CZ2002522A3 - Oslabená populace lidského rotaviru - Google Patents

Oslabená populace lidského rotaviru Download PDF

Info

Publication number
CZ2002522A3
CZ2002522A3 CZ2002522A CZ2002522A CZ2002522A3 CZ 2002522 A3 CZ2002522 A3 CZ 2002522A3 CZ 2002522 A CZ2002522 A CZ 2002522A CZ 2002522 A CZ2002522 A CZ 2002522A CZ 2002522 A3 CZ2002522 A3 CZ 2002522A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
rotavirus
vaccine composition
antacid
vaccine
composition
Prior art date
Application number
CZ2002522A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302173B6 (cs
Inventor
Brigitte Desiree Alberte Colau
Francoise Denamur
Isabelle Knott
Annick Poliszczak
Georges Thiry
Velde Vincent Vande
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9919468.0A external-priority patent/GB9919468D0/en
Priority claimed from GBGB9927336.9A external-priority patent/GB9927336D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ2002522A3 publication Critical patent/CZ2002522A3/cs
Publication of CZ302173B6 publication Critical patent/CZ302173B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/0216—Solid or semisolid forms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/0056—Mouth soluble or dispersible forms; Suckable, eatable, chewable coherent forms; Forms rapidly disintegrating in the mouth; Lozenges; Lollipops; Bite capsules; Baked products; Baits or other oral forms for animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2095—Tabletting processes; Dosage units made by direct compression of powders or specially processed granules, by eliminating solvents, by melt-extrusion, by injection molding, by 3D printing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových vakcinačních prostředků, způsobu jejich výroby a jejich použití v léčbě. Zvláště se pak předkládaný vynález týká nových rotavirových vakcinačních prostředků.
Dosavadní stav techniky
Akutní, infekční průjem je přední příčinou onemocnění a smrti v mnoha světových oblastech. V rozvojových zemích je dopad průjmového onemocnění ohromující. Pro Asii, Afriku a Latinskou Ameriku bylo odhadnuto, že zde existují tři až čtyři biliony případů průjmu každý rok a z těchto případů přibližně pět až 10 milionů končí smrtí (J. A. Walsh se spoluautory, N. Engl. J. Med. 301. 967-974, 1979).
Rotavirus byl rozpoznán jako jedna z nejdůležitějších příčin těžkého průjmu u kojenců a malých dětí (Μ. K. Estes, Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, 3. vydání, vydáno Fieldsem a spol., Raven Publishers, Philadelphia 1996). Odhaduje se, že rotavirové onemocnění je zodpovědné za více než 1 milion úmrtí ročně. Rotavirem indukovaná nemoc nejběžněji působí na děti mezi 6 a 24 měsíci života a vrcholné rozšíření onemocnění obecně nastává během chladnějších měsíců v umírněném podnebí a během celého roku v tropickém podnebí. Rotaviry se typicky přenášejí z osoby na osobu fekálně orální cestou s inkubační dobou přibližně od 1 do 3 dnů. Oproti infekci u věkové skupiny 6 až 24 měsíců jsou novorozenci obecně bez příznaků nebo mají jen slabší onemocnění. Na rozdíl od těžkého onemocnění s nímž se obvykle střetáváme u malých dětí je většina dospělých chráněna v důsledku předchozí rotavirové infekce, takže většina infekcí • · u dospělých je mírná nebo bez příznaků (P. A. Offit se spoluautory, Comp. Ther. 8(8), 21-26, 1982).
Rotaviry jsou obecně kulovité a jejich název je odvozen od jejich odlišené vnitřní a vnější, nebo dvojplášťové struktury kapsidu. Dvojplášťová kapsidová struktura rotaviru typicky obklopuje vnitřní bílkovinný obal či jádro, obsahující genom. Genom rotaviru se skládá z 11 segmentů dvojvláknové RNA, která kóduje přinejmenším 11 odlišných virových bílkovin. Dvě z těchto virových bílkovin, označované jako VP4 a VP7 jsou uspořádány vně dvojplášťové kapsidové struktury. Vnitřní kapsid rotaviru představuje jedna bílkovina, jíž je rotavirová bílkovina, označovaná jako VP6. Poměrná důležitost těchto tří konkrétních rotavirových bílkovin ve vyvolání imunitní odpovědi, která následuje po rotavirové infekci, není známa. Přesto však bílkovina VP6 určuje skupinový a podskupinový antigen a bílkoviny VP4 a VP7 jsou determinanty sérotypové specifičnosti.
Bílkovinou VP7 je glykoprotein o molekulové hmotnosti Mw = 38 000 (nebo Mw = 34 000, pokud není glykosilován), který je translačním produktem genomického segmentu 7, 8 či 9, v závislosti na kmeni. Tato bílkovina stimuluje následně po infekci rotavirem vytváření hlavních neutralizujících protilátek. Bílkovinou VP4 je neglykosylovaná bílkovina o Mw = přibližně 88 000, která je translačním produktem genomického segmentu 4. Tato bílkovina také po rotavirové infekci stimuluje neutralizující protilátky.
Vzhledem k tomu, že bílkoviny VP4 a VP7 jsou virovými bílkovinami, proti nimž jsou namířeny neutralizující protilátky, jsou považovány za prvotní kandidáty pro vývoj rotavirových vakcín, poskytujících ochranu vůči rotavirovým onemocněním.
• · · · • · • · • ·
Je známo, že přirozená rotavirová infekce během ranného dětství vyvolává ochrannou imunitu. Vakcína na bázi živého oslabeného rotaviru je proto velmi žádoucí. S výhodou by se mělo jednat o orálně podávanou vakcínu, neboť tato cesta je přirozenou cestou infekce virem.
Časný vývoj vakcíny k prevenci rotavirových infekcí započal v sedmdesátých letech po objevu viru. Nejprve byly studovány oslabené kmeny od zvířat či lidí a získány byly smíšené výsledky či výsledky přinášející zklamání. Později se úsilí zaměřilo na lidské-zvířecí reasortanty (opětně vytříděné typy) a bylo mnohem úspěšnější.
Rotavirový kmen, známý jako 89-12, byl popsán Wardem, viz patent US 5 474 773 a D. L. Bernsteinem se spoluautory, Vaccine 16(4). 381-387, 1998. Kmen 89-12 byl isolován z podkladového druhu, shromážděného od čtrnáctiletého dítěte s přirozeným rotavirovým onemocněním v roce 1988. Podle patentu US 5 474 773 byl lidský rotavirus HRV 89-12 poté pro kultivaci adaptován dvojitým pasážováním v primárních buňkách opičích ledvin (Afričan Green Monkey Kidney /AGMK/ celíš) a čtyřnásobným pasážováním v buňkách MA-104, jak popsal Ward v J. Clin. Microbiol. 19. 748-753, 1984. Poté byl čištěn plakovou metodou, trojnásobně v buňkách MA-104 (do 9. pasážování) a po dvojím přídavném pasážování byl pěstován v těchto buňkách. Jedno přídavné pasážování bylo uskutečněno (12. pasážování) pro uložení v ATCC (American Type Culture Collection, Americké sbírce typů kultur) pod přírůstkovým číslem ATCC VR 2272. Uložený kmen je známý jako 89-12C2.
Článek v časopisu Vaccine z roku 1998 Bernsteina a spoluautorů je dále uváděn jako článek ve Vaccine (1998). Tento článek popisuje bezpečnost a imunogenitu orálně podávaného přípravku, aspirujícího na živou vakcínu lidského rotaviru. Tato vakcína byla z kmene 89-12, oslabeného pasážováním bez plakového vyčištění dvacetišestinásobně v primárních AGMK buňkách a poté sedminásobným pasážováním v ustanovené buněčné linii AGMK (celkem 33 pasážování).
V tomto popisu vynálezu bude výše zmíněný materiál, který byl pravidelně dvacetišestinásobně pasážován, dále označován jako P26 a materiál, který byl pravidelně třiatřicetinásobně pasážován, bude označován jako P33. Obecně bude rotavirus, získaný n-násobným pasážováním kmene 89-12, označován jako Pn.
V následujících Příkladech byl materiál P33 dále pětinásobně pasážován ve Vero-buňkách. Ten je pak označen jako P38.
Isoláty P26 a P33, popsané v článku ve Vaccine (1989), nebyly uloženy ve sbírce kultur, ani nebyly analyzovány ke stanovení jejich genetické charakterizace.
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že populace P26, posaná v literatuře, zahrnuje směs druhů (variant) . To bylo prokázáno genetickou charakterizací, jak je popsáno dále (viz Příklady). P26 tedy není spolehlivě shodnou populací pro další pasážování a zvláště pro výrobu vakcinačních dávek. Podobně P33 zahrnuje směs variant a není spolehlivě shodný pro výrobu vakcinačních dávek.
Bylo zjištěno, že materiál P26 je směsí alespoň tří variant genu VP4. P33 a P38 jsou podobně směsí dvou variant. Tyto varianty se zdají být, pokud se týká neutralizačních epitopů, antigenně odlišné od kmene 89-12C2, uloženého v ATCC, pokud jsou stanoveny titry neutralizujících • · protilátek ze séra kojenců, očkovaných pomocí P33 vůči těmto variantám. To je doloženo na Obr. 3 (a-d)
Dále bylo zjištěno, že pokud je materiál P33 podáván kojencům, jsou replikovány a vylučovány dvě identifikované varianty. Ze 100 očkovaných kojenců jen 2 vykázali známky gastroenteritidy, způsobené rotavirovou infekcí, zatímco ze skupiny, dostávající placebo, bylo infikováno 20 %. Tato zjištění ukazují, že identifikované varianty jsou asociovány (spojeny) s ochranou vůči rotavirovému onemocnění. Předkládaný vynález poskytuje způsob oddělení rotavirových variant a zlepšenou živou oslabenou rotavirovou vakcínu, získanou z klonovaného (homogenního) lidského kmene rotaviru.
Podle prvního aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje oslabenou rotavirovou populaci (isolovanou), charakterizovanou tím, že obsahuje jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu a tato varianta je definována nukleotidovou sekvencí, kódující alespoň jednu z hlavních virových bílkovin, označovaných jako VP4 a VP7.
Rotavirová populace podle vynálezu je s výhodou klonovanou variantou.
Populací, obsahující jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu, se míní rotavirová populace, která neobsahuje více než 10 %, lépe obsahuje méně než 5 % a nejlépe méně než 1 % odlišné varianty nebo odlišných variant. Virová populace může být vyčištěna do homogenity (stejnorodosti) nebo v podstatě do homogenity pasážováním na vhodných typech buněk, nebo provedením řady jednoho nebo více kroků klonování.
Výhodou tohoto vynálezu je to, že populace, obsahující jedinou variantu, je mnohem vhodnější pro formulaci shodné vakcinační dávky.
• · ·· ··
Za zvýšení účinnosti prevence rotavirové infekce mohou být rovněž asociovány (připojeny) konkrétní varianty, definované svými nukleotidovými sekvencemi, kódujícími hlavní virovou bílkovinu.
V jednom upřednostňovaném aspektu jedinou variantou nebo v podstatě jedinou variantou rotavirové populace podle vynálezu je ta varianta, u níž gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jedno z následujících uspořádání: adeninovou bázi (A) v poloze 788, adeninovou bázi (A) v poloze 802 a thyminovou bázi (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu.
