al(OH)3 (przez HCl z żołądka lub cytrynian Na3 in vitro) albo przez usunięcie Rotawirusa za pomocą aminokwasu zasadowego (lizynę).
PL 205 550 B1
5.7 Infekcyjność asocjacji Al(OH)3-Rotawirus
Pojedyncza dawka liofilizowanego Rotawirusa była odtworzona wodą i podzielona na dwie części. Pierwsza część, rozpatrywana jako próba odniesienia, otrzymała dodatkową objętość wody. Druga część otrzymała 24 mg Al(OH)3 zawieszone w 0,240 ml wody (Przedkliniczne miareczkowanie wirusa).
W obecnoś ci Al(OH)3, Rotawirus jest aktywny a wartość miareczkowania wirusa jest wyższa w porównaniu z próbką odniesienia.
Doświadczenie to powtórzono bez dzielenia liofilizowanej dawki oraz przez dodanie 12 mg Al(OH)3 lub 24 mg Al(OH)3.
W tym przypadku próbką odniesienia był wirus odtworzony przy uż yciu buforu cytrynianowo-wodorowęglanowego. Miano wirusa jest znowu wyższe w obecności Al(OH)3.
DRYC003A4Ó DRVC003A46 DRVC003A46
+ + +
1,5 ml buforu WL 12 mg 24 mg
A1(OH)3
w 0,120 ml w 0,240 ml
τ +
1,380 ml H2O 1,260 ml H2C
5,34 6,24 6,05
5,32 5,95 6,26
Jak w przykładzie powyżej Rotawirus jest związany z cząstkami Al(OH)3, dopóki wirus nie jest odrzucony przez wirowanie. DRVC003A46 jest zliofilozowanym Rotawirusem (sacharoza: 2%, dekstran: 4%; sorbitol: 3%; aminokwasy: 2%).
PL 205 550 B1
SDSAA = sacharoza 2%, dekstran 4%, sorbitol 3%, aminokwasy 2%.
Według z miareczkowania wirusa prowadzonego na supernatancie, ilość Al(OH)3 potrzebnego dla adsorpcji Rotawirusa wydaje się niska (startując z jedną zliofilozowaną dawką 5,7 log) zwiększającą miareczkowanie wirusa):
Al(OH)s Czas adsorpcji Miano w supernatancie
12 mg 1 godz. temp. pokojowa 2,7
24 mg 1 godz. temp. pokojowa 3.4
48 mg 1 godz. temp. pokojowa 3,4
72 mg 1 godz. temp. pokojowa 2,0
96 mg 1 godz. temp. pokojowa Poniżej detekcji
12 mg Przez noc 2,7
24 mg Przez noc Poniżej detekcji
48 mg Przez noc 2,5
12 mg Natychmiast Poniżej detekcji
24 mg Natychmiast 2,0
48 mg Natychmiast Poniżej detekcji
Czas potrzebny do adsorpcji Rotawirusa na Al(OH)3 jest krótki:
Jedna dawka zliofilizowanego Rotawirusa była odtwarzana w obecności 24 mg Al(OH)3 i wirowana po 0, 15, 60 min i 24 godz. „Kulot był zawieszany w SDSAA przed miareczkowaniem wirusa:
PL 205 550 B1
Czas Ku lot Supernatant
0 min. 5,26 3,17
15 min. 5,34 <1,44
60 min. 5,96 <1,44
24 godz. 6,13 <1,44
5.8: Użycie CaCO3 jako środka zobojętniającego kwasy
W celu uniknięcia stosowania glinu w szczepionce, Al(OH)3 będący środkiem zobojętniającym kwasy zastąpiono inną nierozpuszczalną solą nieorganiczną CaCO3 (węglan wapnia).
Zjawiska obserwowane z CaCO3 były porównywalne do tych obserwowanych dla Al(OH)3:
- asocjacja Rotawirusa z solą nieorganiczną ;
- utrzymanie aktywności Rotawirusa w postaci związanej z solą nieorganiczną;
- moż liwość uwalniania Rotawirusa z asocjacji przez rozpuszczenie nieorganicznej zasady przez kwas;
- moż liwość współ -liofilizowania ś rodka zoboję tniającego kwasy z Rotawirusem.
Asocjacja CaCO3 z Rotawirusem
W pierwszej próbie, zliofilizowany Rotawirus (miano wirusa 5,7) był odtworzony w zawiesinie CaCO3 w wodzie (50 mg w 1,5 ml) a następnie wirowany i miano wirusa w supernatancie porównywano z kulotem.
DRVC003A46 DRVC003A46
+ +
50 mg CaCOs 50 mg CaCO3
wl,5mlH2O w 1,5 ml H2O
+ +
wirowanie wirowanie
8000 rpm, 10 min 8000rpm, lOmin
Kulot Supernatant Kulot Supernatant
+ nt + nt
1,5 ml 1,5 ml
SDSAA cytrynianu Na
5,83 4,46 5,88 4,33
Pokazano, że ponad 90% Rotawirusa jest związane z CaCO3.
