EA005952B1 - Ослабленная популяция ротавирусов и содержащая ее вакцинная композиция - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложена ослабленная популяция ротавирусов человека, содержащих нуклеотидную последовательность, представляющую собой единственный вариант или, по существу, единственный вариант гена VP4 и/или единственный или, по существу, единственный вариант гена VP7, которая обеспечивает приготовление партий стабильной вакцины. В предпочтительном воплощении указанная популяция представляет собой популяцию Р43, депонированную в ЕСАСС под регистрационным номером 99081301. Также предложен вариант ротавируса, входящий в состав популяции по изобретению, его потомство, иммунологически активный компонент и ротавирусный псевдовирион на их основе. Данное изобретение также предлагает вакцинную композицию, включающую заявленную ослабленную популяцию ротавирусов, смешанную с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом, которая предпочтительно находится в лиофилизированной форме и приспособлена для перорального введения.

Description

Данное изобретение относится к новым вакцинным препаратам, способам их приготовления и их применению в лечении. В частности, настоящее изобретение относится к новым ротавирусным вакцинным препаратам.

Острая инфекционная диарея представляет собой основную причину заболевания и смерти во многих областях мира. В развивающихся странах последствия диарейного заболевания ошеломляют. Для Азии, Африки и Латинской Америки установлено, что ежегодно здесь бывает от 3 до 4 миллиардов случаев диареи, и из них приблизительно 5-10 млн случаев заканчиваются смертью (ХУайт 1. А. е1 а1.: N. Εη§1. 1. Меб., 301: 967-974 (1979)).

Ротавирусы признаются одной из наиболее важных причин тяжелой диареи у младенцев и маленьких детей (Е81е8, М. К. Ко1ауии8е8 апб ТЬей Верйсабоп ίη Е1е1бз Упо1о§у, ТЫтб Ε6ίΐίοη, ебйеб Ьу Е1е1бз е1 а1., Кауеп РиЬНзйегв, РЫ1абе1рЫа, 1996). Установлено, что заболевание, вызываемое ротавирусами, ответственно за более чем один миллион смертей ежегодно. Вызываемое ратавирусами расстройство обычно поражает детей в возрасте от 6 до 24 месяцев, и максимальное распространение заболевания, как правило случается во время более холодных месяцев в зонах с умеренным климатом и круглогодично - в тропических районах. Ротавирусы, как правило, передаются от человека к человеку фекально-оральным путем с инкубационным периодом, составляющим от приблизительно 1 до приблизительно 3 дней. В отличие от инфекции в возрастной группе от 6 до 24 месяцев, новорожденные, как правило, не обнаруживают симптомов заболевания или имеют лишь легкую форму заболевания. В противоположность тяжелому заболеванию, в норме встречающемуся у маленьких детей, большинство взрослых являются защищенными в результате перенесенной ранее ротавирусной инфекции, так что большая часть инфекций у взрослых протекает легко или бессимптомно (Οίϊϊΐ, Р. А. е1 а1. Сотр. Т1ег., 8(8): 21-26, 1982).

Ротавирусы, как правило, являются сферическими, и их название происходит от их характерной наружной и внутренней частей, или двухоболочечной структуры капсида. Как правило, двухоболочечная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или сердцевину, которая содержит геном. Геном ротавируса состоит из 11 сегментов двухцепочечной РНК, которые кодируют по меньшей мере 11 характерных вирусных белков. Два из этих вирусных белков, обозначаемые как УР4 и УР7, расположены на внешней части двухоболочечной структуры капсида. Внутренний капсид ротавируса представляет один белок, который является ротавирусным белком, обозначенным как УР6. Относительная важность этих трех конкретных ротавирусных белков для индуцирования иммунного ответа, сопровождающего ротавирусную инфекцию, до сих пор не ясна. Тем не менее, белок УР6 определяет группу и подгруппу антигена, а белки УР4 и УР7 представляют собой детерминанты серотипической специфичности.

Белок УР7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 38000 (с молекулярной массой 34000 - для негликозилированного белка), который является продуктом трансляции геномного сегмента 7, 8 или 9 - в зависимости от штамма. Этот белок стимулирует образование главного нейтрализующего антитела, сопутствующее ротавирусной инфекции. Белок УР4 представляет собой негликозилированный белок, имеющий молекулярную массу приблизительно 88000, являющийся продуктом трансляции геномного сегмента 4. Этот белок также стимулирует нейтрализующее антитело, сопутствующее ротавирусной инфекции.

Поскольку белки УР4 и УР7 представляют собой вирусные белки, против которых направлены нейтрализующие антитела, предполагается, что они являются первыми кандидатами для разработки ротавирусных вакцин, обеспечивающих защиту против ротавирусного расстройства.

Известно, что естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве индуцирует защитный иммунитет. Таким образом, живая ослабленная ротавирусная вакцина является весьма желательной. Предпочтительно она должна представлять собой пероральную вакцину, поскольку пероральный путь является естественным путем инфекции вируса.

Ранее разработка вакцины для предотвращения ротавирусных инфекций началась в 1970-х гг. после открытия этого вируса. Сначала были изучены ослабленные штаммы, полученные из животных и людей, что давало смешанные или неутешительные результаты. Более поздние работы были сфокусированы на животно-человеческих псевдовирионах, они оказались более успешными.

Штамм ротавируса, известный как 89-12, был описан Уордом (\Уагб): см. патент США № 5474773 и Ветп81ет, Ό. Ь е1 а1, Уассше, 16(4), 381 - 387, 1998. Штамм 89-12 был выделен из образца стула, отобранного у 14-месячного ребенка с естественным ротавирусным расстройством в 1988 году. Согласно патенту США № 5474773 ротавирус человека НКУ 89-12 затем был адаптирован к условиям культивирования при помощи 2 пассажей в первичных клетках почки африканской зеленой мартышки (ПАЗМ) и 4 пассажей в клетках МА-104 в соответствии с тем как было описано \Уагб в 1. Ο1ίη. МютоЬюЬ, 19, 748-753, 1984. Затем его 3 раза очищали методом бляшек в клетках МА-104 (до пассажа 9) и после 2-х дополнительных пассажей выращивали в этих клетках. Один дополнительный пассаж (пассаж 12) был сделан для депонирования в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под регистрационным номером АТСС УК 2272. Этот депонированный штамм известен как 89-12С2.

На статью ВегпНет е1 а1. в Уассше 1998 года далее будут ссылки как на «статью Уассше (1998)». Эта статья описывает безопасность и иммуногенность перорально вводимого кандидата для вакцины,

- 1 005952 содержащей живой ротавирус человека. Эта вакцина была получена из штамма 89-12, ослабленного путем пассирования без очистки методом бляшек 26 раз в первичных клетках ПАЗМ и затем еще 7 раз в прижившейся клеточной линии ПАЗМ (в сумме 33 пассажа).

В дальнейшем ссылки на Р26 (пассаж 26) будут относиться к вышеупомянутому материалу, который был последовательно пассирован 26 раз, а ссылки на Р33 будут относиться к материалу, который пассировали последовательно 33 раза. В общем, ротавирус, полученный путем пассирования 89-12 η раз, будет обозначен как Рп.

В последующих примерах материал Р33 дополнительно пассировали еще 5 раз в клетках Уего. На него ссылаются как на Р38.

Изоляты Р26 и Р33, описанные в статье Уассте (1998), не депонировали в коллекции культур и не анализировали для установления их генетической характеристики.

В настоящее время обнаружили, что популяция Р26, описанная в литературе, включает в себя смесь вариантов. Это было установлено путем установления генетической характеристики, как описано ниже (смотри примеры). Таким образом, Р26 не представляет собой надежно стабильную популяцию для дальнейших пассажей, в частности для производства партий вакцин. Аналогично, Р33 включает в себя смесь вариантов и не является надежно стабильным для производства партий вакцин.

Было обнаружено, что материал Р26 представляет собой смесь по меньшей мере трех вариантов гена УР4. Р33 и Р38 подобным образом представляют собой смесь двух вариантов. При оценке титров нейтрализующих антител сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р33 против этих вариантов, представляется, что эти варианты антигенно отличаются в отношении вируснейтрализующих антигенных детерминант от штамма 89-12С2, депонированного в АТСС. Это проиллюстрировано на фиг. 3.

Кроме того, было обнаружено, что когда младенцам вводят материал Р33, реплицируются и секретируются два идентифицированных варианта. Из 100 вакцинированных младенцев лишь у двух были обнаружены симптомы гастроэнтерита, вызванного ротавирусной инфекцией, в то время как 20% группы, получившей плацебо, были инфицированы. Эти открытия означают, что указанные идентифицированные варианты связаны с защитой от ротавирусного заболевания.

Таким образом, в задачу настоящего изобретения входило получение ослабленной популяции ротавирусов, обеспечивающей приготовление партий стабильной вакцины.

Поставленная задача решается тем, что предложена ослабленная популяция ротавирусов человека, содержащих нуклеотидную последовательность, представляющую собой единственный вариант или по существу единственный вариант гена УР4 и/или единственный или по существу единственный вариант гена УР7.

Предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, полученная путем клонирования исходной ротавирусной популяции Р33.

Предпочтительно популяция ротавирусов по изобретению происходит от популяции, вызывающей ротавирусную инфекцию человека, наиболее предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, которая реплицируется в людях и экскретируется ими.

В предпочтительном аспекте изобретения указанный по существу единственный вариант гена УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую: аденин (А) в положении 788, или аденин (А) в положении 802, или тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона.

Наиболее предпочтительно ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона.

В еще одном предпочтительном аспекте изобретения указанный по существу единственный вариант гена УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605, или аденин (А) в положении 897, или гуанин (С) в положении 897 от стартового кодона.

Наиболее предпочтительно ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) или гуанин (С) в положении 897 от стартового кодона.

Еще более предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, где ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона; а ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) в положении 897 от стартового кодона.

Наиболее предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, обозначенная как Р43 и депонированная в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 99081301.

Поставленная задача решается также тем, что предложен вариант ротавируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР4, приведенную на фиг. 1, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР7, приведенную на фиг. 2.