V dalším aspektu jedinou variantou nebo v podstatě jedinou variantou rotavirové populace podle vynálezu je ta varianta, u níž gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jedno z následujících uspořádání: thymin (T) v poloze 605, adenin (A) v poloze 897 nebo guanin (G) v poloze 897 od počátečního (startovacího) kodonu. Výhodněji je v poloze 897 adenin (A).
V upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu adenin (A) v polohách 788 a 802 a thymin (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP4.
V jiném upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu thymin (T) v poloze 605 a adenin/guanin (A/G) v poloze 897 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP7. Nejvýhodněji je v genové sekvenci VP7 adenin (A) v poloze 897.
Ve zvláště upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu adenin (A) v polohách 788 a 802 a thymin (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP4; thymin (T) pak v poloze 605 a adenin/guanin (A/G) v poloze .897
• 9 tt ·· ·· od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP7. Nejvýhodněji je v genové sekvenci VP7 adenin (A) v poloze 897.
V jiném aspektu zahrnuje jediná varianta nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP4, kde tato nukleotidová sekvence je stejná jako sekvence uvedená na Obr. 1 a/nebo zahrnuje nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP7, kde tato nukleotidová sekvence je stejná jako sekvence, uvedená na Obr. 2.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby rotavirové populace, obsahující v podstatě jedinou variantu, přičemž tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se:
rotavirový preparát pasážuje ve vhodném buněčném typu; volitelně vybere homogenní kultura za použití kroků, v nichž se
a) využije limitního zředění; nebo
b) využije isolace jednotlivého plaku; a ověří přítomnost v podstatě jediné varianty tak, že se provede sekvenční stanovení příslušné oblasti genové sekvence VP4 a/nebo VP7.
Sekvenční stanovení se může vhodně provádět postupem kvantitativní nebo semikvantitativní hybridizace, jako je hybridizace typu slot blot nebo piaková hybridizace.
Zvolenou variantou je s výhodou varianta, která se replikuje a vylučuje po podání výchozího (startovacího) rotavirového preparátu lidskému subjektu, zejména pak dítěti.
Výsledná klonovaná virová populace, vzniklá způsobem podle tohoto vynálezu, může být zmnožena dalším pasážováním ve vhodné buněčné linii.
• · • · · ·
Vhodné buněčné typy pro pasážování rotavirové populace v dříve zmíněném způsobu zahrnují buňky opičích ledvin (AGMK celíš, Afričan green monkey kidney celíš), kterými mohou být založené buněčné linie nebo prvotní AGMK buňky. Vhodné AGMK buněčné linie zahrnují například linie Věro (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) a CV-1 (ATCC CCL-70). Vhodné jsou také MA-104 (makak rhesus) a MRC-5 (lidské - ATCC CCL-171) buněčné linie. Pro amplifikační účely (zesílení populace) se zvláště upřednostňují buňky Věro. Pasážování v buňkách Věro poskytuje vysoký výtěžek viru.
Postupy k ověření, zda ve virové populaci, získané popsaným způsobem, existuje jediná varianta a ke stanovení povahy této jediné varianty zahrnují standardní sekvenační nebo hybridizační postupy, které jsou v oboru známé a jsou zde dále popsány.
V upřednostňovaném aspektu se způsob podle vynálezu provádí za použití vhodného rotaviru, zejména rotaviru, majícího charakteristiky kmene 89-12 nebo jeho pasážovaného derivátu.
Zvláště upřednostňovanou populací o jediné variantě je P43, která byla získána z P33 (isolovaného lidského rotaviru, pasážovaného třiatřicetinásobně v kultuře na vhodných buněčných typech) sérií klonovacích kroků koncového zředění a následně pasážováním klonovaného materiálu ve Věro buňkách k jeho posílení.
Populace P43 byla podle ujednání Budapešťské dohody uložena v Evropské sbírce živočišných buněčných kultur ve Výzkumné a produkční laboratoři vakcín Laboratorní služby veřejného zdraví, v Centru pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum (v ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory,
4· ··
Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research), v Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, ve Spojeném Království a to dne 13. srpna 1999 pod ukládacím číslem 99081301.
Ačkoli tato uvedená veřejná dostupnost je nejjednodušším způsobem jak získat lidský rotavirus P43, není vcelku nemožné nebo nepravděpodobné že podobné a funkčně v podstatě totožné rotaviry by mohly být vyrobeny těmito nebo jinými způsoby podle poznatků tohoto vynálezu. Takové funkčně v podstatě totožné rotaviry jsou považovány za biologicky rovnocenné lidskému rotaviru P43 podle tohoto vynálezu a spadají tedy do obecného rozsahu předkládaného vynálezu. Rozumí se tím tedy, že vynález zahrnuje rotavirové populace, mající charakteristiky varianty P43, jak je zde popsána.
Rovněž je tedy zřejmé, že vynález zahrnuje materiál, odvozený od uloženého P43 ECACC 99081301 tak, že je podroben dalšímu zpracování, jako je jeho rozmnožování dalším pasážováním, klonováním, nebo jinými postupy, využívajícími živý virus, nebo jakoukoli modifikací P43, včetně postupů genetického inženýrství nebo opětného vytřídění. Takové kroky a postupy jsou v oboru dobře známé.
Materiály, odvozené od P34, které jsou chráněny vynálezem, zahrnují bílkovinný a genetický materiál. Zvláštní pozornost zasluhují reasortní (opětovně vytříděné) rotaviry, které obsahují alespoň jeden antigen nebo alespoň jeden segment P43, například reasortní rotaviry, obsahující virulentní kmen rotaviru, v němž byla jedna část jednoho z 11 genomových segmentů nahražena genomovým segmentem nebo jeho částí z P43. Vhodné vlastnosti mohou mít zejména reasortní rotaviry, v nichž segmentem nebo částečným segmentem, kódujícím NSP4, je segment nebo částečný segment P34. Reasortní rotaviry a způsoby jejich přípravy jsou dobře známé (viz R. H. Foster a A. J. Wagstaff,
- 10 Tetravalent Rotavirus Vaccine, souborný článek. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev 9(2), 155-178, 1998).
Zvláště zajímavými materiály jsou potomstvo P43 a imunologicky aktivní deriváty P43. Imunologicky aktivními deriváty se míní materiály, získané z viru P43, zvláště pak antigeny tohoto viru, které jsou schopné vyvolat imunitní odpověď, působící proti rotaviru po jeho injikaci do hostitelského zvířete.
Při adaptování rotaviru na vhodnou buněčnou linii, například na buňky Věro, může být nezbytné působit na virus tak, aby se zbavil jakékoli znečišťující substance (kontaminantu), kterou mohou být jakákoli nahodilá činidla, která mohou být přítomna a která mohou působit kontaminaci. V případě nahodilých (přidaných) virů, citlivých vůči etheru, se působení může provádět pomocí etheru, jak bude popsáno dále. Předkládaný vynález se také týká zahrnutí takového ovlivnění etherem jako volitelného kroku v celkovém postupu, který slouží k získání oslabeného živého rotaviru nebo vakcíny, která je s ním formulována.
Do rozsahu předkládaného vynálezu patří také směsi P43 s jinými variantami rotaviru, například s jinými klonovanými variantami, nebo s jinými viry, zejména s jinými oslabenými viry. Takové směsi se hodí pro vakcíny podle vynálezu, které jsou popsány dále.
Předkládaný vynález také poskytuje vakcínu živého oslabeného rotaviru, která zahrnuje populaci v podstatě jediné varianty, smíšenou s vhodnou adjuvantní látkou nebo s farmaceutickým nosičem.
Rotavirovou vakcínou podle vynálezu je s výhodou monovalentní rotavirová vakcína, obsahující jediný kmen rotaviru.
• ·
- 11 Předkládaný vynález je zvláště výhodný v tom, že poskytuje vakcínu živého rotaviru, v níž je živoucím oslabeným rotavirem lidský rotavirus a nevyvolává intususcepci.
Vhodné farmaceutické nosiče pro použití ve vakcíně podle vynálezu zahrnují ty, které jsou v oboru známé jako vhodné pro orální podání, zvláště pak dětem. Takové nosiče zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, cukry, vícesytné alkoholy, aminokyseliny, hydroxid hlinitý, hydroxid hořečnatý, hydroxyapatit, talek, oxid titaničitý, hydroxid železitý, stearát hořečnatý, karboxymethylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu, želatinu, rostliný pepton, xantan, karagen, arabskou gumu (klovatinu) a β-cyklodextrin.
Vynález rovněž poskytuje způsob výroby rotavirové vakcíny, například lyofylizací viru v přítomnosti vhodných stabilizátorů nebo smísením viru podle vynálezu s vhodnou adjuvantní látkou nebo s farmaceutickým nosičem.
Výhodné může být také formulování viru podle vynálezu ve vehikulech (nosných prostředích) na bázi lipidů, jako jsou virosomy nebo liposomy, v emulzích oleje ve vodě nebo s částicemi nosiče. Ve formulacích mohou být alternativně nebo nádavkem zahrnuty imunostimulátory, jako jsou ty, známé v oboru pro orálně podávané vakcíny. Takové imunostimulátory zahrnují bakteriální toxiny, zvláště cholerový toxin (CT) ve formě holotoxinu (celé molekuly) nebo pouze řetězce B (CTB) a teplotně labilní enterotoxin z E. coli (LT). Mutované LT, které mají menší sklon k přeměně na svou aktivní formu než přírodní LT, jsou popsány ve WO 96/06627, WO 93/13202 a v US 5 182 109.
Dalšími imunostimulátory, které mohou být výhodně použity, jsou saponinové deriváty jako je QS21 a monofosforyllipid A, zejména pak « ·
- 12 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Vyčištěné saponiny jako orální adjuvntní látky jsou popsány ve WO 98/56415. Saponiny a monofosforyllipid A mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci (viz například WO 94/00153) a mohou být formulovány v adjuvantních systémech společně s jinými činidly. 3D-MPL je dobře známé adjuvans, vyráběné firmou Ribi Immunochem, Montana a jeho výroba je popsána v GB 2 122 204.
Obecná diskuse o vehikulech a adjuvantních látkách pro orální imunizaci lze nalézt v publikaci Vaccine Design, The subunit and Adjuvant Approach, vyd. Powell a Newman, Plenům Press, New York, 1995.
Vynález také poskytuje způsob vakcinace (očkování) lidských subjektů, zvláště kojenců, podáním účinného množství vakcinačního prostředku podle vynálezu subjektu, který to potřebuje. S výhodou se podává živá oslabená vakcína orální cestou.
V upřednostňovaném aspektu je vakcinační prostředek podle vynálezu formulován spolu s antacidem pro minimalizování inaktivace vakcíny žaludeční kyselinou. Vhodné antacídové složky zahrnují anorganické antacida jako například hydroxid hlinitý AI(OH)3 a hydroxid horečnatý (Mg(OH)2. Obchodně dostupné antacida, která jsou vhodná pro použití ve vynálezu, zahrnují přípravek Mylanta™(zaps' znacka\ který obsahuje hydroxid hlinitý a hydroxid horečnatý. Ty jsou ve vodě nerozpustné a jsou poskytovány v suspenzi.