Także, wówczas kiedy wirus był związany możliwe było wykonanie miareczkowania i odzyskanie wyjściowych ilości wirusa.
Również miana wirusa są nieco wyższe niż te uzyskane bez CaCO3.
PL 205 550 B1
Ilość asocjacji CaCO3 z Rotawirusem
Zliofilizowany Rotawirus był odtwarzany za pomocą zawiesiny CaCO3 w wodzie (1,5 ml): 10 mg 50 mg 100 mg a nastę pnie wirowany i miano wirusa z supernatantu porównywano z kulotem.
CaCO3 Bez przygotowywania + wirowanie 1 godz. + wirowanie
Ku loty Supernatant Ku loty Supernatant
100 mg 4,57 3,01 4,79 3,09
50 mg 4,17 4,15 4,22 3,86
10 mg 3,17 4,77 3,87 4,87
Jest zatem jasne, że więcej CaCO3 i więcej wirusa występuje w formie asocjacji i mniej znajduje się w supernatancie. Chociaż, pełna dawka nie jest całkowicie odzyskiwana (spodziewane całkowite
5,3 co najmniej lub nawet 5,8 jak uzyskano wcześniej -patrz powyżej).
Ochrona Rotawirusa przez CaCO3 podczas miareczkowania typu „baby Rosset-Rice środka zobojętniającego kwasy.
Przeprowadzono dwa rodzaje miareczkowania typu „baby Rosset-Rice stosując 10 dawek zliofilizowanego Rotawirusa (DRVC003A46) i 50 mg CaCO3.
W klasycznym miareczkowaniu typu „baby Rosset-Rice środek zoboję tniają cy kwasy jest mieszany z Rotawirusem i do tego podłoża wlewany jest HCl.
W „odwróconym miareczkowaniu typu „baby Rosset-Rice sytuacja jest przeciwna: ś rodek zobojętniający kwasy jest wkraplany do złoża z HCl (jak ma to miejsce in vivo).
Klasyczne miareczkowanie typu „baby Rosset-Rice
Zliofil. Rota przechowywany w: Bufor Teoretyczne miano wirusa Zmierzone miano wirusa
4°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
-80°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
4°C 24 mg Al(OH)3 5,4 <2,9
-80°C 24 mg Al(OH)3 5,4 <2,9
Odwrócone miareczkowanie typu „baby Rosset-Rice
Zliofil. Rota przechowywany w: Bufor Teoretyczne miano wirusa Zmierzone miano wirusa
4°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
-80°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
4°C 24 mg Ai(OH)s 5,4 <2,9
-80°C 24 mg Al(OH)3 5,4 <2,9
Zatem, w doświadczeniu in vitro, węglan wapnia ochrania około 20% Rotawirusów przed HCl, podczas gdy wodorotlenek glinu nie.
5.9: Liofilizacja Rotawirusa w obecności CaCO3 jako środka zobojętniającego kwasy:
PL 205 550 B1
Seria nr Kompozycja Miano wirusa w czasie = zero po liofilizacji Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
99K08/01 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 50 mg 105,28 105,10
99K08/02 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg 105,16 105,15
00C24/01 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.3% 105,07 104,69
00C24/03 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.3% 105,07 104,85
00E09/25 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.25% 105,03 104,91
00E09/30 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.3% 105,01 104,87
00F26/06 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Skrobia: 2% 104,50 104,70
„Wszystko jest w jednym - zliofilizowany Rotawirus i środek zobojętniający kwasy (CaCO3) są w tej samej fiolce. W celu zapobiegania sedymentacji CaCO3 podczas etapu napeł niania potrzebne są czynniki zwiększające lepkość. Przykłady takich czynników zwiększających lepkość obejmują gumę ksantanową i skrobię. Aktywność Rotawirusa utrzymuje się nawet w obecności gumy ksantanowej i skrobi.
PL 205 550 B1
5.10 Zliofilizowane tabletki do szybkiego rozpadu po umieszczeniu w ustach:
Następujące preparaty wykazują koncepcję „lyoc (skrót od ang. lophilised cake). Jest to szybki rozpad zliofilizowanej bryły w ustach.
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa przed liofilizacją Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
99B10/06 Sacharoza: 4% Glutaminian sodu: 3,7% Al(OH)3 48 mg 105,11 104,53
99C11/12 Maltitol: 3% Al(OH)3 48 mg Hydroksypropylometyloceluloza: 1% 10416 103,79
Seria nr Kompozycja preparatu Miano wirusa w czasie = zero po liofilizacji Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
00C24/05 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.3% 105,02 10454
00C24/06 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Ksantan: 0.3% 104,86 10456
00F26/11 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CaCO3: 60 mg Skrobia: 2% 10470 10440
W „koncepcji lyoc można stosować zarówno ksantan jak skrobię (utrzymujących szybki rozpad zliofilizowanej bryły).
