NO328112B1 - Svekket human rotaviruspopulasjon, fremgangsmate for a fremstille denne, samt vaksinepreparat omfattende den svekkede rotaviruspopulasjon, fremgangsmate for a fremstille rotavirusvaksine og anvendelse av svekket humant rotavirus for fremstilling av vaksine - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder svekket human rotaviruspopulasjon, fremgangsmåte for å fremstille denne, samt veksinepreparat omfattende den svekkede humane rotaviruspopulasjon, fremgangsmåte for å fremstille rotavirusvaksinen og anvendelse av svekket humant rotavirus for fremstilling av vaksine.

Akutt, infeksiøs diaré er en hovedårsak til sykdom og mange dødsfall i mange deler av verden. I utviklingsland er forekomsten av diarésykdommer overveldende. For Asia, Afrika og Latin-Amerika har det blitt anslått at det opptrer mellom 3-4 milliarder tilfeller med diaré hvert år, og av disse tilfellene fører tilnærmet 5-10 millioner til dødsfall (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301: 967-974 (1979)).

Rotavirus har blitt erkjent som en av de viktigste årsaker til alvorlig diaré hos småbarn og yngre barn (Estes, M.K., Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, 3. utgave, redigert av Fields et al, Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Det anslås at rotavirussykdom er årsaken til mer enn en million dødsfall årlig. Rotavirusindusert sykdom rammer hyppigst barn i en alder av mellom 6 og 24 måneder, og sykdommen forekommer generelt hyppigst under de kjøligste månedene i temperert klima og året rundt i tropiske områder. Rotavirus overføres typisk fra person til person fra faeces til munn med en inkubasjonstid på fra tilnærmet en til tilnærmet tre dager. I motsetning til infeksjon i aldersgruppen fra 6 måneder til 24 måneder, er nyfødte generelt asymptomatiske eller har kun mild sykdom. I motsetning til den alvorlige sykdom som normalt observeres hos unge barn, er de fleste voksne beskyttet som følge av tidligere rotavirusinfeksjon, slik at de fleste voksne infeksjoner er milde eller asymptomatiske (Offit, P.A. et al., Comp. Ther., 8(8): 21-26,1982).

Rotavirus er generelt kuleformete, og navnet er avledet fra deres særpregete ytre og indre skall eller dobbeltskallete kapsidstruktur. Den dobbeltskallete kapsidstruktur til et rotavirus omgir typisk et indre skall eller en kjerne som inneholder genomet. Genomet til et rotavirus består av 11 segmenter med dobbelttrådet RNA som koder for minst 11 atskilte virusproteiner. To av disse virusproteinene, betegnet VP4 og VP7, er arrangert på utsiden av den dobbeltskallete kapsidstruktur. Rotavirusets indre kapsid omfatter et protein, rotavirusproteinet som betegnes VP6. Den relative betydning av disse tre spesielle rotavirusproteinene når det gjelder å utløse immunresponsen som følger etter en rotavirusinfeksjon er ennå ikke klarlagt. Ikke desto mindre bestemmer VP6-proteinet gruppe- og undergruppeantigenet, mens VP4- og VP7-proteinet er determinanter for serotype spesifisitet.

VP7-proteinet er et glykoprotein med molekylvekt 38 000 (molekylvekt 34 000 når det ikke er glykosylert) som er translasjonsproduktet fra det genomiske segment 7, 8 eller 9, avhengig av stammen. Dette proteinet stimulerer dannelse av det viktigste nøytraliserende antistoff etter rotavirusinfeksjon. VP4-proteinet er et ikke-glykosylert protein med molekylvekt tilnærmet 88 000 som er translasjonsproduktet fra genomsegment 4. Dette proteinet stimulerer også dannelse av nøytraliserende antistoff etter rotavirusinfeksjon.

Siden VP4- og VP7-proteinet er de virusproteiner som nøytraliserende antistoffer er rettet mot, antas de å være hovedkandidater for utvikling av rotavirusvaksiner som kan gi beskyttelse mot rotavirussykdom.

Naturlig rotavirusinfeksjon under den tidlige barndom vites å utløse beskyttende immunitet. En levende, svekket rotavirusvaksine er således svært ønskelig. Denne bør fortrinnsvis være en oral vaksine da dette er den naturlige infeksjonsvei for viruset.

Den tidlige vaksineutvikling for forhindring av rotavirusinfeksjoner begynte på 1970-tallet etter oppdagelsen av viruset. I utgangspunktet ble svekkede stammer fra dyr og mennesker undersøkt, og disse ga varierende eller skuffende resultater. Nyere forsøk har fokusert på menneske-dyre reassortanter, noe som har vært mer vellykket.

Midthun et al., J. Clin. Microbiol. 1986 angår isolering av rotavirus reassortanter avledet fra ko-infeksjon av cellekulturene med et bovint rotavirus av en serotype 6 og med et humant rotavirus av serotype 3.

US 4,571,385 angår en seleksjonsmetode for separering av rotavirus reassortanter avledet fra ko-infeksjon av cellekulturer med et animalsk rotavirus og med et humant rotavirus.

US 4,341,763 angår anvendelse av levende attenuerte eller inaktiverte bovine rotavirus som en vaksine for mennesker.

Garbag-Chenon et al., Res. Virol. 1989 angår sikkerhet og immunogenisitetsstudier av en rotavirusvaksinekandidat omfattende en levende attenuert bovinstamme etter dens administrering til nyfødte.

US 4,624,850 angår en dyrkningsmetode for humane rotavirusstammer og fremstilling av tilsvarende levende attenuerte humane rotavirusstammer anvendt for vaksineproduksj on.

Animal Biology Collection, VR-2104, VR-2018 og VR-2417 deponert hos ATCC viser produktbeskrivelsen av flere isolerte humane rotavirus.

En rotavirusstarnme betegnet 89-12 har blitt beskrevet av Ward; se US patentskrift nr. 5 474 773 og Bernstein, D.L. et al., Vaccine, 16 (4), 381.387,1998. Stamme 89-12 ble isolert fra en avføringsprøve oppsamlet fra et 14 måneder gammelt barn med naturlig rotavirussykdom i 1988. Ifølge US patentskrift nr. 5 474 773 ble det humane rotavirus HRV 89-12 så tilpasset til dyrking ved 2 passasjer i primære nyreceller fra afrikansk, grønn ape (AGMK) og 4 passasjer i MA-104-celler, som beskrevet av Ward in J. Clin. Microbiol., 19, 748-753,1984. Viruset ble så plakkrenset 3 ganger i MA-104-celler (til passasje 9) og dyrket etter ytterligere 2 passasjer i disse cellene. Ytterligere en passasje ble gjort (passasje 12) for deponering hos ATCC under aksesjonsbetegnelsen ATCC VR 2272. Den deponerte stamme betegnes 89-12C2.

1998-artikkelen i Vaccine av Bernstein et al. betegnes nedenfor Vaccine (1998)-artikkelen. Artikkelen beskriver sikkerhet og immunogenisitet av en levende, human rotavirusvaksinekandidat, tilført oralt. Denne vaksinen ble erholdt fra stamme 89-12, svekket ved passasje uten plakkrensing 26 ganger i primære AGMK-celler og så ytterligere 7 ganger i en etablert AGMK-cellelinje (i alt 33 passasjer).

I det påfølgende vil det ovenfor beskrevne materiale som ble gitt 26 seriepassasjer, betegnes P26. og materialet som har blitt gitt 33 seriepassasjer vil betegnes P33. Generelt vil rotavirus avledet ved passasje av 89-12 n ganger betegnes Pn.

I de påfølgende eksempler ble P33-materialet gitt ytterligere 5 passasjer i Vero-celler. Dette preparatet betegnes P38.