Hydroxid hlinitý je zvláště upřednostňovanou složkou vakcinačního prostředku podle vynálezu, neboť může poskytovat nejen antacidní působení, ale i adjuvantní účinek.
- 13 • · • · · *}
Vhodné pro použití jako antacidní látky ve vakcíně podle předkládaného vynálezu jsou také organická antacida, jako jsou karboxylátové sole organických kyselin. Upřednostňované antacidum ve vakcinačním prostředku podle vynálezu obsahuje karboxylátovou sůl organické kyseliny, s výhodou sůl kyseliny citrónové jako je citrát sodný nebo citrát draselný.
Zvláště upřednostňované antacidum, které může být použito ve vakcinačním prostředku podle tohoto vynálezu, je nerozpustná anorganická sůl, uhličitan vápenatý (CaCO3). Uhličitan vápenatý je schopný spojení (asociace) s rotavirem a během spojení s uhličitanem vápenatým je udržována rotavirová aktivita.
K prevenci sedimentace uhličitanu vápenatého během kroku plnění jsou v prostředku s výhodou přítomna viskozní činidla.
Možná viskozní činidla, která lze použít, zahrnují pseudoplastické přídavné látky. Pseudoplastický roztok je definován jako roztok, mající při stání vyšší viskozitu, než je jeho viskozita při protřepávání. Přídavnými látkami tohoto typu jsou přirozené polymery jako je arabská guma, adragantová guma, agar, algináty, pektiny nebo polosyntetické polymery, jako například karboxymethylcelulóza (Tyloses C®), methylcelulóza (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® a MB®), hydroxypropylcelulóza (Klucels®) a hydroxypropylmethylcelulóza (Methocels E® a K®, Viscotrans MPHC®). Obecně se tyto pseudoplastické pomocné látky používají společně s tixotropními činidly. Jinými viskozními činidly, která je možné použít, jsou pseudoplastické pomocné látky s malou kapacitou toku (tekutosti). Tyto polymery, v dostatečné koncentraci, umožňují vznik uspořádání strukturované tekutiny, výsledkem čehož je roztok o vysoké viskozitě, mající při stání nízkou kapacitu tekutosti. K umožnění toku a převádění
- 14 4 je pak potřeba vynaložit určité množství energie. K dočasnému zrušení uspořádání strukturované tekutiny pro získání tekutého roztoku jsou potřebné vnější energie (protřepávání). Příklady takových polymerů jsou látky Carbopols® a xanthanová guma.
•
Tixotropní pomocné látky získají stáním gelovou strukturu, zatímco při protřepávání vytvářejí tekutý roztok. Příklady tixotropních pomocných látek jsou: Veegum® (křemičitan hořečnato-hlinitý) a Avicel RC® (přibližně 89 % mikrokrystalické celulózy a 11 % sodné karboxymethylcelulózy).
Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahuje viskozní činidlo, zvolené z xanthanové gumy nebo škrobu.
Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu je tedy s výhodou formulován s kombinací uhličitanu vápenatého a xanthanové gumy.
Ostatní složky prostředku, použitého ve vynálezu, vhodně zahrnují cukry, například sacharózu a/nebo laktózu.
Vakcinační prostředek podle vynálezu může obsahovat přídavné složky, zahrnující například příchutě (zejména pro orálně podávanou vakcínu) a bakteriostatická činidla.
U vakcinačního prostředku podle vynálezu se předpokládají různé způsoby presentace (předkládání).
V jednom upřednostňovaném ztělesnění se vakcína podává jako kapalný prostředek. Kapalný prostředek se s výhodou vytváří před podáním alespoň z následujících dvou složek:
·» ··
- 15 • * « · Φ V » · · » Φ »>
• « · · » · · » *··· ► » ···» • 4 «4*·
i) virová složka ii) kapalná složka
V tomto ztělesnění jsou virová složka a kapalná složka normálně přítomné v oddělených zásobnících, které výhodně mohou být oddělenými oddíly jediné nádobky, nebo může jít o oddělené nádobky, které mohou být spojeny takovým způsobem, že konečný vakcinační prostředek je rekonstituován (opětně vytvořen) bez jeho vystavení vzduchu.
Před rekonstituováním může být virus v suché nebo kapalné formě. Virová složka je s výhodou lyofilizována. Lyofilizovaný virus je mnohem stálejší než virus ve vodném roztoku. Lyofilizovaný virus může být vhodně rekonstituován za použití kapalného antacidního prostředku k vytvoření kapalného vakcinačního prostředku. Jinou možností je rekonstituce lyofilizovaného viru vodou nebo vodným roztokem a v takovém případě směs lyofilizovaného viru s výhodou obsahuje antacidní složku.
Vakcinační prostředek s výhodou obsahuje virovou složku, formulovanou s uhličitanem vápenatým a xanthanovou gumou v jedom oddílu nebo nádobě a ta je rekonstituována vodou nebo vodným roztokem, přítomným v druhém oddílu nebo nádobě.
V jiném upřednostňovaném ztělesnění je vakcinační prostředek prostředkem v pevné formě, s výhodou lyofilizátem, který je vhodný pro okamžité rozpuštění po vložení do úst. Lyofilizované prostředky mohou být výhodně poskytovány ve formě tablet v farmaceutickém balení do blistru.
V jiném aspektu vynález poskytuje rotavirovou vakcínu ve formě rychle se rozpouštějící tablety pro orální podání.
·► ·♦ • · · ·* ©* »♦ © © · 9 · « © © * ·
- 16 ·· ··©· • «· ·
V jiném aspektu vynález poskytuje prostředek, obsahující živý oslabený kmen rotaviru, zejména kmen lidského rotaviru, přičemž je tento prostředek iyofilizovanou pevnou látkou, schopnou okamžitého rozpuštění po vložení do úst.
Rychle se rozpouštějící tableta podle vynálezu se v ústech subjektu s výhodou rozpouští dostatečně rychle, aby se předešlo bobtnání nerozpuštěné tablety. Tento přístup je zvláště výhodný pro pediatrické rotavirové vakcíny.
Virem je s výhodou živý oslabený lidský rotavirus, který je formulován s anorganickým antacidem jako je uhličitan vápenatý a s viskozním činidlem, jako je xanthanová guma.
Dalším aspektem předkládaného vynálezu je poskytnutí lyofilizované formy prostředku, kde virovou složkou je jakýkoli kmen rotaviru, který je formulován s uhličitanem vápenatým a s xanthanovou gumou.
Vakcíny podle vynálezu mohou být formulovány a podávány známými technikami, za použití vhodného množství živého viru k poskytnutí účinné ochrany vůči rotavirové infekci bez významných vedlejších účinků v typických vakcínách. Vhodným množstvím živého viru bude obvykle množství mezi 104 a 107 ffu (focus forming units, jednotek, vytvářejících ložisko) na dávku. Typická dávka vakcíny může zahrnovat 105 a 106 ffu na dávku a může se podávat v několika dílčích dávkách během určitého časového období, například ve dvou dílčích dávkách, podávaných ve dvouměsíčním intervalu. Přínosu lze ovšem dosáhnout i rozdělením na více než dvě dávky, například na 3 anebo 4 dávky, zvláště v rozvojových zemích. Intervaly mezi jednotlivými dávkami by měly být přibližně v délce dvou měsíců. Optimální množství • · · ·
- 17 • · »· · · živého viru pro jednu dávku nebo pro vícedávkové uspořádání a optimální načasování dávek může být zjištěno standardními studiemi, které zahrnují sledování titrů protilátek a jiných odpovědí, pozorovaných u subjektů.
Vakcína podle vynálezu může také obsahovat jiné vhodné živé viry pro ochranu vůči jiným onemocněním, například poliovirus. Alternativně mohou být jiné vhodné vakcíny s obsahem živého viru pro orální podávání poskytovány v oddělené dávce, ale při stejné příležitosti jako prostředek rotavirové vakcíny podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Popis pro Obr. 3(a-d)
Séra dvanácti dětí ve stáří 4 až 6 měsíců očkovaných materiálem P33, jak je popsán v článku ve Vaccine (1998), byla testována vzhledem k neutralizaci P33, P38, P43 a 89-12 C2.
Rozmezí neutralizačních titrů všech testovaných sér je stejné pro P33, P38 a pro P43. Statistická analýza neukázala žádný statisticky významný rozdíl v celkových neutralizačních titrech vzhledem ke všem těmto třem virům. To ukazuje, že konformační a nekonformační neutralizační epitopy P33, P38 a P43 jsou stejně dobře rozpoznávány anti-P33 séry kojenců, očkovaných pomocí P33. Toto pozorování nepřímo ukazuje, že neutralizační epitopy, odkryté v tomto stanovení in vitro, se mezi P33, P38 a P43 nelišily.
Rozmezí neutralizačních titrů P89-12 C2 se ovšem od P33, P38 a P43 významně lišilo. Toto pózování ukazuje, že konformační a nekonformační neutralizační epitopy P33, P38 a P43 nejsou stejně
• · • ·
- 18 dobře rozpoznávány anti-P33 séry kojenců, očkovaných pomocí P33. Toto pozorování nepřímo ukazuje, že neutralizační epitopy, odkryté v tomto stanovení in vitro, se lišily mezi 89-12 C2 a P33, P38 a P43.
Následující Příklady ozřejmují vynález.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Prokázání toho, že kmen 89-12 je při pasáži 26 (P26) směsí variant
Sekvenování genů VP4 a VP7 z různých pasážování
Provedeno bylo sekvenování genů VP4 a VP7 z pasáže P26 (primární AGMK buňky), pasáže P33 (zavedená /jako opak primární/ AGMK buněčná linie), pasáže P41 a pasáže P43. Celková extrahovaná DNA byla reversně přepsána a amplifikována (zesílena) v PCR (polymerase Chain reaction, polymerázové reakci řetězce) v jedné zkumavce/1 krok.
Primery (startéry) Rota 5bis a Rota 29bis amplifikovaly celý gen VP4 a primery Rota 1 a Rota 2bis amplifikovaly celý gen VP7. Materiál z PCR byl sekvenován za použití různých primerů (viz Tabulka 1).
Sekvence pasáže P26 se lišila od sekvence pasáže P33 třemi bázemi (v polohách 501, 788 a 802 párů bází od starovacího kodonu) u VP4 a třemi bázemi (v polohách 108, 605 a 897 párů bází od starovacího kodonu) u VP7.
- 19 • · · · · • » • · · ·
Zobrazení (skeny) pasáže P26 genů VP4 a VP7 ukazují ve zmutovaných polohách přítomnost sekvence pasáže P33 jako základu. Z toho je zřejmé, že pasáž P26 je směsí alespoň dvou variant.
Zobrazení (skeny) pasáže P33 vyhlížejí homogenně pro VP4 a heterogenně pro VP7 (viz Tabulka 2).
Pasáž P38 (odvozená od pasáže 33) byla pětinásobně pasážována na buňkách Věro a vykázala stejný soubor sekvencí VP4 a VP7 jako pasáž P33 (buněčná linie AGMK). Mezi P33 a P38 tedy nebyly žádné větší změny v populacích.