P r z y k ł a d 6: Zastosowanie węglanu wapnia jako środka zobojętniającego kwasy w kompozycji szczepionki Rotawirusa
Kiedy zawiesina CaCO3 w wodzie jest stosowana jako środek zobojętniający kwasy dla Rotawirusa pojawia się problem, że cząstki węglanu wapnia szybko sedymentują kiedy umieszczone są w wodzie ponieważ gęstość proszku zbliża się do 2,6 a średni rozmiar cząstek wynosi 30 μm. Sedymentację tę można spowolnić przez:
1. podniesienie gęstości otaczającego podłoża
2. podniesienie lepkości otaczającego podłoża
3. zredukowanie wielkości cząstek
4. utrzymywanie cząstek z daleka od siebie
6.1: Podniesienie gęstości otaczającego podłoża:
Kiedy zawiesina CaCO3-woda (umieszczona w strzykawce) jest naniesiona na zliofilizowaną bryłę (zawierającą sacharozę 2%, dekstran 4%, sorbitol, 3% aminokwasy 2%) wzrasta gęstość otaczającego podłoża lecz szybkość sedymentacji CaCO3 nie różni się bardzo od tej dla zawiesiny CaCO3-woda.
PL 205 550 B1
6.2 Podniesienie lepkości otaczającego podłoża
Zaróbki pseudoplastyczne
Roztwór pseudoplastyczny jest określony jako roztwór posiadający wyższą lepkość w stanie spoczynku w porównaniu z lepkością w czasie mieszania.
Zazwyczaj zaróbkami tego typu są:
Naturalne polimery, przykładowo:
guma arabska guma adragantowa agar-agar alginiany pektyny polimery pół-syntetyczne, przykładowo: karboksymetyloceluloza (Tyloses C®) metyloceluloza (Methocels A®, Viscotrans ®, Tylose MH® i MB®) hydroksypropyloceluloza (Klucels®) hydroksypropylometyloceluloza (Methocels E® i K®, Viscontrans MPHC®)
Zasadniczo pseudoplastyczne zaróbki stosowane są wraz z czynnikami tiksotropowymi.
Zaróbki pseudoplastyczne o niskiej zdolności przepływowej
Polimery takie, w dostatecznym stężeniu, pomagają strukturalnemu uporządkowaniu cieczy w wyniku czego tworzony jest roztwór o wysokiej lepkości posiadający niską zdolność przepływową w stanie spoczynku. Trzeba dostarczyć pewnej iloś ci energii do systemu aby umoż liwić przepł yw i przeniesienie. Dostarczenie zewnę trznych energii (mieszanie) jest potrzebne do zniszczenia czasowego strukturalnego uporządkowania cieczy w celu uzyskania roztworu. Przykładem takich polimerów są Carbopol® i guma ksantanowa.
Zaróbki tiksotropowe
Z zaróbkami takimi w stanie spoczynku powstaje struktura żelu, a podczas mieszania uzyskiwany jest roztwór płynny.
Przykładami zaróbek tiksotropowych są: Veegum® (krzemian magnezowo-glinowy) oraz Avicel RC® (około 89% celulozy mikrokrystalicznej i 11% karboksymetylocelulozy Na).
6.3 Zredukowanie wielkości cząstek
Redukcja rozmiaru cząsteczki CaCO3 wpływa na zmniejszenie jego zdolności jako środka zobojętniającego kwasy.
6.4 Utrzymywanie cząstek z daleka od siebie
Ma to miejsce w przypadku Veegum® i Avicel RC®, w których nierozpuszczalne cząstki mniejsze (około 1 urn) niż cząstki CaCO3 leżą pomiędzy CaCO3 w celu uniemożliwienia agregacji.
P r z y k ła d 7: Projekty produktu
Następujące schematy przedstawiają przykłady projektów produktu.
7.1 CaCO3 w strzykawce
Do posiadanych już klinicznych partii Rotawirusa liofilizowanego w fiolkach, można wprowadzić ciekły środek zobojętniający kwasy do odtwarzania znajdujących się w strzykawce.
Strzykawka rk Z 1,3 ml
CaCO3 (60mg/ml) igła
UJ Zliofilizowany Rotawirus
W produkcie tym, sedymentacja CaCO3 musi znajdować się pod kontrolą nie tylko podczas etapów wypełniania, ale także podczas całego dopuszczalnego okresu magazynowania (co najmniej 2 lata).
PL 205 550 B1
7.2 CaCO3 w fiolce z liofilizatem
Strzykawka z 1,3 ml wody
Fiolka ze ziiofilizowanym Rotawirusem + CaCO3 (60mg) Ksantan
7.3 Liofilizacja w plastykowym opakowaniu na tabletki W tym przypadku Rotawirus, CaCO3 i guma ksantanowa są liofilizowane razem bezpoś rednio w plastykowym opakowaniu na tabletki.