Предпочтительным является вариант ротавируса, входящий в состав популяции Р43, или его потомство.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен иммунологически активный компонент указанного варианта ротавируса.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен ротавирусный псевдовирион, содержащий по

- 2 005952 меньшей мере один указанный иммунологически активный компонент или по меньшей мере один сегмент генома вышеуказанного варианта ротавируса.

Задача изобретения решается также тем, что предложена вакцинная композиция, включающая живую ослабленную популяцию ротавирусов по изобретению, смешанную с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом.

Для решения поставленной задачи также предложена вакцинная композиция, включающая живой ослабленный вариант ротавируса, его потомство, иммунологически активный компонент или псевдовирион, как они определены выше, смешанные с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом.

Предпочтительно вакцинная композиция по изобретению приспособлена для перорального введения, более предпочтительно приготовлена в виде препарата с антацидной композицией, наиболее предпочтительно - в лиофилизированной форме.

Особенно предпочтительной является указанная вакцинная композиция, содержащая лиофилизированный живой ослабленный вариант ротавируса и неорганическое антацидное средство, такое как карбонат кальция, и агент, регулирующий вязкость, такой как ксантановая камедь.

Целесообразно, когда в указанной вакцинной композиции ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция находятся в отдельных контейнерах для приготовления препарата в виде жидкой вакцинной композиции перед введением.

Также целесообразно, когда в указанной вакцинной композиции ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция приготовлены в одном контейнере в лиофилизированной форме, которую нужно разводить водным раствором перед введением.

Также особенно предпочтительной является лиофилизированная вакцинная композиция в форме быстрорастворяющейся таблетки для немедленного растворения при помещении на язык.

Под популяцией, включающей в себя единственный вариант или по существу единственный вариант, понимают популяцию ротавирусов, которая не содержит более 10% и предпочтительно содержит менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% отличающегося варианта или вариантов. Популяции вируса могут быть очищены до гомогенного состояния или по существу гомогенного состояния путем пассирования в клетках подходящих типов или путем осуществления серий, состоящих из одной или более чем одной стадий клонирования.

Преимущество данного изобретения заключается в том, что популяция, включающая в себя единственный вариант, является более пригодной для приготовления партии стабильной вакцины. Конкретные варианты, характеризующиеся нуклеотидными последовательностям, кодирующими основной вирусный белок, также могут быть связаны с повышенной эффективностью предотвращения ротавирусной инфекции.

Популяция ротавирусов по изобретению может быть получена способом, при котором пассируют ротавирусный препарат в клетках подходящего типа;

возможно выделяют однородную культуру с помощью стадий

а) конечных разведений; или

б) изолирования отдельных бляшек; и проверяют на присутствие по существу единственного варианта путем выполнения определения последовательности соответствующей области последовательности гена УР4 и/или УР7.

Определение последовательности может быть удобным образом осуществлено с использованием методики количественной или полуколичественной гибридизации, такой как слот-блот-гибридизация или гибридизация с вирусными нуклеиновыми кислотами в бляшках.

Предпочтительно выделенный вариант представляет собой вариант, который реплицируется и секретируется, когда исходный ротавирусный препарат вводят человеку, в частности ребенку.

Клонированная вирусная популяция, полученная способом по данному изобретению, может быть амплифицирована путем дополнительного пассирования в подходящей линии клеток.

Типы клеток, подходящие для пассирования ротавирусной популяции в вышеуказанном способе, включают в себя клетки почки африканской зеленой мартышки (ПАЗМ), которые могут представлять собой прижившиеся клеточные линии или первичные клетки ПАЗМ. Подходящие линии клеток ПАЗМ включают в себя, например, Уего (АТСС ССЬ-81), 1)В8-1^;1Ш.-2 (АТСС СЬ-160), В8С-1 (ЕСАСС 85011422) и СУ-1 (АТСС ССЬ-70). Также подходят линии клеток МА-104 (макаки резус) и МКС-5 (человека - АТСС ССЬ-171). Клетки Уего особенно предпочтительны для целей амплификации. Пассирование в клетках Уего дает высокий выход вируса.

Методики проверки того, действительно ли в вирусной популяции, полученной в результате осуществления вышеуказанного способа, присутствует единственный вариант, и методики определения природы этого единственного варианта включают в себя стандартные процедуры секвенирования и гибридизации, известные в данной области техники и описанные ниже.

Получение ротавирусной популяции по данному изобретению осуществляют с использованием подходящего ротавируса, в частности ротавируса, имеющего характеристики штамма 89-12 или его пассированного производного.

- 3 005952

Особенно предпочтительная популяция единственного варианта представляет собой Р43, которая получена из Р33 (выделенный ротавирус человека 33 раза пассируется в культуре в клетках подходящего типа) с помощью ряда стадий клонирования путем конечных разведений с последующим пассированием клонированного материала в клетках Уего для амплификации.

Популяция Р43 была депонирована в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС), Лаборатория исследования и производства вакцин, Лабораторная служба общественного здравоохранения, Научно-производственный центр микробиологии, Ройои Όο\νπ. ЗайкЬиту, ХУПЫиге. 8Р4 ΟΙΟ, ИиИеб Кшдбот, 13 августа 1999 г. под регистрационным номером 99081301 по условиям Будапештского договора.

Хотя эта указанная общедоступность представляет собой самый простой способ получения ротавирусов человека Р43, в целом вполне возможно или вероятно, что соответствующие и по существу функционально идентичные ротавирусы могут быть получены этими или другими способами с учетом данного изобретения. Полагается, что такие по существу функционально идентичные ротавирусы являются биологическим эквивалентом ротавирусу человека Р43 по данному изобретению и, следовательно, входят в объем настоящего изобретения. Следовательно, понятно, что данное изобретение охватывает ротавирусные популяции, обладающие характеристиками варианта Р43 в соответствии с тем, как описано в материалах данной заявки.

Также следует понимать, что данное изобретение охватывает материалы, полученные из депонированного Р43 ЕСАСС 99081301, путем подвергания их дополнительной обработке, например, размножению их путем дополнительного пассирования, клонирования или других процедур с использованием живого вируса, или путем модифицирования Р43 любым путем, в том числе методами генной инженерии или методами псевдовирионов. Такие стадии и методы хорошо известны в данной области техники.

Материалы, полученные из депонированного Р43, которые охватываются данным изобретением, включают в себя белок и генетический материал. Особенный интерес представляют ротавирусные псевдовирионы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент Р43, например псевдовирионы, которые представляют собой вирулентный штамм ротавируса, в котором один или часть одного из 11 сегментов генома замещена сегментом генома Р43 или его частью. Конкретно, полезные свойства может иметь ротавирусный псевдовирион, в котором сегмент или часть сегмента, кодирующая Ν8Ρ4, представляет собой сегмент или часть сегмента Р43. Ротавирусные псевдовирионы и методики их получения хорошо известны (Бок1ет, К. Н. апб ХУад^аГЕ А. 1. Те1тауа1еп1 Ко1ау1тик Уаеете, а ге\зе\\·. ΑΌΙ8 бгид еуа1иа1юп, ВюПтидк, Оеу, 9(2), 155-178, 1998).

Материалами, представляющими особенный интерес, являются потомство Р43 и иммунологически активные производные Р43. Под иммунологически активными производными подразумевают материалы, полученные из вируса Р43 или с ним, в частности антигены этого вируса, которые способны вызвать иммунный ответ против ротавирусов при введении в животное-хозяина.

При адаптации ротавируса к подходящей клеточной линии, например к клеткам Уего, может быть необходимо обработать вирус таким образом, чтобы избавиться от любого возможного загрязнения, как, например, от любых случайных агентов, которые могут присутствовать и которые могут иным образом вызвать загрязнение. В случае случайных вирусов, чувствительных к эфиру, это можно сделать путем обработки эфиром как описано ниже. Настоящее изобретение также относится к включению такой обработки эфиром в качестве возможной стадии в общую процедуру получения ослабленного живого ротавируса или приготовленной с ним вакцины.

Также в объем данного изобретения входят смеси Р43 с другими ротавирусными вариантами, например с другими клонированными вариантами, или с другими вирусами, в частности с другими ослабленными вирусами. Такие смеси полезны в вакцинах по изобретению, которые описаны ниже.

Предпочтительно ротавирусная вакцина по изобретению представляет собой моновалентную ротавирусную вакцину, содержащую единственный штамм ротавируса.

Настоящее изобретение является особенно полезным, предлагая живую ротавирусную вакцину, в которой живой ослабленный ротавирус представляет собой ротавирус человека и не вызывает инвагинации.

Подходящие фармацевтические носители для использования в вакцине по данному изобретению включают в себя известные в данной области носители, про которые известно, что они подходят для перорального введения, особенно младенцам. Такие носители включают в себя углеводы, полиспирты, аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана, гидроксид железа, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, гуммиарабик, β-циклодекстрин, но не ограничиваются ими.

Ротавирусная вакцина по изобретению может быть получена, например, с помощью сублимационной сушки вируса в присутствии подходящих стабилизаторов или путем смешивания вируса по данному изобретению с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем.

Также может быть полезно приготовить препараты вируса по изобретению в носителях на основе липидов, таких как виросомы или липосомы, в эмульсиях типа «масло в воде» или с частицами носителя.

- 4 005952

В качестве альтернативы или в дополнение в препарат могут быть включены иммуностимуляторы, такие как известные в данной области иммуностимуляторы для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают в себя бактериальные токсины, в частности холерный токсин (ХТ) в форме голотоксина (целая молекула) или только как цепь В (ХТВ) и термолабильный энтеротоксин Е. сой (ЛТ). Мутантные ЛТ (мЛТ), которые превращаются в свою активную форму с меньшей вероятностью чем нативный ЛТ, также описаны в АО 96/06627, АО 93/13202 и И8 5182109.