Tabulka 1: Oligonukleotidy, použité pro RT-PCR a sekvenování
název sekvence poloha
VP7 Rota 1 GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG -49 až -2z
Rota Ibis G -16 až 10
Rota 2bis GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A 1014-988
Rota 7 GGT CAC ATC GGA CAA TTC TAA TCT AAG 266-287
Rota 12 CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 372-394
Rota 46 TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT 651-682
Rota 18 AGT GG CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC 682-651
- 20 • ·
VP4 Rota 5 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A 2-23
Rota 6 ATT TCG GACCAT TTA TAA CC 878-859
Rota 5bis TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A 2-23
Rota 6bis ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG 878-856
Rota 25 GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG 268-296
Rota 26 CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC 296-268
Rota 27bis TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G 721-745
Rota 28 TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG 753-727
Rota 31 GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G 1048-1070
Rota 32 CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C 1070-1048
Rota 45 TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG 1205-1227
Rota 53 CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA 1227-1205
Rota 54 GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA 1465-1487
Rota 55 TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC 1487-1465
Rota 40 CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G 1703-1727
Rota 39 CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G 1727-1703
Rota 33 CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G 2008-2032
Rota 34 CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G 2032-2008
Rota 29bis AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G 2335-2311
- 21 • · · · · ·
Tabulka 2: oligonukleotidy, použité v hybridizaci
název sekvence poloha
VP7 Rota 41 AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA TC 882-913
Rota 42 AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC 882-913
VP4 Rota 15 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783
Rota 16 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783
Rota 35 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783
Rota 36 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783
Báze, napsané tučným písmem v Tabulce 2, jsou místy specifických sekvenčních variant ve VP4 a VP7.
Tabulka 3: sekvenční varianty genů VP4 a VP7 3.1
VP4 VP7
501 pb 167 ak 788 pb 263 ak 802 pb 268 ak 108 pb 36 ak 605 pb 202 ak 897 pb 299 ak
P26 (AGMK) A G/A G/A A C/T A
P33 (AGMK) T A A G/A T/C A/G
P38 (VĚRO) T A A A/G T G/A
P43 (VĚRO) T A A A T A
pb = páry bází ak = aminokyseliny
- 22 • · · · • · • · · ·
Ve druhém klonu ze tří klonů, které byly rozvinuty na úroveň produkce, je nukleotid v poloze 897 pb na VP7 spíše G než A, jako ve zvoleném klonu P43. Výsledkem je v sekvenci aminokyselin přítomnost methioninu na místě isoleucinu. Varianty, odpovídající oběma zvoleným klonům, klonu P43 a klonu, majícímu G v genu VP7 v poloze 897 pb od startovacího kodonu, byly vylučovány stolicí kojenců, kteří byli před tím očkováni materiálem P33.
V Tabulce 3.1, kde jsou v určité poloze uvedeny dvě alternativní báze, představuje první z nich bázi, která se objevuje v hlavní populaci a druhou je báze, která se objevuje u menší části populace. Varianty hlavní populace a menší populace jsou posuzovány podle síly signálu při sekvenování.
Tabulka 3.2
VP4 VP7
501 pb 167 ak 788 pb 263 ak 802 pb 268 ak 108 pb 36 ak 605 pb 202 ak 897 pb 299 ak
P26 (AGMK) Leu Gly/Glu Gly/Arg Arg Thr/Met lle
P33 (AGMK) Phe Glu Arg Arg/Arg Met/Thr Ile/Met
P38 (VĚRO) Phe Glu Arg Arg/Arg Met Met/lle
P43 (VĚRO) Phe Glu Arg Arg Met lle
Tabulka 3.2 znázorňuje změny v aminokyselinách, vyplývající z odlišností nukleotidů mezi variantami.
• · ··
- 23 Tabulka 4
VP4 (polohy 788 - 802) VP7 (poloha 897)
G - G A - A A - G G - A A G
sondy Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42
pasáže
P26 - + + + nedefin. nedefin.
P33 - + - - ++ +
P38 - + - - + ++
P43 - + - - + -
Hvbridizace typu slot blot
Změny v populacích mezi pasážemi P26 až P33 v buňkách AGMK byly dále potvrzeny hybridizací typu slot blot. Genové fragmenty VP4 a VP7, vytvořené pomocí RT/PCR, byly hybridizovány oligonukleotidovými sondami, specifickými pro každou variantu (viz Tabulky 3.1 a 3.2). Na rozdíl od pasáže P26, která hybridizovala s Rota 16, Rota 35 a Rota 36 a nikoli s Rota 15, fragment VP4 z PCR materiálu P33 hybridizoval v polohách 788 a 802 pouze s Rota 16 a nikoli buď s Rota 15, nebo s Rota 35 či s Rota 36. Tyto výsledky prokázaly přítomnost alespoň 3 variant v P26 (viz Tabulka 4).
U fragmentu VP7 z PCR materiálu P33 byla poloha 897 hybridizována pomocí Rota 41 a Rota 42. Tyto výsledky potvrdily přítomnost alespoň dvou variant v materiálu P33.
Příklad 2: Isolace a charakterizace klonu P43
K isolování složek P33 jako homogenní virové populace byla provedena 3 zředění do koncového bodu (end-point dilution) P33/AGMK v buňkách Věro a výsledný virus byl použit k infikování buněk Věro.
·· ·· ·· >>
- 24 Positivní jamky byly vybrány za použití dvou kriterií: růstu prokázaného nejvyšším počtem ložisek, objevených v jamkách a nejisolovanějších positivních jamek na destičkách, jak se provádí klasicky. Po třech pasážích zředěním do koncového bodu v devadesátišesti jamkových mikrotitračních destičkách bylo deset positivních jamek postupně amplifikováno (zesíleno) na buňkách Věro a byl vyhodnocen jejich výtěžek.
Na základě výtěžku byly tři klony rozvinuty na pasážovací úroveň produkčního množství. Imunitní rozpoznání polyklonálními protilátkami bylo prokázáno jako podobné jak mezi těmito třemi klony, tak i mezi klony a P33. Homogennost klonů byla stanovena hybridizací typu slot blot. Konečný výběr jediného kmene byl založen na posouzení výtěžku a sekvence.
Vybraný klon byl amplifikován (zesílen) následnými pasážemi v buňkách Věro k vytvoření matečného či kmenového zaočkování (Master seed), pracovního zaočkování (Working seed) a konečně produkčních množství (dávek).
Zvolený klon byl geneticky charakterizován na různých úrovních pasážování sekvenováním VP4 a VP7 (identita) a specifickou hybridizací typu slot blot VP4 a VP7 materiálů, amplifikovaných PCR (homogennost). Sekvence genů VP4 a VP7 materiálu P43 jsou uvedeny na obr. 1 a Obr. 2 a jsou identické s P41.
Homogennost vybraného kmene byla určena selektivní hybridizací za použití oligonukleotidových sond, rozlišujících nukleotidové změny v oblastech VP4 a/nebo VP7 pro každou variantu, identifikovanou během sekvenování P26/primárních AGMK (viz Tabulka 4).
- 25 4 · • 4 · 4
Fragment VP4 byl hybridizován účinkem Rota 16 a nebyl
hybridizován účinkem Rota 15, Rota 35 či Rota 36.
Fragment VP4 byl hybridizován účinkem Rota 41 a nebyl
hybridizován účinkem Rota 42.
Tyto výsledky potvrzují, že P43 je homogenní populace.
Příklad 3: Odstranění případného vedlejšího nahodilého viru
Κ P33 (zralé AGMK) byl přidáván ether do konečné 20% koncentrace po dobu 1 hodiny. Poté byl pomocí N2 vybubláván ven po dobu 35 minut. Na titr P33 nebyl pozorován žádný dopad.
Příklad 4: Formulování živé oslabené vakcíny
Produkční množství, popsaná výše, jsou formulována pro orální podávání kojencům následující metodou.
1. Lyofilizovaný virus
Pro přípravu virových dávek se používají standardní techniky.
Zamražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí se vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem Eagle, 6 2 na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě 10 ’ ffu/ml. Naředěný virus se poté dále zředí lyofilizačním stabilizátorem (4% sacharóza, 8% dextran, 6% sorbitol a 4% aminokyselina) až na cílový titr viru, v tomto případě na 105,6 ffu/dávku. Alikvotní množství stabilizovaného virového prostředku o objemu 0,5 ml se asepticky přenesou do lahviček o objemu 3 ml. Každá lahvička se částečně uzavře gumovou zátkou, vzorek se lyofilizuje ve vakuu a poté se • · » · ♦ * *
- 26 lahvička zcela uzavře a kolem její vrchní části se upevní hliníková čepička, držící zátku na svém místě.
Pro použití se virus rekonstituuje za použití následných antacidních rekonstituentů:
(a) citrátový rekonstituent
Citát sodný se rozpustí ve vodě, sterilizuje se filtrací a asepticky se převede do zásobníků v množství 1,5 ml a koncentraci 544 mg dihydrátu citrátu trojsodného na dávku 1,5 ml. Zásobníky na rekonstituent mohou být například lahvičky o objemu 3 ml, nebo 4 ml, nebo injekční stříkačky o objemu 2 ml, nebo měkké plastové vymáčknutelné tobolky pro orální podávání. Jinou možností, jak udržet sterilní složky ve sterilních podmínkách, je konečné autoklávování zásobníku.
(b) rekonstituent AI(OH)3
Aseptická suspenze hydroxidu hlinitého (Mylanta, zaps. značka) se asepticky naředí sterilní vodou, asepticky se v množství po 2 mí přenese do zásobníků rekonstituentu (například do injekčních stříkaček o objemu 2 ml, nebo do měkkých plastových vymáčknutelných tobolek), z nichž každý obsahuje 48 mg AI(OH)3. Jinou možností, jak udržet sterilní složky ve sterilních podmínkách, je ozářit sespenzi hydroxidu hlinitého γ-zářením (s výhodou v naředěném stavu).
K prevenci usazování suspenze se začleňují standardní přísady. Takové standardní přísady zahrnují například stearát hořečnatý, karboxymethylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu a silikonové polymery. Začleněna mohou být i bakteriostatická
činidla, například butylparaben, propylparaben nebo jiná standardní bakteriostatická činidla, používaná v potravinách a příchutě.
2. Lyofilizovaný virus s ΑΙ(ΟΗ)., v kapalném prostředku
Pro přípravu dávek viru se používají standardní techniky. Zmražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem Eagle, na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě 106,2 ffu/ml. Přidá se suspenze hydroxidu hlinitého k dosažení konečného množství 48 mg/dávku a virový prostředek se naředí lyofilizačním stabilizátorem (4% sacharóza, 8% dextran, 6% sorbitol a 4% aminokyselina) až na cílový titr viru, v tomto případě na 105,6 ffu/dávku. Alikvotní množství stabilizovaného virového prostředku o objemu 0,5 ml se asepticky přenesou do lahviček o objemu 3 ml. Lyofilizace a uzavření lahviček se pak provádí stejným způsobem, jaký je popsán v části 1.
3. Lyofilizovaný virus s AKQHK pro balení do blistrů
Pro přípravu dávek viru se používají standardní techniky. Zmražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem Eagle, na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě 106,2 ffu/ml. Přidá se suspenze hydroxidu hlinitého k dosažení konečného množství 48 mg/dávku a virový prostředek se naředí lyofilizačním stabilizátorem, kterým může být sacharóza, dextran nebo aminokyselina v množství 4 %, nebo želatina či rostlinný pepton, anebo xanthan až na cílový titr viru, v tomto případě na 105,6 ffu/dávku. K převodu dávek o objemu 0,5 ml nebo s výhodou menším do prohlubní v blistru se používá aseptického plnění. Prostředek se lyofilizuje a prohlubně blistru se uzavřou tepelným zapečetěním.