P r z y k ł a d 8: Liofilizacja różnych szczepów Rotawirusa
Seria nr Szczep Rotawirusa Kompozycja preparatu Miano wirusa w czasie = zero po liofilizacji Miano wirusa po liofilizacji i 1 tygodniu w 37°C
00F26/01 G1 SB czyszcz. nr 61 PRO/0232 Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,6 104,7
00F26/02 G2(DS-1) Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,4 10 4,
00F26/03 G3(P) Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,6 104,5
00F26/04 G4(VA-70) Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% CO Y O co Y O
00F26/05 G9(W161) Sacharoza: 2% Dekstran: 4% Sorbitol: 3% Aminokwasy: 2% 104,6 104,5
Szczepy DS-1, P i VA70 są opisane jako referencyjne szczepy ludzkiego rotawirusa, odpowiednio, dla serotypu G2, G3 i G4 na stronie 1361 z „Fields Raven press 1990, wyd. drugie.
W doś wiadczeniu tym liofilizowano róż ne szczepy Rotawirusa. Dla wszystkich wykazano utrzymywanie się miana wirusa podczas liofilizacji jak i w teście przyspieszonej stabilności (jeden tydzień w 37°C).
PL 205 550 B1
P r z y k ł a d 9: Faza pierwsza badania bezpieczeństwa u dorosłych przyjmujących doustnie szczepionkę z Rotawirusa.
Badania Fazy I prowadzono w celu oszacowania bezpieczeństwa i wywoływania reakcji przez pojedynczą dawkę 106,6 ffu szczepionki z P43 na zdrowych dorosłych w wieku 18 do 45 lat.
Próba kliniczna była podwójna ślepa i losowa. Dawało to kontrolę z placebo i niezależność. Badania prowadzono w jednym centrum w Belgii.
Badana populacja
Wśród 33 zarejestrowanych osobników, gdzie 11 stanowiło grupę placebo a 22 grupę szczepioną, wszyscy ukończyli badanie. Wszyscy wolontariusze należeli do rasy kaukaskiej. Ich średni wiek w czasie szczepienia wynosił 33,5 roku, mieś cił się w zakresie 18 do 44 lat. Prób ę rozpoczę to w styczniu i przebiegał a przez prawie jeden miesiąc.
Materiał
Szczepionka
Partie kliniczne szczepionki P43 wyprodukowano, oczyszczono, wytworzono i zliofilizowano zgodnie z Good Manufacturing Practices. Partie były sprawdzone przez urząd kontroli jakości (Quallity Control and Quality Assurance). Każda fiolka zawierała następujące składniki:
Składnik aktywny:
Szczep P43 min. 105,8 ffu
Zaróbki, środki stabilizujące:
Sacharoza 9 mg
Dekstran 18 mg
Sorbitol 13,5 mg
Aminokwasy 9 mg
Placebo
Przygotowano i sprawdzono fiolki z placebo. Każda fiolka z placebo zawierała następujące składniki:
Sacharoza 9 mg
Dekstran 18 mg
Sorbitol 13,5 mg
Aminokwasy 9 mg
Rozpuszczalnik
Jako rozpuszczalnik do odtwarzania szczepionki i placebo stosowano wodę do zastrzyków.
Podawanie
Około 10 do 15 min. przed podaniem szczepionki lub placebo, osobnicy z obu grup otrzymywali doustnie 10 ml Mylanta®. Mylanta® jest zarejestrowanym środkiem zobojętniającym kwasy. Ten środek zobojętniający kwasy podnosi pH w żołądku i zapobiega inaktywacji rotawirusa podczas przechodzenia przez żołądek.
W celu przygotowania szczepionki dwie fiolki ze zliofilizowanym P43 zawierają cym 105,8 ffu na fiolkę odtwarzano przy użyciu 1,5 ml wody do zastrzyków. Dawało to obliczone miano wirusa 106,1 ffu na dawkę. Odtworzona szczepionka była szybko podawana doustnie w postaci pojedynczej dawki.
W celu przygotowania placebo, dwie fiolki ze zliofilizowanym placebo był y odtwarzane przy uż yciu 1,5 ml wody do zastrzyków i podawane doustnie jako pojedyncza dawka.
Bezpieczeństwo i wywoływanie reakcji
Zastosowano następujące kryteria bezpieczeństwa i wywoływania reakcji:
Obserwowanie czy pojawiają się podczas ośmiu dni po podaniu narzucające się ogólne objawy, takie jak gorączka, biegunka, wymioty, nudności, ból brzucha i utrata apetytu. Obserwowanie czy pojawiają się nienarzucające się objawy w ciągu 30 dni po podaniu. Obserwowanie czy pojawiają się poważne niepomyślne przypadki przez cały okres badania.
Pobieranie próbek biegunek podczas ośmiu dni po podaniu.
Wyniki:
W czasie odpowiedniego okresu obserwacji nie zanotowano narzucających się objawów, nienarzucających się objawów ani poważnych niepomyślnych wypadków.
Nie zanotowano przypadków biegunki.
Wnioski
Preparat biologiczny SB szczepionki P43 był bezpieczny w porównaniu z placebo, kiedy podawano go doustnie z podwójną ślepą próbą w postaci pojedynczej dawki 106,1 ffu zdrowym wolontariuszom w wieku 18 do 44 lat.
