ES2260046T3 - Procedimiento para separar variantes rotavirus y vacuna de rotavirus vivos atenuados. - Google Patents

Procedimiento para separar variantes rotavirus y vacuna de rotavirus vivos atenuados.

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ES2260046T3 ES00958452T ES00958452T ES2260046T3 ES 2260046 T3 ES2260046 T3 ES 2260046T3 ES 00958452 T ES00958452 T ES 00958452T ES 00958452 T ES00958452 T ES 00958452T ES 2260046 T3 ES2260046 T3 ES 2260046T3
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Abstract

Una población de rotavirus atenuado humano, que se caracteriza porque comprende una única variante o sustancialmente una única variante, estando dicha variante definida por una secuencia nucleotídica que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.

Description

Procedimiento para preparar variantes rotavirus y vacuna de rotavirus vivos atenuados.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, a procedimientos para prepararlas y a su uso en tratamiento. En particular, la presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas con rotavirus.
La diarrea infecciosa aguda es una causa principal de enfermedad y muerte en muchas zonas del mundo. En los países en desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreica es muy importante. Se ha estimado que en Asia, África y Latinoamérica existen entre 3-4 billones de casos de diarrea cada año y, de estos casos, alrededor de 5-10 millones tienen como resultado la muerte (Walsh, J.A. y col.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).
Se ha reconocido que los rotavirus son una de las causas más importantes de diarrea intensa en lactantes y niños pequeños (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, editado por Fields y col., Raven Publishers, Filadelfia, 1996). Se ha estimado que la enfermedad por rotavirus es responsable de alrededor de un millón de muertes anuales. La enfermedad inducida por rotavirus afecta principalmente a niños de edades comprendidas entre los 6 y los 24 meses, y la prevalencia máxima de la enfermedad suele producirse durante los meses más fríos en climas templados y durante todo el año en zonas tropicales. Los rotavirus se transmiten típicamente de una persona a otra por la vía oro-fecal, con un periodo de incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. Al contrario que la infección en el grupo de 6 meses-24 meses de edad, por lo general, los neonatos son asintomáticos o solo presentan la enfermedad leve. En contraste con la enfermedad grave que se suele encontrar en niños pequeños, la mayoría de los adultos están protegidos como resultado de infecciones previas por rotavirus, por lo que en la mayoría de los adultos las infecciones son leves o asintomáticas (Offit, P.A. y col. Comp. Ther., 8(8):21-26,
1982).
En general. los rotavirus son esféricos y su nombre deriva de su característica estructura de cápside de cubierta externa e interna o de doble cubierta. Normalmente, la estructura de la cápside de doble cubierta de un rotavirus rodea una cubierta proteica interna o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un rotavirus está compuesto por 11 segmentos de de ARN bicatenario que codifica al menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales, denominadas VP4 y VP7 (proteína G) están dispuestas en el exterior de la estructura de cápside de doble cubierta. La cápside interna del rotavirus presenta una proteína, que es la proteína del rotavirus denominada VP6. La importancia relativa de estas proteínas concretas de los rotavirus en provocar la respuesta inmunitaria que sigue a la infección por rotavirus todavía no está clara. No obstante, la proteína VP6 determina el antígeno del grupo y subgrupo y las proteínas VP4 y VP7 son los determinantes de la especificidad de serotipo.
La proteína VP7 es una glucoproteína de PM de 38.000 (PM de 4.000 cuando no está glicosilada) que es el producto de la traducción del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación del principal anticuerpo neutralizante tras la infección por rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada de aproximadamente 88.000 de PM, que es el producto de la traducción del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula el anticuerpo neutralizante tras la infección por rotavirus.
Dado que las proteínas VP4 y VP7 son la proteínas víricas contra las que están dirigidos los anticuerpos neutralizantes, se cree que son los candidatos primarios para el desarrollo de vacunas de rotavirus, proporcionando protección contra la enfermedad por rotavirus.
Se sabe que la infección natural por rotavirus durante la primera etapa de la infancia produce inmunidad protectora. Por tanto, es deseable una vacuna contra rotavirus con microorganismos vivos, atenuados. Preferentemente, esta debería ser una vacuna oral, ya que esta es la vía natural de adquirir la infección del virus.
El primer desarrollo de vacunas para prevenir las infecciones por rotavirus comenzó en la década de 1970 tras el descubrimiento del virus. Inicialmente, se estudiaron las cepas atenuadas de animales y seres humanos, con resultados mixtos o decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se han centrado en reagrupados de seres humanos-animales que han tenido más éxito.
Ward ha descrito una cepa de rotavirus conocida como 89-12; véase la patente de EE.UU. nº 5.474.773 y Bernstein, D. L. y col., Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. La cepa 89-12 se aisló de una muestra de heces recogida de un niño de 14 meses de edad con una enfermedad natural por rotavirus en 1988. De acuerdo con la patente de EE.UU. nº 5.474.773, el rotavirus humano HRV 89-12 se adaptó al cultivo mediante 2 pases en células de riñón de mono verde africano (AGMK) y 4 pases en células MA-104 como describe Ward en J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. A continuación se purificó en placas 3 veces en células MA-104 (hasta el pase 9) y se cultivó tras 2 pases adicionales en estas células. Se realizó un pase adicional (pase 12) para su depósito con el número de registro de la ATCC VR 2272. La cepa depositada se conoce como 89-12C2.
A continuación se hace referencia al artículo de 1998 de Bernstein y col. sobre Vacunas, como el artículo Vacunas (1998). El artículo describe la seguridad e inmunogenicidad de un candidato a vacuna con rotavirus humanos vivos administrada por vía oral. Esta vacuna se obtuvo de la cepa 89-12, atenuada mediante pases sin purificación en placas 26 veces en células AGMK primarias y después otras 7 veces en una línea celular AGMK establecida (33 pases en total).
En lo sucesivo, el material mencionado anteriormente que se ha sometido a 26 pases seriados se denominará P26 y el material que se ha sometido a 33 pases seriados se denominará P33. En general, los rotavirus derivados de n pases de la cepa 89-12 se denominarán Pn.
En los ejemplos siguientes el material P33 se pasó otras 5 veces en células Vero. Esta se denomina P38.
Los aislamientos P26 y P33 descritos en el artículo Vacunas (1998) no se depositaron en una recolección de cultivo, ni tampoco se sometieron a análisis para establecer su caracterización genética.
En la actualidad se ha descubierto que la población P26 descrita en la literatura comprende una mezcla de variantes. Esta se ha establecido mediante caracterización genética como se describe en la presente memoria descriptiva a continuación (véanse los ejemplos). Por tanto, la P26 no es una población fiablemente consistente para más pases, en particular para la producción de lotes de vacunas. De igual forma, la P33 comprende una mezcla de variantes y no es fiablemente consistente para la producción de lotes de vacunas.
Se ha descubierto que el material P26 es una mezcla de al menos tres variantes del gen VP4. P33 y P38 son, de igual forma, una mezcla de dos variantes. Estas variantes parecen ser antigénicamente diferentes en términos de epítopos neutralizantes a la cepa 89-12C depositada en la ATCC al evaluar los títulos de anticuerpos neutralizantes de sueros de lactantes vacunados con P contra estas variantes. Esto se ilustra en la Figura 3.
Además, se ha descubierto que cuando el material P33 se administra a lactantes se replican y excretan dos variantes identificadas. De 100 lactantes vacunados, Solo 2 mostraron signos de gastroenteritis debida a la infección con rotavirus, mientras que el 20% de un grupo tratado con placebo estaba infectado. Estos hallazgos sugieren que las variantes identificadas están asociadas con la protección de la enfermedad por rotavirus.
La presente invención proporciona un procedimiento para separar variantes de rotavirus y una vacuna de rotavirus atenuados vivos mejorada derivada de una cepa de rotavirus humana clonada (homogénea).
En consecuencia, de acuerdo con un primer aspecto la presente invención proporciona una población de rotavirus atenuados (aislamiento), que se caracteriza porque comprende una variante única o sustancialmente una variante única, definida dicha variantes por la secuencia nucleotídica que codifica al menos una de las principales proteínas víricas denominadas VP4 y VP7.
Preferentemente, la población de rotavirus según la invención es una variante clonada.
Por población que comprende una única variante, o sustancialmente una única variante, se quiere decir una población de rotavirus que no contiene más del 10%, y preferentemente menores del 5% y más preferentemente menos del 1% de una variante o variantes diferentes. Las poblaciones de virus se pueden purificar hasta homogeneidad u homogeneidad sustancial mediante pases en tipos de células adecuados o realizando una seria de una o más etapas de clonación.