» 9
K prevenci usazování suspenze hydroxidu hlinitého se volitelně začleňují standardní přísady. Takové standardní přísady zahrnují například stearát hořečnatý, karboxymethylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu a silikonové polymery. Začleněny mohou být i příchutě.
Příklad 5: Virová titrace rotaviru pro různé prostředky
5.1: Srovnání prostředků na základě laktózv a na základě sacharózv
číslo šarže složení prostředku virový titr před lyofiiizací virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37°C
98G06/01 laktóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 105’22 104'67
98G06/03 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 105,28 104’92
Rotavirus P43 byl formulován buď se sacharózou nebo s laktózou, jak je znázorněno ve výše uvedené tabulce. Titace viru před lyofiiizací je virový titr v kompletní formulované tekutině (obsahující sacharózu, dextran, sorbitol a aminokyseliny), nepodrobené kroku lyofilizace.
Dobré výsledky jsou takové, v nichž je dosaženo < 0,5 log snížení v kroku lyofilizace a < 0,5 log snížení během 1 týdne při 37°C (urychlený test stability).
• ·
- 29 • · · · • · · ·
Přesnost virové titrace je kolem ± 0,2 log.
Výsledky ukazují, že lze použít sacharózu namísto laktózy.
5.2. Účinek argininu a náhrada sorbitolu manitolem:
číslo šarže složení prostředku virový titr v t=0 po lyofilizaci virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37°C
98L16/01 laktóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104’8 104’8
98L16/02 laktóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % arginin: 3 % 104’8 104,9
98L16/04 laktóza: 2% dextran: 4 % manitol: 3% aminokyseliny: 2 % arginin: 3 % 104’7 105
Výsledky ukazují, že přídavek argininu (o němž je známo, že zlepšuje stálost viru během lyofilizace a rovněž poskytuje zásadité prostředí ke kompenzaci kyselosti žaludku) udržuje virový titr.
Sorbitol má sklon příliš značně snižovat teplotu sklovatění lyofilizovaného koláče. To lze překonat použitím manitolu namísto sorbitolu, jak je ukázáno výše a virový titr je zachováván.
• *
- 30 5.3. Různá složení prostředku
Tento pokus prokazuje, že lze vytvořit větší množství prostředků.
číslo šarže složení prostředku virový titr před lyofilizací virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37°C
99C11/01 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 105’24 1O5·07
99C11/02 sacharóza: 2% dextran: 4 % manitol: 3% aminokyseliny: 2 % 1O5’09 104'92
99C11/04 dextran: 4 % manitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104'89 1O5'06
číslo šarže složení prostředku virový titr v t=0 po lyofilizací virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37°C
98C17/01 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 105’40 105’41
98C17/02 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 1,5% aminokyseliny: 2 % arginin: 3 % 105’30 104'93
98C17/03 sacharóza: 2% dextran: 4 % aminokyseliny: 2 % 105’31 105’24
31 - .; .·· ·♦ ·· ·· . · · «... ... · · · · · · ·., ... •··· ·· ···· »· , ,,
98C17/04 sacharóza: 2% dextran: 4 % manitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104’42 104'45
98C17/05 sacharóza: 2% dextra n: 4 % manitol: 1,5% aminokyseliny: 2 % 104'39 1O4’40
98C17/06 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % 105’44 104’97
98C17/07 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 1,5% 105'11 104’89
5.4. Spojení mezi rotavirem a antacidem ΑΚΟΗ)-,
rotavirus AI(OH)3 H2O doba styku při tepl. místnosti odstředění titr vir. supernatantu (ffu/ml) vir. ti peletu (ffu/ml
105·6 ffu/ml 48 mg v 0,24 ml 0,76 ml 30 minut 8000 rpm* 10 minut 103'66
105'6 ffu/ml 48 mg v 0,24 ml 0,76 ml 30 minut 8000 rpm 10 minut 104’41
105’6 ffu/ml 1 ml 30 minut 8000 rpm 10 minut 105’68
v lyofiliz. koláči 12 mg v 0,12 ml 1,38 ml 30 minut 8000 rpm 10 minut pod hranicí detekce 104’47
rpm = otáčky za minutu
• ·
- 32 • · • · · ·
AI(OH)3 se používá jako antacidum. Výsledky ukazují, že rotavirus je asociován (spojen) s nerozpustnou anorganickou solí /AI(OH)3/ od doby, kdy je společně s AI(OH)3 odstřeďován (snížení virové aktivity v supernatantu).
5.5. Rozředění antacida ΑΚΟΗ), citrátem sodným před titrací viru
vzorky viru naředění podmínky virové titry (ffu/ml)
99B10/06 kapalný prostředek před lyofilizaci; 105,43 1,5 ml citrátu trojsodného 24 hodin při teplotě místnosti 105’11
99B10/06 lyofilizovaný 105'43 1,5 ml citrátu trojsodného 24 hodin při teplotě místnosti 104’53
Pokud je rotavirus asociován s AI(OH)3, je možné lyofilizovat vše (včetně AI(OH)3. Po lyofilizaci je možné zpětně získat rotavirus naředěním AI(OH)3 citrátem sodným. Tento krok rotavirus nepoškozuje a udržuje jeho aktivitu po tomto kroku naředění.
5.6. Infekčnost rotaviru po uvolnění spojení mezi AI(OH), a rotavirem
Mechanismus uvolnění viru (naředěním nosiče) může velmi dobře nastat i v podmínkách in vivo. Ve skutečnosti se při pH o hodnotě nižší než 6 stává AI(OH)3 zcela rozpustným a rotavirus tak může být uvolněn do žaludku.
AI(OH)3 + 3H+-Al+++ (vodou rozpustný) + 3 H2O
V žaludku se ionty trojmocného hliníku neabsorbují (J. J. Powell, R. Jugdaohsingh a R. P. H. Thompson, The Regulation of minerál
- 33 adsorption in the gastrointestinal tract, Proceedings of the Nutrition Society 58, 147-153, 1999).
V tenkém střevu se, vzhledem ke vzrůstu pH, nerozpustné formy hliníku vysrážejí /Ai(OH)3 nebo AIPO4/ a eliminují se přirozeným způsobem.
Není známo, jestli bude nově vzniklá sraženina AI(OH)3 (nebo AIPO4) schopna reasociace (opětovného spojení) s rotavirem. To vyvolává otázku účinnosti samotného spojení AI(OH)3 - rotavirus.
Možné je rovněž uvolnění rotaviru se spojení AI(OH)3 - rotavirus jinými mechanismy. Například lysin zasahuje do adsorpce viru na AI(OH)3. Specifická adsorpce na hydroxid hlinitý je známa i u jiných aniontů, jako je boritanový, síranový, uhličitanový a fosforečný aniont a tedy teoreticky by mělo být možné uvolnit (kompeticí o adsorpční místo) rotavirus ze spojení AI(OH)3 - rotavirus.
DRVC003A46 mg AI(OH)3 v 0,120 ml mg lysinu 1,280 ml H2O minut při tepl. místnosti odstředění
000 ot/min, 10 minut
kulot supernatant naředění citrátem pod hranicí detekce
3,8
- 34 • · » · ·
Rotavirus tedy může být ze spojení AI(OH)3 - rotavirus uvolněn a uvolněný rotavirus zůstává aktivní.
Toto uvolnění může být provedeno buď naředěním AI(OH)3 (HCI v žaludku nebo in vitro pomocí trojsodného citrátu), nebo nahražením rotaviru zásaditou aminokyselinou (lysinem).
5.7. Infekčnost spojení Al(QH)a- rotavirus
Jedna dávka lyofilizovaného rotaviru byla rekonstituována vodou a rozdělena do dvou částí. K první části, považované za srovnávací, byl přidán ještě jeden objem vody. Ke druhé části bylo přidáno 24 mg AI(OH)3, suspendovaného v 0,240 ml vody (preklinická titrace viru).
DRVC003A46
1,5ml H2O
0,750 ml 0,750 ml
+ +
0,240 ml 24 mg
H2O AI(OH)3 v 0,240 ml
1 hodina 1 hodina
5,55 6,22
Pokud je AI(OH)3 přítomen, rotavirus je aktivní a hodnota virové titrace je ve srovnání se srovnávacím vzorkem vyšší.
Tento pokus byl opakován bez rozdělení lyofilizované dávky, přidáním 12 mg AI(OH)3nebo 24 mg AI(OH)3.
Zde byl srovnávacím vzorkem jeden ze vzorků, rekonstituovaný
citrátovo-hydrogenuhličitanovým pufrem. Virový titr je tedy opět vyšší v přítomnosti AI(OH)3.
DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46
+ + +
1,5 ml WL pufru 12 mg AI(OH)3 24 mg AI(OH)3
v 0,120 ml v 0,240 ml
+ +
1,380 ml H2O 1,260 ml H2O
5,34 6,24 6,05
5,32 5,95 6,26
Stejně jako ve výše uvedeném příkladu se rotavirus spojuje (asociuje) s částicemi AI(OH)3 , neboť virus lze oddělit odstředěním. DRVC003A46 je lyofilizovaný formulovaný rotavirus (sacharóza 2 %, dextran 4 %, sorbitol 3 %, aminokyseliny 2 %).
DRVC003A46 DRVC003A46
+ +
12 mg AI(OH)3 24 mg AI(OH)3
v 0,120 ml v 0,240 ml
+ +
1,380 ml H2O 1,260 ml H2O
+ +
odstředění odstředění
8 000 ot./min 8 000 ot./min
10 minut 10 minut
kulot supernatant kulot supernatant
+ +
1,5 ml 1,5 ml
SDSAA SDSAA
5,78 <1,44 5,92 <1,44
5,96 <1,44 6,11 <1,44
- 36 SDSAA = 2% sacharóza, 4% dextran, 3% sorbitol, 2% aminokyseliny
Podle virové titrace prováděné v supernatantu se zdá, že množství AI(OH)3, potřebné k adsorbování rotaviru, je malé (počínaje jednou lyofilizovanou dávkou 5,7 log) za zvyšování virové titrace:
AI(OH)3 adsorpční doba titr v supernatantu
12 mg 1 hodina při tepl. místnosti 2,7
24 mg 1 hodina při tepl. místnosti 3,4
48 mg 1 hodina při tepl. místnosti 3,4
72 mg 1 hodina při tepl. místnosti 2,0
96 mg 1 hodina při tepl. místnosti pod hranicí detekce
12 mg přes noc 2,7
24 mg přes noc pod hranicí detekce
48 mg přes noc 2,5
12 mg okamžitě pod hranicí detekce
24 mg okamžitě 2,0
48 mg okamžitě pod hranicí detekce
Doba, potřebná k adsorbci rotaviru na AI(OH)3 se zdá být krátká.