PL 205 550 B1
Lista sekwencji <110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.
<120> Vaccine <130> B45194 <160> 2 , <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 2350 <212> DNA <213 > Ludzkie <400> 1 atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga cttacatgat 60 gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120 gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180 gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240 tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300 ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360 atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420 gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480 accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540 ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600 cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660 aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720 tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780 tggaaagaaa tgcagtat&a tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840 gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900 caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960 ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg 1020 tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca 1080 tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaactcagt gaaatgtaca 1140 ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct 1200 gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta 1260 aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga 1320 acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac 1380 cacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag 1440 actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta 1500 cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca 1560 ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact 1620 aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt 1680 tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt 1740 agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta 1800 actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta 1860 aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta 1920 aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca 1980 gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta 2040 atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg 2100 ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata 2160 atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg 2220 ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca 2280 attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga 2340 ggatgtgacc 2350 <210> 2 <211> 1009 <212> DNA <213> Ludzkie <400> 2 atątatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt 120 tatgcagcat tatttgcctt gacaagagct cagaattatg ggcttaactt accaataaca 180 ggatcaatgg acactgtata cgctaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240 ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatta atgatggtga atggaaagac 300 tcattgtcac aaatgtttct cacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360 tattcaagta tcgttgattt ttctgtcgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420 ctaatgaaat atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480 aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaatacg 600 caaatgttag gaataggttg tcaaacaaca aacgtagact cgtttgaaat ggttgctgag 660 aatgagaaat tagctatagt ggatgccgtt gatgggataa atcataaaac aaatttgaca 720 actacgacat gcactattcg aaattgcaag aagttaggtc caagagagaa tgtagctgta 780 atacaagttg gtggctctaa tgtattagac ataacagcag atccaacgac taatccacaa 840 actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tactatagta 900 gattatatta accaaatcgt gcaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata gatatatctt agattagatc gatgtgacc 1009

Claims (35)

1. Populacja atenuowanego ludzkiego rotawirusa, znamienna tym, że obejmuje pojedynczy wariant albo zasadniczo pojedynczy wariant, który jest zdefiniowany przez sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej jedno z głównych białek wirusowych oznaczonych jako VP4 i VP7.
2. Populacja rotawirusa według zastrz. 1, znamienna tym, że jest sklonowanym szczepem.
3. Populacja rotawirusa według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że pochodzi z infekcji ludzkim rotawirusem.
4. Populacja rotawirusa według zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że replikuje się w i jest wydzielana przez ludzi.
5. Populacja rotawirusa według zastrz. 1 do 4, znamienna tym, że zasadniczo pojedynczy wariant jest wariantem, w którym gen VP4 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą co najmniej jedną z następujących zasad: adeninę (A) w pozycji 788, adeninę (A) w pozycji 802 i tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start.
6. Populacja rotawirusa według zastrz. 5, w której gen VP4 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą: adeninę (A) w pozycjach 788 i 802 oraz tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start.
7. Populacja rotawirusa według zastrz. 1 do 6, w której zasadniczo pojedynczy wariant jest wariantem, w którym gen VP7 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą co najmniej jedną z następujących zasad: tyminę (T) w pozycji 605, adeninę (A) w pozycji 897 i guaninę (G) w pozycji 897 od kodonu start.
8. Populacja rotawirusa według zastrz. 7, w której gen VP7 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą: tyminę (T) w pozycji 605 oraz adeninę (A) albo guaninę (G) w pozycji 897 od kodonu start.
9. Populacja rotawirusa według zastrz. 5 do 8, w której gen VP4 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą: adeninę (A) w pozycjach 788 i 802 oraz tyminę (T) w pozycji 501 od kodonu start, a gen VP7 obejmuje sekwencję nukleotydową obejmującą: tyminę (T) w pozycji 605 oraz adeninę (A) w pozycji 897 od kodonu start.
10. Rotawirus, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko VP4, przedstawioną na Figurze 1 i/albo sekwencję nukleotydową kodującą białko VP7, przedstawioną na Figurze 2.
11. Populacja rotawirusa według zastrz. 1 do 10 oznaczona jako P43 i zdeponowana pod numerem dostępu ECACC 99081301.
12. Wariant rotawirusa oznaczony jako P43 i zdeponowany w ECACC pod numerem dostępu 99081301, potomstwo rotawirusa i jego pochodne aktywne immunologicznie oraz materiały z nich uzyskane.
13. Reasortant ludzkiego rotawirusa, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jeden antygen albo co najmniej jeden segment wariantu P43 rotawirusa określonego w zastrz. 11 albo 12.
