KR20020092344A - 백신 - Google Patents

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프랑소와즈 데나무르
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Abstract

본 발명은 VP4 및 VP7으로 표기되는 하나 이상의 주요 바이러스 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 의해 정의되는 단일 변이체 또는 실질적인 단일 변이체를 포함하는 약독화된 로타바이러스 군집에 관한 것이다. 본 발명은 특히 P43으로서 표기되는 로타바이러스 군집을 제공한다. 본 발명은 혀위에 놓여졌을 때 즉시 용해되기 위한 신속하게 용해되는 정제 형태의 로타바이러스 백신을 위한 신규한 포뮬레이션을 추가로 제공한다.

Description

백신{VACCINE}
급성 감염성 설사는 세계의 많은 지역에서 질환 및 사망의 주요한 원인이다. 개발도상국에서, 설사 질환의 영향은 막대하다. 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카에 있어서, 매년 30억 내지 40억 건의 설사 질환이 발생하고 이들 건 중에 약 5백만 내지 천만명이 사망하게 된다고 추정되고 있다[참조: Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)].
로타바이러스는 영아 및 어린 아이에 있어서 심각한 설사의 가장 중요한 원인중 하나로서 인식되고 있다(참조: Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 로타바이러스 질환은 매년 100만명 이상의 사망의 원인으로 추정되고 있다. 로타바이러스-유도된 질병은 생후 6 내지 24개월된 어린이에게 가장 보편적으로 영향을 미치며, 상기 질환의 최대 유행은 일반적으로 온대 기후에서 추워지는 달 동안 및 열대 지역에서는 1년 내내 발생한다. 로타바이러스는 전형적으로 약 1일 내지 약 3일의 잠복 기간을 가지고 대소변-경구 경로에 의해 사람에서 사람으로 전염된다. 생후 6 내지 24개월된 그룹에서의 감염과는 달리, 신생아는 일반적으로 병증이 없거나 온화한 질환만을 가진다. 어린이에게 일반적으로 일어나는 심각한 질환과는 대조적으로, 대부분의 성인은 이전의 로타바이러스 감염의 결과로서 보호되며 따라서 대부분의 성인 감염은 온화하거나 병증이 없다[참조: Offit, P.A. et al. Comp. Ther., 8(8): 21-26, 1982].
로타바이러스는 일반적으로 구형이며, 이들의 이름은 이들의 독특한 안과 밖 또는 이중-껍질의 캡시드 구조체로부터 유래하였다. 전형적으로, 로타바이러스의 이중-껍질의 캡시드 구조체는 내부 단백질 껍질 또는 지놈을 함유하는 코어를 에워싸고 있다. 로타바이러스의 지놈은 11개 이상의 구별되는 바이러스 단백질을 엔코딩하는 이중가닥 RNA의 11개 절편으로 구성되어 있다. 이들 바이러스 단백질 중 VP4 및 VP7으로 표기되는 두 개는 이중 껍질 캡시드 구조체의 외부에 정렬되어 있다. 로타바이러스의 내부 캡시드에는 하나의 단백질이 존재하는데, 이는 VP6로 표기되는 로타바이러스 단백질이다. 로타바이러스 감염에 뒤따르는 면역 반응을 일으키는데 있어서 이들 세가지 특정 로타바이러스 단백질의 상대적인 중요성은 아직 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, VP6 단백질은 그룹 및 서브그룹 항원을 결정짓고, VP4 및 VP7 단백질은 혈청형 특이성의 결정인자이다.
VP7 단백질은 균주에 따라, 지놈 절편 7, 8 또는 9의 번역 생성물인 38,000 MW 당단백질(글리코실화되지 않은 경우 34,000 MW)이다. 상기 단백질은 로타바이러스 감염에 뒤따르는 주요 중화 항체의 형성을 자극한다. VP4 단백질은 지놈 절편 4의 번역 생성물인 약 88,000 MW의 글리코실화되지 않은 단백질이다. 또한 상기 단백질은 로타바이러스 감염에 뒤따르는 중화 항체를 자극한다.
VP4 및 VP7 단백질이 중화 항체에 대한 바이러스 단백질이기 때문에, 이들은 로타바이러스 질병에 대한 보호를 가능하게 해주는, 로타바이러스 백신의 개발을 위해 중요한 후보물질로 생각된다.