Una ventaja de la invención es que una población que comprende una única variante es más adecuada para la formulación de un lote de vacuna consistente. Variantes concretas definidas por secuencias nucleotídicas que codifican la principal proteína vírica también pueden asociarse con eficacia potenciada en la prevención de la infección por rotavirus.
En un aspecto preferido, la única variante o la sustancialmente única variante en la población de rotavirus de la invención es una variante en la que el gen de VP4 comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una de las siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.
En otro aspecto preferido, la única variante o la sustancialmente única variante en la población de rotavirus de la invención es una variante en la que el gen de VP7 comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una de las siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación. Preferentemente en la posición 897 hay una adenina
(A).
En un aspecto preferido la única variante en la población según la invención presenta una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación en la secuencia del gen
de VP4.
En otro aspecto preferido la única variante en la población según la invención presenta una timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la posición 897 desde el codón de iniciación en la secuencia de VP7. Más preferentemente en la secuencia de VP7 hay una adenina (A) en la posición 897.
En un aspecto especialmente preferido la única variante en la población según la invención presenta una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación en la secuencia génica VP4, y una timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la posición 897 desde el codón de iniciación en la secuencia VP7. Más preferiblemente, en la secuencia VP7 hay una adenina (A) en la posición 897.
En otro aspecto la única variante comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP4, en la que la secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 1, y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP7, en la que la secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 2.
La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una población de rotavirus que comprenden una variante sustancialmente única, donde el procedimiento comprende:
el pase de una preparación de rotavirus en una tipo celular adecuado;
opcionalmente seleccionar un cultivo homogéneo usando las etapas de:
a) dilución límite; o
b) aislamiento en placas individual; y
comprobar la presencia de una variante sustancialmente única mediante una determinación de la secuencia de una región adecuada de la secuencia génica de VP4 y/o VP7.
La determinación de la secuencia se puede llevar a cabo de forma adecuada mediante una técnica de hibridación cuantitativa o semicuantitativa tal como hibridación puntual o hibridación en placas.
Preferentemente, la variante seleccionada es una variante que se replica y excreta cuando la preparación de rotavirus de partida se administra a un sujeto humano, en particular un niño.
La población de virus clonado resultante como resultado del procedimiento de acuerdo con la invención puede amplificarse mediante más pases en una línea celular adecuada.
Entre los tipos celulares adecuados para pasar la población de rotavirus en el procedimiento anterior se incluyen células de riñón de mono verde africano (AGMK), que pueden ser líneas celulares establecidas o células AGMK primarias. Entre las líneas celulares AGMK adecuadas se incluyen, por ejemplo, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160). BSC-1 (ECACC 85011422) y CV-1 (ATCC CCL-70). También son adecuadas las líneas celulares MA-104 (mono rhesus) y MRC-5 (humana ATCC CCL-171). Las células Vero son particularmente preferidas con fines de amplificación. Los pases en células Vero proporcionan un elevado rendimiento de virus.
En la técnica se conocen técnicas para comprobar sin existe una única variante en una población de virus resultante del procedimiento y para determinar la naturaleza de la única variante que implican secuenciación convencional o procedimientos de hibridación y se describen en la presente memoria descriptiva a continuación.
En un aspecto preferido, el procedimiento de la invención se realiza usando un rotavirus adecuados, en particular un rotavirus que tiene las características de la cepa 89-12 o de un derivado de la misma sometido a pases.
Un población de variante única particularmente preferida es la P43, que se obtuvo de la P33 (un rotavirus humano aislado 33 veces en cultivos en tipos celulares adecuados) mediante una serie de etapas de clonación de dilución Terminal seguidas por pases del material clonado en células Vero para su amplificación.
Una población P43 se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC), Laboratorio de Investigación y Producción de Vacunas, Servicio de Laboratorio de Salud Pública, Centro para la Microbiología e Investigación Aplicada, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido, el 13 de agosto de 1999 con el número de registro 99081301, en los términos del Tratado de Budapest.
Aunque esta disponibilidad pública indicada en el procedimiento más sencillo de obtener P43 rotavirus humano, no es del todo imposible o improbable que puedan producirse rotavirus similares y sustancialmente idénticos funcionalmente mediante estos u otros procedimientos a la luz de las enseñanzas de esta invención.
Se considera que dichos rotavirus sustancialmente idénticos funcionalmente son biológicamente equivalentes al rotavirus humano P43 de esta invención y, por tanto, se encuentran dentro del alcance general de la presente invención. Por tanto, deberá entenderse que la invención abarca poblaciones de rotavirus que tienen las características de la variante P43 como se describe en la presente memoria descriptiva.
Bien deberá entenderse que la invención abarca materiales derivados de la P43 depositada en la ECACC 99081301 sometiéndola a posterior procesamiento mediante su propagación a través de posteriores pases, clonación u otros procedimientos utilizando el virus vivo o mediante la modificación de P43 de cualquier forma que incluya técnicas de ingeniería genética o técnicas de reagrupación. Tales etapas y técnicas son bien conocidas en la técnica.
Materiales derivados de la P43 depositada abarcadas por la invención incluyen material proteico y genético. De particular interés son los rotavirus reagrupados que comprenden al menos un antígeno o al menos un segmento de P43, por ejemplo reagrupados que comprenden una cepa virulenta de rotavirus en la que uno o parte de uno de los 11 segmentos del genoma ha sido reemplazado por el segmento genómico o parte del mismo de P43. Específicamente, un reagrupado de rotavirus en el que el segmento o segmento parcial que codifica la NSP4 es un segmento o segmento parcial de P43, puede poseer propiedades útiles. Los rotavirus reagrupados y técnicas para prepararlos son bien conocidos (Foster, R. H. y Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).
Materiales de particular interés son la progenie de P43 y los derivados inmunológicamente activos de P43. Derivados inmunológicamente activos quiere decir materiales obtenidos de o con el virus P43, en particular antígenos del virus, que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria que es reactiva contra el rotavirus cuando se inyecta en un animal huésped.
Al adaptar el rotavirus a una línea célula adecuada, por ejemplo células Vero, puede ser necesario tratar el virus para eliminar cualquier posible contaminante tales como agentes extraños que puedan estar presentes y que, de otro modo, causarían contaminación. En el caso de virus extraños sensibles a éter, esto se puede realizar mediante tratamiento con éter como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva. La presente invención también se refiere a la inclusión de tal tratamiento con éter como etapa opcional en el procedimiento global para la obtención de un rotavirus vivo atenuado o una vacuna formulada con el mismo.
Asimismo, dentro del alcance de la invención están las mezclas de P43 con otras variantes de rotavirus, por ejemplo otras variantes clonadas con otros virus, en particular otros virus atenuados. Tales mezclas son útiles en las vacunas de la invención que se describen más adelante en la presente memoria descriptiva.
La presente invención también proporciona una vacuna de rotavirus vivo atenuado que comprende una población de variante sustancialmente única mezclada con un adyuvante o un transportador farmacéutico adecuado.
Preferentemente, la vacuna de rotavirus según la invención es una vacuna del rotavirus monovalente que contenga una única cepa de rotavirus.
La presente invención es particularmente ventajosa para proporcionar una vacuna de rotavirus vivo en la que el rotavirus vivo atenuado es un rotavirus humano y no produce intususpección.
Entre los transportadores farmacéuticos adecuados para usar en la vacuna según la invención se incluyen los conocidos en la técnica como adecuados para administración oral, en especial a lactantes. Tales transportadores incluyen, sin estar limitados a ellos, hidratos de carbono, polialcoholes, aminoácidos, hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco, óxido de titanio, hidróxido de hierro, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, gelatina, peptona vegetal, goma xantán, carragenina, goma arábiga, \beta-ciclodextrina.
La invención también proporciona un procedimiento para preparar una vacuna de rotavirus, por ejemplo liofilizando el virus en presencia de estabilizantes adecuados o mezclando el virus según la invención con un adyuvante o transportador farmacéutico adecuado.
También puede ser una ventaja formular el virus de la invención en vehículos basados en lípidos, tal como virosomas o liposomas, en emulsiones de aceite en agua o con partículas transportadoras. Como alternativa o adicionalmente, se pueden incluir en la formulación inmunoestimulantes tales como los conocidos en la técnica para vacunas orales. Entre tales inmunoestimulantes se incluyen toxinas bacterianas, en particular la toxina del cólera (TC) en forma de la holotoxina (la molécula entera) o la cadena B sólo (CTB) y la enterotoxina termolábil de E. coli (LT). Las LT mutadas (LTm) que es menos probable que se conviertan en su forma activa que la LT nativa se describen en los documentos WO 96/06627, WO 93/13202 y US 5,182,109.