Дополнительные иммуностимуляторы, которые может быть полезным включить, представляют собой производные сапонина, такие как 0821 и монофосфориллипид А, в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид Α (3И-МРЬ). Очищенные сапонины как пероральные адъюванты описаны в АО 98/56415. Сапонины и монофосфориллипид А можно использовать по отдельности или в комбинации (см., например АО 94/00153), и можно включать в состав препарата в адъювантных системах вместе с другими агентами. 3И-МРЬ является хорошо известным адъювантом, производимым ЫЫ 1ттипос11ст. Моп1аиа, и его производство описано в СВ 2122204.

Общее обсуждение носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти в Уассше ИеДдп, ТЬе 8иЬиш1 апб Аб]иуап1 АрргоасЬ, ебйеб Ьу Ротее11 апб №тешап, Р1епит Ргекк, Иете Уогк, 1995.

Вакцинацию людей, особенно младенцев, осуществляют путем введения эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Предпочтительно вводят живую ослабленную вакцину пероральным путем.

В соответствии с предпочтительным аспектом, композицию вакцины по данному изобретению готовят с антацидным средством, чтобы минимизировать инактивацию вакцины кислотой в желудке. Подходящие антацидные компоненты включают в себя неорганические антацидные средства, например гидроксид алюминия А1(ОН)₃ и гидроксид магния Мд(ОН)₂. Имеющиеся в продаже антацидные средства, которые подходят для использования по данному изобретению, включают в себя Му1ап1а (товарный знак), который содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и поставляются в суспензии.

Гидроксид алюминия представляет собой особенно предпочтительный компонент композиции вакцины по данному изобретению, поскольку он может обеспечивать не только антацидное действие, но также и адъювантное действие.

Также для использования в качестве антацидных средств в вакцине по данному изобретению подходят органические антацидные средства, такие как соли органических кислот по карбоксильной группе. Предпочтительное антацидное средство для вакцинной композиции по данному изобретению содержит соль органической кислоты по карбоксильной группе, предпочтительно соль лимонной кислоты, такую как цитрат натрия или цитрат калия.

Особенно предпочтительное антацидное средство, которое может быть использовано в вакцинной композиции по настоящему изобретению, представляет собой нерастворимую неорганическую соль карбонат кальция (СаСО₃). Карбонат кальция способен образовывать ассоциаты с ротавирусом, и активность ротавируса сохраняется во время ассоциации с карбонатом кальция.

Для предотвращения осаждения карбоната кальция во время стадии заполнения в препарате предпочтительно присутствуют агенты, регулирующие вязкость.

Возможные агенты, регулирующие вязкость, которые могут быть использованы, включают в себя псевдопластические эксципиенты. Псевдопластический раствор определяют как раствор, обладающий более высокой вязкостью при стоянии по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Эксципиенты этого типа представляют собой природные полимеры, такие как гуммиарабик, трагакантовая камедь, агар-агар, альгинаты, пектины или полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлозу (Ту1окек С®), метилцеллюлозу (Ме1Ьосе1к А®, Уксойапк МС®, Ту1оке МН® и МВ®), гидроксипропилцеллюлозу (К1исе1к®) и гидроксипропилметилцеллюлозу (Мейосек Е® и К®, Уксоп1гапк МРНС®). Как правило, эти псевдопластические эксципиенты используют вместе с тиксотропными агентами. Альтернативные агенты, регулирующие вязкость, которые можно использовать, представляют собой псевдопластические эксципиенты, обладающие низкой текучестью. Эти полимеры, взятые в достаточной концентрации, приводят к структурной перегруппировке в жидкости, приводящей в результате к раствору с высокой вязкостью, обладающему низкой текучестью при стоянии. Некоторое количество энергии требуется подвести к системе для того, чтобы дать ей возможность течь и обеспечить перемещение. Требуется энергия извне (перемешивание) для временного разрушения структурной перегруппировки в жидкости, чтобы получить жидкий раствор. Примеры таких полимеров представляют собой СагЬорок® и ксантановую камедь.

Тиксотропные эксципиенты приобретают структуру геля при стоянии, тогда как при перемешивании они образуют жидкий раствор. Примеры тиксотропных эксципиентов представляют собой: Уеедит® (Магниево-алюминиевый силикат) и Ау1се1 ЯС® (приблизительно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Иа-карбоксиметилцеллюлозы).

Вакцинная композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя агент, регулирующий вязкость, выбранный из ксантановой камеди или крахмала.

Таким образом, вакцинную композицию по настоящему изобретению предпочтительно готовят в

- 5 005952 виде препарата с комбинацией карбоната кальция и ксантановой камеди.

Другие компоненты композиции, используемые в данном изобретении, соответственно, включают сахара, например сахарозу и/или лактозу.

Вакцинная композиция по данному изобретению может содержать дополнительные компоненты, включая, например корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты.

Предусмотрено различное воспроизведение вакцинной композиции по данному изобретению.

В одном предпочтительном воплощении вакцину вводят в виде жидкого препарата. Предпочтительно жидкий препарат получают разведением перед введением из по меньшей мере двух компонентов:

1) вирусного компонента

2) жидкого компонента.

В этом воплощении вирусный компонент и жидкий компонент, как правило, содержатся в отдельных контейнерах, которые могут удобным образом представлять собой отдельные отсеки одной емкости или отдельные емкости, которые могут быть соединены таким образом, что конечную вакцинную композицию получают разведением без открытия доступа воздуха.

Перед разведением вирус может находиться в сухой форме или жидкой форме. Предпочтительно вирусный компонент является лиофилизированным. Лиофилизированный вирус является более стабильным, чем вирус в жидком растворе. Лиофилизированный вирус может быть соответствующим образом разведен с использованием жидкой антацидной композиции для получения жидкого вакцинного препарата. Или же лиофилизированный вирус может быть разведен в воде или водном растворе, причем в этом случае лиофилизированная вирусная композиция предпочтительно содержит антацидный компонент.

Предпочтительно, вакцинный препарат включает в себя вирусный компонент, приготовленный в виде препарата с карбонатом кальция и ксантановой камедью в одном отсеке емкости, который разводят водой или водным раствором, находящимся во втором отсеке емкости.

В еще одном предпочтительном воплощении вакцинная композиция представляет собой твердый препарат, предпочтительно лиофилизированный брикет, который пригоден для растворения непосредственно при помещении его в ротовую полость. Лиофилизированные препараты могут быть удобным образом предложены в форме таблеток в фармацевтической блистерной упаковке.

Предпочтительно быстрорастворимая таблетка по данному изобретению растворяется в ротовой полости субъекта достаточно быстро для того, чтобы предотвращалось проглатывание нерастворившейся таблетки. Этот подход особенно предпочтителен для педиатрических ротавирусных вакцин.

Предпочтительно вирус представляет собой живой ослабленный ротавирус человека, который приготовлен в виде препарата с неорганическим антацидным средством, таким как карбонат кальция, и агентом, регулирующим вязкость, таким как ксантановая камедь.

Вакцины по данному изобретению могут быть приготовлены и введены известными способами с применением подходящего количества живого вируса для обеспечения эффективной защиты от ротавирусной инфекции без значительных неблагоприятных побочных эффектов типичных вакцин. Подходящее количество живого вируса, как правило, составляет от 10⁴ до 10⁷ бляшкообразующих единиц (БОЕ) на дозу. Типичная доза вакцины может включать в себя 10⁵ - 10⁶ БОЕ на дозу и может быть введена в виде нескольких доз в течение периода времени, например в виде двух доз, вводимых с двухмесячным интервалом. Польза, тем не менее, может быть получена при использовании схемы приема, включающей более 2 доз, например 3 или 4 дозы, особенно в развивающихся странах. Длительность интервала между дозами может составлять больше или меньше двух месяцев. Оптимальное количество живого вируса для схемы приема в виде однократной дозы или множественных доз и оптимальное время для этих доз могут быть установлены путем стандартных исследований, включающих в себя наблюдение за титром антител и другими реакциями у субъектов.

Вакцина по данному изобретению может также включать в себя другие подходящие живые вирусы для защиты от других заболеваний, например полиовирус. Или же можно давать другие подходящие живые вирусные вакцины для перорального введения в виде отдельной дозы, но в том же самом случае, что и ротавирусную вакцинную композицию по данному изобретению.

Подпись к фиг. 3

Образцы сыворотки крови, полученные от двенадцати 4-6-месячных младенцев, вакцинированных материалом Р33 в соответствии с тем, как описано в статье Уассте (1998), тестировали в отношении нейтрализации Р33, Р38, Р43 и 89-12С2.

Диапазон титров нейтрализации для всех протестированных образцов сыворотки крови является одним и тем же для Р33, Р38 и Р43. Статистический анализ не продемонстрировал значимого различия в общих титрах нейтрализации в отношении всех трех вирусов. Это свидетельствует о том, что конформационные и неконформационные вируснейтрализующие антигеннные детерминанты Р33, Р38 и Р43 в равной степени хорошо распознаются антителами против Р33 в образцах сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р33. Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что вируснейтрализующие антигенные детерминанты, выявленные в этом анализе ίη νίΐτο, не различаются у Р33, Р38 и Р43.

Диапазон титров нейтрализации Р89-12С2 тем не менее значительно отличается от Р33, Р38 и Р43. Это наблюдение свидетельствует о том, что конформацонные и неконформационные вируснейтрали

- 6 005952 зующие антигенные детерминанты Р33, Р38 и Р43 не распознаются в равной степени хорошо антителами против Р33 в образцах сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р33. Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что вируснейтрализующие антигенные детерминанты, выявленные в этом анализе ίη νίΐτο, отличались у 89-12 С2 и Р33, Р38 и Р43.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Примеры

Пример 1. Демонстрация того, что штамм 89-12 в пассаже 26 (Р26) представляет собой смесь вариантов

Секвенирование генов УР4 и УР7 из партий разных пассажей

Было осуществлено секвенирование генов УР4 и УР7 из пассажа Р26 (первичные клетки ПАЗМ), пассажа Р33 (прижившаяся (как противоположность первичной) линия клеток ПАЗМ), пассажа Р41 и пассажа Р43. Экстракт тотальной РНК был подвергнут обратной транскрипции и амплифицирован путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) в одной пробирке/в одну стадии.