유아기 동안 천연 로타바이러스 감염은 보호적 면역성을 발생시키는 것으로 알려졌다. 따라서 살아있는 약독화된 로타바이러스 백신이 매우 바람직하다. 바람직하게는 상기 바이러스 감염의 천연 경로인 것과 같이, 이것은 경구 백신이어야 한다.
로타바이러스 감염을 예방하기 위한 초기 백신 개발은 바이러스의 발견 후에 1970년대에 시작되었다. 초기에, 동물 및 사람으로부터의 약독화된 균주가 연구되었고 혼합되거나 실망스런 결과를 나타내었다. 좀 더 최근의 노력들은 더욱 성공적인 사람-동물 재집합체에 초점을 맞추었다.
89-12로서 공지된 로타바이러스 균주는 워드(Ward)에 의해 설명되었다[참조: US Patent Number 5,474,773 and Bernstein, D.L. et al, Vaccine, 16(4), 381-387, 1998]. 89-12 균주는 1988년에 천연 로타바이러스 질병에 걸린 생후 14개월된 아이로부터 수집된 대변 검사물로부터 단리되었다. 그런 다음 미국 특허 제 5,474,773호에 따라 HRV 89-12 사람 로타바이러스는 일차 아프리카 녹색 원숭이 신장(AGMK) 세포중에 2회 계대에 의해 적응 배양되고 문헌[참조: Ward, J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984]에 기술된 바와 같이 MA-104 세포중에 4회 계대 배양되었다. 그런 다음 MA-104 세포중에 추가로 2회 계대시킨 후에 플라크를 MA-104 세포중에 3회 정제(제 9 계대까지)시키고 성장시켰다. 하나의 추가적인 계대가 수행되었고(제 12 계대) ATCC에 수탁 번호 ATCC VR 2272호로 기탁되었다. 상기 기탁된 균주는 89-12C2로서 공지되었다.
번스테인(Bernstein) 등에 의한 문헌(Vaccine)내의 1998년 논문은 문헌(Vaccine(1998) 논문)으로서 하기 내용을 언급하였다. 상기 논문은 경구적으로 투여된 살아있는 사람 로타바이러스 백신 후보물질의 안전성 및 면역원성을 설명하였다. 상기 백신은 일차 AGMK 세포중에 플라크 정제없이 26회에 이어 확립된 AGMK 세포주에서 7회 계대(총 33회 계대)시킴으로써 약독화된 균주 89-12로부터 수득되었다.
이하 연속적으로 26회 계대시킨 전술된 물질을 P26으로서 칭할 것이고 연속적으로 33회 계대시킨 상기 물질을 P33으로서 칭할 것이다. 일반적으로, 89-12를 n 회 계대시킴으로써 유도된 로타바이러스를 Pn으로서 칭할 것이다.
실시예에서 P33 물질을 Vero 세포상에 추가로 5회 계대시켰다. 이를 P38으로서 칭한다.
문헌[Vaccine (1998) 논문]에 기술된 P26 및 P33은 컬춰 컬렉션에 기탁하지 않았고, 이들의 유전학적 특징화를 확립하기 위해 분석하지도 않았다.
본 발명은 신규한 백신 포뮬레이션, 이들을 제조하는 방법 및 치료에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 로타바이러스 백신 포뮬레이션에 관한 것이다.
현재 문헌에 기술된 P26 군집이 변이체의 혼합물을 포함함이 밝혀졌다. 이것은 하기 기술하는 바와 같이 유전학적 특징화에 의해 확립되었다(실시예 참조).그러므로 P26은 추가적인 계대, 특히 백신 로트(lot)의 생성을 위한 신뢰할 수 있도록 일관성 있는 군집은 아니다. 유사하게, P33은 변이체의 혼합물을 포함하며 백신 로트의 생성을 위해 신뢰할 수 있도록 일관성 있는 것은 아니다.
P26 물질은 3가지 이상의 VP4 유전자 변이체의 혼합물임이 밝혀졌다. P33 및 P38은 유사하게 두 가지 변이체의 혼합물이다. 이들 변이체는 이들 변이체에 대한 P33으로 백신접종된 유아로부터의 혈청의 중화 항체 역가를 평가하는 경우 ATCC에 기탁된 89-12C2 균주에 대해, 중화 에피토프에 기초하여, 항원적으로 상이한 것 같다. 이를 도 3에 도시하였다.