Otros inmunoestimulantes que pueden incluirse de forma ventajosa son derivados de saponina tales como QS21 y monofosforil lípido A, en particular el monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL). Las saponinas purificadas como adyuvantes orales se describen en el documento WO 98/56415. Las saponinas y el monofosforil lípido A se pueden emplear por separado o en combinación (p. ej., documento WO 94/00153) y se pueden formular en sistemas adyuvantes junto con otros agentes. El 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana, y su fabricación se describe en el documento GB 2122204.
Una exposición general de vehículos y adyuvantes para la inmunización oral se puede encontrar en Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995.
La invención también proporciona un procedimiento para vacunar sujetos humanos, en especial lactantes, mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición vacunal según la invención. Preferentemente, la vacuna viva atenuada se administra mediante administración oral.
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En un aspecto preferido, la composición vacunal de la invención se formula con un antiácido para minimizar la inactivación de la vacuna por el ácido del estómago. Entre los componentes antiácido adecuados se incluyen antiácidos inorgánicos, por ejemplo hidróxido de aluminio Al(OH)_{3} e hidróxido de magnesio Mg(OH)_{2}.
Entre los antiácidos comercialmente disponibles que son adecuados para usar en la invención se incluyen Mylanta(marca comercial), que contiene hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio. Estos son insolubles en agua y se proporcionan en suspensión.
El hidróxido de aluminio es un componente particularmente preferido de una composición vacunal según la invención, ya que puede proporcionar no solo un efecto antiácido sino también un efecto adyuvante.
También adecuados para usar como antiácidos en la vacuna de la invención son los antiácidos orgánicos, tales como las sales carboxilato de ácido orgánico. Un antiácido preferido en la composición de la vacuna de la invención contiene una sal carboxilato de ácido orgánico, preferentemente una sal de ácido cítrico tal como citrato sódico o citrato potásico.
Un antiácido particularmente preferido que puede usarse en la composición de la vacuna de la presente invención es la sal inorgánica insoluble, carbonato cálcico (CaCO_{3}). El carbonato cálcico es capaz de asociarse con el rotavirus y la capacidad del rotavirus se mantiene durante la asociación con el carbonato cálcico.
Para prevenir la sedimentación del carbonato cálcico durante la etapa de llenado, en la formulación preferentemente hay agentes viscosos.
Entre los posibles agentes viscosos que se pueden usar se incluyen excipientes pseudoplásticos. Una solución pseudoplástica se define como una solución que posee una viscosidad más elevada en reposo en comparación con su viscosidad en agitación. Excipientes de este tipo son los polímeros naturales tales como goma arábiga, goma adragant, agar-agar, alginatos, pectinas o polímeros semisintéticos, por ejemplo: carboximetilcelulosa (Tyloses C®), metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®), hidroxipropilmetilcelulosa (Klucels®), hidroxipropilcelulosa (Methocels E® y K®, Vicotrans MPHC®). En general, esos excipientes pseudoplásticos se usan junto con agentes tixotrópicos. Agentes viscosos alternativos que se pueden usar son los excipientes pseudoplásticos con baja capacidad de flujo. Esos polímeros, a una concentración suficiente, dan lugar a una disposición fluida estructural que tiene como resultado una solución de viscosidad elevada con baja capacidad de flujo en reposo. Se necesita proporcionar al sistema una cierta cantidad de energía para permitir el flujo y la transferencia. Son necesarias energías externas (agitación) para destruir temporalmente la disposición fluida estructural con el fin de obtener una solución
fluida.
Ejemplos de tales polímeros son Carbopols® y goma xantán.
Los excipientes tixotrópicos se convierten en una estructura de gel en reposo, mientras que en agitación forman una solución fluida. Ejemplos de excipientes tixotrópicos son: Veegum® (silicato de aluminio-magnesio), Avicel RC® (aproximadamente un 89% de celulosa microcristalina y un 11% de carboximetilcelulosa Na).
La composición de la vacuna de la presente invención comprende, preferentemente, un agente viscoso seleccionado de goma xantán o almidón.
Por tanto, la composición de la vacuna de la presente invención se formula, preferentemente, con una combinación de carbonato de calcio y goma xantán.
Otros componentes de una composición usada en la invención incluyen de forma adecuada azúcares, por ejemplo sacarosa y/o lactosa.
La composición de la vacuna de acuerdo con la invención puede contener componentes adicionales, incluidos, por ejemplo, aromatizantes (en particular para una vacuna oral) y agentes bacteriostáticos.
Se prevén preparaciones diferentes de la composición de la vacuna de acuerdo con la invención.
En una forma de realización preferida, la vacuna se administra en forma de una formulación líquida. Preferentemente, formulación líquida se reconstituye antes de la administración a partir de al menos los siguientes dos componentes:
i) componente vírico
ii) componente líquido.
En esta forma de realización, el componente vírico y el componente líquido normalmente están presentes en envases distintos, que pueden ser de forma conveniente compartimentos separados de un único vaso, o vasos separados que se pueden conectar de tal forma que la composición final de la vacuna se reconstituye sin exponerse al aire.
Antes de la reconstitución, el virus puede estar en forma seca o en forma líquida. Preferentemente el componente vírico está liofilizado. El virus liofilizado es más estable que el virus en una solución acuosa. El virus liofilizado puede reconstituirse de forma adecuada usando una composición antiácida líquida para producir una formulación de vacuna líquida. Como alternativa, el virus liofilizado puede reconstituirse con agua o con solución acuosa, en cuyo caso la composición de virus liofilizado contiene, preferentemente un componente antiácido.
Preferentemente, la formulación de la vacuna comprende un componente vírico formulado con carbonato de calcio y goma xantán en un compartimento o vaso, y esto se reconstituye con agua o solución acuosa presente en el segundo compartimento o vaso.
En otra forma de realización preferida, la composición de la vacuna es una formulación sólida, preferentemente una torta liofilizada que es adecuada para la disolución inmediata cuando se introduce en la boca, Las formulaciones liofilizadas se pueden proporcionar convenientemente en forma de comprimidos en un envase blíster farma-
céutico.
En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna de rotavirus en forma de un comprimido de disolución rápida para administración oral.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cepa de rotavirus atenuado vivo, en particular una cepa de rotavirus humano, en la que la composición es un sólido liofilizado capaz de la disolución inmediata cuando se introduce en la boca.
Preferentemente, el comprimido de disolución rápida según la invención se disuelve en la boca del sujeto lo suficiente rápido como para impedir la deglución del comprimido no disuelto. Este enfoque es particularmente ventajoso para las vacunas de rotavirus pediátricas.
Preferentemente, el virus es un rotavirus vivo atenuado humano que se formula con un antiácido inorgánico tal como carbonato de calcio y un agente viscoso tal como goma xantán.
Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una formulación liofilizada en la que el componente vírico es cualquier cepa de rotavirus que se formula con carbonato de calcio y goma xantán.
Las vacunas de la invención se pueden formular y administrar mediante técnicas conocidas, usando una cantidad adecuada de virus vivo para proporcionar protección eficaz contra la infección por rotavirus sin efectos secundarios adversos significativos en vacunas típicas. Normalmente, una cantidad adecuada de virus vivo estará entre 10^{4} y 10^{7} uff por dosis. Una dosis típica de vacuna puede comprender 10^{5}-10^{6} uff por dosis y se puede administrar en varias dosis en un periodo de tiempo, por ejemplo en dos dosis administradas con un intervalo de dos meses. Sin embargo se pueden obtener beneficios teniendo más de 2 dosis, por ejemplo un régimen de 3 ó 4 dosis, particularmente en los países en desarrollo. El intervalo entre dosis puede ser de una duración mayor o menor a dos meses. Una cantidad óptima de virus vivos para una dosis única o para un régimen de múltiples dosis, y el momento adecuado para las dosis, se puede determinar mediante estudios estándar que implican la observación de los títulos de anticuerpos y otras respuestas en los sujetos.
La vacuna de la invención puede también comprende otros virus vivos adecuados para la protección contra otras enfermedades, por ejemplo poliovirus. Como alternativa, otras vacunas con virus vivos adecuados para administración pueden administrarse en una dosis aparte pero a la vez que la composición de vacuna de rotavirus según la
invención.