14. Sposób wytwarzania populacji oczyszczonego rotawirusa obejmującej zasadniczo pojedynczy wariant, znamienny tym, że obejmuje:
pasażowanie preparatu rotawirusa na odpowiedniej linii komórek; ewentualnie selekcjonowanie homogennej hodowli z zastosowaniem etapów: ograniczonego rozcieńczenia, albo izolacji indywidualnych łysinek oraz sprawdzanie pod kątem obecności zasadniczo pojedynczego wariantu przez ustalenie sekwencji odpowiedniego regionu sekwencji genu VP4 i/albo VP7.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że preparat rotawirusa jest pasażowany na komórkach AGMK.
16. Sposób według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że preparat rotawirusa ma charakterystykę szczepu 89-12 albo jego pochodnej.
17. Sposób według zastrz. 14 do 16, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap działania eterem w celu usunięcia wrażliwych na eter czynników zanieczyszczających.
18. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że obejmuje żywego atenuowanego wirusa określonego w zastrz. 1 do 13 zmieszanego z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym albo adiuwantem.
19. Kompozycja szczepionki według zastrz. 18, znamienna tym, że jest przystosowana do podawania doustnego.
PL 205 550 B1
20. Kompozycja szczepionki według zastrz. 19, znamienna tym, że atenuowany wirus jest sformułowany ze środkiem zobojętniającym kwasy.
21. Kompozycja szczepionki według zastrz. 20, znamienna tym, że środek zobojętniający kwasy obejmuje organiczny środek zobojętniający kwasy.
22. Kompozycja szczepionki według zastrz. 21, znamienna tym, że środkiem zobojętniającym kwasy jest cytrynian sodu.
23. Kompozycja szczepionki według zastrz. 20, znamienna tym, że środek zobojętniający kwasy obejmuje nieorganiczny środek zobojętniający kwasy.
24. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, znamienna tym, że środkiem zobojętniającym kwasy jest wodorotlenek glinu.
25. Kompozycja szczepionki według zastrz. 23, znamienna tym, że środkiem zobojętniającym kwasy jest węglan wapnia.
26. Kompozycja szczepionki według zastrz. 25, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje czynnik zwiększający lepkość.
27. Kompozycja szczepionki według zastrz. 26, znamienna tym, że czynnikiem zwiększającym lepkość jest guma ksantanowa.
28. Kompozycja szczepionki według zastrz. 25 do 27, znamienna tym, że żywy atenuowany wirus jest sformułowany z węglanem wapnia i gumą ksantanową oraz odtwarzany roztworem wodnym.
29. Kompozycja szczepionki według zastrz. 20 do 28, znamienna tym, że żywy atenuowany wirus jest sformułowany ze środkiem zobojętniającym kwasy i zliofilizowany w opakowaniu listkowym.
30. Kompozycja szczepionki według zastrz. 18 do 29, znamienna tym, że wirus jest w postaci zliofilizowanej.
31. Kompozycja szczepionki według zastrz. 30, znamienna tym, że żywy atenuowany wirus oraz środek zobojętniający kwasy znajdują się w dwóch oddzielnych pojemnikach do sformułowania ciekłej kompozycji szczepionki przed podaniem.
32. Kompozycja szczepionki według zastrz. 30, znamienna tym, że żywy atenuowany wirus oraz środek zobojętniający kwasy znajdują się w tym samym pojemniku tworząc zliofilizowaną kompozycję szczepionki do odtworzenia roztworem wodnym przed podaniem.
33. Sposób wytwarzania kompozycji szczepionki rotawirusa, znamienny tym, że obejmuje zmieszanie zliofilizowanego żywego atenuowanego ludzkiego rotawirusa z odpowiednim nośnikiem lub adiuwantem z wytworzeniem kompozycji jak określono w zastrz. 18-32.
34. Zastosowanie atenuowanego ludzkiego rotawirusa do wytwarzania szczepionki jak określono w zastrz. 18 - 32 do zapobiegania infekcji rotawirusem u człowieka.