또한 P33 물질이 영아에 투여되는 경우, 두 가지 확인된 변이체가 복제되고 분비되는 것이 밝혀졌다. 100명의 백신접종된 영아 중에서, 단 2명만이 로타바이러스 감염으로 인한 위장염의 징후를 보인 반면, 플라세보(placebo) 그룹 중 20%가 감염되었다. 이러한 발견은 확인된 변이체가 로타바이러스 질환으로부터의 보호와 관련되어 있음을 시사한다. 본 발명은 로타바이러스 변이체 및 클로닝된 (동종) 사람 로타바이러스 균주로부터 유래된 향상된 살아있는 약독화된 로타바이러스 백신을 분리하는 방법을 제공한다.
따라서, 제 1 측면에 따라 본 발명은 약독화된 로타바이러스 군집(단리물)을 제공화며, 상기 군집은 단일 변이체 또는 실질적인 단일 변이체를 포함하는 것으로 특징화되며, 상기 변이체는 VP4 및 VP7으로서 표기된 하나 이상의 주요 바이러스 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 의해 정의된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 로타바이러스 군집은 클로닝된 변이체이다.
단일 변이체, 또는 실질적인 단일 변이체를 포함하는 군집은 10% 초과, 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 상이한 변이체 또는 변이체들을 함유하지 않는 로타바이러스 군집을 의미한다. 바이러스 군집은 적절한 세포 타입상에 계대시키거나 일련의 하나 이상의 클로닝 단계를 수행함으로써 동종성 또는 실질적인 동종성을 위해 정제될 수 있다.
본 발명의 장점은 단일 변이체를 포함하는 군집이 일관성 있는 백신 로트(lot)의 형성을 위해 더욱 적합하다는 점이다. 또한 주요 바이러스 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 의해 정의된 특정 변이체가 로타바이러스 감염의 예방에 있어서 향상된 효능과 관련될 수 있다.
하나의 바람직한 일면에서, 본 발명의 로타바이러스 군집에서 단일 또는 실질적인 단일 변이체는 VP4 유전자가 다음 중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 변이체이다: 개시 코돈으로부터 788 위치에 아데닌 염기(A), 802 위치에 아데닌 염기(A) 및 501 위치에 티민 염기(T).
추가 일면에서 본 발명의 상기 군집에서 단일 또는 실질적인 단일 변이체는 VP7 유전자가 다음 중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 변이체이다: 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 897 위치에 아데닌(A) 또는 897 위치에 구아닌(G). 바람직하게는 897 위치에는 아데닌(A)이 존재한다.
바람직한 일면에서 본 발명에 따른 군집에서 단일 변이체는 VP4 유전자 서열의 개시 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌(A) 및 501 위치에 티민(T)을 갖는다.
또 다른 바람직한 일면에서 본 발명에 따른 군집에서 단일 변이체는 VP7 서열의 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌/구아닌(A/G)을 갖는다. 가장 바람직하게는 VP7 서열의 897 위치에는 아데닌(A)이 존재한다.
특히 바람직한 일면에서 본 발명에 따른 군집에서 단일 변이체는 VP4 유전자 서열의 개시 코돈으로부터 788 위치에 아데닌(A) 및 501 위치에 티민(T), 및 VP7 서열의 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌/구아닌(A/G)을 갖는다. 가장 바람직하게는 VP7 서열의 897 위치에는 아데닌(A)이 존재한다.
또 다른 일면에서 단일 변이체는 VP4 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열(여기서, 상기 누클레오티드 서열은 도 1에 도시한 바와 같다) 및/또는 VP7 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열(여기서, 상기 누클레오티드 서열은 도 2에 도시한 바와 같다)을 포함한다.
또한 본 발명은 적합한 세포 타입상에 로타바이러스 프레퍼레이션을 계대시키고; a) 제한 희석법 또는 b) 개별적인 플라크 단리법 중 어느 한 단계를 사용하여 동종 배양물을 임의로 선택하고; VP4 및/또는 VP7 유전자 서열의 적절한 영역의 서열 결정을 수행함으로써 실질적인 단일 변이체의 존재를 검사하는 것을 포함하여, 실질적인 단일 변이체를 포함하는 로타바이러스 군집을 생성시키는 방법을 제공한다.
서열 결정은 슬롯 블롯 하이브리드화 또는 플라크 하이브리드화와 같은 정량적 또는 세미-정량적 하이브리드화에 의해 적절하게 수행될 수 있다.