P26- og P33-isolatet som beskrives i Vaccine (1998)-artikkelen ble ikke deponert i en kultursamling og heller ikke analysert for å fastslå deres genetiske egenskaper.

Det har nå blitt funnet at P26-populasjonen som beskrives i litteraturen omfatter en blanding av varianter. Dette har blitt fastslått ved genetisk karakterisering som beskrevet heri nedenfor (se eksemplene). P26 er derfor ikke en pålitelig, vedvarende populasjon for ytterligere passasjer, særlig ikke for fremstilling av vaksineporsjoner. På tilsvarende måte omfatter P33 en blanding av varianter og er ikke pålitelig stabil for produksjon av vaksineporsj oner.

Det har blitt funnet at P26-materialet er en blanding av minst tre VP4-genvarianter. P33 og P38 er på tilsvarende måte en blanding av to varianter. Når det gjelder nøytraliserende epitoper ser disse variantene ut til å være antigenisk forskjellig fra 89-12C2-stammen som ble deponert hos ATCC ved en evaluering av det nøytraliserende antistofftiter i serum fra barn vaksinert med P33 mot disse variantene. Dette er vist i figur 3.

Det har videre blitt funnet at når P33-materialet tilføres til småbarn, replikeres og utskilles to identifiserte varianter. Av 100 vaksinerte småbarn viste kun to tegn på gastroenteritt grunnet rotavirusinfeksjon, mens 20% av en placebogruppe ble infisert. Disse funn tyder på at de identifiserte varianter er forbundet med beskyttelse mot rotavirussykdom. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye rotavirusvarianter og en forbedret levende, svekket rotavirusvaksine.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse ifølge et første aspekt svekket human rotaviruspopulasjon, kjennetegnet ved at den omfatter en enkelt variant eller en i det vesentlige enkelt variant, hvor nevnte variant er betegnet P43 og er deponert under aksesjonsnummeret ECACC 99081301.

Med en populasjon som omfatter en enkelt variant eller i det vesentlige en enkelt variant, menes en rotaviruspopulasjon som ikke inneholder mer enn 10%, fortrinnsvis mindre enn 5%, og mest foretrukket mindre enn 1% av en eller flere andre varianter. Viruspopulasjoner kan renses til homogenitet eller i det vesentlige homogenitet ved passasje i egnete celletyper eller ved å utføre en serie av ett eller flere kloningstrinn.

En fordel med oppfinnelsen er at en populasjon som omfatter en enkelt variant er mer egnet for formulering av en konsistent vaksineproduksjon. Spesielle varianter, definert ved nukleotidsekvenser som koder for hovedvirusproteinet, kan også være forbundet med forhøyet virkning når det gjelder forhindring av rotavirusinfeksjon.

I en foretrukket utførelse er rotavirusvarianten betegnet P43 en rotavirusvariant, kjennetegnet ved at den betegnes P43 og er deponert under aksesjonsnummeret ECACC 99081301, rotavirusavkom og immunologisk aktive derivater av denne og materialer erholdt derfra.

I ytterligere en utførelse er den humane rotavirusvariant kjennetegnet ved at den omfatter minst ett antigen eller minst ett segment fra rotavirusvarianten P43 ifølge krav 2.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av rotavirus som definert i hvilket som helst av kravene 1-3, kjennetegnet ved at den omfatter: • passasje av et rotaviruspreparat i en egnet cellelinje;

• om ønskelig seleksjon av homogen kultur ved anvendelse av enten:

o grensefortynning; eller

o enkeltplakk isolering; og

kontroll av nærvær av i det vesentlige en enkelt variant ved å sekvensere et egnet område av VP4- og/eller VP7-gensekvensen.

Sekvensbestemmelsen kan med fordel utføres ved en kvantitativ eller semikvantitativ hybridiseringsteknikk, for eksempel "slot-blot"-hybridisering eller plakkhybirdisering.

Den utvalgte variant er fortrinnsvis en variant som replikeres og utskilles når utgangsrotaviruspreparatet tilføres til et menneske, fortrinnsvis et barn.

Den resulterende klonede viruspopulasjon som er resultatet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan amplifiseres ved ytterligere passasjer i en egnet cellelinje.

Egnede celletyper for passasje av rotaviruspopulasjonen i fremgangsmåten ovenfor, omfatter nyreceller fra afrikansk, grønn ape (AGMK-celler), som kan være etablerte cellelinjer eller primære AGMK-celler. Egnede AGMK-cellelinjer omfatter for eksempel Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhl-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) og CV-1 (ATCC CCL-70). Også egnede er cellelinjene MA-104 (rhesus-ape) og MRC-5 (human-ATCC CCL-171). Vero-celler foretrekkes spesielt for amplifiseirngsformål. Passasje i Vero-celler gir høyt virusutbytte.

Teknikker for å kontrollere hvorvidt det er en enkelt variant i en viruspopulasjon som erholdes ved fremgangsmåten og for bestemmelse av denne eneste variants egenskaper, omfatter standard fremgangsmåter for sekvensering eller hybridisering som er kjente innen faget og som beskrives heri nedenfor.

I en foretrukket utførelse utføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av et egnet rotavirus, fortrinnsvis et rotavirus med egenskapene til 89-12-stammen eller et derivat av denne erholdt ved passasje.

En spesielt foretrukket enkeltvariantpopulasjon er P43, som ble erholdt fra P33 (et isolert, humant rotavirus med 33 gangers passasje i kultur i egnede celletyper) ved en serie av grensefortynningskloningstrinn fulgt av passasje av det klonede materiale i Vero-celler for amplifisering.

En P43-populasjon ble deponert hos European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Storbritannia den 13. august 1999 under deponeringsnummeret 99081301, under betingelsene i Budapestkonvensjonen.

Selv om denne beskrevne offentlige tilgjengelighet er den enkleste måte å erholde det humane rotavirus P43 på, er det ikke fullstendig umulig eller usannsynlig at liknende og funksjonelt i det vesentlige identiske rotavirus kan fremstilles ved disse eller andre fremgangsmåter i lys av foreliggende oppfinnelses lære. Slikt funksjonelt, i det vesentlige identiske rotavirus ansees å være biologisk ekvivalente med det humane rotavirus P43 ifølge oppfinnelsen og ligger derfor innenfor foreliggende oppfinnelses generelle område. Det vil derfor forstås at oppfinnelsen omfatter rotaviruspopulasjoner med egenskapene til P43-varianten som beskrevet heri.

Det vil også forstås at oppfinnelsen omfatter materialer avledet fra det deponerte P43 ECACC 99081301 ved ytterligere behandling av dette, for eksempel videreføring av det ved ytterligere passasjer, kloning eller andre fremgangsmåter som benytter det levende virus, eller ved å modifisere P43 på en eller annen måte, innbefattet ved teknikker for genetisk modifisering eller reassortant-teknikker. Slike trinn og teknikker er velkjente innen faget.

Materialer avledet fra det deponerte P43 som omfattes av oppfinnelsen, omfatter proteinmateriale og genetisk materiale. Av spesiell interesse er reassorterte rotavirus som omfatter minst ett antigen eller minst ett segment fra P43, for eksempel reassortanter som omfatter en virulent rotavirusstamme hvori et eller en del av ett av de II genomsegmentene har blitt erstattet med genomsegmentet eller en del av dette fra P43. Særlig kan en rotavirus-reassortant, hvori segmentet eller delsegmentet som koder for NSP4 er et P43-segment eller et -delsegment, ha nyttige egenskaper. Reassorterte rotavirus og teknikker for fremstilling av disse er velkjente (Foster, R.H. and Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).