Праймеры Ро1а 5Ь1К и Ро1а 29Ь1К обеспечивали амплификацию полного гена УР4, и праймеры Ро1а 1 и Ро1а 2Ь1К обеспечивали амплификацию полного УР7. Материал после ПЦР секвенировали с использованием различных праймеров (см. табл. 1).

Последовательность пассажа Р26 отличалась от последовательности пассажа Р33 на 3 основания (в положениях 501, 788 и 802 п.н. от стартового кодона) в УР4 и на три основания в УР7 (108, 605 и 897 п.н. от стартового кодона).

Развертки последовательности пассажа Р26 для УР4 и УР7 демонстрируют в мутированных положениях наличие последовательности пассажа Р33 как фона. Таким образом, можно видеть, что пассаж Р26 представляет собой смесь по меньшей мере 2 вариантов.

Развертки последовательностей пассажа Р33 представляются однородными для УР4 и разнородными для УР7 (см. табл. 2).

Пассаж Р38 (полученный из пассажа 33) был пассирован 5 раз в клетках Уето и продемонстрировал тот же самый набор последовательностей УР4 и УР7, что и пассаж Р33 (линия клеток ПАЗМ). Таким образом, у популяции Р38 не было значительного изменения по сравнению с Р33.

Таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые для полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР-ОТ) и секвенирования________________________________________

	1 обозн;	последовательность	положение
УР7	Вой 1	ССС ПТ ААА АСА САС ААТ ПС ССТ СТС Θ	-4910 -22’
	Кой 16Ϊ5	СОТ ТАС СТС СП ПА атс тат сот а	·16ΐο10
	Кой 2Ы$	ССТ САС АТС САА САА ПС ТАА ТСТ ААС	1014-988
	Ной 7	САА СТА СТС ААА ТСА АТС АТС С	266-287
	Кой 12	ТСТ ТСА ПТ ПС ТСТ ССА ТСС АС	372-394
	Кой 46	СОТ ТСС ТСА САА ТСА САА АП АСС ТАТ АСТСС	651-682
	Кой 18	ССА СТА ТАС СТА АП ТСТ САТ ТСТ САС СААСС	682-651
УР4	Ной 5	ТСС СП ССС САТ ПТ АТА САС А	2-23
	Кой 6	АП ТСС САС САТ ПА ТАА СС	878-659
	Ной 5Ы$	ТСС СП САС ТСА ПТ АТА САС А	2-23
	Ной 6Ь:з	АП ТСА 6АС САТ ПА ТАА ССТ АС	878-856
	Ной 25	ССА СТА СТА ТАТ САА АСТ АСА ААТ ААТ АС	268-296
	Ной 26	СТА ПА ПТ СТА СП ТСА ТАТ АСТ АСТ СС	296-268
	Ной 27Ь|5	ТСС АТА САС ТАТ ААС АСА ССА САА С	721-745
	Ной 28	ПС АП ААС ПС ТСС ТСТ СП АТА СТС	753-727
	Ной 31	СТА ТАТ СТА САС ТАТ ТСС САТ С	1048-1070
	Ной 32	САТ ССС ААТ АСТ СТА САТ АТА С	1070-1048
	Ной 45	ТСТ ААС ТСС ССС ААА АТС САА СС	1205-1227
	Ной 53	ССТ ТСС АП ПС ССС САС ПА СА	1227-1205
	Ной 54	СТА АСА САА САТ ПА САС ССС СА	1465-1487
	Ной 55	ТСС ССС ТСТ ААА ТСТ ТСТ СП АС	1487-1465
	Ной 40	СП САТ ССТ САТ САА ССА ССА ТСТ С	1703-1727
	Ной 39	САС АТС СТС СП САТ САС САТ САА 6	1727-1703
	КОЙ 33	ССА ТСА ТАТ ССА АТА ПА ААС САТ 6	2008-2032
	Ной 34	САТ ССТ ПА АТА ПС САТ АТС АТС 6	2032-2008
	Ной 29015	АСС СП САС АСА АП ТАС АП СТА С	2335-2311

- 7 005952

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые в гибридизации

	обозначение	последовательность	положение
νΡ7	Ко!а 41 КоЕа42	АСТ АТТ ПА ТАС ТАТ АСТ АСА ПА ТАТ ТАА ТС АСТ АП ПА ТАС ТАТ ССТ АСА ПА ТАТ ТАА ТС	882-913 882-913
УР4	Кой 15 КоЕа 16 КоЕа 35 КоЕа 36	АТС ССС АП АТА СТС САТ ТСС ПТ С АТС ССТ АП АТА СТС САТ ПС ПТ С АТС ССС АП АТА СТС САТ ПС ПТ С АТС ССТ АП АТА СТС САТ ТСС ПТ С	807-783 807-783 807-783 807-783

Основания, выделенные в табл. 2 жирным шрифтом, представляют собой места специфического изменения последовательностей у ΥΡ4 и ΥΡ7.

Таблица 3. изменение последовательности генов УР4 и УР7 3.1

УР4	УР7
	501 п.н. 167 а/к (аминокислота)	788 п.н. 263 а/к	802 п.н. 268 а/к	108 п.н. 36 а/к	605 п.н. 202 а/к	897 п.н. 299 а/к
Р26 (ПАЗМ)	А	Θ/Α	С/А	А	СП	А
РЗЗ (ПАЗМ)	Т	А	А	Θ/Α	Т/С	Α/Θ
Р38 (УЕКО)	Т	А	А	А/6	т	Θ/Α
Р43 (УЕЯО)	т	А	А	А	т	А

Ν.Β. Во втором клоне из 3-х клонов, которые были развиты до уровня продуцирующей партии, нуклеотид в положении 897 УР7 представляет собой скорее О, чем А, как в выделенном клоне Р43. В результате это дает метионин вместо изолейцина в аминокислотной последовательности. Варианты, соответствующие как выделенному клону Р43, так и клону, у которого в УР7 в положении 897 п.н. от стартового кодона находится О, экскретировались в стуле младенцев, которые были вакцинированы материалом Р33.

В табл. 3.1 там, где в определенном положении указаны два альтернативных основания, первое из этих двух представляет собой основание, которое обнаруживается в значительной популяции, и второе представляет собой основание, которое обнаруживается в незначительной популяции. Значительные и незначительные популяции вариантов расцениваются по силе сигнала при секвенировании.

3.2

Табл. 3.2 демонстрирует аминокислотные замены, являющиеся результатом различий в нуклеотидах между вариантами.

Таблица 4______

	УР4 (положения 788 - 902)	УР7 (положение 897)
	С-6	А-А	Α-Θ	С-А	А	с
Зонды	КоЕа 15	КоЕа 16	КоЕа 35	КоЕа 36	КоЕа 41	КоЕа 42
Пассажи
Р26	-	+	+	+	но	НО
РЗЗ		+	-	-	++	+
Р38	-	+	-	-	+	++
Р43	-	+	-	-	+	-

- 8 005952

Слот-блот-гибридизация

Изменения в популяциях от пассажа Р26 к пассажу Р33 в клетках ПАЗМ в дальнейшем были подтверждены слот-блот-гибридизацией. Фрагменты генов УР4 и УР7, произведенные при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР-ОТ), гибридизовали с олигонуклеотидными зондами, специфичными для каждого варианта (см. табл. 3.1 и 3.2). В отличие от Р26, который гибридизовался с Во1а 16, Ро1а 35 и Ро1а 36, но не с Ко!а 15, ПЦР-фрагмент УР4 материала Р33 в положениях 788 и 802 гибридизовался только с Во1а 16, но не с Во1а 15, или Ро1а 35, или Ро1а 36. Эти результаты установили наличие по меньшей мере 3 вариантов в Р26 (см. табл. 4).

Для ПЦР-фрагмента УР7 материала Р33 в положении 897 происходила гибридизация с Во!а 41 и Ро1а 42. Эти результаты установили наличие по меньшей мере двух вариантов в материале Р33.

Пример 2. Выделение и характеристика клона Р43

Для выделения компонентов Р33 в виде однородной вирусной популяции осуществляли три конечных разведения Р33/ПАЗМ в клетках Уего и полученный в результате вирус использовали для инфицирования клеток Уего.

Лунки с положительным результатом были отобраны с использованием двух критериев: рост, демонстрируемый самым большим числом очагов, обнаруживаемых в лунках, и наиболее выделяющиеся лунки с положительным результатом на планшетах в соответствии с тем как это делается классически. После 3 пассажей путем конечных разведений в 96-луночных титрационых микропланшетах 10 лунок с положительным результатом были последовательно амплифицированы в клетках Уего и оценены в отношении их выхода.

Основываясь на выходе, три клона развили до уровня пассирования производящей партии. Было показано, что иммунологическое распознавание поликлональными антителами близко как между тремя клонами, так и между этими клонами и Р33. Однородность клонов оценивали слот-блот-гибридизацией. Конечное выделение единственного клона было основано на выходе и последовательности.

Выделенный клон амплифицировали путем последовательных пассажей в клетках Уего для получения контрольного посевного материала, рабочего посевного материала и конечных производящих партий.

Выделенный клон генетически характеризовали на различных уровнях пассирования путем секвенирования УР4 и УР7 (идентичность) и путем специфичной слот-блот-гибридизации УР4 и УР7 (гомогенность) материалов, амплифицированных ПЦР. Последовательности генов УР4 и УР7 материала Р43 представлены на фиг. 1 и 2 соответственно, и они идентичны Р41.

Однородность выделенного клона оценивали путем избирательной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов, способных различать нуклеотидные замены в областях УР4 и/или УР7 для каждого варианта, идентифицированного при секвенировании Р26/первичные ПАЗМ (см. табл. 4).

Фрагмент УР4 гибридизовался с Во!а 16, но не с Во!а 15, Ро1а 35 или Ро1а 36.

Фрагмент УР7 гибридизовался с Во!а 41, но не с Во!а 42.

Эти результаты подтвердили, что Р43 представляет собой однородную популяцию.