바람직하게는 선택된 변이체는 출발 로타바이러스프레퍼레이션(preparation)이 사람 피검자, 특히 어린이에게 투여되는 경우 복제되고 배출되는 변이체이다.
본 발명에 따른 방법으로부터 생성된 클로닝된 바이러스 군집은 적절한 세포주상에서 추가 계대에 의해 증폭될 수 있다.
상기 방법에서 로타바이러스 군집을 계대시키기 위해 적합한 세포 타입에는 아프리카 녹색 원숭이 신장(AGMK) 세포가 포함되며, 이 세포는 확립된 세포주이거나 일차 AGMK 세포일 수 있다. 적합한 AGMK 세포주에는 예컨대, Vero(ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2(ATCC CL-160), BSC-1(ECACC 85011422) 및 CV-1(ATCC CCL-70)이 포함된다. 또한 MA-104(붉은털 원숭이) 및 MRC-5(사람-ATCC CCL-171) 세포주가 적합하다. Vero 세포는 증폭 목적을 위해 특히 바람직하다. Vero 세포상에서의 계대는 높은 바이러스 수율을 생성시킨다.
상기 방법으로부터 생성된 바이러스 군집에 단일 변이체가 존재하는 지를 검사하고 단일 변이체의 특성을 결정하기 위한 기술에는 당 분야에 공지된 표준 서열분석 또는 하이브리드화 방법이 포함되며 이를 하기에 설명하였다.
바람직한 일면에서 본 발명의 방법은 적절한 로타바이러스, 특히 89-12 균주 또는 이들의 계대된 유도체의 특징을 갖는 로타바이러스를 사용하여 수행된다.
특히 바람직한 단일 변이체 군집은 P43이며, 이를 일련의 엔드(end) 희석 클로닝 단계에 이어 증폭을 위해 Vero 세포상에서 클로닝된 물질을 계대시킴으로써 P33(적절한 세포 타입상에서 배양물중에 33회 계대된 단리된 사람 로타바이러스)으로부터 수득하였다.
P43 군집을 기탁 기관[European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom)에 부다페스트 조약에 따라 기탁 번호 제 99081301호로 1999년 8월 13일에 기탁하였다.
이러한 상기 공개적 유용성이 사람 로타바이러스 P43을 수득하는 가장 간단한 방법이지만, 유사한 기능적으로 실질적으로 동일한 로타바이러스가 본 발명의 교시적인 측면에서 이러한 방법 또는 그 밖의 방법에 의해 생성될 수 있음은 전혀 불가능한 것이 아니다. 이러한 기능적으로 실질적으로 동일한 로타바이러스는 본 발명의 사람 로타바이러스 P43과 생물학적으로 동등하다고 생각되며 따라서 본 발명의 일반적인 범위내에 존재한다. 그러므로 본 발명이 본원에 기술된 바와 같이 P43의 특징을 갖는 로타바이러스 군집을 포함함이 이해될 것이다.
또한 본 발명이 살아있는 바이러스를 사용하는 추가적인 계대, 클로닝 또는 기타 방법에 의해 증식시키거나 유전자 조작 기술 또는 재집합 기술을 포함하는 임의의 방법으로 P43을 변형시키는 것과 같은 추가적인 프로세싱으로 처리함으로써 기탁된 P43 ECACC 99081301로부터 유래된 물질을 포함함이 이해될 것이다. 이러한 단계 및 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 포함되는 기탁된 P43으로부터 유래된 물질에는 단백질 및 유전 물질이 포함된다. 특히 관심있는 것은 하나 이상의 항원 또는 P43의 하나 이상의 절편을 포함하는 재집합 로타바이러스, 예컨대 11개 지놈 절편 중 하나 또는 하나의일부분이 P43의 지놈 절편 또는 이의 일부분으로 대체된 로타바이러스의 유독성 균주를 포함하는 재집합체이다. 상세하게는, NSP4를 코딩하는 절편 또는 일부 절편이 P43 절편 또는 부분 절편인 로타바이러스 재집합체는 유용한 특성을 가질 수 있다. 재집합체 로타바이러스 및 이들을 제조하는 기술은 널리 공지되어 있다[참조: Foster, R. H. and Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998].