Materialer av spesiell interesse er avkom fra P43 og immunologisk aktive derivater av P43. Immunologisk aktive derivater betyr materialer erholdt fra eller med P43-viruset, nærmere bestemt antigener fra viruset, som kan utløse en immunrespons som gir reaksjon mot rotavirus når det injiseres i et vertsdyr.

Ved tilpasning av rotaviruset til en egnet cellelinje, for eksempel Vero-celler, kan det være nødvendig å behandle viruset for å bli kvitt eventuelle mulige kontaminanter, for eksempel eventuelle tilfeldig innførte midler som kan foreligge og som ellers ville gi kontaminering. Når det gjelder etersensitive forurensende virus, kan behandlingen gjøres ved eterbehandling som beskrevet heri nedenfor. Foreliggende oppfinnelse gjelder også innføring av en slik eterbehandling som et valgfritt trinn i den generelle fremgangsmåte for erholdelse av et svekket, levende rotavirus eller en vaksine utformet fra dette.

Også innenfor oppfinnelsens område er blandinger av P43 med andre rotavirusvarianter, for eksempel andre klonede varianter, eller med andre virus, fortrinnsvis andre svekkede virus. Slike blandinger er anvendbare i vaksinene ifølge oppfinnelsen som beskrives heri nedenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et vaksinepreparat, kjennetegnet ved at det omfatter et levende, svekket virus ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3 sammenblandet med et egnet farmasøytisk bærerstoff eller en adjuvans.

Rotavirusvaksinen ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis en vaksine tilpasset oral administrering.

Rotavirusvaksinen ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis en monovalent rotavirusvaksine, som omfatter en enkelt rotavirusstamme.

Foreliggende oppfinnelse er spesielt fordelaktig for tilveiebringelse av en levende rotavirusvaksine hvori det levende, svekkede rotavirus er et humant rotavirus som ikke gir intus-suscepsjon.

Egnede farmasøytiske bærestoffer for anvendelse i vaksinen ifølge oppfinnelsen omfatter bærestoffer som er kjent innen faget som egnede for oral tilførsel, særlig til barn. Slike bærestoffer omfatter, men er ikke begrenset til karbohydrater, polyalkoholer, aminosyrer, aluminiumhydroksid, magnesiumhydroksid, hydroksyapatitt, talkum, titanoksid, jernhydroksid, magnesiumstearat, karboksymetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, mikrokrystallinsk cellulose, gelatin, vegetabilsk pepton, xantan, caraghenan, gummi arabikum og (3-syklodekstrin.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av en rotavirusvaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 8-22, kjennetegnet ved at den omfatter blanding av et svekket humant rotavirus med en egnet farmasøytisk bærer eller adjuvans.

Det kan også være fordelaktig å utforme viruset ifølge oppfinnelsen i lipidbaserte bærere, for eksempel virosomer eller liposomer, i olje i vann-emulsjoner eller med bærerpartikler. Alternativt eller i tillegg, kan immunstimulerende midler, for eksempel midler som er kjente innen faget for orale vaksiner, inngå i preparatet. Slike immunstimulerende midler omfatter bakterielle toksiner, fortrinnsvis koleratoksin (CT) i form av holotoksinet (hele molekylet) eller bare B-kjeden (CTB), og det varmelabile enterotoksin fra E. coli (LT). Muterte LT (mLT) som har mindre tendens til å omdannes til sin aktive form enn nativt LT, beskrives i WO 96/06627, WO 93/13202 og US patentskrift nr. 5 182 109.

Ytterligere immunstimulerende midler som med fordel kan inngå er saponinderivater som QS21 og monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL). Rensete saponiner som orale adjuvanser beskrives i WO 98/56451. Saponiner og monofosforyl-lipid A kan benyttes hver for seg eller i kombinasjon (se for eksempel WO 94/00153) og kan utformes i adjuvanssystemer sammen med andre midler. 3D-MPL er en velkjent adjuvans som fremstilles av Ribi Immunochem, Montana, og fremstillingen beskrives i GB 2122204.

En generell diskusjon vedrørende bærere og adjuvanser for oral immunisering kan finnes i Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, redigert av Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av et svekket humant rotavirus for fremstilling av en vaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 10-22 for forebyggelse av rotavirusinfeksjon hos et menneske.

I en foretrukket utførelse utformes vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen med et antacidpreparat for å minimalisere inaktivering av vaksinen ved syre i magen. Egnede syrenøytraliserende bestanddeler omfatter uorganiske antacider, for eksempel aluminiumhydroksid Al(OH)3 og magnesiumhydroksid Mg(OH)2. Kommersielt tilgjengelige antacider som er egnede for anvendelse i oppfinnelsen omfatter "Mylanta"

(varemerke), som inneholder aluminiumhydroksid og magnesiumhydroksid. Disse er uløselige i vann og gis i suspensjon.

Aluminiumhydroksid er en spesielt foretrukket bestanddel av et vaksinepreparat ifølge oppfinnelsen, da dette ikke bare gir en syrenøytraliserende virkning, men også en adj uvansvirkning.

Også egnede for anvendelse som antacida i vaksinen ifølge oppfinnelsen er organiske antacider, for eksempel organiske karboksylsyresalter. Et foretrukket antacida i vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen inneholder et organisk karboksylsyresalt, fortrinnsvis et salt av sitronsyre som natriumsitrat eller kaliumsitrat.

Et spesielt foretrukket antacider som kan anvendes i vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen er det uløselige, uorganiske salt kalsiumkarbonat (CaCOa). Kalsiumkarbonat kan assosieres til rotaviruset, og rotavirusaktiviteten opprettholdes mens viruset er assosiert med kalsiumkarbonat.

For å forhindre utfelling av kalsiumkarbonat under oppfyllingstrinnet, foreligger fortrinnsvis viskositetsmidler i preparatet.

Mulige viskositetsmidler som kan anvendes omfatter pseudoplastiske eksipienser. En pseudoplastisk løsning defineres som en løsning som har høyere viskositet ved henstand, sammenliknet med viskositeten under omrøring. Eksipienser av denne type er naturlige polymerer som gummi arabikum, adragantgummi, agar-agar, alginater, pektiner eller semisyntetiske polymerer som for eksempel karboksymetylcellulose ("Tyloses C"), metylcellulose ("Metocels A", Viscotrans MC", "Tylose MH" og "MB"), hydroksypropylcellulose ("Klucels"), og hydroksypropylmetylcellulose ("Metocels E" og "K", "Viscontrans MPHC"). Generelt anvendes disse pseudoplastiske eksipienser sammen med tiksotrope midler. Alternative viskositetsmidler som kan anvendes er pseudoplastiske eksipienser med lav flytevne. Ved tilstrekkelig konsentrasjon gir disse polymerer opphav til et strukturelt væskearrangement som fører til en svært viskøs løsning med lav flytevne ved henstand. En viss mengde energi må tilføres til systemet for å oppnå flyt og masseoverføring. Ytre energi (omrøring) er nødvendig for midlertidig ødeleggelse av det strukturelle væskearrangement for å oppnå en flytende løsning. Eksempler på slike polymerer er "Carbopols" og xantangummi.

Tiksotrope eksipienser danner en gelstruktur ved henstand, mens de under omrøring danner en flytende løsning. Eksempler på tiksotrope eksipienser er "Veegum" magnesium-aluminium silikat og "Avicel RC" (tilnærmet 89% mikrokrystallinsk cellulose og 11% karboksymetylcellulose-Na).

Vaksinepreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis et viskositetsmiddel utvalgt blant xantangummi og stivelse.

Vaksinepreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse utformes således fortrinnsvis med en kombinasjon av kalsiumkarbonat og xantangummi.

Andre bestanddeler av et preparat som anvendes i oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis sukker, for eksempel sukkrose og/eller laktose.

Vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen kan inneholde ytterligere bestanddeler, for eksempel smaksstoffer (fortrinnsvis for en oral vaksine) og bakteriostatiske midler.

Man tenker seg forskjellige utforminger av vaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelse tilføres vaksinen som et flytende preparat. Det flytende preparat rekonstitueres fortrinnsvis før tilførsel fra minst følgende to bestanddeler:

i) virusbestanddel

ii) væskebestanddel.

I denne utførelse foreligger virusbestanddelen og væskebestanddelen normalt i atskilte beholdere, som med fordel kan være atskilte deler av en enkelt beholder, eller separate beholdere som kan sammenkobles på en slik måte at det endelige vaksinepreparat rekonstitueres uten at det eksponeres for luft.

Før rekonstitueringen kan viruset foreligge i tørr form eller væskeform. Virusbestanddelen er fortrinnsvis frysetørket, Frysetørket virus er mer stabilt enn virus i en vandig løsning. Det frysetørkete kan med fordel rekonstitueres ved anvendelse av et flytende antacidpreparat for fremstilling av et flytende vaksinepreparat. Alternativt kan det frysetørkete virus rekonstitueres med vann eller en vandig løsning, i dette tilfelle inneholder det frysetørkete viruspreparat fortrinnsvis en antacidbestanddel.

Vaksinepreparatet omfatter fortrinnsvis en virusbestanddel utformet med kalsiumkarbonat og xantangummi i en avdeling eller beholder, og dette rekonstitueres med vann eller en vandig løsning som foreligger i den andre avdeling eller beholder.

I en annen foretrukket utførelse er vaksinepreparatet et fast preparat, fortrinnsvis en frysetørket masse som er egnet for umiddelbar oppløsning når den plasseres i munnen. Frysetørkete preparater kan med fordel foreligge i form av tabletter i en farmasøytisk plastforpakning.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et vaksinepreparat ifølge hvilket som helst av av kravene 10 til 18, kjennetegnet ved at det levende svekkede virus er utformet med antacidpreparatet og lyofilisert i en plastforpakning.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et vaksinepreparat ifølge krav 20, kjennetegnet ved at det levende svekkede virus og antacidpreparatet foreligger i separate beholdere for utforming som et flytende vaksinepreparat før administrering.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et vaksinepreparat ifølge krav 20, kjennetegnet ved at det levende svekkede virus og antacidpreparatet foreligger i samme beholder for utforming som et lyofilisert vaksinepreparat for rekonstitusjon med en vandig løsning før administrering.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en rotavirusvaksine i form av en hurtig oppløsbar tablett for oral tilførsel.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et preparat som omfatter en levende, svekket rotavirusstamme, fortrinnsvis en human rotavirusstamme, hvori preparatet er et frysetørket, fast stoff som kan oppløses umiddelbart når det plasseres i munnen.

Den hurtig oppløsbare tablett ifølge opprinnelsen oppløses fortrinnsvis i pasientens munn tilstrekkelig hurtig til at svelging av den uoppløste tablett forhindres. Denne tilnærming er spesielt fordelaktig for pedriatiske rotavirusvaksiner.

Viruset er fortrinnsvis et levende, svekket rotavirus som er utformet med et uorganisk antacida, for eksempel kalsiumkarbonat, og et viskositetsmiddel, for eksempel xantangummi.

Ytterligere en utførelse av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et frysetørket preparat hvori virusbestanddelen er enhver rotavirusstamme som er utformet med kalsiumkarbonat og xantangummi.

Vaksiner ifølge oppfinnelsen brukes som medisin og kan utformes og tilføres ved kjente teknikker ved anvendelse av en mengde levende virus som er egnet for erholdelse av effektiv beskyttelse mot rotavirusinfeksjon uten signifikante uønskede bivirkninger for typiske vaksinemottakere. En egnet mengde levende virus vil normalt være mellom IO<4> og IO<7> ffu pr. dose. En typisk dose av vaksinen kan omfatte IO<5->IO<6> ffu pr. dose og kan gis i flere doser over et visst tidsrom, for eksempel i to doser gitt med to måneders mellomrom. Fordeler kan imidlertid oppnås ved å benytte mer enn to doser, for eksempel et doseringsskjema med tre eller fire doser, særlig i utviklingsland. Tidsrommet mellom dosene kan være mer eller mindre enn to måneder langt. En optimal mengde levende virus for en enkelt dose eller for et flerdoseskjema og optimale doseringstidspunkter kan fastslås ved standardundersøkelser som omfatter observasjon av antistofftiteret og andre responser i pasienter.

Vaksinen ifølge oppfinnelsen kan også omfatte andre egnede levende virus for beskyttelse mot andre sykdommer, for eksempel poliovirus. Alternativt kan andre egnede levende virusvaksiner for oral tilførsel gis i en separat dose, men på samme tidspunkt som rotavirusvaksinepreparatet ifølge oppfinnelsen.

Tekst til figur 3

Serum fra tolv 4 til 6 måneder gamle småbarn vaksinert med P33-materiale som beskrevet i Vaccine (1998)-artikkelen, ble analysert for nøytralisering av P33, P38, P43 og 89-12C2.

Det nøytraliserende titerområdet for de analyserte sera er like for P33, P38 og P43. Den statistiske analyse viser ingen signifikant forskjell i det totale nøytraliserende titer mot disse tre virus. Dette tyder på at konformasjonelle og ikke-konformasjonelle nøytraliserende epitoper i P33, P38 og P43 gjenkjennes like godt av anti-P33-seraene fra P33-vaksinerte småbarn. Denne observasjon tyder indirekte på at de nøytraliserende epitoper som gjenkjennes i denne in vi/ro-analysen ikke er forskjellige mellom P33, P38 og P43.

Det nøytraliserende titerområdet for P89-12C2 var imidlertid signifikant forskjellig fra området for P33, P38 og P43. Denne observasjon tyder på at de konformasjonelle og ikke-konformasjonelle nøytraliserende epitoper i P33, P38 og P43 ikke gjenkjennes like godt av anti-P33-serum fra P33-vaksinerte småbarn. Denne observasjon tyder indirekte på at de nøytraliserende epitoper som gjenkjennes i denne in vzYrø-analysen er endret i 89-12C2, sammenliknet med P33, P38 og P43.

De påfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Demonstrasjon av at stamme 89-12 ved passasje 26 (P26) er en blanding av varianter

Sekvensering av VP4- og VP7- genet fra forskjellige passasjer

Sekvensering av VP4- og VP7-genet fra passasje P26 (primære AGMK-celler), passasje P33 (etablert (i motsetning til primær)AGMK-cellelinje), passasje P41 og passasje P43, ble utført. Ekstrahert total-RNA ble revers transkribert og amplifisert ved PCR i ett rør/ett trinn.

Primerne Rota 5bis og Rota 29bis amplifiserte hele VP4-genet, og primerne Rota 1 og Rota 2bis amplifiserte hele VP7-genet. PCR-materialet har blitt sekvensert ved anvendelse av forskjellige primere (se tabell 1).

Sekvensen fra passasje P26 avvek fra sekvensen fra passasje P33 i tre baser (i posisjonene 501, 788 og 802bp fra startkodonet) i VP4 og i tre baser i VP7 (108, 605 og 897 bp fra startkodonet).

Passasje P26-sekvensanalyser av VP4 og VP7 viser i muterte posisjoner nærvær av passasje P33-sekvensen som bakgrunn. Det kan således observeres at passasje P26 er en blanding av minst to varianter.

Passasje P33-sekvensanalyser ser homogene ut når det gjelder VP4 og heterogene for VP7 (se tabell 2).

Passasje P38 (avledet fra passasje P33) var gitt fem gangers passasje i Vero-celler og viste det samme sett av VP4- og VP7-sekvenser som passasje P33 (AGMK-cellelinje). Det var således ingen vesentlig endring av populasjonene mellom P33 og P38.