Пример 3. Удаление потенциального случайного вируса

Эфир добавляли к Р33 (рост в ПАЗМ) до конечной концентрации 20% в течение 1 ч. Затем эфир выдували Ν₂ в течение 35 мин. Не наблюдали никакого влияния на титр посевного материала Р33.

Пример 4. Приготовление препарата живой ослабленной вакцины

Производящие партии, описанные выше, готовили в виде препарата для перорального введения младенцам следующим способом.

1. Лиофилизированный вирус

Для приготовления доз вируса используются стандартные способы. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 10^6,2 БОЕ/мл. Разведенный вирус затем дополнительно разводят лиофилизационным стабилизатором (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 10^5,6 БОЕ/мл. Аликвоты по 0,5 мл стабилизированной вирусной композиции асептически переносят во флаконы на 3 мл. Каждый флакон затем частично закрывают резиновой пробкой, образец сушат вымораживанием в вакууме, затем флакон закрывают полностью и обжимают вокруг флакона алюминиевую крышку, чтобы поддерживать пробку на месте.

Для использования вирус разводят в одном из следующих антацидных разбавителей:

(а) Цитратный разбавитель:

Цитрат натрия растворяют в воде, стерилизуют путем фильтрации и асептически переносят в емкости для разведения в количестве по 1,5 мл при концентрации 544 мг №₃Цитрат-2Н₂О на дозу 1,5 мл. Емкости для разведения могут представлять собой, например, флаконы на 3 мл, или флаконы на 4 мл, или шприцы на 2 мл, или сжимаемые мягкие пластиковые капсулы для перорального введения. В качестве варианта поддержания стерильных компонентов в стерильных условиях, конечную емкость можно автоклавировать.

- 9 005952 (б) Разбавитель А1(ОН)₃

Стерильную суспензию гидроксида алюминия (товарный знак Му1аи!а) асептически разводят стерильной водой, асептически переносят в емкости для разведения (например шприцы на 2 мл или сжимаемые мягкие пластиковые капсулы) в количествах по 2 мл, содержащих по 48 мл А1(ОН)₃. Альтернативой использования стерильных компонентов в стерильных условиях является γ-облучение суспензии гидроксида алюминия (предпочтительно на стадии разведения).

Для предотвращения осаждения суспензии включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают в себя, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и кремниевые полимеры. Также можно включать бактериостатические агенты, например бутилпарабен, пропилпарабен или другие стандартные бактериостатические агенты, используемые в продуктах питания, а также корригенты.

2. Лиофилизированный вирус с А1(ОН)₃ в жидком препарате

Стандартные способы используют для приготовления доз вируса. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 10^6,2 БОЕ/мл. Суспензию гидроксида алюминия добавляют для достижения конечного количества 48 мг/дозу и вирусную композицию разводят лиофилизационным стабилизатором (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 10^5,6 БОЕ/мл. Аликвоты по 0,5 мл стабилизированной вирусной композиции асептически переносят во флаконы на 3 мл. Затем осуществляют лиофилизацию и закупорку флаконов как описано в части 1.

3. Лиофилизированный вирус с А1(ОН)3 для представления в блистерной форме

Для приготовления доз вируса используют стандартные способы. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 10^6,2 БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия для достижения конечного количества 48 мг/дозу и эту вирусную композицию разбавляют лиофилизационным стабилизатором, который может представлять собой сахарозу, декстран или аминокислоту 4%, или желатин, или растительный пептон, или ксантан до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 10^5,6 БОЕ/мл. Осуществляют операцию асептического заполнения, чтобы перенести дозы по 0,5 мл или, предпочтительно, меньшие в углубления блистерных упаковок. Композицию подвергают лиофилизации и углубления блистерных упаковок термически запаивают.

Для предотвращения осаждения суспензии гидроксида алюминия возможно включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают в себя, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и кремниевые полимеры. Можно также включать корригенты.

Пример 5. Вирусное титрование ротавирусов для различных препаратов

5.1: Сравнение препаратов на основе лактозы и сахарозы__________________________

Партия №	Композиция препарата	Титр вируса до лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
98606/01	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	10ίΖ2	ТсР7
98Θ06/03	Сахароза; 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	1(4®

Ротавирус Р43 был приготовлен в виде препарата или с сахарозой или с лактозой в соответствии с тем как показано в таблице, представленной выше. Вирусное титрование до лиофилизации представляет собой титр вируса в полностью приготовленной в виде препарата жидкости (содержащей сахарозу, декстран, сорбит, аминокислоты) без осуществления стадии лиофилизации.

Хорошие результаты являются такими, когда достигается уменьшение на стадии лиофилизации < 0,5 1од и уменьшение за «1 неделю при 37°С» (ускоренный тест на стабильность) < 0,5 1од.

Точность вирусного титрования составляет приблизительно +/- 0,2 1од.

- 10 005952

Результаты указывают на то, что вместо лактозы может использоваться сахароза. 5.2: Влияние аргинина и замены сорбита на мальтит:_________________________

Партия Ыя	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = нулю после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
98116/01	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	До*®	То*®
98116/02	Лактоза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% Аргинин: 3%	104И	104'®
981.16/04	Лактоза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2% Аргинин: 3%	ю4·'	То®

Эти результаты демонстрируют, что добавление аргинина (который, как известно, улучшает стабильность вируса во время лиофилизации и также обеспечивает основную среду, для того чтобы компенсировать кислотность желудка) поддерживает титр вируса.

Сорбит стремится уменьшить температуру стеклования лиофилизированного брикета в слишком большой степени. Это можно преодолеть, используя мальтит вместо сорбита, как показано выше, и титр вируса все так же поддерживается.

5.3: Композиции различных препаратов

Этот эксперимент демонстрирует, что возможно большое количество препаратов.

Партия №	Композиция препарата	Титр вируса до лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
99С11/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	10524	Ю5 07
99С11/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 3%	10аиа	104щ

- 11 005952

	Аминокислоты: 2%
99С11/04	Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2%	104,а9	юь'ио

Партия №	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = нулю после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
99С17/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	ю5·40	105'41
99С17/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 1,5% Аминокислоты: 2%		ю4-а3
99С17/03	Сахароза: 2% Декстран: 4% Аминокислоты: 2%	10ь.а1
99С17/04	Сахароза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 3% Аминокислоты: 2%	104·4Ζ	То*43
99С17/05	Сахароза: 2% Декстран: 4% Мальтит: 1,5% Аминокислоты: 2%	70^	ЦдТЭД
99С17/06	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3%	ю13,44	10497
99С17/07	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 1,5%	105'11	ю4·89

- 12 005952

5.4 Ассоциация ротавируса с антацидным средством А1(ОН)₃

Ротавирус	А1(ОН)3	Н2О	Время контакта при комнатной температуре	Центрифугирование	Титр вируса в супернатанте, в БОЕ/мл	Титр вируса в осадке, в БОЕ/мл
10* БОЕ/мл	48 мг в 0,240 мл	0,76 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	юао°
1056 БОЕ/мл	0,48 мг в 0,240 мл	0,76 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин
105,6 БОЕ/мл		1 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин
Ротавирус в лиофилизированном осадке	12 мг в 0,120 мл	1,380 мл	30 мин	8000 об/мин, 10 мин	Ниже предела обнаружения	Ίο*7

А1(ОН)₃ используется в качестве антацидного средства. Это показывает, что ротавирус ассоциирует с нерастворимой неорганической солью (А1(ОН)₃), поскольку он центрифугируется вместе с А1(ОН)₃ (уменьшение вирусной активности в супернатанте).

5.5: Растворение антацидного средства А1(ОН)₃ в цитрате натрия перед титрованием вируса

Образцы вируса	Растворение	Условия	Титры вируса, БОЕ/мл
Жидкий препарат 99В10/06 перед лиофилизацией; 105,«	1,5 мл ЫазЦитрата	24 часа при комнатной температуре	ίο531
Лиофилизированный 99В10/06:10е'43	1,5 мл №зЦитрата	24 часа при комнатной температуре	ю4а3

Когда ротавирус ассоциирован с А1(ОН)3, можно все подвергнуть лиофилизации (включая А1(ОН)3). После лиофилизации можно выделить ротавирус путем растворения А1(ОН)3 в цитрате натрия. Эта стадия не вредит ротавирусу и позволяет сохранить его активность после этой стадии растворения.

5.6: Инфекционность ротавируса после высвобождения из ассоциации А1(ОН)₃-ротавирус:

Механизм высвобождения вируса (путем растворения носителя) может очень хорошо происходить ίη νίνο. Действительно, при значениях рН ниже 6 гидроксид алюминия становится полностью растворимым, и, таким образом, ротавирус будет высвобождаться в желудке.

А1(ОН)₃ + 3Н⁺ А1⁺⁺⁺ (водорастворимый) + 3 Н₂О

В желудке ионы А1⁺⁺⁺ не всасываются (ТТРотееН, К. .Тидбаойяпдй апб К. Р. Н. Тйошркоп, Тйе гсди1а1юп о! штега1 абкогрйоп ίη 1йе ца81го1Ше8(1па11гаск, Ргосеебтдк о! 1йе Жйгйюп 8ос1е1у (1999), 58, 147-153).

В кишечнике вследствие увеличения рН выпадают в осадок нерастворимые формы алюминия (А1(ОН)₃ или А1РО₄), и они удаляются естественным путем.

Не известно, способен ли вновь образующийся осадок А1(ОН)₃ (или А1РО₄) повторно ассоциировать с ротавирусом. Вследствие этого возникает вопрос об инфекционности самой ассоциации А1(ОН)₃ротавирус.

Возможно также высвобождение ротавируса из ассоциации А1(ОН)3-ротавирус по другим механизмам. Например, лизин мешает адсорбции вируса на А1(ОН)3. Известно, что другие анионы, как, например, борат, сульфат, карбонат и фосфат, специфически адсорбируются на гидроксиде алюминия, таким образом, теоретически должно быть возможно вытеснение (ввиду конкуренции за сайт адсорбции) ротавируса из ассоциации А1(ОН)3-ротавирус.