특정한 관심있는 물질은 P43의 자손 및 P43의 면역학적으로 활성인 유도체이다. 면역학적으로 활성인 유도체는 P43 바이러스로부터 또는 P43 바이러스를 사용하여 수득된 물질, 특히 상기 바이러스의 항원을 의미하며, 이는 숙주 동물내로 주입되었을 때 로타바이러스에 대해 반응성인 면역 반응을 일으킬 수 있다.
적절한 세포주, 예컨대 Vero 세포에 로타바이러스를 적응시킬시에, 존재할 수 있고 그렇지 않으면 오염을 유발할 수 있는 임의의 우발적인 제(agent)와 같은 잠재적인 오염물질을 제거하기 위해 바이러스를 처리할 필요가 있을 수 있다. 에테르-민감성 우발성 바이러스의 경우, 하기 설명하는 바와 같이 처리함으로써 수행될 수 있다. 또한 본 발명은 약독화된 살아있는 로타바이러스 또는 이와 함께 제형화된 백신을 수득하기 위한 전체 과정에서 임의적인 단계로서 이러한 에테르 처리를 포함하는 것에 관한 것이다.
또한 본 발명의 범위내에는 P43을 기타 로타바이러스 변이체, 예컨대 기타 클로닝된 변이체, 또는 기타 바이러스 특히 기타 약독화된 바이러스와 혼합시키는 것이 포함된다. 이러한 혼합물은 하기 기술하는 본 발명의 백신에 유용하다.
또한 본 발명은 적합한 애쥬번트 또는 약제학적 캐리어와 함께 혼합된 실질적인 단일 변이체 군집을 포함하는 살아있는 약독화된 로타바이러스 백신을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 로타바이러스 백신은 단일 로타바이러스 균주를 함유하는 1가 로타바이러스 백신이다.
본 발명은 살아있는 약독화된 로타바이러스가 사람 로타바이러스이고 장중첩증을 유발시키지 않는 살아있는 로타바이러스 백신을 제공하는데 있어서 특히 장점적이다.
본 발명에 따른 백신에 사용하기에 적합한 약제학적 캐리어에는 특히 영아에게 경구 투여하기에 적합한 것과 같이 당분야에 공지되어 있는 것들이 포함된다. 이러한 캐리어에는 탄수화물, 폴리알콜, 아미노산, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 하이드록시아파타이트, 활석, 티타늄 옥시드, 수산화철, 마그네슘 스테아레이트, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 젤라틴, 식물성 펩톤, 잔탄, 카라그헤난, 아라비아 검(gum), β-사이클로덱스트린이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 적합한 안정화제의 존재하에 바이러스를 예컨대, 동결건조시키거나 본 발명에 따른 바이러스를 적합한 애쥬번트 또는 약제학적 캐리어와 함께 혼합시킴으로써 로타바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 수중유 에멀션중이나 캐리어 입자와 함께 비로솜 또는 리포솜과 같은 지질-기재 비히클내에 본 발명의 바이러스를 제형화시키는 것이 장점적일 수 있다.대안적으로 또는 추가적으로 경구 백신용의 당분야에 공지된 바와 같은 면역자극제가 포뮬레이션내에 포함될 수 있다. 이러한 면역자극제에는 세균 독소, 특히 홀로톡신(holotoxin(전체 분자)) 또는 B 사슬 단독(CTB) 형태의 콜레라 독소(CT) 및 대장균의 열불안정성 장독소(LT)가 포함된다. 네이티브(native) LT보다 활성인 형태로 변환시킬 것 같지 않은 돌연변이된 LT(mLT)는 WO 96/06627호, WO 93/13202호 및 US 5,182,109호에 기술되어 있다.
장점적으로 포함될 수 있는 추가적인 면역자극제는 QS21 및 모노포스포릴 지질 A, 특히 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 같은 사포닌 유도체를 포함한다. 사포닌 및 모노포스포릴 지질 A는 개별적으로 또는 함께(예컨대, WO 94/00153호) 사용될 수 있고 기타 작용제와 함께 애쥬번트 시스템에서 제형화될 수 있다. 3D-MPL은 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조된 널리 공지된 애쥬번트이고 이의 제조방법은 GB 2122204에 기술되어 있다.
경구 면역화를 위한 비히클 및 애쥬번트의 일반적 논의는 문헌[참조: Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995]에서 발견될 수 있다.
또한 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 백신 조성물을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여함으로써 사람 피검자, 특히 영아를 백신접종시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는 살아있는 약독화된 백신은 경구 투여에 의해 투여된다.