Jedna dávka lyofilizovaného rotaviru byla rekonstituována v přítomnosti 24 mg AI(OH)3 a odstředěna po 0, 15, 60 minutách a po 24 hodinách. Kulot byl resuspendován v SDSAA před titrací viru:
- 37 • · · ·
doba kulot supernatant
0 min 5,26 3,17
15 min 5,34 < 1,44
60 min 5,96 < 1,44
24 hod 6,13 < 1,44
5.8. Použití CaCOo jako antacidu
K vylouční přítomnosti hliníku z vakcíny byl antacid AI(OH)3 nahražen jinou nerozpustnou anorganickou solí: uhličitanem vápenatým CaCO3.~
Jevy, pozorované za přítomnosti CaCO3 jsou obdobné jevům, popsaným za použití AI(OH)3:
- asociace (spojení) rotaviru s anorganickou solí;
- udržení aktivity rotaviru při jeho asociaci s anorganickou solí;
- možnost uvolnění rotaviru z asociace rozpuštěním anorganické zásady kyselinou;
- možnost společné lyofilizace antacidu a rotaviru.
Asociace CaCO3 a rotaviru
V prvním zkušebním vzorku byl lyofilizovaný rotavirus (virový titr 5,7) rekonstituován suspenzí CaCO3 ve vodě (50 mg v 1,5 ml); poté byl odstředěn a virový titr supernatantu byl srovnán s kulotem.
- 38 DRVC003A46 mg CaCO3 v 1,5 ml H2O
DRVC003A46 +
mg CaCO3 v 1,5 ml H2O +
odstředění 8 000 ot./min 10 minut
XX kulot supernatant +
1,5 ml
SDSAA odstředění 8 000 ot./min 10 minut
5,83 4,46
Tyto výsledky ukazují, CaCO3.
kulot supernatant +
1,5 ml citrátu sodného
5,88 4,33 více než 90 % rotaviru je asociováno s
Rovněž po asociaci viru bylo možné uskutečnit titraci a znovu získat původní množství viru.
Také virové titry byly poněkud vyšší než titry, získané bez přítomnosti CaCO3.
DRVC003A46 +
1,5 ml H2O + odstředění 8000 ot./min 10 minut
DRVC003A46 +
1,5 ml pufru W.L kulot supernatant
4,99
5,03
5,35
- 39 * ·
Množství CaCO3 a asociace rotaviru
Lyofilizovaný rotavirus byl rekonstituován suspenzí CaCO3 ve vodě (1,5 ml):
mg 50 mg
100 mg a poté odstředěn; virový titr supernatantu byl srovnán s kulotem.
CaCO3 přípr. dle popisu a odstředění 1 hodina + odstředění
kuloty supernatant kuloty supernatant
100 mg 4,57 3,01 4,79 3,09
50 mg 4,17 4,15 4,22 3,86
10 mg 3,17 4,77 3,87 4,87
Je zřejmé, že s rostoucím množstvím CaCO3 se asociuje více viru a méně se nalézá v supernatantu. Ovšem plná dávka není zcela získána (očekávané množství přinejmenším 5,3 nebo dokonce 5,8 jak bylo získáno dříve - viz výše).
Ochrana rotaviru pomocí CaCO3 během titrace antacidu typu mini Rossett-Rice
Za použití deseti dávek lyofilizovaného rotaviru (DRVC003A46) a 50 mg CaCO3 byly provedeny dva typy titrace mini Rossett-Rice:
V klasické titraci Rossett-Rice se antacid smísí s rotavirem a do tohoto média se vlije HCI.
V inversní mini titraci Rossett-Rice je situace opačná: antacid se přikapává do zásobní HCI (jak k tomu dochází in vivo).
- 40 • * · ·· • · · t ® « (k
klasická mini titrace Rossett-Rice
lyofiliz. Rota, skladování při: pufr teoretický virový titr naměřený virový titr
4°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
-80°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
4°C 24 mg AI(OH)3 5,4 < 2,9
-80°C 24 mg AI(OH)3 5,4 < 2,9
inversní mini titrace Rossett-Rice
lyofiliz. Rota, skladování při: pufr teoretický virový titr naměřený virový titr
4°C 60 mg CaCO 3 5,3 4,6
-80°C 60 mg CaCO3 5,3 4,6
4°C 24 mg AI(OH)3 5,4 < 2,9
-80°C 24 mg AI(OH)3 5,4 < 2,9
V tomto pokusu v uspořádání in vivo je tedy uhličitan vápenatý schopný chránit přibližně 20 % rotaviru před přítomností HCI, zatímco hydroxid hlinitý toho schopen není.
5.9: Lyofilizace rotaviru v přítomnosti antacidu CaCO3:
číslo šarže složení prostředku virový titr v t=0 po lyofilizaci virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37°C
99K08/01 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % CaCO3: 50 mg 105,28 1O5’10
99K08/02 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg 105·16 105'15
00C24/01 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,3 % 1O5'07 104’69
00C24/03 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,3% 1O5'07 104’85
00E09/25 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,25 % 1Q5,03 104,91
00E09/30 sacharóza: 2% dextra n: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,3% 105·01 104’87
00F26/06 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg škrob: 2 % 104'50 1O4·70
Zde se jedná o uspořádání vše v jednom - lyofilizace rotaviru a antacidu CaCO3 společně v jedné lahvičce. K prevenci usazování CaCO3 během kroku plnění jsou potřeba viskozní činidla. Příklady takových viskozních činidel zahrnují xanthanovou gumu a škrob. Aktivita rotaviru je uchovávána i v přítomnosti xanthanové gumy a škrobu.
5.10. Lyofilizované tablety pro rychlý rozpad po vložení do úst:
Následující prostředky dokládají koncept lyoc, což je rychlé rozpuštění lyofilizovaného koláče v ústech.
č. šarže složení prostředku virový titr před lyofilizací virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37°C
99B10/06 sacharóza: 4% glutamát Na: 3,7 % AI(OH)3 : 48 mg 105’11 104'53
99C11/12 maltitol: 3% AI(OH)3 : 48 mg hydroxy propylmethyl celulóza: 1 % 104’16 103'79
- 43 • · ·· · · ·· • · · · · ·
číslo šarže složení prostředku virový titr v t=0 po lyofilizaci virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37°C
00C24/05 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,3 % 1O5’02 104’54
00C24/06 sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO3: 60 mg xanthan: 0,3 % 104'86 104'56
00F26/11 sacharóza: 1% dextran: 2 % sorbitol: 1,5 % aminokyseliny: 1 % CaCO3: 60 mg škrob: 2 % 1O4’70 1O4'40
V konceptu lyoc je možné použít jak škrob, tak i xanthanovou gumu (za udržení rychlého rozpouštění lyofilizovaného koláče).
Příklad 6: Použití uhličitanu vápenatého jako antacida pro rotavirový vakcinační prostředek
Pokud se jako antacidum pro rotavirus použije suspenze CaCO3 ve vodě, objevuje se problém, že částice uhličitanu vápenatého se ve vodě rychleji usazují, neboť hodnota hustoty prášku se blíží 2,6 a průměrná velikost částic činí 30 pm.
- 44 • · • · · ·
Toto usazování lze zpomalit:
1. Zvýšením hustoty okolního média.
2. Zvýšením viskozity okolního média.
3. Snížením velikosti částic.
4. udržováním částic odděleně od sebe navzájem.
6.1, Zvýšení hustoty okolního média
Pokud se na lyofilizovaný koláč (obsahující 2% sacharózu, 4% dextran, 3% sorbitol a 2% aminokyseliny) nanese suspenze CaCO3 ve vodě (umístěná v injekční stříkačce), zvýší se hustota okolního média, ovšem rychlost usazování CaCO3 se příliš neliší od suspenze CaCO3 ve vodě.
6.2, Zvýšení viskozity okolního média
Pseudoplastické pomocné látky
Pseudoplastický roztok je definován jako roztok, mající vyšší viskozitu při stání než viskozitu při protřepávání.
Obvyklými pomocnými látkami tohoto typu jsou:
- přírodní polymery, například:
arabská guma adragantová guma agar algináty pektiny
- polosyntetické polymery, například:
karboxymethylcelulóza (Tyloses C®) methylcelulóza (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose
MH® a MB®) • · hydroxypropylcelulóza (Klucels®) hydroxypropylmethylcelulóza (Methocels E® a K®, Viscotrans MPH®)
Obecně se tyto pseudoplastické pomocné látky používají společně s tixotropními činidly.
Pseudoplastické pomocné látky s nízkou kapacitou tekutosti
Takové polymery, v dostatečné koncentraci, umožňují vznik uspořádání strukturované tekutiny, výsledkem čehož je roztok o vysoké viskozitě, mající při stání nízkou kapacitu tekutosti. K umožnění toku a převádění je pak potřeba vynaložit určité množství energie.
K dočasnému zrušení uspořádání strukturované tekutiny pro získání tekutého roztoku jsou potřebné vnější energie (protřepávání).
Příklady takových polymerů jsou látky Carbopols® a xanthanová guma.
Tixotropní pomocné látky
S těmito pomocnými látkami se stáním získá gelová struktura, zatímco při protřepávání se získá tekutý roztok.
Příklady tixotropních pomocných látek jsou: Veegum® (křemičitan hořečnato-hlinitý) a Avicel RC® (přibližně 89 % mikrokrystalické celulózy a 11 % sodné karboxymethylcelulózy).
6.3, Snížení velikosti částic
Výsledkem snížení velikosti částic CaCO3 je snížení antacidní kapacity sloučeniny.
- 46 • · · · • · · *
6.4, Udržování částic odděleně od sebe navzájem
To je případ látek Veegum® a Avicel®, u nichž jsou nerozpustné částice (přibližně o rozměru 1 mm), menší než částice CaCO3 , umístěny mezi částice CaCO3 k prevenci agregace (vytváření sraženin).
Příklad 7: Vzhled výrobku
Následující schémata dokládají příklady možných vzhledů výrobku
7,1, CaCOn v injekční stříkačce
Poté, co byly klinické šarže rotaviru umístěny do lyofilizovaných lahviček, lze antacid umístit do kapalného rekonstituentu, obsaženého v injekčních stříkačkách.
inj. stříkačka
Is 1,3 ml
CaCO3 (60 mg x ml1) jehla
lyofilizovaný rotavirus
U tohoto předkládání produktu musí být usazování CaCO3 pod kontrolou nejen během kroků plnění, ale i během celé doby skladování produktu (alespoň 2 roky).
7.2. CaCO; v Ivofilizované lahvičce • *
-47 inj.stříkačka s 1,3 ml vody jehla
lyofilizované lahvička rotavirus +
CaCO3 (60 mg) xanthan
7.3. Lvofilizace v blistru
V tomto případě se rotavirus, CaCO3 a xanthanová guma lyofilizují společně přímo v blistru.
Příklad 8:
Lyofilizace různých kmenů rotaviru
č.šarže kmen rotaviru složení prostředku virový titr v t=0 po lyofilizaci virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37°C
00F26/01 G1 SB vyčišť.č. 61 PRO/0232 sacharóza: 2% dextra n: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104,6 104J
OOF26/02 G2 (DS-1) sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % 104’4 104’4
00F26/03 G3(P) sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104·6 104’5
00F26/04 G4 (VA-70) sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104'8 104’8
00F26/05 G9 (W161) sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % 104’6 104'5
Kmeny DS-1, P a VA70 jsou popsány jako srovnávací kmeny lidského rotaviru pro sérotyp G2, G3 a G4 na straně 1361 ve Fields, Raven Press 1990, druhé vydání.
V tomto pokusu byly lyofilizovány různé kmeny rotaviru.