N.B. I en annen klon fra de tre kloner som ble utviklet til produksjonsnivå, er nukleotidet ved 897 bp i VP7 G snarere enn A som forefinnes i den P43-selekterte klon. Dette fører til metionin i stedet for isoleusin i aminosyresekvensen. Varianter som tilsvarer både den selekterte P43-klon og klonen hvori det er en G i VP7 i posisjon 897 bp fra startkodonet, ble utskilt i avføring hos barn som var vaksinert med P33-materialet.

I tabell 3.1, der det foreligger to alternative baser i en gitt posisjon, representerer den første av disse basen som foreligger i hovedpopulasjonen, mens den andre er basen som forekommer i en mindre del av populasjonen. Hovedpopulasjoner og mindre populasjoner vurderes utfra signalstyrken ved sekvensering.

Tabell 3.2 viser aminosyreendringene som oppstår utfra nukleotidforskjellene mellom variantene.

Slot-blot hybridisering

Populasjonsendringene mellom passasje P26 og passasje P33 i AGMK-celler har blitt ytterligere bekreftet ved slot-blot-hybridisering. VP4- og VP7-genfragmentene dannet ved RT/PCR ble hybridisert med oligonukleotidprober som var spesifikke for hver variant (se tabell 3.1 og 3.2). I motsetning til P26, som hybridiserte med Rota 16, Rota 35 og Rota 36 og ikke med Rota 15, hybridiserte VP4-PCR-fragmentet fra P33-materialet i posisjonene 788 og 802 kun med Rota 16, og verken med Rota 15, Rota 35 eller Rota 36. Disse resultatene fastslo nærvær av minst tre varianter i P26 (se tabell 4).

For VP7-PCR-fragmentet fra P33-materialet hybridiserte posisjon 897 med Rota 41 og Rota 42. Disse resultater fastslo nærvær av minst to varianter i P33-materialet.

Eksempel 2: Isolering og karakterisering av P43-klonen

For isolering av P33-bestanddeler som en homogen viruspopulasjon, ble tre sluttpunktsfortynninger av P33/AGMK i Vero-celler utført, og det resulterende virus ble anvendt for infeksjon av Vero-celler.

Positive brønner ble selektert ut fra to kriterier: Vekst, vist ved det største antall foci påvist i brønnene og de mest isolerte positive brønnene i platene, som det gjøres på klassisk måte. Etter tre grensefortynningspassasjer i 96-brønners mikrotiterplater ble ti positive brønner amplifisert etter hverandre i Vero-celler og evaluert for utbytte.

Basert på utbyttet ble tre kloner utviklet til produksjonsnivå. Immungjenkjenningen ved polyklonale antistoffer ble vist å være lik mellom de tre klonene og mellom klonene og P33. Klonenes homogenitet ble anslått ved slot-blot-hybridisering. Den endelige seleksjon av en enkelt klon var basert på utbytte og sekvens.

Den utvalgte klon ble amplifisert ved på hverandre følgende passasjer i Vero-celler for dannelse av en hovedsuspensjon, en arbeidssuspensjon og endelig produksj onsporsj oner.

Den utvalgte klon ble genetisk karakterisert ved forskjellige passasjenivåer ved sekvensering av VP4 og VP7 (identitet) og ved spesifikk slot-blot-hybridisering med VP4 og VP7 (homogenitet) fra de PCR-amplifiserte materialer. Sekvensen til VP4- og VP7-genet i P43-materialet gis i figur 1, henholdsvis 2 og er identisk med P41.

Den utvalgte klons homogenitet ble anslått ved selektiv hybridisering ved anvendelse av oligonukleotidprober som gjenkjenner nukleotidendringer i VP4- og/eller VP7-området i hver av variantene som ble identifisert under sekvensering av P26/primære AGMK (se tabell 4).

VP4-fragmentet hybridiserte med Rota 16 og ikke med Rota 15, Rota 35 eller Rota 36.

VP7-fragmentet hybridiserte med Rota 41 og ikke med Rota 42.

Disse resultatene bekreftet at P43 er en homogen populasjon.

Eksempel 3: Fjerning av eventuelt tilleggsvirus

Eter ble tilsatt til P33 (dyrket i AGMK) til en sluttkonsentrasjon på 20% i en time. Eteren ble så utboblet med N2 i 35 minutter. Ingen virkning på titeret i P33-suspensjonen ble observert.

Eksempel 4: Utforming av en levende, svekket vaksine

Produksj onsporsj onene beskrevet ovenfor utformes for oral tilførsel til småbarn ved følgende fremgangsmåte.

1. Frysetørket virus

Standardteknikker benyttes for fremstilling av virusdoser. Nedfrosset, renset virusmasse opptines og fortynnes med et egnet medium, i dette tilfellet Dulbecco's modifiserte Eagle's Medium, opptil en ønsket standard viruskonsentrasjon, i dette tilfellet IO<6,2 >ffu/ml. Det fortynnede virus fortynnes så videre med frysetørkingsstabilisator (4% sukrose, 8% dekstran, 6% sorbitol, 4% aminosyrer) opptil det ønskede virustiter, i dette tilfellet IO<5,6> ffu/dose. Uttak på 0,5 ml av det stabiliserte viruspreparat overføres a septisk til 3 ml ampuller. Ampullene lukkes så delvis med en gummikork, prøven frysetørkes under vakuum, ampullen lukkes fullstendig og en aluminiumshette klemmes på plass rundt ampullen for å holde korken på plass.

Før anvendelse rekonstitueres viruset ved anvendelse av en av følgende syrenøytraliserende rekonstitueirngsmidler:

( a) Sitrat rekonstitueringsmiddel

Natriumsitrat løses i vann, steriliseres ved filtrering og overføres aseptisk til rekonstitueringsmiddelbeholdere i mengder på 1,5 ml ved en konsentrasjon på 544 mg NaaSitrat. 2H2O pr. 1,5 ml dose. Rekonstitueringsmiddelbeholderne kan for eksempel være 3 ml ampuller, 4 ml ampuller eller 2 ml sprøyter, eller sammenklembare kapsler av myk plast for oral tilførsel. Som et alternativ til å benytte sterile bestanddeler under sterile betingelser kan den endelige beholder autoklaveres.

( b ) AKOHVrekonstitueringsmiddel

En aseptisk aluminiumhydroksidsuspensjon ("Mylanta"-varemerke) fortynnes aseptisk med sterilt vann og overføres aseptisk til rekonstitueringsmiddelbeholdere (for eksempel 2 ml sprøyter eller sammenklembare kapsler av myk plast) i mengder på 2 ml som hver inneholder 48 mg Al(OH)3. Et alternativ til anvendelse av sterile bestanddeler under sterile betingelser er å y-bestråle aluminiumhydroksidsuspensjonen (fortrinnsvis på et fortynnet stadium).

Standardbestanddeler inngår for å forhindre at suspensjonen setter seg. Slike standardbestanddeler omfatter for eksempel magnesiumstearat, karboksymetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, mikrokrystallinsk cellulose og silikonpolymerer. Bakteriostatiske midler, for eksempel butylparaben, propylparaben eller andre standard bakteriostatiske midler som anvendes i næringsmidler, og smaksstoffer kan også inngå.