Leyenda de la figura 3
Se analizaron sueros de doce lactantes de 4 a 6 meses de edad vacunados con el material P33 como se describe en el artículo Vacunas (1998) para determinar la neutralización de P33, P38, P43 y 89-12C2.
El intervalo de los títulos de neutralización de todos los sueros analizados es similar para P33, P38 y P43. El análisis estadístico no muestra diferencias significativas en los títulos de neutralización global contra los tres virus. Esto sugiere que los epítopos de neutralización conformacionales y no conformacionales de P33, P38 y P43 son igualmente bien reconocidos por los sueros anti-P33 de los lactantes vacunados con P33. Esta observación sugiere de forma indirecta que los epítopos de neutralización revelados en este ensayo in vitro no se vieron alterados ente P33, P38
y P43.
Sin embargo, el intervalo de los títulos de neutralización de P89-12C2 difiere significativamente de P33, P38 y P43. Esta observación sugiere que los epítopos de neutralización conformacionales y no conformacionales de P33, P38 y P43 no son igualmente bien reconocidos por los sueros anti-P33 de los lactantes vacunados con P33. Esta observación sugiere de forma indirecta que los epítopos de neutralización revelados en este ensayo in vitro no se vieron alterados ente 89-12C2 y P33, P38 y P43.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Demostración de que la cepa 89-12 en el pase 26 (P26) es una mezcla de variantes Secuenciación de los genes de VP4 y VP7 de lotes de diferentes pases
Se llevó a cabo la secuenciación de los genes de VP4 y VP7 del pase P26 (células AGMK primarias), pase P33 (línea celular AGMK establecida (al contrario que primaria), pase P41 y pase 43. La extracción del ARN tota se sometió a transcripción inversa y se amplificó mediante PCR en un tubo/una etapa.
Los cebadores Rota 5bis y Rota 29bis amplificaron la totalidad del gen VP4 y los cebadores Rota 1 y Rota 2bis amplificaron la totalidad del gen VP7. El material de la PCR se ha secuenciado usando distintos cebadores (véase la Tabla 1).
La secuencia del pase P26 difería de la secuencia del pase P33 en 3 bases (en las posiciones 501, 788 y 802 pb desde el codón de iniciación) en VP4 y en tres bases en VP7 (108, 605 y 897 pb desde el codón de iniciación).
Las radiografías de la secuencia del pase P26 de VP4 y VP7 muestran en las posiciones mutadas la presencia de la secuencia del pase P33 de fondo. Por tanto, se puede observar que el pase P26 es una mezcla de al menos 2
variantes.
Las radiografías de la secuencia del pase P33 parecen homogéneas en VP4 y heterogéneas para VP7 (véase la Tabla 2).
El pase P38 (derivado del pase 33) se pasó 5 veces en células Vero y exhibió el mismo conjunto de secuencias de VP4 y VP7 que el pase P33 (línea celular AGMK). Por tanto, no se produjeron cambios de importancia en las poblaciones entre P33 y P38.
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TABLA 1 Oligonucleótidos usados para RT-PCR y secuenciación
1
2
TABLA 2 Oligonucleótidos usados en la hibridación
3
4
Las bases en negrita en la Tabla 2 son los sitios de variación de secuencia específica en VP4 y VP7.
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TABLA 3 Variación de la secuencia de los genes VP4 y VP7
3.1
VP4 VP7
501 pb 788 pb 802 pb 108 pb 605 pb 987 pb
167 aa 263 aa 268 aa 36 aa 202 aa 299 aa
P26 (AGMK) A G/A G/A A C/T A
P33 (AGMK) T A A G/A T/C A/G
P38 (VERO) T A A A/G T G/A
P43 (VERO) T A A A T A
N.B. En un segundo clon de los 3 clones que se desarrollaron al nivel del lote de producción, el nucleótido de la posición 897 pb de VP7 es G, en lugar de A como ocurre en el clon seleccionado P43. Esto tiene como resultado una metionina en lugar de una isoleucina en la secuencia de aminoácidos. Las variantes correspondientes al clon seleccionado P43 y al colon en el que hay una G en VP7 en la posición 897 pb con respecto al codón de iniciación se excretaron en las heces de lactantes que habían sido vacunados con el material P33.
En la Tabla 3.1, donde hay dos bases alternativas en una posición concreta, a primera de las dos representa la base que aparece en una población mayoritaria y la segunda es la base que aparece en una población minoritaria. Las poblaciones de variantes mayoritarias y minoritarias se juzgan mediante la fuerza de la señal en la secuenciación.
3.2
VP4 VP7
501 pb 788 pb 802 pb 108 pb 605 pb 987 pb
167 aa 263 aa 268 aa 36 aa 202 aa 299 aa
P26 (AGMK) Leu Gly/Glu Gly/Arg Arg Thr/Met Ile
P33 (AGMK) Phe Glu Arg Arg/Arg Met/Thr Ile/Met
P38 (VERO) Phe Glu Arg Arg/Arg Met Met/Ile
P43 (VERO) Phe Glu Arg Arg Met Ile
La tabla 3.2 muestra los cambios de aminoácidos resultantes de las diferencias en los nucleótidos entre las variantes.
TABLA 4
VP4 (posiciones 788-802) VP7 (posición 897)
G-G A-A A-G G-A A G
Sondas Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42
Pases
P26 - + + + nd Nd
+P33 - + - - ++ +
P38 - + - - + ++
P43 - + - - + -
Hibridación puntual
El cambio en las poblaciones entre los pases P26 a P33 en células AGMK se ha confirmado además mediante hibridación puntual. Los fragmentos de los genes VP4 y VP7 generados mediante RT-PCR se hibridaron con sondas oligonucleotídicas específicas para cada variante (véanse las Tablas 3.1 y 3.2). En contraste con P26, que hibridó con Rota 16, Rota 35 y Rota 36 y no con Rota 15, el fragmento VP4 de PCR del material P33, en las posiciones 788 y 802 hibridó únicamente con Rota 16 y no con Rota 15 ni con Rota 35 o Rota 36. Estos resultados establecieron la presencia de al menos 3 variantes en P26 (véase la Tabla 4).
Para el fragmento de PCR de VP7 del material P33, la posición 897 hibridó con Rota 41 y con Rota 42. Estos resultados establecieron la presencia de al menos dos variantes en el material P33.
Ejemplo 2 Aislamiento y caracterización del clon P43
Para aislar los componentes de P33 en forma de una población de virus homogénea se realizaron tres diluciones finales de P33/AGMK en células Vero y se usó el virus resultante para infectar las células Vero.
Los pocillos positivos se seleccionaron usando dos criterios: crecimiento demostrado por el mayor número de focos detectados en los pocillos y la mayoría de pocillos positivos aislados en las placas, como se ha realizado normalmente. Tras 3 pases de dilución final en placas de microtitulación de 96 pocillos, 10 pocillos positivos se amplificaron de forma sucesiva en células Vero y se evaluaron para determinar su rendimiento.
Según el rendimiento se desarrollaron tres clones hasta el nivel de pase del lote de producción.
Se mostró que el inmunoreconocimiento mediante anticuerpos policlonales era similar entre los tres clones y entre los clones y P33. La homogeneidad de los clones se valoró mediante hibridación puntual. La selección final de un único clon se basó en el rendimiento y la secuencia.
El clon seleccionado se amplificó mediante pases sucesivos en células Vero para generar una siembra Primaria, una siembra de Trabajo y, por último, lotes de producción.
El clon seleccionado se caracterizó genéticamente a diferentes niveles de pases mediante la secuenciación de VP4 y VP7 (identidad) y mediante hibridación puntual específica de VP4 y VP7 (homogeneidad) de los materiales amplificados mediante PCR. La secuencia de los genes VP4 y VP7 del material P43 se proporcionan en las Figuras 1 y 2, respectivamente, y son idénticas a las de P41.
La homogeneidad del clon seleccionado se valoró mediante hibridación selectiva usando sondas oligonucleotídicas discriminatorias de cambios nucleotídicos en regiones de VP4 y/o VP7 para cada variante identificada durante la secuenciación de P26/AGMK primarias (véase la Tabla 4).
El fragmento de VP4 hibridó con Rota 16 y no con Rota 15, Rota 35 o Rota 36.
El fragmento de VP7 hibridó con Rota 41 y no con Rota 42.
Estos resultados confirmaron que P43 es una población homogénea.
Ejemplo 3 Eliminación de los posibles virus extraños
A P33 (cultivada en AGMK) se añadió éter hasta una concentración final del 20% durante 1 h. A continuación se burbujeó éter mediante con N_{2} durante 35 min. No se observó impacto alguno sobre el título de la siembra de P33.