Bylo ukázáno, že u všech šarží byly jak virový titr, tak i stálost za urychlených podmínek (1 týden při 37°C) během lyofilizace udržovány.
Příklad 9: Fáze I bezpečnostní studie orálního podání jedné dávky rotavirové vakcíny u dospělých
Fáze I této studie byla prováděna ke stanovení bezpečnosti a reaktivnosti jedné orálně podávané dávky 106,° ffu vakcíny P43 zdravým dospělým lidem ve věku 18 až 45 let.
Klinický test byl dvojitě slepý a randomizovaný (na základě náhodnosti). Byl kontrolován placebem a samostatný. Studie byla prováděna v jediném centru v Belgii.
- 49 • · · · • · · ·· ····
Studovaná populace
Přihlášeno bylo celkem 33 subjektů, 11 ve skupině dostávající placebo a 22 ve skupině, dostávající vakcínu a všichni studii dokončili. Veškeří dobrovolníci byli běloši. Jejich průměrný věk v době vakcinace byl 35,3 roky, v rozmezí od 18 do 44 let. Test započal v lednu a probíhal po dobu právě jednoho měsíce.
Materiál
Vakcína
Vyrobena byla klinická mmnožství vakcíny P43, která byla vyčištěna, formulována a lyfilizována podle zásad Správné výrobní praxe (Good Manufacturing Practices). Množství byla podrobena Kvalitativní kontrole a získala Záruku kvality. Každá lahvička vakcíny obsahovala následující složky:
aktivní přísada:
kmen P43 minimálně 105,8ffu pomocné látky, stabilizátory:
sacharóza 9 mg dextran 18 mg sorbitol 13,5 mg aminokyseliny 9 mg placebo
Vyrobeny a poskytnuty byly lahvičky s obsahem placeba, přičemž každá z nich obsahovala následující složky:
- 50 pomocné látky, stabilizátory:
sacharóza 9 mg dextran 18 mg sorbitol 13,5 mg aminokyseliny 9 mg
Ředidlo
Jako ředidlo k rekonstituování vakcíny a placeba byla použita voda pro injekce.
Podávání
Přibližně 10 až 15 minut před podáním vakcíny nebo placeba dostaly subjekty v obou skupinách orálně 10 ml přípravku Mylanta®. Mylanta® je zapsaný (registrovaný) antacid. Antacid zvyšuje pH v žaludku a předchází inaktivaci rotaviru během jeho průchodu žaludkem.
K přípravě vakcíny byly dvě lahvičky lyofilizovaného P43, obsahující 105,8 ffu na lahvičku, rekonstituovány 1,5 ml ředící vody pro injekce. Tím bylo dosaženo vypočítaného virového titru 106,1 ffu na dávku. Rekonstituovaná vakcína byla ihned podávána v jedné orální dávce.
K přípravě placeba byly dvě lahvičky lyofilizovaného placeba rekonstituovány 1,5 ml vodou pro injekce a podávány orálně jako jedna dávka.
Bezpečnost a reaktivita
Použita byla následující kritéria bezpečnosti a reaktivnosti:
• · • · • ·
- 51 - Obecnými navozenými příznaky byly horečka, průjem, zvracení, nevolnost, bolesti břicha a ztráta chuti k jídlu. Byly zaznamenávány během osmi dnů po podání.
- Nenavozené příznaky byly zaznamenávány během 30 dnů po podání.
- Vážné vedlejší účinky byly zaznamenávány během celého období průběhu studie.
- Vzorky průjmu bylo třeba shromažďovat osmi dnů po podání.
Výsledky byly následující:
Během jednotlivých sledovaných období nebyly zaznamenány žádné navozené příznaky, žádné nenavozené příznaky ani žádné vážné vedlejší účinky.
Nebyly zaznamenány žádné případy průjmu.
Závěry:
Vakcína SB Bioiogicals P43 byla bezpečná ve srovnání s placebem při podání orální cestou ve dvojitě slepém uspořádání v podobě jedné dávky a v dávce 106,1 ffu zdravým dospělým dobrovolníkům ve věku 18 až 44 let.
Zastupuje:

Claims (38)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Oslabená populace rotaviru, vyznačující se tím, že zahrnuje jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu, přičemž uvedená varianta je definována nukleotidovou sekvencí, kódující alespoň jednu z hlavních virových bílkovin, označovanou jako VP4 a VP7.
  2. 2. Populace rotaviru podle nároku 1,vyznačující se tím, že je klonovaným kmenem.
  3. 3. Populace rotaviru podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že je odvozena od infekce lidského rotaviru.
  4. 4. Populace rotaviru podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, v y z n a č u j í c í se t í m, že se replikuje u lidí a je jimi vylučována.
  5. 5. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v y z n ač u j í c í se tím, že v podstatě jedinou variantou je varianta, v níž gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jednu z následujících baží: adeninovou bázi A v poloze 788, adeninovou bázi A v poloze 802 a thyminovou bázi T v poloze 501 od startovacího kodonu.
  6. 6. Populace rotaviru podle nároku 5, vyznačující se tím, že gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující adeninovou bázi A v polohách 788 a 802 a thyminovou bázi T v poloze 501 od startovacího kodonu.
  7. 7. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v y z n ač u j í c í se t í m, že v podstatě jedinou variantou je varianta, ve které gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jednu z
    - 53 následujících bází: thymin T v poloze 605, ademin A v poloze 897 a guanin G v poloze 897 od startovacího kodonu.
  8. 8. Populace rotaviru podle nároku 7, vyznačující se tím, že gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující thymin T v poloze 605 a adenin A nebo guanin G v poloze 897 od startovacího kodonu.
  9. 9. Populace rotaviru podle nároku 5 až 8, vyznačující se t í m, že gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující adenin A v polohách 788 a 802 a thymin T v poloze 501 od startovacího kodonu; a gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující thymin T v poloze 605 a adenin A v poloze 897 od startovacího kodonu.
  10. 10. Rotavirus, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP4, kde nukleotidová sekvence odpovídá obr.1 a/nebo nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP7, kde nukleotidová sekvence odpovídá obr.2.
  11. 11. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se t I m, že je označována jako P43 a je uložena pod přírůstkovým číslem ECACC 99081301.
  12. 12. Varianta rotaviru označovaná P43 a uložená v Evropské sbírce živočišných buněčných kultur pod přírůstkovým číslem 99081301, potomstvo rotaviru a imunologicky aktivní deriváty rotaviru a materiály z něho získané.
  13. 13. Rotavirový reasortant, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen, nebo alespoň jeden segment rotavirové varianty P43 podle nároku 11 nebo nároku 12.
    - 54
  14. 14. Způsob výroby vyčištěné lidské rotavirové populace, zahrnující v podstatě jedinou variantu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky v nichž se:
    pasážuje rotavirový preparát na vhodné buněčné linii; volitelně zvolí homogenní kultura za použití kroků buď: limitního zředění; nebo izolace jednotlivého plaku; a ověří přítomnost v podstatě jediné varianty sekvenováním vhodné oblasti genové sekvence VP4 a/nebo VP7.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že se rotavirový preparát pasážuje na primárních buňkách opičích ledvin AGMK.
  16. 16. Způsob podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se t í m, že rotavirový preparát má charakteristiky kmene 89-12, nebo jeho derivátu.
  17. 17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16, vyznačující se t i m, že zahrnuje přídavný krok působení etherem k odstranění nahodilých kontaminujících činidel, citlivých vůči etheru.
  18. 18. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje živý oslabený virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, smíšeným s vhodným farmaceutickým nosičem nebo s adjuvans.
  19. 19. Vakcinační prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je upravený pro orální podávání.
  20. 20. Vakcinační prostředek podle nároku 19, vyznačující se t í m, že živý oslabený virus je formulován s antacidním prostředkem.
  21. 21. Vakcinační prostředek podle nároku 20, vyznačující se t í m, že antacidní prostředek zahrnuje organický antacid.
  22. 22. Vakcinační prostředek podle nároku 21, vyznačující se t í m, že antacidem je citrát sodný.
  23. 23. Vakcinační prostředek podle nároku 20, vyznačující se t í m, že antacidní prostředek zahrnuje anorganický antacid.
  24. 24. Vakcinační prostředek podle nároku 23, vyznačující se t í m, že antacidem je hydroxid hlinitý.
  25. 25. Vakcinační prostředek podle nároku 23, vyznačující se t í m, že antacidem je uhličitan vápenatý.
  26. 26. Vakcinační prostředek podle nároku 25, vyznačující se t i m, že dále obsahuje viskozní činidlo.
  27. 27. Vakcinační prostředek podle nároku 26, s e t í m, že viskozním činidlem je xanthanová guma.
  28. 28. Vakcinační prostředek podle kteréhokoliv z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že živý oslabený virus je formulován s uhličitanem vápenatým a xanthanovou gumou a rekonstituován vodným roztokem.
    • ·
    - 56 29. Vakcinační prostředek podle kteréhokoliv z nároků 20 až
    28, vyznačující se tím, že živý oslabený virus je formulován s antacidním prostředkem a lyofilizován v blistrovém balení.
    30. Vakcinační prostředek podle kteréhokoliv z nároků 18 až
  29. 29, vyznačující se tím, že virus je v lyofilizované formě.
  30. 31. Vakcinační prostředek podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se t i m, že živý oslabený virus a antacidní prostředek jsou přítomné před podáváním v oddělených zásobnících pro přípravky, jako je kapalný vakcinační prostředek.
  31. 32. Vakcinační prostředek podle nároku 30, vyznačující se t i m, že živý oslabený virus a antacidní prostředek jsou před podáváním přítomné ve stejném zásobníku pro přípravek jako lyofilizovaný vakcinační prostředek, který má být rekonstituován vodným roztokem.
  32. 33. Vakcinační prostředek obsahující živý oslabený lidský rotavirus, vyznačující se tím, že virus je v lyofilizované formě.
  33. 34. Vakcinační prostředek podle nároku 33, vyznačující se t í m, že prostředek je ve formě rychle se rozpouštějící tablety pro okamžité rozpuštění po vložení do úst.
  34. 35. Vakcinační prostředek podle nároku 33 nebo nároku 34, v y značující se tím, že obsahuje lyofilizovaný živý oslabený rotavirus, smísený s anorganickým antacidem jako je uhličitan vápenatý a s viskózním činidlem jako je xanthanová guma.
    • ·
  35. 36. Vakcinační prostředek podle nároku 35, vyznačující se t í m, že oslabený virus a antacidní prostředek jsou před podáváním přítomné v oddělených zásobnících pro přípravky, jako kapalný vakcinační prostředek.
  36. 37. Vakcinační prostředek podle nároku 35, vyznačující se t í m, že oslabený virus a antacidní prostředek jsou formulovány ve stejném zásobníku jako lyofilizovaný vakcinační prostředek pro rekonstituci vodným roztokem před podáváním.
  37. 38. Způsob výroby rotavirové vakciny, vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky, v nichž se smísí lyofilizovaný živý oslabený lidský rotavirus s antacidem a s viskózním činidlem.
  38. 39. Způsob prevence rotavirové infekce u lidí podáním účinného množství vakciny podle kteréhokoliv z nároků 18 až 27 lidskému subjektu, který to potřebuje.