35. Preparat szczepionki jak określono w zastrz. 18-32 do zastosowania w medycynie.
PL354135A 1999-08-17 2000-08-15 Populacja rotawirusa, jego wariant, reasortant i zastosowanie, sposób wytwarzania populacji rotawirusa, kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania oraz preparat szczepionki PL205550B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9919468.0A GB9919468D0 (en) 1999-08-17 1999-08-17 Vaccine
GBGB9927336.9A GB9927336D0 (en) 1999-11-18 1999-11-18 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL354135A1 PL354135A1 (pl) 2003-12-29
PL205550B1 true PL205550B1 (pl) 2010-04-30

Family

ID=26315853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL354135A PL205550B1 (pl) 1999-08-17 2000-08-15 Populacja rotawirusa, jego wariant, reasortant i zastosowanie, sposób wytwarzania populacji rotawirusa, kompozycja szczepionki i sposób jej wytwarzania oraz preparat szczepionki

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7285280B1 (pl)
EP (1) EP1212084B1 (pl)
JP (3) JP2003507040A (pl)
KR (1) KR100695599B1 (pl)
CN (1) CN100379451C (pl)
AP (1) AP1768A (pl)
AR (1) AR029643A1 (pl)
AT (1) ATE327765T1 (pl)
AU (1) AU767885B2 (pl)
BG (1) BG65314B1 (pl)
BR (1) BRPI0013357B8 (pl)
CA (1) CA2379196C (pl)
CO (1) CO5580165A1 (pl)
CY (2) CY1106103T1 (pl)
CZ (1) CZ302173B6 (pl)
DE (2) DE122006000026I1 (pl)
DK (1) DK1212084T3 (pl)
DZ (1) DZ3219A1 (pl)
EA (1) EA005952B1 (pl)
ES (1) ES2260046T3 (pl)
FR (1) FR06C0018I2 (pl)
HK (1) HK1046860B (pl)
HU (2) HU228975B1 (pl)
IL (3) IL147926A0 (pl)
LU (1) LU91251I2 (pl)
MA (1) MA25489A1 (pl)
MX (1) MXPA02001648A (pl)
MY (1) MY133158A (pl)
NL (1) NL300233I2 (pl)
NO (2) NO328112B1 (pl)
NZ (1) NZ517131A (pl)
OA (1) OA12312A (pl)
PE (1) PE20010487A1 (pl)
PL (1) PL205550B1 (pl)
PT (1) PT1212084E (pl)
SI (1) SI1212084T1 (pl)
SK (1) SK287261B6 (pl)
TR (1) TR200200420T2 (pl)
TW (1) TWI283270B (pl)
UA (1) UA77388C2 (pl)
UY (1) UY26297A1 (pl)
WO (1) WO2001012797A2 (pl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA005952B1 (ru) * 1999-08-17 2005-08-25 Смитклайн Бичем Байолоджикалз С.А. Ослабленная популяция ротавирусов и содержащая ее вакцинная композиция
US6592869B2 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Vaccine composition and method of using the same
GB0020089D0 (en) * 2000-08-15 2000-10-04 Smithkline Beecham Biolog Vaccine Composition
KR20030026654A (ko) * 2001-09-26 2003-04-03 주식회사 씨트리 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용
GB0414787D0 (en) 2004-07-01 2004-08-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
SG147465A1 (en) * 2003-09-02 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0503337D0 (en) * 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
US20090028828A1 (en) * 2005-08-17 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rotavirus Vaccine Inducing Heterotypic Cross Protection
JP5215865B2 (ja) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
KR101051986B1 (ko) * 2006-09-28 2011-07-26 중앙대학교 산학협력단 인간로타바이러스 및 이를 이용한 백신 조성물
WO2008058035A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-15 Alphavax, Inc. Alphavirus and alphavirus replicon particle formulations and methods
EP2236617A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Methods of terminal sterilization of biofunctional compositions
EP2429577B1 (en) 2009-05-12 2019-01-30 The Government of The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, New human rotavirus strains and vaccines
US9598676B2 (en) 2009-07-13 2017-03-21 Bharat Biotech International Limited Composition useful as rotavirus vaccine and a method therefor
FR2960781B1 (fr) * 2010-06-07 2013-11-22 Sanofi Pasteur Preparation d'un vaccin oral sec stabilise, compose d'un virus vivant attenue
CN110227152A (zh) 2012-04-23 2019-09-13 巴拉特生物技术国际有限公司 轮状病毒疫苗组合物及其制备方法
IN2015DN01342A (pl) 2012-08-27 2015-07-03 Murdoch Childrens Res Inst
JP6808650B2 (ja) * 2015-05-21 2021-01-06 シャアメン ユニバーシティ 短縮型ロタウイルスｖｐ４タンパク質およびその適用
CN108431214B (zh) 2015-10-05 2022-03-01 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途
WO2017081110A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Curevac Ag Rotavirus vaccines
JP2019502685A (ja) * 2015-12-18 2019-01-31 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 熱安定性ロタウイルスワクチン製剤およびその使用方法
MA44557B1 (fr) 2016-06-16 2021-11-30 Bharat Biotech Int Ltd Vaccin contre le rotavirus sans tampon, stable en milieu acide, et d'un faible volume de dose à administrer
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