2. Frysetørket virus med AKOHh i et flytende preparat

Standard teknikker benyttes for fremstilling av virusdoser. Nedfrosset, renset virusmasse opptines og fortynnes med et egnet medium, i dette tilfellet Dulbecco's modifiserte Eagle's Medium, til en ønsket standard viruskonsentrasjon, i dette tilfellet IO<6>'<2> ffu/ml. Aluminiumhydroksidsuspensjon tilsettes til en sluttmengde på 48 mg/dose og viruspreparatet fortynnes med frysetørkingsstabilisator (4% sukrose, 8% dekstran, 6% sorbitol, 4% aminosyrer) opptil det ønskede virustiter, i dette tilfellet IO<5>'<6> ffu/dose. Uttak på 0,5 ml av det stabiliserte viruspreparat overføres aseptisk til 3 ml ampuller. Frysetørking og lukking av ampullene utføres så som beskrevet i del 1.

3. Frysetørket virus med AKOETh for levering i plastbeholdere

Standard teknikker benyttes for fremstilling av virusdoser. Nedfrosset, renset virusmasse opptines og fortynnes med et egnet medium, i dette tilfellet Dulbecco's modifiserte Eagle's Medium, til en ønsket standard viruskonsentrasjon, i dette tilfellet 10 ' ffu/ml. Aluminiumhydroksidsuspensjon tilsettes til en sluttmengde på 48 mg/dose og viruspreparatet fortynnes med frysetørkingsstabilisator som kan være sukrose, dekstran eller 4% aminosyrer, eller gelatin, vegetabilsk pepton eller xantan, opptil det ønskede virustiter på IO<5,6> ffu/dose. En aseptisk oppfyllingsfremgangsmåte benyttes for overføring av doser på 0,5 ml, eller fortrinnsvis mindre, til hulrommene i plastbeholderen. Preparatet frysetørkes og hulrommene i plastbeholderen forsegles ved varmebehandling.

Om ønskelig inngår standard bestanddeler for å forhindre at

aluminiumhydroksidsuspensjonen setter seg. Slike standardbestanddeler omfatter for eksempel magnesiumstearat, karboksymetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, mikrokrystallinsk cellulose og silikonpolymerer. Smaksstoffer kan også inngå.

Eksempel 5: Titrering av virus i forskjellige preparater

5.1: Sammenlikning mellom laktose- os sukrosebaserte preparater:

P43-rotavirus enten med sukrose eller med laktose som vist i tabellen ovenfor. Virustiteret før frysetørking er virustiteret i den ferdig utformede væske (inneholdende sukrose, dekstran, sorbitol og aminosyrer) og uten frysetørkingstrinnet.

Gode resultater er resultater hvori en <0,5 log reduksjon i frysetørkingstrinnet og <0,5 log reduksjon i løpet av en uke ved 37 °C (akselerert stabilitetsanalyse) oppnås.

Presisjonen i titrering av viruset er tilnærmet +/- 0,2 log.

Resultatene antyder at sukkrose kan anvendes i stedet for laktose.

5.2: Virkning av arsinin oe erstatning av sorbitol med maltitol:

Resultatene viser at tilsetning av arginin (som vites å forbedre stabiliteten av virus under frysetørking og også gir et basalmedium som kompenserer for surhetsgraden i magen) bevarer virustiteret.

Sorbitol har en tendens til å redusere glassoverføringstemperaturen for den frysetørkete masse i for stor grad. Dette kan overvinnes ved å benytte maltitol i stedet for sorbitol som vist ovenfor, og virustiteret opprettholdes fortsatt.

5.3: Utforming av forskjellige preparater

Dette eksperiment viser at en rekke utforminger er mulige.

5.4: Assosiasjon mellom Rotavirus og Al(OH)3-antacider:

A1(0H)3 anvendes som antacid. Dette viser at Rotavirus er forbundet med det uløselige uorganiske salt (AL(OH)3 siden det nedsentrifugeres sammen med Al(OH)3 (redusert virusaktivitet i supernatanten).

5.5: Oppløsning av Al(OH)3-antacid med Natriumsitrat før virustitrering

Når Rotavirus er assosiert med Al(OH)3 er det mulig å frysetørke alt (innbefattet Al(OH)3). Etter frysetørkingen er det mulig å gjenvinne Rotaviruset ved å løse Al(OH)3 i natriumsitrat. Dette trinn skader ikke Rotaviruset og opprettholder aktiviteten etter dette oppløsningstrinn.

5.6: Infeksjonsevne til Rotavirus etter frigjøring fra A1(OH)3-Rotavirus-komplekset:

Mekanismen for frigjøring av virus (ved oppløsning av bæreren) kan godt tenkes å forekomme in vivo. Faktisk blir aluminiumhydroksid fullstendig løselig under pH 6, og Rotavirus vil således frigjøres i magen.

I magen absorberes ikke Al""-1" ioner (J.J. Powell, R. Jugdaohsingh og R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153).

I tarmen utfelles uløselige former av aluminium (Al(OH)3 eller AJJPO4) grunnet forhøyet pH og fjernes på naturlig måte.

Det er ikke kjent hvorvidt den nydannede utfelling av Al(OH)3 (eller AIPO4) vil kunne reassosiere med fritt Rotavirus. Dette reiser spørsmålet om infeksjonevnen til Al(OH)3-Rotavirus-komplekset selv.

Frigjøring av Rotavirus fra Al(OH)3-Rotavirus-komplekset ved andre mekanismer er også mulig. For eksempel interfererer lysin med adsorpsjon av virus til Al(OH)3. Andre anioner som borat, sulfat, karbonat og fosfat vites å adsorpberes spesifikt til alummiurnhydroksid, det skulle derfor være teoretisk mulig å forskyve (ved konkurranse om adsorpsjonssetet) Rotavirus fra Al(OH)3-Rotavirus-komplekset.

Rotavirus kan således frigjøres fra Rotavirus - Al(OH)3-komplekset, og det frigjorte Rotavirus forblir aktivt.

Frigjøringen kan utføres enten ved å oppløse Al(OH)3 ved HC1 i magen eller med NasSitrat in vitro, eller ved å forskyve Rotaviruset med en basisk aminosyre (lysin).

5.7: Infeksjonsevne av Al(OH)3-Rotavirus-komplekset

En enkelt dose med frysetørket Rotavirus ble rekonstituert med vann og delt i to. Den første del, som utgjør referansedelen, ble gitt ytterligere et volum vann. Den andre del ble tilsatt 24 mg Al(OH)3 suspendert i 0,240 ml vann (preklinisk virustitrering). Når A1(0H)3 foreligger er Rotavirus aktivt, og virustiterverdien er høyere enn i referanseprøven.

Dette eksperiment ble gjentatt uten å oppdele den frysetørkete dose og ved tilsetning av 12 mg Al(OH)3 eller 24 mg Al(OH)3.

Her var referanseprøven prøven som var rekonstituert med en sitrat-bikarbonatbuffer. Virustiteret er igjen høyere i nærvær av Al(OH)3.

Som i eksemplet ovenfor assosieres Rotavirus med Al(OH)3-partiklene, siden viruset kan fjernes ved sentrifugering. DRVC003A46 er et frysetørket Rotavirus (Sukrose: 2%; Dekstran: 4%; Sorbitol: 3%; Aminosyrer: 2%).

SDSAA = 2% sukrose, 4% dekstran, 3% sorbitol, 2% aminosyre.

Ifølge virustitreringen utført på supernatanten ser mengden av A1(0H)3 som er nødvendig for adsorpsjon av Rotavirus ut til å være lav (med utgangspunkt i en frysetørket dose 5,7 log) oppskalering av virustitrering:

Tiden som er nødvendig for adsorpsjon av Rotavirus til Al(OH)3 ser ut til å være kort: En dose med frysetørket Rotavirus ble rekonstituert i nærvær av 24 mg Al(OH)3 og sentrifugert etter 0,15 og 60 minutter, samt etter 24 timer. Nedsentrifugert materiale ble resuspendert i SDSAA før virustitrering:

5.8: Anvendelse av CaCC>3 som antacid

For å unngå aluminium i vaksinen ble antacidet Al(OH)3 erstattet med et annet uløselig, uorganisk salt: CaCC<3 (kalsiumkarbonat).