    Zastupuje:
    - 59 • · · · ?(/Up2.-ÍLL·
    1(1
CZ20020522A 1999-08-17 2000-08-15 Oslabená populace lidského rotaviru CZ302173B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9919468.0A GB9919468D0 (en) 1999-08-17 1999-08-17 Vaccine
GBGB9927336.9A GB9927336D0 (en) 1999-11-18 1999-11-18 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2002522A3 true CZ2002522A3 (cs) 2002-05-15
CZ302173B6 CZ302173B6 (cs) 2010-11-24

Family

ID=26315853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20020522A CZ302173B6 (cs) 1999-08-17 2000-08-15 Oslabená populace lidského rotaviru

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7285280B1 (cs)
EP (1) EP1212084B1 (cs)
JP (3) JP2003507040A (cs)
KR (1) KR100695599B1 (cs)
CN (1) CN100379451C (cs)
AP (1) AP1768A (cs)
AR (1) AR029643A1 (cs)
AT (1) ATE327765T1 (cs)
AU (1) AU767885B2 (cs)
BG (1) BG65314B1 (cs)
BR (1) BRPI0013357B8 (cs)
CA (1) CA2379196C (cs)
CO (1) CO5580165A1 (cs)
CY (2) CY1106103T1 (cs)
CZ (1) CZ302173B6 (cs)
DE (2) DE122006000026I1 (cs)
DK (1) DK1212084T3 (cs)
DZ (1) DZ3219A1 (cs)
EA (1) EA005952B1 (cs)
ES (1) ES2260046T3 (cs)
FR (1) FR06C0018I2 (cs)
HK (1) HK1046860B (cs)
HU (2) HU228975B1 (cs)
IL (3) IL147926A0 (cs)
LU (1) LU91251I2 (cs)
MA (1) MA25489A1 (cs)
MX (1) MXPA02001648A (cs)
MY (1) MY133158A (cs)
NL (1) NL300233I2 (cs)
NO (2) NO328112B1 (cs)
NZ (1) NZ517131A (cs)
OA (1) OA12312A (cs)
PE (1) PE20010487A1 (cs)
PL (1) PL205550B1 (cs)
PT (1) PT1212084E (cs)
SI (1) SI1212084T1 (cs)
SK (1) SK287261B6 (cs)
TR (1) TR200200420T2 (cs)
TW (1) TWI283270B (cs)
UA (1) UA77388C2 (cs)
UY (1) UY26297A1 (cs)
WO (1) WO2001012797A2 (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122006000026I1 (de) * 1999-08-17 2006-10-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Methoden um Rotavirusvarianten zu trennen und lebender attenuierter Rotavirus impfstoff
US6592869B2 (en) * 1999-08-24 2003-07-15 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Vaccine composition and method of using the same
GB0020089D0 (en) * 2000-08-15 2000-10-04 Smithkline Beecham Biolog Vaccine Composition
KR20030026654A (ko) * 2001-09-26 2003-04-03 주식회사 씨트리 인간 로타바이러스의 활성을 저해하는 항체의 생산용 항원및 그의 제조방법과 이용
GB0414787D0 (en) 2004-07-01 2004-08-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
SG147465A1 (en) * 2003-09-02 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0503337D0 (en) * 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
ES2534637T3 (es) * 2005-08-17 2015-04-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna de rotavirus que induce protección cruzada heterotípica
CA2630220C (en) 2005-11-22 2020-10-13 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens
KR101051986B1 (ko) * 2006-09-28 2011-07-26 중앙대학교 산학협력단 인간로타바이러스 및 이를 이용한 백신 조성물
WO2008058035A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-15 Alphavax, Inc. Alphavirus and alphavirus replicon particle formulations and methods
EP2236617A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Methods of terminal sterilization of biofunctional compositions
WO2010132561A2 (en) 2009-05-12 2010-11-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention New human rotavirus strains and vaccines
CN102470170B (zh) 2009-07-13 2015-03-18 巴拉特生物技术国际有限公司 用作轮状病毒疫苗的组合物及其方法
FR2960781B1 (fr) * 2010-06-07 2013-11-22 Sanofi Pasteur Preparation d'un vaccin oral sec stabilise, compose d'un virus vivant attenue
RU2643929C2 (ru) 2012-04-23 2018-02-06 Бхарат Байотек Интернэшнл Лимитед Новые ротавирусные вакцинные композиции и способ получения вышеуказанных композиций
BR112015004085A2 (pt) * 2012-08-27 2017-08-08 Murdoch Childrens Res Inst método para cultivar uma cepa de rotavírus (rv); método para gerar uma rv3 atenuada em células vero; rv3 adaptada à vero isolada; composição de rv morto ou vivo atenuado; método para vacinar um indivíduo humano contra infecção por rv; método para tratar um indivíduo humano com uma infecção por rv ou em risco de desenvolver uma infecção ou reinfecção por rv; uso da rv3 de vero; anticorpo isolado; e método para detectar ou monitorar a rv3 de vero
CN106167518B (zh) * 2015-05-21 2021-01-15 厦门大学 截短的轮状病毒vp4蛋白及其用途
CN108431214B (zh) 2015-10-05 2022-03-01 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途
CN108367164A (zh) * 2015-12-18 2018-08-03 默沙东公司 热稳定的轮状病毒疫苗制剂及其使用方法
MA44557B1 (fr) 2016-06-16 2021-11-30 Bharat Biotech Int Ltd Vaccin contre le rotavirus sans tampon, stable en milieu acide, et d'un faible volume de dose à administrer
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
CN110856493B (zh) * 2018-08-20 2022-02-25 中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所 一种植物病毒弱毒疫苗组合物、弱毒疫苗保存方法及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927323B2 (ja) * 1976-10-12 1984-07-05 花王株式会社 歯みがき組成物
US4341763A (en) * 1981-03-10 1982-07-27 Smithkline-Rit Methods of vaccinating humans against rotavirus infection
US4571385A (en) * 1983-06-27 1986-02-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors
US4624850A (en) * 1984-02-09 1986-11-25 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine
US5626851A (en) * 1987-11-30 1997-05-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Rotavirus reassortant vaccine
ES2121841T3 (es) * 1990-11-16 1998-12-16 Childrens Hosp Medical Center Una vacuna para proporcionar proteccion inmunologica contra enfermedades de rotavirus en humanos.
US5471385A (en) * 1992-05-21 1995-11-28 Tsubakimoto Chain Co. Routeless guiding method for moving body
US5773009A (en) * 1994-04-15 1998-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rotavirus strain G9P11
WO1996001651A1 (en) * 1994-07-11 1996-01-25 The Government Of The United States Of America, Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated human rotavirus vaccine
US6403098B1 (en) * 1996-09-26 2002-06-11 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
EP0939648B1 (en) * 1996-09-26 2007-11-07 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
US5932223A (en) * 1996-09-26 1999-08-03 Merck & Co., Inc. Rotavirus vaccine formulations
US6552024B1 (en) * 1999-01-21 2003-04-22 Lavipharm Laboratories Inc. Compositions and methods for mucosal delivery
DE122006000026I1 (de) * 1999-08-17 2006-10-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Methoden um Rotavirusvarianten zu trennen und lebender attenuierter Rotavirus impfstoff

Also Published As

Publication number Publication date
NZ517131A (en) 2003-07-25
IL147926A0 (en) 2002-08-14
EP1212084B1 (en) 2006-05-31
FR06C0018I2 (fr) 2007-04-27
HU228975B1 (en) 2013-07-29
ES2260046T3 (es) 2006-11-01
SI1212084T1 (sl) 2006-08-31
CN100379451C (zh) 2008-04-09
KR100695599B1 (ko) 2007-03-14
AP1768A (en) 2007-08-16
NL300233I1 (nl) 2006-09-01
SK287261B6 (sk) 2010-04-07
HUS1300072I1 (hu) 2019-11-28
JP2011045374A (ja) 2011-03-10
ATE327765T1 (de) 2006-06-15
NO2010011I1 (no) 2010-06-07
EA200200142A1 (ru) 2002-08-29
CZ302173B6 (cs) 2010-11-24
IL147926A (en) 2008-03-20
OA12312A (en) 2006-05-12
CA2379196C (en) 2015-05-26
SK2432002A3 (en) 2002-09-10
CO5580165A1 (es) 2005-11-30
BG65314B1 (bg) 2008-01-31
PL354135A1 (en) 2003-12-29
NO328112B1 (no) 2009-12-07
WO2001012797A2 (en) 2001-02-22
AP2002002424A0 (en) 2002-03-31
KR20020092344A (ko) 2002-12-11
CY2006004I1 (el) 2009-11-04
HUP0203335A3 (en) 2004-07-28
US7285280B1 (en) 2007-10-23
CY2006004I2 (el) 2009-11-04
NO2010011I2 (no) 2015-02-02
PT1212084E (pt) 2006-07-31
DE122006000026I1 (de) 2006-10-12
WO2001012797A3 (en) 2001-08-02
AU6996100A (en) 2001-03-13
US20090130145A1 (en) 2009-05-21
PE20010487A1 (es) 2001-06-23
JP2007319164A (ja) 2007-12-13
AU767885B2 (en) 2003-11-27
US7790179B2 (en) 2010-09-07
AR029643A1 (es) 2003-07-10
HUP0203335A1 (hu) 2003-02-28
EP1212084A2 (en) 2002-06-12
DK1212084T3 (da) 2006-07-10
NO20020763D0 (no) 2002-02-15
NO20020763L (no) 2002-04-16
IL188686A0 (en) 2008-04-13
NL300233I2 (nl) 2006-10-02
MXPA02001648A (es) 2002-08-06
DZ3219A1 (fr) 2001-02-22
BR0013357A (pt) 2002-04-30
DE60028390T2 (de) 2006-11-02
EA005952B1 (ru) 2005-08-25
CY1106103T1 (el) 2010-07-28
BRPI0013357B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0013357B1 (pt) 2016-08-02
JP2003507040A (ja) 2003-02-25
CN1379683A (zh) 2002-11-13
LU91251I9 (cs) 2018-12-31
MY133158A (en) 2007-10-31
DE60028390D1 (de) 2006-07-06
HK1046860A1 (en) 2003-01-30
TWI283270B (en) 2007-07-01
PL205550B1 (pl) 2010-04-30
BG106417A (en) 2003-04-30
LU91251I2 (fr) 2006-08-14
HK1046860B (zh) 2006-10-06
CA2379196A1 (en) 2001-02-22
US20080063662A1 (en) 2008-03-13
US7790180B2 (en) 2010-09-07
UY26297A1 (es) 2001-03-16
UA77388C2 (uk) 2006-12-15
FR06C0018I1 (cs) 2006-07-21
MA25489A1 (fr) 2002-07-01
TR200200420T2 (tr) 2002-05-21
US20080057082A1 (en) 2008-03-06
JP5474720B2 (ja) 2014-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7790180B2 (en) Immunogenic composition of a homogeneous live attenuated human rotavirus population
EP2233153B1 (en) Rotavirus vaccine inducing heterotypic cross protection
EP2272532B1 (en) Rotavirus vaccine
US7579008B2 (en) Immunization with an attenuated human rotavirus
EP1676586B1 (en) Method of separating rotavirus variants and live attenuated rotavirus vaccine
ZA200601771B (en) Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20210223