- 13 005952 □КУС003А46 +

мгА1(ОН)₃ в 0,120 мл +

мглизина

1,380 мл Н₂О +

мин, комн. т.

+

Центрифугирование

8000 об/мин, 10 мин

Осадок +

Супернатант растворение в цитрате ниже предела обнаружения 3,8

Таким образом, ротавирус может быть высвобожден из ассоциации ротавирус- А1(ОН)₃, и высвобожденный ротавирус остается активным.

Это высвобождение можно осуществлять или путем растворения А1(ОН)₃ (НС1 в желудке, или Να₃ Цитратом ίη νίίτο) или путем вытеснения ротавируса основной аминокислотой (лизином).

5.7: Инфекционность ассоциации А1(ОН)₃-ротавирус

Разовую дозу лиофилизированного ротавируса развели в воде и разделили на две части. В первую часть, принятую за эталон, добавили дополнительный объем воды. Во вторую часть добавили 24 мг А1(ОН)₃, суспендированного в 0,240 мл воды (преклиническое титрование вируса).

ϋΚνθ003Α4

0,750 мл	0,750 мл
+	+
0,240 мл	24 мг
Н2О	А1(ОН)3
	в 0,240 мл
1 час	1 час
5,55	6,22

В присутствии А1(ОН)₃ ротавирус является активным и значение титра вируса выше по сравнению с эталонным образцом.

Этот эксперимент был повторен без разделения лиофилизированной дозы и с добавлением 12 мг А1(ОН)₃ или 24 мг А1(ОН)₃.

В данном случае эталонным образцом является тот, который развели цитрат-бикарбонатным буфером. Таким образом, титр вируса снова оказывается выше в присутствии А1(ОН)₃.

- 14 005952

ОНУСООЗА46	ОКУСООЗА46	ОРУСООЗА46
+	+	+
1,5 мл	12 мг	24 мг
буфера	А1(0Н)з	А1(ОН)3
	в 0,120 мл	в 0,240 мл
	+	+
	1,380 мл Н2О	1,260 мл Н2О
5,34	6,24	6,05
5,32	5,95	6,26

Как показано в приведенном выше примере, ротавирус ассоциирует с частицами А1(ОН)₃, поскольку вирус может быть удален центрифугированием. ΌΚ.νθ003Α46 представляет собой лиофилизированный приготовленный в виде препарата ротавирус (сахароза 2%; декстран 4%; сорбит 3%; аминокислоты 2%).

ОКУСООЗА46

ОКУСООЗАДб

12мгА1(ОН)₃ в 0,120 мл

24мгА!(ОН)з в 0,240 мл

1,380 мл Н₂О

1,260 мл Η₂Ο центрифугирован ие

8000 об/мин 10 мин центрифугирование

8000 об/мин 10 мин

Осадок

Супернатант

Осадок

Супернатант <1,44 < 1,44

1,5 мл СДСАК

5,92

6,11 <1,44 <1,44

1,5 мл

СДСАК

5,78

5,96

СДСАК = Сахароза 2%, Декстран 4%, Сорбит 3%, Аминокислота 2%

В соответствии с титрованием вируса, проведенным в супернатанте, количество А1(ОН)₃, необходимое для адсорбции ротавируса, по-видимому, будет небольшим (начиная с одной лиофилизированной дозы 5,7 1од и увеличивая титрование вируса):

- 15 005952

1 А1(0Н)з	Время адсорбции	Титр в супернатанте
12 мг	1 час, КТ (комнатная температура)	2,7
24 мг	1 час КТ	3,4
48 мг	1 час КТ	3,4
72 мг	1 час КТ	2,0
96 мг	1 час КТ	Ниже предела обнаружения
12 мг	В течение ночи	2,7
24 мг	В течение ночи	Ниже предела обнаружения
48 мг	В течение ночи	2,5
12 мг	Немедленно	Ниже предела обнаружения
24 мг	Немедленно	2,0
48 мг	Немедленно I Ниже предела обнаружения

Необходимый для адсорбции ротавируса на А1(ОН)₃ промежуток времени, по-видимому, является коротким.

Одну доза лиофилизированного ротавируса растворили в присутствии 24 мг А1(ОН)₃ и центрифугировали через 0, 15, 60 мин и 24 ч. Осадок ресуспендировали в СДСАК перед титрованием вируса:

Промежуток времени	Осадок	Супернатант
0 мин	5,26	3,17
15 мин	5,34	< 1,44
60 мин	5,96	< 1,44
24 часа	6,13	< 1,44

5.8: Использование СаСО₃ в качестве антацидного средства

Для того, чтобы избежать присутствия алюминия в вакцине, антацидное средство А1(ОН)₃ заменяли другой нерастворимой неорганической солью -СаСО₃ (карбонат кальция).

Явления, наблюдаемые при использовании СаСО₃, подобны явлениям, описанным для А1(ОН)₃: ассоциация ротавируса с неорганической солью; поддержание активности ротавируса, когда он ассоциирован с неорганической солью;

возможность высвобождения ротавируса из ассоциации путем растворения неорганического основания в кислоте;

возможность совместной лиофилизации антацидного средства и ротавируса.

Ассоциация СаСО3 и ротавируса

В первом испытании лиофилизированный ротавирус (титр вируса 5,7) разводили суспензией СаСО₃ в воде (50 мг в 1,5 мл), затем центрифугировали и титр вируса в супернатанте сравнивали с осадком.

- 16 005952

ОНУСООЗАДб +

мг СаСОз в 1,5 мл Н₂О + центрифугирование 8000 об/мин 10 мин

ОКУСООЗА46 +

мг СаСОз в 1,5 мл Н₂О + центрифугирование 8000 об/мин 10 мин

Осадок Супернатант +

1,5 мл

Ыа Цитрата

5,88 4,33

Осадок Супернатант

1,5 мл

СДСАК

5,83 4,46

Это указывает на то, что более 90% ротавируса ассоциировало с СаСО₃.

Также, когда вирус был ассоциирован, можно было осуществить титрование и извлечь исходные количества вируса.

Кроме того, титры вируса слегка превышают титры, полученные без СаСО₃.

Количество СаСО₃ и ассоциация ротавируса

Лиофилизированный ротавирус разводили суспензией СаСО3 в воде (1,5 мл): 10 мг затем мг

100 мг, с осадком.

и в

СаСОз	Незамедлительно + центрифугирование	1 час + центрифугировние
	Осадок	Супернатант	Осадок	Супернатант
100 мг	4,57	3,01	4,79	3,09
50 мг	4,14	4,15	4,22	3,86
10 мг	3,17	4,77	3,87	4,87

Таким образом, очевидно, что чем больше СаСО₃, тем больше вируса ассоциировано и меньше обнаруживается в супернатанте. Тем не менее, вся доза полностью не высвобождается (ожидается в сумме по меньшей мере, 5,3 или даже 5,8, как получалось ранее - описано выше).

Защита ротавируса с использованием СаСО₃ во время малого антацидного титрования Россета-Райса (ВаЬу Во88ей-К1се ап1ас1б ΙίίΓαΙίοη)

Используя 10 доз лиофилизированного ротавируса (ПКУС003Л46) и 50 мг СаСО₃, осуществляли два типа малого титрования Россета-Райса:

В классическом титровании Россета-Райса антацидное средство смешивают с ротавирусом и в эту

- 17 005952 среду выливают НС1.

В обратном малом титровании Россета-Райса, ситуация противоположная: антацидное средство прикапывают в НС1 (как это происходит ίη νίνο).

Классическое малое титрование Россета-Райса
Лиофилиз. ротавир., хранящийся при:	Буфер	Теоретический титр вируса	Измеренный титр вируса
4°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
-80°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
4°С	24 мгА1(ОН)3	5,4	<2,9
-80°С	24 мгА1(ОН)з	5,4	<2,9

Обратное малое титрование Россета-Райса
Лиофилиз. ротавир., хранящийся при:	Буфер	Теоретический титр вируса	Измеренный титр вируса
4°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
-80°С	60 мг СаСОз	5,3	4,6
4°С	24 мгА1(ОН)3	5,4	<2,9
-80°С	24 мгА1(ОН)з	5,4	<2,9

Таким образом, в этом эксперименте ίη νίίτο карбонат кальция способен защитить приблизительно 20% ротавируса от присутствующей НС1, тогда как гидроксид алюминия не способен это делать.

5.9: Лифилизация ротавируса в присутствии антацидного средства СаСО₃

Партия №	Композиция	Титр вируса в момент времени = нулю после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
99К08/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%		10*’1ϋ

- 18 005952

	СаСО3: 50 мг
99К08/02	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг
00С24/01	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг Ксантан: 0,3%
00С24/03	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3:60 мг Ксантан: 0,3%
00Е09/25	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг Ксантан: 0,25%
00Е09/ЗО	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСО3: 60 мг Ксантан: 0,30%
ООГ26/06	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3%
	Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Крахмал: 2%

10ь-1В	10®·’®
	ю4'ъэ
10®“'	ю4“
10®’га	104Э1
10®и1	104В/
	ΐο^ :

Это представляет собой все в одном - лиофилизация ротавируса и антацидного средства (СаСО₃) вместе в одном флаконе. Для предотвращения осаждения СаСО₃ во время стадии заполнения необходимы агенты, регулирующие вязкость. Примеры таких агентов, регулирующих вязкость, включают ксантановую камедь и крахмал.

5.10 Лиофилизированные таблетки для быстрого распада после помещения в ротовую полость:

Следующие препараты демонстрируют концепцию «лиоб», то есть быстрое растворение лиофилизированного брикета в ротовой полости.