Observasjonene med CaC03 tilsvarer dem beskrevet for Al(OH)3:

- Assosiasjon mellom Rotaviruset og det uorganiske salt; - Opprettholdelse av Rotavirusaktiviteten i kompleks med det uorganiske salt; - Mulig frigjøring av Rotaviruset fra komplekset ved å oppløse det uorganiske salt med en syre;

- Mulig samtidig frysetørking av antacidet og Rotaviruset.

Kompleks mellom CaCQ3 og Rotavirus

I et første forsøk ble frysetørket Rotavirus (virustiter 5,7) rekonstituert med en suspensjon av CaC03 i vann (50 mg i 1,5 ml) og så sentrifugert og virustiteret i supernatanten ble sammenliknet med titeret i det nedsentrifugerte materiale.

Dette tyder på at mer enn 90% av Rotaviruset er assosiert med CaC03.

Når viruset forelå i komplekset var det også mulig å utføre titreringen og gjenvinne de opprinnelige virusmengdene.

Virustiteret er også noe høyere enn titeret oppnådd uten CaC03.

Mengde kompleks mellom CaCOi og Rotavirus

Frysetørket Rotavirus ble rekonstituert med en CaC03-suspensjon i vann (1,5 ml):

10 mg

50 mg

100 mg

og så sentrifugert, og virustiteret i supernatanten ble sammenliknet med det nedsentrifugerte materialet.

Det er således åpenbart at jo mere CaC03, jo mere virus blir assosiert og jo mindre virus foreligger i supernatanten. Imidlertid gjenvinnes ikke den fullstendige dose (totalt forventet minst 5,3, eller til og med 5,8 som observert tidligere - se ovenfor).

Beskyttelse av Rotavirus med CaCOi under Baby Rosett- Rice- antacidtitrering Ved anvendelse av 1 doser frysetørket Rotavirus (DRVC003A46) og 50 mg CaC03, ble to typer baby-Rossett-Rice-titrering utført: I en klassisk Rossett-Rice-titrering blandes antacidet med Rotavirus og HC1 uthelles i denne blanding.

I den "inverse" baby-Rossett-Rice er situasjonen den omvendte: Antacid tilsettes til HCl-porsjonen (som det skjer in vivo).

I dette in vzYro-eksperiment kan således kalsiumkarbonat beskytte tilnærmet 20% av Rotaviruset mot nærvær av HC1 mens aluminiumshydroksid ikke beskytter.

5.9: Frysetørking av Rotavirus i nærvær av CaC03-antacida:

Dette er "alt i ett"-frysetørking av Rotavirus og antacid (CaC03) sammen i samme ampulle. For å forhindre utfelling av CaC03 under oppfyllingstrinnet er viskositetsmidler nødvendige. Eksempler på slike viskositetsmidler omfatter xantangummi og stivelse. Rotavirusaktiviteten opprettholdes selv i nærvær av xantangummi og stivelse.

5.10: Frysetørkete tabletter for hurtig desintegrering ved plassering i munnen: De påfølgende preparater demonstrerer "lyoc"-konseptet. Det vil si hurtig oppløsning av den frysetørkete masse i munnen.

I "lyoc-konseptet" kan både xantan og stivelse anvendes (med opprettholdelse av den frysetørkete masses hurtige oppløsningsegenskaper).

Eksempel 6: Anvendelse av kalsiumkarbonat som antacid for Rotavirusvaksinepreparat

Dersom en suspensjon av CaC03 i vann anvendes som antacid for Rotavirus er det et problem at kalsiumkarbonatpartiklene sedimenteres hurtig ved tilsetting av vann, siden tettheten av viruset er nær 2,6 og den gjennomsnittlige partikkelstørrelse er 30 um. Sedimenteringshastigheten kan reduseres ved:

1. å øke tettheten i det omliggende medium

2. å øke viskositeten av det omliggende medium

3. å redusere partikkelstørrelsen

4. å holde partiklene fra hverandre

6. 1: Øket tetthet i det omliggende medium:

Dersom CaC03-vannsuspensjonen (ved plassering i sprøyten) plasseres på den frysetørkete masse (inneholdende 2% sukrose, 4% dekstran, 3% sorbitol og 2% aminosyrer) forhøyes tettheten av det omliggende medium, men sedimentasjonshastigheten for CaC03 er ikke svært forskjellig fra hastigheten i CaC03-vannsuspensj onen.

6. 2: Øket viskositet i det omliggende medium:

Pseudoplastiske eksipienser

En pseudoplastisk løsning defineres som en løsning som har høyere viskositet ved henstand, sammenliknet med viskositeten under omrøring.

Vanlige eksipienser av denne type er:

naturlige polymerer, for eksempel:

gummiarabicum

adragant gummi

agar-agar

alginater

pektiner

semisvntetiske polymerer, for eksempel:

karboksymetylcellulose ("Tyloses C")

metylcellulose ("Methocels A", "Viscotrans MC", "Tylose MH" og "MB") hydroksypropylcellulose ("Klucels")

hydroksypropylmetylcellulose ("Methocels E" og "K", "Viscotrans MPHC")

Generelt anvendes disse pseudoplastiske eksipiensene sammen med tiksotrope midler.

Pseudoplastiske eksipienser med lav flytevne

Ved tilstrekkelig høy konsentrasjon gir disse polymerer opphav til et strukturelt væskearrangement som fører til en løsning med høy viskositet og lav flytevne ved henstand. En viss mengde energi må tilføres til systemet for å oppnå flyt og masseoverføring.

Ytre energi (omrøring) er nødvendig for midlertidig ødeleggelse av det strukturelle væskearrangement, slik at det oppnås en flytende væskeløsning.

Eksempler på slike polymerer er "Carbopols" og xantangummi.

Tiksotrope eksipienser

Med disse eksipienser erholdes en genstruktur ved henstand, mens det under omrøring oppnås en flytende løsning.

Eksempler på tiksotrope eksipienser er " Veegum" (magnesium-aluminiumsilikat) og "Avicel RC" (tilnærmet 89% mikrokrystallinsk cellulose og 11% karboksymetylcellulose Na).

6. 3 Reduksjon av partikkelstørrelsen

En reduksjon CaC03-partikkelstørrelsen førte til reduksjon av den syrenøytraliserende evne til forbindelsen.

6. 4 Å holde partiklene borte fra hverandre

Dette er tilfelle for "Veegum" og "Avicel", for hvilke uløselige partikler som er mindre (tilnærmet 1 \ im) enn CaC03-partiklene plasseres mellom CaC03-partiklene for å forhindre aggregering.

Eksempel 7: Produktutforming

De påfølgende skjemaer viser eksempler på mulige produktutforminger.

7. 1 CaCOi i sprøyten

Idet det allerede foreligger kliniske porsjoner med Rotavirus i frysetørkete ampuller kan antacidaet plasseres i rekonstitueringsvæsken som foreligger i sprøyten.

I denne produktutforming må sedimentering av CaC03 være under kontroll, ikke bare under oppfyllingstrinnet, men også under den fullstendige lagringstid for produktet (minst 2 år).

7. 2 CaCOi i den fr<y>setørkete ampulle

7. 3. Frysetørking i en plastforpakning

I dette tilfellet frysetørkes Rotavirus, CaCC<3 og Xantangummi sammen, direkte i plastforpakningen.

Eksempel 8: Frysetørking av forskjellige Rotavirus-stammer

Stammene DS-1, P og VA70 er bekrevet som referansestammer av humant Rotavirus for serotype G2, G3 henholdsvis G4 på side 1361 i "Fields" Raven press 1990,2. utgave.