CN110856493B (zh) * 2018-08-20 2022-02-25 中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所 一种植物病毒弱毒疫苗组合物、弱毒疫苗保存方法及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927323B2 (ja) * 1976-10-12 1984-07-05 花王株式会社 歯みがき組成物
US4341763A (en) * 1981-03-10 1982-07-27 Smithkline-Rit Methods of vaccinating humans against rotavirus infection
US4571385A (en) 1983-06-27 1986-02-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors
EP0152295B1 (en) * 1984-02-09 1991-03-20 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine and preparation thereof
US5626851A (en) * 1987-11-30 1997-05-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Rotavirus reassortant vaccine
DE69130068T2 (de) * 1990-11-16 1999-01-07 Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio Humane rotativen, impfstoffe und methoden
US5471385A (en) * 1992-05-21 1995-11-28 Tsubakimoto Chain Co. Routeless guiding method for moving body
US5773009A (en) * 1994-04-15 1998-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rotavirus strain G9P11
AU3125795A (en) * 1994-07-11 1996-02-09 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Attenuated human rotavirus vaccine
US6403098B1 (en) * 1996-09-26 2002-06-11 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
EP0939648B1 (en) * 1996-09-26 2007-11-07 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
US5932223A (en) * 1996-09-26 1999-08-03 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
US6552024B1 (en) * 1999-01-21 2003-04-22 Lavipharm Laboratories Inc. Compositions and methods for mucosal delivery
EA005952B1 (ru) * 1999-08-17 2005-08-25 Смитклайн Бичем Байолоджикалз С.А. Ослабленная популяция ротавирусов и содержащая ее вакцинная композиция

Also Published As

Publication number Publication date
SK287261B6 (sk) 2010-04-07
JP2007319164A (ja) 2007-12-13
AP1768A (en) 2007-08-16
CN1379683A (zh) 2002-11-13
EA200200142A1 (ru) 2002-08-29
PT1212084E (pt) 2006-07-31
TWI283270B (en) 2007-07-01
SI1212084T1 (sl) 2006-08-31
DZ3219A1 (fr) 2001-02-22
NO328112B1 (no) 2009-12-07
DE60028390D1 (de) 2006-07-06
NO20020763L (no) 2002-04-16
BG106417A (en) 2003-04-30
HUP0203335A3 (en) 2004-07-28
UY26297A1 (es) 2001-03-16
MY133158A (en) 2007-10-31
BG65314B1 (bg) 2008-01-31
FR06C0018I2 (fr) 2007-04-27
NZ517131A (en) 2003-07-25
US20080057082A1 (en) 2008-03-06
NL300233I1 (nl) 2006-09-01
JP2003507040A (ja) 2003-02-25
NL300233I2 (nl) 2006-10-02
LU91251I9 (pl) 2018-12-31
CA2379196A1 (en) 2001-02-22
PL354135A1 (pl) 2003-12-29
US7285280B1 (en) 2007-10-23
SK2432002A3 (en) 2002-09-10
JP5474720B2 (ja) 2014-04-16
PE20010487A1 (es) 2001-06-23
US7790179B2 (en) 2010-09-07
CY2006004I2 (el) 2009-11-04
CN100379451C (zh) 2008-04-09
CO5580165A1 (es) 2005-11-30
AU6996100A (en) 2001-03-13
DK1212084T3 (da) 2006-07-10
DE122006000026I1 (de) 2006-10-12
AU767885B2 (en) 2003-11-27
JP2011045374A (ja) 2011-03-10
FR06C0018I1 (pl) 2006-07-21
CA2379196C (en) 2015-05-26
CZ2002522A3 (cs) 2002-05-15
EP1212084B1 (en) 2006-05-31
WO2001012797A2 (en) 2001-02-22
HUP0203335A1 (hu) 2003-02-28
IL188686A0 (en) 2008-04-13
IL147926A0 (en) 2002-08-14
BR0013357A (pt) 2002-04-30
HK1046860A1 (en) 2003-01-30
EP1212084A2 (en) 2002-06-12
CY1106103T1 (el) 2010-07-28
US20090130145A1 (en) 2009-05-21
US20080063662A1 (en) 2008-03-13
CZ302173B6 (cs) 2010-11-24
BRPI0013357B8 (pt) 2021-05-25
KR20020092344A (ko) 2002-12-11
HU228975B1 (en) 2013-07-29
ES2260046T3 (es) 2006-11-01
MA25489A1 (fr) 2002-07-01
BRPI0013357B1 (pt) 2016-08-02
WO2001012797A3 (en) 2001-08-02
HUS1300072I1 (hu) 2019-11-28
DE60028390T2 (de) 2006-11-02
EA005952B1 (ru) 2005-08-25
KR100695599B1 (ko) 2007-03-14
LU91251I2 (fr) 2006-08-14
NO2010011I1 (no) 2010-06-07
TR200200420T2 (tr) 2002-05-21
US7790180B2 (en) 2010-09-07
NO20020763D0 (no) 2002-02-15
NO2010011I2 (no) 2015-02-02
HK1046860B (zh) 2006-10-06
ATE327765T1 (de) 2006-06-15
MXPA02001648A (es) 2002-08-06
CY2006004I1 (el) 2009-11-04
IL147926A (en) 2008-03-20
AR029643A1 (es) 2003-07-10
AP2002002424A0 (en) 2002-03-31
OA12312A (en) 2006-05-12
UA77388C2 (uk) 2006-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7790180B2 (en) Immunogenic composition of a homogeneous live attenuated human rotavirus population
EP2233153B1 (en) Rotavirus vaccine inducing heterotypic cross protection
EP2272532B1 (en) Rotavirus vaccine
US7579008B2 (en) Immunization with an attenuated human rotavirus
EP1676586B1 (en) Method of separating rotavirus variants and live attenuated rotavirus vaccine
ZA200601771B (en) Vaccine