- 19 005952

Партия №	Композиция препарата	Титр вируса перед лиофилизацией	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
99В10/06	Сахароза 4% Глутамат натрия 3,7% А1(ОН)э 48 мг	7θ57Π	10*53
99С11/12	Мальтит 3% А1(ОН)3 48 мг Гидрокси пропилметилцеллюлоза: 1%	10*’*	ю3,/а

Партия №	Композиция препарата	Титр вируса в момент времени = нулю после лиофилизации	Титр вируса после лиофилизации и еще 1 недели при 37°С
0ОС24/О5	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%	1Оа·02	104,м
	СаСОз: 60 мг Ксантан 0,3%
00С24Ю6	Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% СаСОз: 60 мг Ксантан 0,3%	104.»	Ю*'аб
00Г26/11	Сахароза: 1% Декстран: 2% Сорбит: 1,5% Аминокислоты: 1% СаСОз: 60 мг Крахмал: 2%	-γθττο —	ю*·40 ~

В концепции лиоб может быть использован как ксантан, так и крахмал (они поддерживают свойство лиофилизированного брикета быстро растворяться).

Пример 6. Применение карбоната кальция в качестве антацидного средства для ротавирусной вакцинной композиции

Когда для ротавируса используется суспензия СаСО₃ в качестве антацидного средства, существует проблема, заключающаяся в том, что частицы карбоната кальция быстро осаждаются при помещении в воду, поскольку величина плотности порошка достигает 2,6 и средний размер частиц составляет 30 мкм.

Осаждение можно замедлить путем

1. увеличения плотности окружающей среды

2. увеличения вязкости окружающей среды

3. уменьшения размера частиц

4. удерживая частицы на расстоянии друг от друга

6.1: Увеличение плотности окружающей среды:

Когда суспензию СаСО₃-вода (помещенную в шприц) вносят на лиофилизированный осадок (содержащий сахарозы 2%, декстрана 4%, сорбита 3%, аминокислот 2%), плотность окружающей среды увеличивается, но скорость осаждения СаСО3 не очень сильно отличается от суспензии СаСО3-вода.

6.2 Увеличение вязкости окружающей среды:

Псевдопластические эксципиенты

Псевдопластический раствор определяют как раствор, имеющий более высокую вязкость при стоя

- 20 005952 нии по сравнению с его вязкостью при перемешивании.

Обычными эксципиентами этого типа являются следующие: природные полимеры, например: гуммиарабик трагакантовая камедь агар-агар альгинаты пектины полусинтетические полимеры, например: карбоксиметилцеллюлоза (Ту1о5С5 С®) метилцеллюлоза (МеШосек А®, Уксойаик МС®, Ту1о5С МН® и МВ®) гидроксипропилцеллюлоза (К1исек®) гидроксипропилметилцеллюлоза (МеШосек Е® и К®, УксопЩиъ МРНС®) Как правило, эти псевдопластические эксципиенты используют вместе с тиксотропными агентами.

Псевдопластические эксципиенты с низкой текучестью

Эти полимеры, взятые в достаточной концентрации, приводят к структурной жидкостной перегруппировке, приводящей в результате к раствору с высокой вязкостью, обладающему низкой текучестью при стоянии. Некоторое количество энергии необходимо подвести к системе для того, чтобы дать ей возможность течь и обеспечить перемещение. Требуется энергия извне (перемешивание) для временного разрушения структурной жидкостной перегруппировки для получения жидкого раствора. Примеры таких полимеров представляют собой СагЬорок® и ксантановую камедь.

Тиксотропные эксципиенты

С этими эксципиентами при стоянии образуется структура геля; тогда как при перемешивании образуется жидкий раствор.

Примеры тиксотропных эксципиентов представляют собой: Уеедит® (Магниево-алюминиевый силикат) и Ау1се1 ВС® (приблизительно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Ναкарбоксиметилцеллюлозы).

6.3 Уменьшение размера частиц

Уменьшение размера частиц СаСО₃ приводило в результате к уменьшению антацидной способности этого соединения.

6.4 Удерживание частиц на расстоянии друг от друга

Это происходит в Уеедит® и Ау1се1®, нерастворимые частицы которых, меньшие (приблизительно 1 мкм) чем частицы СаСО₃, помещают между частицами СаСО₃ для предотвращения аггрегации.

Пример 7: Исполнение продукта

Следующие схемы демонстрируют примеры возможных вариантов исполнения продукта.

7.1 СаСО₃ в шприце

Уже имея клинические партии ротавируса в лиофилизированных флаконах, антацидное средство можно помещать в жидкость для разведения, содержащуюся в шприце. ί Шприц с 1,3 мл

СаСОз (60 мг/мл)

Игла

I I Лиофилизированный ротавирус

При таком исполнении продукта осаждение СаСО₃ должно контролироваться не только во время стадий заполнения, но также и в течение всего срока хранения продукта (по меньшей мере 2 г.).

7.2 СаСО₃ в лиофилизированном флаконе

- 21 005952

Шприц с 1,3 мл воды

Игла

Лиофилизиро ванный сосуд с ротавирусом + СаСОз (60 мг), ксантан

7.3. Лиофилизация в блистерной упаковке

В этом случае ротавирус, СаСО₃ и ксантановую камедь лиофилизируют вместе непосредственно в блистерной упаковке.

Пример 8. Лиофилизация различных штаммов ротавируса______________________

Партия Ыа

Штамм

Композиция ротавируса препарата

Титр вируса в момент

Титр вируса после времени = лиофилизации и еще 1 недели

кислоты: 2% кислоты: 2% кислоты: 2%

Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% АминоСахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% АминоСахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% АминоСахароза: 2%

Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2%

Сахароза: 2% Декстран: 4% Сорбит: 3% Аминокислоты: 2% нулю после лиофилизации

Штаммы Ό8-1, Р и УА70 описаны в качестве стандартных штаммов ротавирусов человека для серотипов С2, 03 и 04 соответственно на странице 1361 в «Не1к8» Βανοη ргскк 1990, кееонк екШоп.

В этом эксперименте лиофилизировали различные штаммы ротавирусов.

Для всех штаммов поддерживали титр вирусов во время лиофилизации и демонстрировали уско- 22 005952 ренную стабильность (одна неделя при 37°С).

Пример 9. Исследования фазы I безопасности одного перорального введения ротавирусной вакцины взрослым людям

Исследования фазы I осуществляли, чтобы оценить безопасность и реактогенность одной пероральной дозы Р43-вакцины, составляющей 10^6,0 БОЕ, для здоровых людей в возрасте от 18 до 45 лет.

Клиническое испытание было дважды слепым и рандомизированным. Исследование включало плацебо-контроль и было изолированным. Это исследование проводилось в одном отдельном центре в Бельгии.

Исследуемая группа

Было зарегистрировано в общей сложности 33 субъекта, из них 11 в группе плацебо и 22 в вакцинируемой группе, и все они полностью прошли исследование. Все добровольцы были представителями кавказской расы. Их средний возраст к моменту вакцинации составлял 35,3 года, при диапазоне от 18 до 44 лет. Испытание началось в январе и продолжалось в течение чуть более одного месяца.

Материал

Вакцина

Клинические партии Р43-вакцины были произведены, очищены, приготовлены в виде препарата и лиофилизированы в соответствии с ОМР (Соой МапиГас!игшд РгасДсе, Качественная производственная практика). Партии были предоставлены для употребления с осуществлением контроля качества и гарантии качества. Каждый флакон вакцины содержал следующие компоненты:

Активный ингредиент:

Штамм Р43 минимум 10^5,8 БОЕ

Эксципиенты. стабилизаторы:

Сахароза 9 мг

Декстран 18 мг

Сорбит 13,5 мг

Аминокислоты 9 мг

Плацебо

Флаконы плацебо были приготовлены и предоставлены для употребления. Каждый флакон плацебо содержал следующие компоненты:

Эксципиенты. стабилизаторы:

Сахароза 9 мг

Декстран 18 мг

Сорбит 13,5 мг

Аминокислоты 9 мг

Разбавитель

Вода для инъекций использовалась в качестве разбавителя для разведения вакцины и плацебо.

Введение

Приблизительно за 10-15 мин до введения вакцины или плацебо субъектам в обоих группах давали перорально по 10 мл Му1ап!а®. Му1ал!а® представляет собой зарегистрированное антацидное средство. Антацидное средство повышает рН желудка и предотвращает инактивацию ротавируса в процессе его прохождения через желудок.

Для приготовления вакцины содержимое двух флаконов лиофилизированного Р43, содержащих 10^5,8 БОЕ на флакон, разводили 1,5 мл разбавителя - воды для инъекций. Это позволило достигнуть рассчитываемого титра вируса, составляющего 10^6,1 БОЕ/дозу. Разведенную вакцину сразу же вводили в виде разовой пероральной дозы.

Приготовляя плацебо, два флакона лиофилизированного плацебо разводили 1,5 мл воды для инъекций и вводили перорально в виде разовой дозы.

Безопасность и реактогенность

Применялись следующие критерии безопасности и реактогенности:

Наиболее важные общие симптомы представляли собой лихорадочное состояние, диарею, рвоту, тошноту, боль в животе и потерю аппетита. Их регистрировали в течение восьми дней после введения.

Симптомы, которые имели меньшую важность, регистрировали в течение 30 дней после введения.

Серьезные побочные явления регистрировали в течение всего периода исследования.

Образцы стула при диарее собирали в течение восьми дней после введения.

Результаты были следующими:

В течение соответствующих периодов наблюдения не было зарегистрировано никаких важных симптомов, никаких менее важных симптомов и никаких серьезных побочных явлений.

Не было зарегистрировано случаев диареи.

Заключение

Р43-Вакцина 8Β Вю1одюак является безопасной сравнительно с плацебо в дважды слепом испытании при пероральном введении в виде разовой дозы 10^6,1 БОЕ здоровым взрослым добровольцам в возрасте от 18 до 44 лет.

- 23 005952

Перечень последовательностей (110) СмитКлайн Бичем Баолоджикалз с.а.