Ejemplo 4 Formulación de una vacuna viva atenuada
Los lotes de producción descritos anteriormente se formulan para administración oral a lactantes a través del siguiente procedimiento.
1. Virus liofilizados
Para preparar las dosis de virus se usan técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. A continuación, el virus diluido se diluye más con estabilizante de liofilización (sacarosa al 4%, dextrano al 8%, sorbitol al 6%, aminoácido al 4%) hasta el título viral objetivo, en este caso 10^{5,6} uff/dosis. Alícuotas de 0,5 ml de composición vírica estabilizada se transfieren asépticamente a viales de 3 ml. A continuación, cada vial se cierra parcialmente con un tapón de goma, la muestra se liofiliza al vacío, después el vial se cierra del todo y se enrosca en su lugar una tapa de aluminio alrededor del vial para mantener el tapón en su sitio.
Para usar, el virus se reconstituye usando uno de los siguientes reconstituyentes antiácidos:
(a) Reconstituyente citrato
El citrato sódico se disuelve en agua, se esteriliza mediante filtración y se transfiere asépticamente a envases de reconstitución en cantidades de 1,5 ml a una concentración de 544 mg de CitratoNa_{3}-2H_{2}O por dosis de 1,5 ml. Los envases de reconstitución pueden ser, por ejemplo, viales de 3 ml o viales de 4 ml o jeringas de 2 ml, o cápsulas blandas comprimibles de plástico para administración oral. Como alternativa al mantenimiento de los componentes estériles en condiciones estériles, el envase final se puede someter a esterilización en autoclave.
(b) Reconstituyente Al(OH)_{3}
Una suspensión aséptica de hidróxido de aluminio (Mylanta, marca comercial) se diluye asépticamente en agua estéril, se transfiere asépticamente a envases de reconstitución (por ejemplo jeringas de 2 ml o blandas comprimibles de plástico) en cantidades de 2 ml que contienen 48 mg de Al(OH)_{3.} Una alternativa a usar los componentes estériles en condiciones estériles consiste en irradiar con rayos \gamma la suspensión de hidróxido de aluminio (preferentemente en una etapa diluida).
Se incluyen ingredientes convencionales para impedir que la suspensión sedimente. Entre tales ingredientes convencionales se incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina y polímeros de silicona. También se pueden incluir agentes bacteriostáticos, por ejemplo butilparabén, propilparabén u otros agentes bacteriostáticos usados en los alimentos, y aromatizantes.
2. Virus liofilizado con Al(OH)_{3.} en formulación líquida
Para preparar las dosis de virus se usan técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade suspensión de aluminio de hidróxido hasta alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición del virus se diluye más con estabilizante de liofilización (sacarosa al 4%, dextrano al 8%, sorbitol al 6%, aminoácido al 4%) hasta el título viral objetivo, en este caso 10^{5,6} uff/dosis. Alícuotas de 0,5 ml de composición vírica estabilizada se transfieren asépticamente a viales de 3 ml. A continuación se lleva a cabo la liofilización y el cierre de los viales como se ha descrito en la parte 1.
3. Virus liofilizado con Al(OH)_{3.}para presentación en blíster
Para preparar las dosis de virus se usan técnicas convencionales. El virus a granel purificado congelado se descongela y se diluye con la composición de medio adecuada, en este caso medio Eagle modificado de Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade suspensión de aluminio de hidróxido hasta alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición del virus se diluye más con estabilizante de liofilización, que puede ser sacarosa, dextrano o aminoácido al 4%, o gelatina, o peptona vegetal, o xantán hasta el título viral objetivo de 10^{5,6} uff/dosis. Para transferir dosis de 0,5 ml, o preferentemente menos, a los huecos del blíster, se emplea una operación de llenado aséptica. La composición se liofiliza y los huecos del blíster se sellan mediante sellado térmico.
Opcionalmente se incluyen ingredientes estándar para impedir que la suspensión de hidróxido de aluminio sedimente. Tales ingredientes estándar incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina y polímeros de silicona. También se pueden incluir aromatizantes.
Ejemplo 5 Titulación vírica de rotavirus para varias formulaciones 5.1 Comparación entre las formulaciones con base de lactosa y de sacarosa
Nº de lote Composición de la Título viral antes de Título viral tras la liofilización
formulación la liofilización y 1 semana a 37ºC
98G06/01 Lactosa: 2% 10^{5.22} 10^{4,67}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
98G06/03 Sacarosa: 2% 10^{5.28} 10^{4,92}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
El rotavirus P43 se formuló con sacarosa o con lactosa como se muestra en la tabla anterior.
La titulación viral antes de la liofilización es el título viral en el líquido formulado completado (que contiene sacarosa dextrano sorbitol aminoácidos) y sin la etapa de liofilización.
Los resultados buenos son aquéllos en los que se alcanzan una disminución < 0,5 log en la etapa de liofilización y una disminución < 0,5 log durante la "1 semana a 37ºC" (ensayo de estabilidad acelerada).
La precisión de la titulación viral es de alrededor de + o - 0,2 log.
Los resultados indican que se puede usar sacarosa en lugar de lactosa.
5.2: Efecto de la arginina y sustitución de sorbitol con maltitol
Nº de lote Composición de la Título viral en el momento= Título viral tras la liofilización
formulación cero tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
98L16/01 Lactosa: 2% 10^{4,8} 10^{4,8}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
98L16/02 Lactosa: 2% 10^{4,7} 10^{5}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
Los resultados demuestran que la adición de arginina (de la que se sabe que mejora la estabilidad del virus durante la liofilización y también proporciona un medio básico con el fin de compensar la acidez del estómago) mantiene el título viral.
El sorbitol tiende a disminuir la temperatura de transición vírica de la torta liofilizada en más de un grado. Esto se puede superar usando maltitol en lugar de sorbitol como se ha mostrado anteriormente y el título viral se sigue manteniendo.
5.3 Varias composiciones de la formulación
Este experimento demuestra que son posibles numerosas formulaciones.
Nº de lote Composición de la Título viral antes de Título viral tras la liofilización
formulación la liofilización y 1 semana a 37ºC
99C11/01 Sacarosa: 2% 10^{5,24} 10^{5.07}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
99C11/02 Sacarosa: 2% 10^{5,09} 10^{4,92}
Dextrano: 4%
Maltitol: 3%
Aminoácidos: 2%
99C11/04 Dextrano: 4% 10^{4,89} 10^{5,06}
Maltitol: 3%
Aminoácidos: 2% 
\vskip1.000000\baselineskip
Nº de lote Composición de la Título viral en el momento= Título viral tras la liofilización
formulación cero tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
99C17/01 Sacarosa: 2% 10^{5,40} 10^{5,41}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
99C17/02 Sacarosa: 2% 10^{5,30} 10^{4,93}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 1,5%
Aminoácidos: 2%
99C17/03 Sacarosa: 2% 10^{5,31} 10^{5,24}
Dextrano: 4%
Aminoácidos: 2%
99C17/04 Sacarosa: 2% 10^{4,42} 10^{4,45}
Dextrano: 4%
Maltitol: 3%
Aminoácidos: 2%
99C17/05 Sacarosa: 2% 10^{4,39} 10^{4,40}
Dextrano: 4%
Maltitol: 1,5%
Aminoácidos: 2%
99C17/06 Sacarosa: 2% 10^{5,44} 10^{4,97}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
99C17/07 Sacarosa: 2% 10^{5,11} 10^{4,89}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 1,5%
5.4 Asociación entre Rotavirus y antiácido Al(OH)_{3}
Rotavirus Al(OH)_{3} H_{2}O Tiempo de Centrifugación Título viral Título
contacto a en el viral en el
temperatura sobrenadante precipitado
ambiente en uff/ml en uff/ml
10^{5,6} 48 mg en 0,76 ml 30 min 8000 rpm 10^{3,65}
uff/ml 0,240 ml 10 min
10^{5,6} 48 mg en 0,76 ml 30 min 8000 rpm 10^{4,41}
uff/ml 0,240 ml 10 min
10^{5,6} 1 ml 30 min 8000 rpm 10^{5,68}
uff/ml 10 min
Rotavirus 12 mg 1,380 ml 30 min 8000 rpm Por debajo de 10^{4,7}
en torta 0,120 ml 10 min los límites
liofilizada de detección
El Al(OH)_{3} se usa como antiácido. Esto muestra que el rotavirus se asocia con la sal inorgánica insoluble (Al
(OH)_{3}). Ya que se centrifugó junto con el Al(OH)_{3} (disminución de actividad viral en el sobrenadante).