바람직한 일면에서 본 발명의 백신 조성물은 위에서 산에 의한 백신의 불활성화를 최소화시키기 위한 제산제와 함께 제형화된다. 적합한 제산제 성분에는 예컨대, 수산화 알루미늄 Al(OH)3및 수산화마그네슘 Mg(OH)2과 같은 무기 제산제가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 시판중인 제산제는 수산화 알루미늄 및 수산화 마그네슘을 함유하는 밀란타(Mylanta)(상표)를 포함한다. 이들은 물에 불용성이며 현탁물로 제공된다.
수산화알루미늄은 제산 효과 뿐만 아니라 애쥬번테이션 효과를 제공할 수 있기 때문에 본 발명에 따른 백신 조성물의 특히 바람직한 성분이다.
또한 본 발명의 백신중에 사용하기에 적합한 제산제는 유기산 카복실레이트 염과 같은 유기 제산제이다. 본 발명의 백신 조성물중의 바람직한 제산제는 유기산 카복실레이트 염, 바람직하게는 소듐 시트레이트 또는 칼륨 시트레이트와 같은 시트르산의 염을 함유한다.
본 발명의 백신 조성물중에 사용될 수 있는 특히 바람직한 제산제는 불용성 무기산 염, 탄산칼슘(CaCO3)이다. 탄산칼슘은 로타바이러스와 결합될 수 있고 로타바이러스 활성은 탄산칼슘과 결합 동안 유지된다.
충전 단계 동안 탄산 칼슘의 침강을 방지하기 위해, 바람직하게는 점성제가 포뮬레이션내에 존재한다.
사용될 수 있는 가능한 점성제에는 의가소성 부형제를 포함한다. 의가소성 용액은 교반하에 이의 점도에 비해 지속적인 더 높은 점도를 갖는 용액으로서 정의된다. 이러한 타입의 부형제는 아라비아 검, 아드라강트 검(adragante gum), 아가-아가, 알기네이트, 펙틴과 같은 천연 중합체 또는 세미-합성 중합체 예컨대:카복시메틸셀룰로오스(Tyloses C®), 메틸셀룰로오스(Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® 및 MB®), 하이드록시프로필셀룰로오스(Klucels®) 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(Methocels E® 및 K®, Viscontrans MPHC®)이다. 일반적으로 이러한 의가소성 부형제는 틱소트로픽(thixotropic)제와 함께 사용된다. 사용될 수 있는 대안적인 점성제는 낮은 흐름 능력을 가진 의가소성 부형제이다. 충분한 농도에서 이들 중합체는 지속적인 낮은 흐름 능력을 갖는 높은 점도액을 초래하는 구조적 유체 배열을 일으킨다. 특정한 양의 에너지가 시스템에 제공되어 흐름 및 전달을 가능하게 할 필요가 있다. 유체액을 수득하기 위해 구조적 유체 정렬을 일시적으로 파괴하기 위해서는 외부 에너지(교반)가 필요하다. 이러한 중합체의 예는 Carbopols® 및 잔탄 검이다.
틱소트로픽 부형제는 지속적인 겔 구조물이 되지만 교반하에 이들은 유체액을 형성한다. 틱소트로픽 부형제의 예는 Veegum®(마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 Avicel RC®(약 89% 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 및 11% 카복시메틸셀룰로오스 Na)이다.
본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 잔탄 검 또는 전분으로부터 선택된 점성제를 포함한다.
따라서 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 탄산칼슘 및 잔탄 검과 함께 제형화된다.
본 발명에서 사용된 조성물의 기타 성분은 적합하게는 당, 예컨대, 수크로오스 및/또는 락토오스를 포함한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 예컨대, 향미(특히 경구용) 및 세균발육억제제를 포함하는 추가적인 성분을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 상이한 프리젠테이션을 고찰하였다.
하나의 바람직한 구체예에서, 백신은 액체 포뮬레이션으로서 투여된다. 바람직하게는 상기 액체 포뮬레이션은 적어도 다음 두 가지 성분으로부터 투여전에 재구성된다:
i) 바이러스 성분
ii) 액체 성분
본 구체예에서, 바이러스 성분 및 액체 성분은 정상적으로는 별도의 컨테이너에 존재하며, 이는 편리하게 하나의 용기의 별도의 격실이거나, 최종 백신 조성물이 공기에 노출되지 않고 재구성되도록 연결될 수 있는 별도의 용기일 수 있다.