I dette eksperiment har forskjellige Rotavirusstammer blitt frysetørket.

For alle ble virustiteret bevart under frysetørkingen, og akselerert stabilitet (en uke ved 37 °C) har blitt vist.

Eksempel 9: Fase I-sikkerhetsundersøkelse i voksne med en oral tilførsel av Rotavirusvaksinen.

En fase I-undersøkelse ble utført for å anslå sikkerhet og reaktivitet av en enkelt oral dose med IO<6,0> ffu av P43-vaksinen hos friske, voksne med alder 18 til 45 år.

Tre kliniske forsøk var dobbelt blindt og randomisert. Det var placebokontrollert og selvstendig. Undersøkelsen ble utført i ett enkelt senter i Belgia.

Forsøkspersoner

I alt 33 individer, 11 i placebogruppeh, og 22 i vaksinegruppen, inngikk, og alle fullførte undersøkelsen. Alle frivillige var europeere. Gjennomsnittsalderen på vaksinasjonstidspunktet var 35,3 år, innen grensene 18 til 44 år. Forsøket begynte i januar og varte i litt over en måned.

Materialer

Vaksine

Kliniske porsjoner av P43-vaksinen ble fremstilt, renset, utformet og frysetørket ifølge Good Manufacturing Practices. Porsjonene ble godkjent ved Quality Control and Quality Assurance. Hver vaksineampulle inneholdt følgende bestanddeler:

Aktiv bestanddel:

Eksipienser. stabiliseirngsmidler:

Placebo

Ampuller med placebo ble fremstilt og utdelt. Hver placeboampulle inneholdt følgende bestanddeler:

Eksipienser. stabiliseringsmidler:

Fortynningsmiddel

Injeksjonsvann ble benyttet som fortynningsmiddel for rekonstituering av vaksine og placebo.

Tilførsel

Tilnærmet 10 til 15 minutter før tilførsel av vaksine eller placebo ble deltakerne i begge grupper gir 10 ml "Mylanta" oralt. "Mylanta" er et registrert antacid. Antacidet øker pH i magen og forhindrer inaktivering av Rotaviruset under passasje gjennom magen.

For fremstilling av vaksinen ble to ampuller med frysetørket P43 inneholdende 10 ' ffu pr. ampulle rekonstituert med 1,5 ml av fortynningsmiddelet injeksjonsvann. Dette ga et beregnet virustiter på IO<6,1> ffu pr. dose. Den rekonstituerte vaksine ble tilført umiddelbart som en enkelt oral dose.

For fremstilling av placebopreparatet ble to ampuller med frysetørket placebo rekonstituert med 1,5 ml injeksjonsvann og tilført oralt som en enkelt dose.

Sikkerhet og reaktivitet

Følgende kriterier på sikkerhet og reaktivitet gjaldt:

Generelle symptomer som ble anmodet oppgitt var feber, diaré, oppkast, kvalme, magesmerter og manglende apetitt. Disse ble notert i løpet av 8 dager etter tilførselen. Ikkeforventede symptomer ble notert i løpet av 30 dager etter tilførselen.

Alvorlige bivirkninger ble notert under hele forsøksperioden.

Diaréprøver skulle oppsamles under 8 dager etter tilførselen.

Resultatene var:

Ingen forventede symptomer, ingen ikkeforventede symptomer og ingen alvorlige bivirkninger ble rapportert i løpet av de angitte observasjonstidsrom.

Ingen tilfeller av diaré ble rapportert.

Konklusjoner

SB Biologicals P43-vaksine var sikker relativt til placeboen ved oral tilførsel på dobbelt blind måte som en enkelt dose med dose IO<6>'<1> ffu til friske, vokse frivillige mellom 18 og 44 år.

Claims (25)

1. Svekket human rotaviruspopulasjon, karakterisert v e d at den omfatter en enkelt variant eller en i det vesentlige enkelt variant, hvor nevnte variant er betegnet P43 og er deponert under aksesjonsnummeret ECACC 99081301.

2. Rotavirusvariant, karakterisert ved at den betegnes P43 og er deponert under aksesjonsnummeret ECACC 99081301, rotavirusavkom og immunologisk aktive derivater av denne og materialer erholdt derfra.

3. Humant rotavirusreassortant, karakterisert ved at den omfatter minst ett antigen eller minst ett segment fra rotavirusvarianten P43 ifølge krav 2.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av rotavirus som definert i hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den omfatter: • passasje av et rotaviruspreparat i en egnet cellelinje; • om ønskelig seleksjon av homogen kultur ved anvendelse av enten: o grensefortynning; eller o enkeltplakk isolering; og • kontroll av nærvær av i det vesentlige en enkelt variant ved å sekvensere et egnet område av VP4- og/eller VP7-gensekvensen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at rotaviruspreparatet er passert i AGMK-celler.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller krav 5, karakterisert v e d at rotaviruspreparatet har egenskapene til en 89-12-stamme eller et derivat av denne.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 4 til 6, karakterisert ved at den videre omfatter trinnet med eterbehandling for fjerning av eventuelle etersensitive kontaminerende midler.

8. Vaksinepreparat, karakterisert ved at det omfatter et levende, svekket virus ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3 sammenblandet med et egnet farmasøytisk bærerstoff eller en adjuvans.

9. Vaksinepreparat ifølge krav 8, karakterisert ved at det er tilpasset oral administrering.

10. Vaksinepreparat ifølge krav 9, karakterisert ved at det levende svekkede virus er utformet med et antacidpreparat.

11. Vaksinepreparat ifølge krav 10, karakterisert ved at antacidpreparatet omfatter et organisk antacid.

12. Vaksinepreparat ifølge krav 11, karakterisert ved at antacidet er natriumsitrat.

13. Vaksinepreparat ifølge krav 10, karakterisert ved at antacidpreparatet omfatter et uorganisk antacid.

14. Vaksinepreparat ifølge krav 13, karakterisert ved at antacidaet er aluminiumhydroksid.

15. Vaksinepreparat ifølge krav 13, karakterisert ved at antacidet er kalsiumkarbonat.

16. Vaksinepreparat ifølge krav 15, karakterisert ved at det videre omfatter et viskositetsmiddel.

17. Vaksinepreparat ifølge krav 16, karakterisert ved at viskositetsmiddelet er xantangummi.

18. Vaksinepreparat ifølge hvilket som helst av av kravene 15-17, karakterisert ved at det levende svekkede virus er utformet med kalsiumkarbonat og xantangummi og rekonstituert med en vandig løsning.

19. Vaksinepreparat ifølge hvilket som helst av av kravene 10 til 18, karakterisert ved at det levende svekkede virus er utformet med antacidpreparatet og lyofilisert i en plastforpakning.

20. Vaksinepreparat ifølge hvilket som helst av av kravene 8 til 19, karakterisert ved at viruset er i lyofilisert form.

21. Vaksinepreparat ifølge krav 20, karakterisert ved at det levende svekkede virus og antacidpreparatet foreligger i separate beholdere for utforming som et flytende vaksinepreparat før administrering.

22. Vaksinepreparat ifølge krav 20, karakterisert ved at det levende svekkede virus og antacidpreparatet foreligger i samme beholder for utforming som et lyofilisert vaksinepreparat for rekonstitusjon med en vandig løsning før administrering.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av en rotavirusvaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 8-22, karakterisert ved at den omfatter blanding av et svekket humant rotavirus med en egnet farmasøytisk bærer eller adjuvans.

24. Anvendelse av et svekket humant rotavirus for fremstilling av en vaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 10-22 for forebyggelse av rotavirusinfeksjon hos et menneske.

25. Vaksineformulering ifølge et hvilket som helst av kravene 8-22 til bruk som medisin.