5.5 Disolución del antiácido Al(OH)_{3} mediante citrato sódico antes de la titulación viral
Muestras virales Disolución Condiciones Títulos virales uff/ml
99B10/06 1,5 ml de CitratoNa_{3} 24 h a temperatura 10^{5,11}
formulación líquida ambiente
antes de la liofilización;
10^{5,43}
99B10/06 1,5 ml de CitratoNa_{3} 24 h a temperatura 10^{4,53}
liofilizado; ambiente
10^{5,43}
Cuando el rotavirus se asocia con el Al(OH)_{3} es posible liofilizar todo (incluido el Al(OH)_{3}). Tras la liofilización es posible recuperar el rotavirus mediante la disolución de Al(OH)_{3} en citrato sódico. Esta etapa no daña al rotavirus y conserva su actividad tras esta etapa de disolución.
5.6: Infectividad del rotavirus tras la liberación de la asociación Al(OH)_{3}-rotavirus
El mecanismo de liberación de virus (mediante disolución del transportador) puede muy bien producirse in vivo. De hecho, a un pH inferior a 6, el hidróxido de aluminio se convierte en completamente soluble y, por tanto, el rotavirus se liberará en el estómago.
Al(OH)_{3} + 3H+ \longrightarrow Al^{+++} (hidrosoluble) + 3H_{2}O
En el estómago, los iones de Al^{+++} no se absorben (J. J. Powell, R. Jugdaohsingh y R.P.H. Thompson. The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153).
En el intestino, debido al incremento del pH, las formas insolubles de aluminio precipitan (Al(OH)_{3} o AlPO_{4}) y se eliminan de la forma natural.
Se desconoce si el precipitado recién formado (Al(OH)_{3} o AlPO_{4}) podrá volver a asociarse con el rotavirus libre. Esto eleva la cuestión de la infectividad de la propia asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus.
También es posible la liberación del rotavirus de la asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus por otros mecanismos. La lisina, por ejemplo, interfiere en la adsorción viral del Al(OH)_{3}.
Se sabe que otros aniones, como borato, sulfato, carbonato y fosfato, se adsorben específicamente en hidróxido de aluminio, por tanto, en teoría, debería ser posible desplazar (mediante competición por el sitio de adsorción) el rotavirus de la asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus.
5
Por tanto, el rotavirus se puede liberar de la asociación Al(OH)_{3}-Rotavirus y el rotavirus liberado permanece activo.
Esta liberación se puede realizar mediante la disolución de Al(OH)_{3} (por HCl en el estómago o por Na_{3}Citrato in vitro) o desplazando el rotavirus con un aminoácido básico (lisina).
5.7: Infectividad de la asociación Al(OH)_{3}-rotavirus
Una única dosis de rotavirus liofilizado se reconstituyó con agua y se dividió en dos partes. La primera parte, considerada como la referencia, recibió un volumen adicional de agua. La segunda parte recibió 24 mg de Al(OH)_{3} suspendido en 0,240 ml de agua (titulaciones virales preclínicas).
6
Cuando está presente Al(OH)_{3,} el rotavirus es activo y el valor de la titulación viral es más elevado en comparación con la muestra de referencia.
Este experimento se repitió sin dividir la dosis liofilizada y mediante la adición de 12 mg de Al(OH)_{3} o 24 mg de Al(OH)_{3}.
Aquí, la muestra de referencia fue la reconstituida con un tampón de citrato-bicarbonato. Por tanto, el título viral es, de nuevo, mayor en presencia de Al(OH)_{3}.
8
Como en el ejemplo anterior, el rotavirus se asocia con las partículas de Al(OH)_{3}, ya que el virus se puede descartar mediante centrifugación. DRVC003A46 es un rotavirus liofilizado formulado (Sacarosa: 2%, Dextrano: 4%, Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2%).
9
SDSAA= Sacarosa 2%, Dextrano 4%, Sorbitol 3%, aminoácido 2%.
\newpage
Según la titulación viral lleva a cabo sobre el sobrenadante, la cantidad de Al(OH)_{3} necesaria para adsorber Rotavirus parece ser baja (comenzando con una dosis liofilizada 5,7 log) aumentando la titulación viral):
Al(OH)_{3}, Tiempo de adsorción Título en el sobrenadante
12 g 1 h TA 2,7
24 mg 1 h TA 3,4
48 gm 1 h TA 3,4
72 mg 1 h TA 2,0
96 mg 1 h TA Por debajo de los límites de
detección
12 mg Durante la noche 2,7
24 mg Durante la noche Por debajo de los límites de
detección
48 mg Durante la noche 2,5
12 g Inmediata Por debajo de los límites de
detección
24 mg Inmediata 2,0
48 mg Inmediata Por debajo de los límites de
detección
El tiempo necesario para adsorber el rotavirus en Al(OH)_{3} parece ser corto:
Una dosis de rotavirus liofilizado se reconstituyó en presencia de 24 mg de Al(OH)_{3} y se centrifugó tras 0, 15, 60 min y 24 horas. El "Culot" se resuspendió e SDSAA antes de la titulación viral:
Tiempo Culot Sobrenadante
0 min 5,26 3,17
15 min 5,34 < 1,44
60 min 5,96 < 1,44
24 horas 6,13 < 1,44
5.8: Usando CaCO_{3} como antiácido
Con el fin de evitar el aluminio en la vacuna el antiácido Al(OH)_{3} se sustituyó con otra sal inorgánica insoluble: CaCO_{3} (carbonato cálcico).
Los fenómenos observados con CaCO_{3} son paralelos a los descritos para Al(OH)_{3}:
-
Asociación de rotavirus con la sal inorgánica;
-
Mantenimiento de la actividad del rotavirus cuando se asocia con la sal inorgánica:
-
Posibilidad de liberación del rotavirus de la asociación mediante disolución de la base inorgánica por un ácida;
-
Posibilidad de co-liofilización del antiácido y el rotavirus.
Asociación de CaCO_{3} y rotavirus
En un primer ensayo, el rotavirus liofilizado (título viral 5,7) se reconstituyó con una suspensión de CaCO_{3} en agua (50 mg en 1,5 ml); y después se centrifugó, y el título viral del sobrenadante se comparó con el culot.
10
Esto indica que más del 90% del rotavirus está asociado con CaCO_{3}.
Asimismo, cuando el virus estaba asociado, era posible realizar la titulación y recuperar las cantidades virales originales.
También, los títulos virales son ligeramente superiores a los obtenidos con CaCO_{3}.
11
Cantidad de asociación CaCO_{3} y rotavirus
El rotavirus liofilizado se reconstituyó con suspensión de CaCO_{3} en agua (1,5 ml)
10 mg
50 mg
100 mg
y se centrifugó, y el título viral del sobrenadante se comparó con el culot.
CaCO_{3} Extemp.+ Centrif. 1 Hora +Centrif.
Culots Sobrenadante Culots Sobrenadante
100 mg 4,57 3,01 4,79 3,09
50 mg 4,17 4,15 4,22 3,86
10 mg 3,17 4,77 3,87 4,87
Por tanto, claramente, más CaCO_{3} y más virus se asocian, y menos se encuentra en el sobrenadante.
No obstante, la dosis total no se recupera por completo (cabe esperar un total de al menos 5,3 o incluso 5,8 como se ha obtenido anteriormente, véase antes).
Protección con CaCO_{3} del rotavirus durante la titulación del antiácido mediante análisis de Rossett-Rice para bebés
Usando 10 dosis de rotavirus liofilizado (DRVC003A46) y 50 mg de CaCO_{3} se llevaron a cabo dos tipos de titulación de Rossett-Rice para bebés:
En una titulación de Rossett-Rice para bebés típica, el antiácido se mezcla con rotavirus y se vierte HCl en este medio.
En el análisis de Rossett-Rice para bebés "inverso", la situación es la inversa: el antiácido se vierte en el HCl (como ocurre in vivo).