(120) Вакцина (130)В 45194 (160)2 (170) ГазгЗЕО для Атботез Уегзюп 3.0 (210) 1 (211)2350 (212)ДНК (213) Человек (400) 1 ахддсЕЕсас ЕсаЕЕсаоад асаассгсЕс асхааЕссаЕ аЕЕсадсада ЕЕЕасасдас60 дааасададс аааЕЕддахс адаааааасЕ садааЕдЕаа сЕапаааЕсс дддЕссасхе120 дсасадасЕа дахаЕдсЕсе адссааЕЕдд даЕсасддад адаЕааасда сссдасхаса180 дЕадаассаа ЕЕЕЕадасдд ЕССЕсаесад ссаассасаЕ ЕЕасЕссасс ЕааЕдаЕЕас240

ЕддасасЕЕа ссаахЕсааа сасаааЕдда дЕадеасасд ааадсасааа саасадедас300

ЕЕЕЕддасЕд садхсдХЕдс ЕаЕЕдаассд сасдссаасс садхадасад асаасаЕаЕд360 ахаСЕСддЕд ааадсаадса аЕЕЕааЕдгд адЕааедасЕ саааЕаааед даадхЕЕССа420 дааагдЕЕЕа даадсадсад ЕсааааЕдаа СЕЕЕаЕааха дасдЕасаСЕ аасЕЕсхдаЕ480 ассадассед саддаасаЕЕ ЕааахаЕддс ддаададсаЕ ддасаЕЕЕса Еддхдаааса540 ссдададсЕа сЕасЕдасад ЕЕсаадеасх дсаааЕЕЕаа асаахаЕасс ааххасааСЕ600 сасЕсадааЕ ЕЕЕасаЕСаЕ ЕссааддЕОС саддааЕСха аасдЕааеда ахаЕаххаас660 ааЕддхсхдс сассаасЕса аааЕасхада аахдхадххс сахЕдссахЕ ассассхада720 хсдахасадЕ ахаадададс асаадЕхааЕ даадаеахха хадЕСхеааа ааеЕХсахха780 сддааадааа хдсадхахаа садддахаЕЕ ахааххадаЕ ЕЕаааЕЕЕдд хаахадхаСЕ840 дхааадасдд даддасЕадд ссаЕаааЕдд ЕсЕдаааХас сахасааддс адсаааххас900 сааЕасааЕЕ асЕСасдЕда сддхдааеаа дхаассдеас асассаСЕЕд ЕЕсадЕаааЕ960 ддадхдааса аЕЕХхадсса сааЕддаддд хЕЕссассса схдаХЕЕЕдд хасххсаадд1020

ЕаЕдаадЕЕа ссааададаа СЕсЕЕасдЕа хахдсадасх асхдддахда ЕЕсаааадса1080

ЕЕЕадаааЕа ЕддхасасдЕ ЕадаЕсасха дсадсхаахс хаваххсадх дааахдхаса1140 ддЕддаадЕЕ аххаЕЕЕсад сахассадЕа ддедсахддс садЕааЕдаа сддеддсдсЕ1200 дсххсдХЕдс аЕСЕСдеедд адххаеаЕЕа Ессасдсаах хсасхдаххх хдХаЬсахЕа1260 аасЕсаееас даЕссадаЕС садСЕЕдаса дссдаЕдаае сассЕЕЕсЕс ааеасхдада1320 асасдхасад Едаахссдха сддаЕЕасса дссдсхаахс сааахаахдд ааахдаасас1380

Еасдааахах саддааддхх еесжсесвее ЕсхххадхЕс саасхаасда ЕдаЕЕаЕсад1440 аеЕссааЕЕа хдаасхсадЕ дасддхаада саадаЕЕЕад адсдссаасх ЕасЕдаЕЕЕа1500 сдадаадаах ххаасхсасс дхсасаадаа ахадсЕаЕдд сасааехдах ЕдасЕхадса1560 сЕдЕЕдсехс хадасахдСЕ ЕЕссаЕдЕЕЕ ЕсаддааЕха ааадхасааЕ хдаЕссааес1620 ааахсаахдд сдасЕадедс аахдаадааа хххадаааах сааааееадс хасахсаасх1680

Есадааахда схааЕЕсаЕЕ дхсадаедсс дсЕЕсаЕсад сахсаадааа сдсхссхаЕх1740 адахсдаахх ЕаЕсЕдсдаЕ ххсаааХЕдд асхаасдххх саааСдахдЕ дссааасдХа1800 асЕааЕЕсас Едааедасах схсаасасаа асахехасаа ххадхаадаа асЕЕадаЕЕа1860 ааадааахда ххаехсааас хдааддаахд адсххЕдасд асахсхсадс адсхдхасСа1920 аааасааааа хадахаЕдСс хасЕсааахх ддааааааха СЕХхассхда хахадххаса1980 даадсаЕСЕд адаааЕЕХах сесаааасда ЕсаХаЕсдаа хаСЕааадда хдахдаадха2040 аЕддааасса асасхдаадд ааааЕЕсЕЕЕ дсахасаааа ЕЕааЕасаСЕ ЕдаЕдаадЕд2100 ссаЕссдасд хааахааахх сдсЕдаасЕа дхаасадасх ссссадххах ассадсдаха2160 ахсдасхеха адасаххдаа ааасхсаааЕ даЕааххахд даахсасЕсд хасадаадсд2220 ххааахххаа хсааахсдаа хссаааЕасд ссасдхаасЕ хсаххаахса ааахаассса2280 аххахаадда асадаасхда асадххааЕа схасааедеа ааесдхдада аедссасхда2340 ддахдхдасс2350

- 24 005952 (210)2 (211) 1009 (212) ДНК (213) Человек (400)2 яЕдЕаЕсдЕс ссддлсаслс сасмеесел зссссЕссдд сассаассае сасаеассаа аассадсаас ссджасаасд даесасасса саеасадасе еасдеадсаС ЕяЕЕЕдсеЕЕ дасаададсс садаасеасд ддссЕаасЕГ адассаахдд асассдсаса сдесаасссс асссаадаад даасаесссс Ца^дЕС'где аесаессаас сдаадсаадс асссааасса асдасддсда ьсаЕсдссас ааасдссссс сасааааддс сддссааеад дассадссса сасссаадеа ссдссдаесс ЕСССдЕсдаЕ ссасаассаг аседсдасса ссаасдааас аедассаааа ЕСЕЕдаасса даЕаЕдссад адееадссда сасдсаассс аасддасаса асасеасаЕЕ аЕЕаЕсааса гсааасаадс ддаеаЕсаае дддассасса сдсассдсда аадсдсдссс ссСасссаас ессдседасс ассааеааса аасаессаса ЗЕддааадас СССЕааадад сааессадеа ЕЕсаасассд аседддадаа асЕдааеасд саааЕдЕЕад дааЕаддЕсд ссааасааеа аасдсадасЕ сдсЕСдааас аасдааааас садсгаЕадЕ ддасдссдЕЕ дасаддаиаа аЕсагааааЕ асеасдасаЕ дсасЕаЕЕсд аааЕЕдеаад аадЕсаддсс саадададаа асасаадЕЕд деддсеееаа ЕдсаЕЕэдас асаасадсад аЕссаасдас ассдададаа сдасдададс дааЕЕддааа ааагддсддс аадЕаЕЕЕЕа дассасасса ассаааЕсдЕ дсаддсааЕд ЕссаааадаЕ саадаесаЕС дссЕЕЕЕаЕЕ аЕададЕаЕа дагасассЕЕ адагЕадагс даЕдсдасс ддсЕдсЕдад аааЕЕЕдаеа сдсадсЕдЕа Еаасссасаа сассасадса аааЕЕсЕдса $0

120

180

0

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1009

Claims (23)

1. Ослабленная популяция ротавирусов человека, содержащих нуклеотидную последовательность, представляющую собой единственный вариант, или, по существу, единственный вариант гена УР4 и/или единственный или, по существу, единственный вариант гена УР7.

2. Популяция ротавирусов по п.1, полученная путем клонирования исходной ротавирусной популяции Р33.

3. Популяция ротавирусов по любому из пп.1 или 2, которая происходит от популяции, вызывающей ротавирусную инфекцию человека.

4. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-3, которая реплицируется в людях и экскретируется ими.

5. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-4, где указанный, по существу, единственный вариант гена УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положении 788, или аденин (А) в положении 802, или тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона.

6. Популяция ротавирусов по п.5, где ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона.

7. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-6, где указанный, по существу, единственный вариант гена УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605, или аденин (А) в положении 897, или гуанин (С) в положении 897 от стартового кодона.

8. Популяция ротавирусов по п.7, где ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) или гуанин (С) в положении 897 от стартового кодона.

9. Популяция ротавирусов по пп.5-8, где ген УР4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона; а ген УР7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) в положении 897 от стартового кодона.

10. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-9, обозначенная как Р43 и депонированная в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 99081301.

11. Вариант ротавируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР4, приведенную на фиг. 1, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок УР7, приведенную на фиг. 2.

12. Вариант ротавируса, входящий в состав популяции по п.10, или его потомство.

13. Иммунологически активный компонент варианта ротавируса по п.12.

14. Ротавирусный псевдовирион, содержащий по меньшей мере один иммунологически активный компонент по п.13 или по меньшей мере один сегмент генома варианта ротавируса по п.12.

15. Вакцинная композиция, включающая живую ослабленную популяцию ротавирусов по любому из пп.1-10, смешанную с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом.

16. Вакцинная композиция, включающая живой ослабленный вариант ротавируса, его потомство, иммунологически активный компонент или псевдовирион по любому из пп.11-14, соответственно, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом.

- 25 005952

17. Вакцинная композиция по любому из пп.15-16, приспособленная для перорального введения.

18. Вакцинная композиция по п.17, приготовленная в виде препарата с антацидной композицией.

19. Вакцинная композиция по любому из пп.15-18 в лиофилизированной форме.

20. Вакцинная композиция по п.19, содержащая лиофилизированный живой ослабленный вариант ротавируса и неорганическое антацидное средство, такое как карбонат кальция, и агент, регулирующий вязкость, такой как ксантановая камедь.

21. Вакцинная композиция по п.20, где ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция находятся в отдельных контейнерах для приготовления препарата в виде жидкой вакцинной композиции перед введением.

22. Вакцинная композиция по п.20, где ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция приготовлены в одном контейнере в лиофилизированной форме, которую нужно разводить водным раствором перед введением.

23. Вакцинная композиция по п.19 в форме быстрорастворяющейся таблетки для немедленного растворения при помещении на язык.