\newpage
Titulación de Rossett-Rice para bebés típica
Rota. liof. Almacenado a Tampón Título viral teórico Título viral medido
4ºC 60 mg CaCO_{3} 5,3 4,6
-80ºC 60 mg CaCO_{3} 5,3 4,6
4ºC 24 mg Al(OH)_{3} 5,4 <2,9
-80ºC 24 mg Al(OH)_{3} 5,4 <2,9 
\vskip1.000000\baselineskip
Titulación de Rossett-Rice para bebés inversa
Rota. liof. Almacenado a Tampón Título viral teórico Título viral medido
4ºC 60 mg CaCO_{3} 5,3 4,6
-80ºC 60 mg CaCO_{3} 5,3 4,6
4ºC 24 mg Al(OH)_{3} 5,4 <2,9
-80ºC 24 mg Al(OH)_{3} 5,4 <2,9
Por tanto, en este experimento in vitro, el carbonato de calcio es capaz de proteger alrededor del 20% del rotavirus de la presencia de HCl, mientras que el hidróxido de aluminio no puede.
5.9: Liofilización del rotavirus en presencia de antiácido CaCO_{3}
Nº de lote Composición de Título viral en el momento= Título viral tras la liofilización
la formulación cero tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
99PK08/01 Sacarosa: 2% 10^{5,28} 10^{5,10}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 50 mg
99PK08/02 Sacarosa: 2% 10^{5,16} 10^{5,15}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
00C24/01 Sacarosa: 2% 10^{5,07} 10^{4,69}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán: 0,3%
00C24/03 Sacarosa: 2% 10^{5,07} 10^{4,85}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán: 0,3%
(Continuación)
Nº de lote Composición de Título viral en el momento= Título viral tras la liofilización
la formulación cero tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
00E09/25 Sacarosa: 2% 10^{5,03} 10^{4,91}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán: 0,25%
00E09/30 Sacarosa: 2% 10^{5,01} 10^{4,87}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán: 0,30%
00F26/06 Sacarosa: 2% 10^{4,50} 10^{4,70}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Almidón: 2% 
\vskip1.000000\baselineskip
Esta es una liofilización de "todo en uno" del rotavirus y el antiácido (CaCO_{3}) juntos en el mismo vial. Para prevenir la sedimentación de CaCO_{3} durante la etapa de llenado, son necesarios hay agentes viscosos. Ejemplos tales agentes viscosos incluyen goma xantán y almidón. La actividad de rotavirus se mantiene incluso en presencia de goma xantán y almidón.
5.10 Comprimidos liofilizados para la disgregación rápida cuando se introducen en la boca
Las siguientes formulaciones demuestran el concepto "liof". Es decir, la rápida disolución de la torta liofilizada en la boca.
\vskip1.000000\baselineskip
Nº de lote Composición de Título viral antes Título viral tras la liofilización
la formulación de la liofilización y 1 semana a 37ºC
99B10/06 Sacarosa: 4% 10^{5,11} 10^{4,53}
Glutamato sódico: 3,7%
Al(OH)3 48 mg
99C11/12 Maltitol:3% 10^{4,16} 10^{3,79}
Al(OH)3 48 mg
Hidroxipropilmetilcelulosa: 1%
Nº de lote Composición de Título viral en el momento= Título viral tras la liofilización
la formulación cero tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
00C24/05 Sacarosa: 2% 10^{5,02} 10^{4,54}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán 0,3%
00C24/06 Sacarosa: 2% 10^{4,86} 10^{4,56}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
CaCO_{3}: 60 mg
Xantán 0,3%
00F26/11 Sacarosa: 2% 10^{4,70} 10^{4,40}
Dextrano: 4%
Sorbitol: 1,5%
Aminoácidos: 1%
CaCO_{3}: 60 mg
Almidón 2% 
\vskip1.000000\baselineskip
En el concepto "liof", se puede usar tanto xantán como almidón (manteniendo las propiedades de disolución rápida de la torta liofilizada).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Uso de carbonato de calcio como antiácido pata la composición de la vacuna de rotavirus
Cuando se usa una suspensión de CaCO_{3} como antiácido para el rotavirus existe el problema de que las partículas de carbonato de calcio sedimentan con rapidez cuando se introducen en agua, dado que el valor de densidad del polvo se acerca a 2,6 y el tamaño de la partícula media es de 30 \mum.
Esta sedimentación se puede retrasar mediante:
1
aumentando la densidad del medio circundante
2
aumentando la viscosidad del medio circundante
3
reduciendo el tamaño de las partículas
4
manteniendo las partículas lejos unas de otras
6.1 Aumentando la densidad del medio circundante
Cuando la suspensión de CaCO_{3}-agua (colocada en la jeringa) se coloca sobre la tora liofilizada (que contiene sacarosa 2%, dextrano 4%, sorbitol 3%, aminoácidos 2%), la densidad del medio circundante aumenta, pero la velocidad de sedimentación del CaCO_{3} no es muy diferente de la de la suspensión CaCO_{3}-agua.
6.2 Aumentando la viscosidad del medio circundante Excipientes pseudoplásticos
Una solución pseudoplástica se define como una solución que tiene una viscosidad superior en reposo en comparación con su viscosidad en agitación.
\newpage
Excipientes frecuentes de este tipo son:
Polímeros naturales por ejemplo:
Goma arábiga
Goma adragante
Agar-agar
Alginatos
Pectinas
\vskip1.000000\baselineskip
Polímeros naturales por ejemplo:
carboximetilcelulosa (Tyloses C®)
Metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®)
Hidroxipropilmetilcelulosa (Klucels®)
Hidroxipropilcelulosa (Methocels E® y K®, Vicotrans MPHC®).
En general, esos excipientes pseudoplásticos se usan junto con agentes tixotrópicos.
Excipientes pseudoplásticos con baja capacidad de flujo
Esos polímeros, a una concentración suficiente, dan lugar a una disposición fluida estructural que tiene como resultado una solución de viscosidad elevada con baja capacidad de flujo en reposo. Se necesita proporcionar al sistema una cierta cantidad de energía para permitir el flujo y la transferencia.
Son necesarias energías externas (agitación) para destruir temporalmente la disposición fluida estructural con el fin de obtener una solución fluida.
Ejemplos de tales polímeros son Carbopol® y goma xantán.
Excipientes tixotrópicos
Con estos excipientes, en reposo, se obtiene una estructura de gel; mientras que en agitación forman una solución fluida.
Ejemplos de excipientes tixotrópicos son: Veegum® (silicato de aluminio-magnesio), Avicel® (aproximadamente un 89% de celulosa microcristalina y un 11% de carboximetilcelulosa Na).
6.3. Reduciendo el tamaño de las partículas
Una reducción del tamaño de la partícula de CaCO_{3} tuvo como resultado una disminución de la capacidad antiácida del compuesto.
6.4. Manteniendo las partículas lejos unas de otras
Este es el caso en Veegum® y Avicel® para los que partículas insolubles más pequeñas (de aproximadamente 1 \mum) que las partículas de CaCO_{3} se colocan entre las partículas de CaCO_{3} con el fin de impedir la agregación.
Ejemplo 7 Diseño del producto
Los siguientes esquemas demuestran ejemplos de posibles diseños de producto.
7.1 CaCO_{3} en la jeringa
Teniendo ya lotes clínicos de rotavirus en viales liofilizados, el antiácido se puede colocar en el líquido reconstituyente contenido en la jeringa.
12
En esta presentación del producto, la sedimentación del CaCO_{3} debe controlarse no sólo durante las etapas de llenado sino también durante todo el periodo de caducidad del producto (al menos 2 años).
7.1 CaCO_{3} en el vial liofilizado
13
7.3 Liofilización en un blíster
En este caso el rotavirus, el CaCO_{3} y la goma xantán se liofilizan juntos directamente en el blíster.
14
Ejemplo 8 Liofilización de diferentes cepas de rotavirus
Nº de lote Cepa de Composición de Título viral a t= cero Título viral tras la liofilización
rotavirus la formulación tras la liofilización y 1 semana a 37ºC
00F26/01 G1 Sacarosa: 2% 10^{4,6} 10^{4,7}
SB purif. Dextrano: 4%
Nº 61 Sorbitol: 3%
PRO/0232 Aminoácidos: 2%
00F26/02 G2 Sacarosa: 2% 10^{4,5} 10^{4,5}
(DS-1) Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
00F26/03 G3 Sacarosa: 2% 10^{4,5} 10^{4,5}
(P) Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
00F26/04 G4 Sacarosa: 2% 10^{4,8} 10^{4,8}
(VA-70) Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2%
00F26/05 G9 Sacarosa: 2% 10^{4,6} 10^{4,5}
(W161) Dextrano: 4%
Sorbitol: 3%
Aminoácidos: 2% 
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas DS-1, P y VA70 se describen como cepas de referencia de rotavirus humano para los serotipos G2, G3 y G4 respectivamente en la página 1361 de "Fields" Raven PRess 1990, segunda edición.
En este experimento de han liofilizado diferentes cepas de rotavirus.
Para todas el título viral se ha mantenido durante la liofilización y se ha mostrado una estabilidad acelerada (una semana a 37ºC).
Ejemplo 9 Estudio de seguridad en fase 1 de una administración oral de la vacuna de rotavirus
Se llevó a cabo un estudio en fase I para evaluar la seguridad y la reactogenicidad de una única dosis oral de 10^{6,0} uff de la vacuna con P33 en adultos sanos de 18 a 45 años de edad.
El estudio clínica era aleatorizado, doble ciego. Era controlado con placebo y autónomo. El estudio se realizó en un único centro en Bélgica.
Población del estudio
Se incluyó un total de 33 sujetos, 11 en el grupo de placebo y 22 en el grupo de la vacuna y todos completaron el estudio. Todos los voluntarios eran caucasianos. Su media de edad en el momento de la vacunación fue de 35,5 años de edad, con un intervalo de 18-44-años. El estudio comenzó en enero y duró justo un mes.
\newpage
Material Vacuna
Se produjeron lotes clínicos de vacuna P43, se purificaron, se formularon y se liofilizaron de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación. Los lotes se emitieron mediante Control de Calidad y la Garantía de Calidad. Cada vial de vacuna contenía componentes siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Ingrediente activo:
Cepa P43 Min 10^{5,8} uff 
\vskip1.000000\baselineskip
Excipientes, estabilizantes:
Sacarosa 9 mg
Dextrano 18 mg
Sorbitol 13,5 mg
Aminoácidos 9 mg
Placebo
Se prepararon y liberaron viales de placebo. Cada vial de placebo contenía componentes siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Excipientes, estabilizantes:
Sacarosa 9 mg
Dextrano 18 mg
Sorbitol 13,5 mg
Aminoácidos 9 mg
Diluyente
Se usó agua para inyectables como diluyente para reconstituir la vacuna y el placebo.
Administración
Aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de la administración de la vacuna o del placebo, los sujetos de ambos grupos recibieron 10 ml de Mylanta® por vía oral. Mylanta® es un antiácido registrado. El antiácido incrementa el pH del estómago e impide la inactivación del rotavirus durante su paso a través del estómago.
Para preparar la vacuna se reconstituyeron dos viales de P43 liofilizada que contenían 10^{5,8} uff por vial con 1,5 ml de agua para inyectables como diluyente. Esto alcanzó un título viral calculado de 10^{6,1} uff por dosis. La vacuna reconstituida se administró rápidamente como una única dosis oral.
Para preparar placebo se reconstituyeron dos viales de placebo liofilizado con 1,5 ml de agua para inyectables y se administró por vía oral como una única dosis.
Seguridad y reactogenicidad
Se aplicaron los siguientes criterios de seguridad y reactogenicidad:
Los síntomas generales notificados fueron fiebre, diarrea, vómitos, náuseas, dolor abdominal y pérdida de apetito. Se registraron durante ocho días después de la administración.
Los síntomas no comunicados se registraron durante 30 días después de la administración.
Los acontecimientos adversos graves se registraron durante todo el periodo de estudio.
Se debían obtener muestras de diarrea durante ocho días después de la administración.
\newpage
Los resultados fueron:
No se registraron síntomas comunicados, ni acontecimientos adversos no comunicados ni graves durante los respectivos periodos de observación.
No se registraron casos de diarrea.
Conclusiones
La vacuna P43 de productos biológicos SB era segura con respecto al placebo cuando se administró por vía oral siguiendo un patrón doble ciego en forma de una dosis única a la dosis de 10^{6,1} uff a voluntarios adultos sanos de 18 a 44 años de edad.
<110> Smithkline Beecham Bioligicals S.A.
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<120> Vaccine
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<130> B45194
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<160> 2
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<170> FastSEQ for Windows Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 2350
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<212> DNA
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<213> Human
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<400> 1
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15 
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<210> 2
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<211> 1009
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<212> DNA
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<213> Human
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<400> 2
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16

Claims (35)

1. Una población de rotavirus atenuado humano, que se caracteriza porque comprende una única variante o sustancialmente una única variante, estando dicha variante definida por una secuencia nucleotídica que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.
2. Una población de rotavirus según la reivindicación 1, que es una cepa clonada.
3. Una población de rotavirus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que deriva de una infección humana por rotavirus.
4. Una población de rotavirus según una cualquiera de las reivindicación 1 a 3, que se replica y excreta en seres humanos.
5. Una población de rotavirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la sustancialmente única variante es una variante en la que el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una de las siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.
6. Una población de rotavirus según la reivindicación 5, en la que el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.
7. Una población de rotavirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la sustancialmente única variante es una variante en la que el gen VP7 comprende una secuencia nucleotídica que comprende al menos una de las siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
8. Una población de rotavirus según la reivindicación 7, en la que el gen VP7 comprende una secuencia nucleotídica que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
9. Una población de rotavirus según las reivindicaciones 5 a 8, en la el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que una adenina (A) en las posiciones 788 y 802, y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación; y el gen VP7 comprende una secuencia nucleotídica que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) 897 desde el codón de iniciación.
10. Un rotavirus que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP4, en la que la secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 1 y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína VP7, en la que la secuencia nucleotídica es como se muestra en la Figura 2.
11. Una población de rotavirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, denominada P43 y depositada con el número de registro ECACC 99081301.
12. Una variante de rotavirus denominada P43 y depositada con el número de registro ECACC 99081301, la progenie del rotavirus y derivados inmunológicamente activos del mismo y materiales obtenidos del mismo.
13. Un rotavirus reagrupado humano que comprende al menos un antígeno o al menos un segmento de la variante P43 del rotavirus según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
14. Un procedimiento para producir una población de rotavirus humano purificado, que comprende una sustancialmente única variante, donde el procedimiento comprende:
pasar una preparación de rotavirus en una línea celular adecuada;
opcionalmente seleccionar un cultivo homogéneo usando las etapas de:
dilución límite; o
aislamiento en placas individual; y
comprobar la presencia de una variante sustancialmente única mediante secuenciación de una región adecuada de la secuencia génica de VP4 y/o VP7.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que la preparación de rotavirus se somete a pases en células AGMK.
16. Un procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que la preparación de rotavirus posee las características de una cepa 89-12 o derivado de la misma.
17. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende la etapa adicional de tratamiento con éter para eliminar los agentes contaminantes adquiridos sensibles a éter.
18. Una composición de vacuna que comprende un virus atenuado vivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 mezclado con un transportador o adyuvante farmacéutico adecuado.
19. Una composición de vacuna según la reivindicación 18 adaptada para administración oral.
20. Una composición de vacuna según la reivindicación 19, en la que el virus atenuado vivo se formula con una composición antiácida.
21. Una composición de vacuna según la reivindicación 20, en la que la composición antiácida comprende un antiácido orgánico.
22. Una composición de vacuna según la reivindicación 21, en la que el antiácido es citrato sódico.
23. Una composición de vacuna según la reivindicación 20, en la en la que la composición antiácida comprende un antiácido inorgánico.
24. Una composición de vacuna según la reivindicación 23, en la que el antiácido es hidróxido de aluminio.
25. Una composición de vacuna según la reivindicación 23, en la que el antiácido es carbonato cálcico.
26. Una composición de vacuna según la reivindicación 25, que además comprende un agente viscoso.
27. Una composición de vacuna según la reivindicación 26, en la que el agente viscoso es goma de xantano.
28. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que el virus atenuado vivo se formula con carbonato cálcico y goma de xantano y se reconstituye con solución acuosa.
29. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en la que el virus atenuado vivo se formula con la composición antiácida y se liofiliza en un envase blíster.
30. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, en la que el virus está en forma liofilizada.
31. Una composición de vacuna según la reivindicación 30, en la que el virus atenuado vivo y la composición antiácida se encuentran presentes en envases distintos para su formulación como composición de vacuna líquida antes de la administración.
32. Una composición de vacuna según la reivindicación 30, en la que el virus atenuado vivo y la composición antiácida se encuentran presentes en el mismo envase para su formulación como composición de vacuna liofilizada para reconstituirse con solución acuosa antes de la administración.
33. Un procedimiento de fabricación de una vacuna de rotavirus según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 32, que comprende la mezcla de un rotavirus atenuado humano con un transportador o adyuvante adecuado.
34. Uso de un rotavirus atenuado humano en la preparación de una vacuna según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 32 para la prevención de la infección por rotavirus en un sujeto humano.
35. Una formulación de vacuna según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 32 para usar en medicina.
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