재구성 이전에, 바이러스는 건조 형태 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 바이러스 성분은 동결건조되어 있다. 동결건조된 바이러스는 수용액중의 바이러스보다 더욱 안정적이다. 동결건조된 바이러스는 액체 백신 포뮬레이션을 생성시키기 위해 액체 제산제 조성물을 사용하여 적절하게 재구성될 수 있다. 또한 동결건조된 바이러스는 물 또는 수용액과 함께 재구성될 수 있으며, 이러한 경우 동결건조된 바이러스 조성물은 바람직하게는 제산제 성분을 함유한다.
바람직하게는, 백신 포뮬레이션은 하나의 격실 또는 용기내에 탄산칼슘 및 잔탄 검과 함께 제형화된 바이러스 성분을 포함하며 이것은 제 2 격실 또는 용기내에 존재하는 물 또는 수용액과 재구성된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 백신 조성물은 입안에 위치시켰을 때 즉시 용해되기에 적합한 고체 포뮬레이션, 바람직하게는 동결건조된 케이크이다. 동결건조된 포뮬레이션은 편리하게는 약제학적 블리스터 팩내에 정제 형태로 제공된다.
또 다른 일면에서 본 발명은 경구 투여를 위한 신속하게 용해되는 정제의 형태로 로타바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 일면에서 본 발명은 살아있는 약독화된 로타바이러스 균주, 특히 사람 로타바이러스 균주를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 입안에 위치되었을 때 즉시 용해될 수 있는 동결건조된 고체이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 신속하게 용해되는 정제는 용해되지 않은 정제를 삼키는 것을 방지할 만큼 충분히 신속하게 피검자의 입에서 용해된다. 이러한 접근법은 소아 로타바이러스 백신을 위해 특히 장점적이다.
바람직하게는 바이러스는 탄산칼슘과 같은 유기 제산제 및 잔탄 검과 같은 점성제와 함께 제형화된 살아있는 사람 로타바이러스이다.
본 발명의 추가적인 일면은 동결건조된 포뮬레이션을 제공하는 것이며, 여기서 바이러스 성분은 탄산칼슘 및 잔탄 검과 함께 제형화된 임의의 로타바이러스 균주이다.
본 발명의 백신은 전형적인 백신접종자에게 현저한 불리한 부작용없이 로타바이러스 감염에 대한 효과적인 보호를 제공하기에 적합한 양의 살아있는 바이러스를 사용하여, 공지된 기술에 의해 제형화되고 투여될 수 있다. 적합한 양의 살아있는 바이러스는 정상적으로는 투여량 당 104내지 107ffu일 것이다. 백신의 전형적인 용량은 투여량 당 105내지 106ffu를 포함할 수 있으며 시간에 걸쳐 수 회 투여, 예컨대, 2개월 간격으로 2회 투여로 제공될 수 있다. 그러나 잇점은 특히, 개발도상국에서 2회 투여 이상, 예컨대 3 또는 4회 투여 요법으로 수득될 수 있다. 투여 간격은 2개월 가량일 수 있다. 단일 투여 또는 다중 투여 요법을 위한 살아있는 바이러스의 최적의 양, 및 투여를 위한 최적의 시기는 피검자에서의 항체 역가 및 기타 반응의 관찰과 관련된 표준 연구에 의해 확정될 수 있다.
또한 본 발명의 백신은 기타 질환에 대한 보호를 위한 기타 적절한 살아있는 바이러스, 예컨대 폴리오바이러스를 포함할 수 있다. 또한 경구 투여를 위한 기타 적절한 살아있는 바이러스 백신은 개별적인 투여량이긴 하지만 본 발명에 따른 로타바이러스 백신 조성물과 동일한 때에 제공될 수 있다.
도 3에 대한 도면 설명
문헌[Vaccine (1998) 논문]에 기술된 바와 같이 P33으로 백신접종된 생후 4 내지 6개월된 유아 12명으로부터의 혈청을 P33, P38, P43 및 89-12C2의 중화에 대해 시험하였다.
시험된 모든 혈청의 중화 역가의 범위는 P33, P38 및 P43에 대해 유사하였다. 통계학적 분석은 3가지 바이러스 전부에 대한 전체 중화 역가에 있어서 어떠한 현저한 차이도 나타내지 않았다. 이는 P33, P38 및 P43의 형태적 및 비-형태적 중화 에피토프가 P33 백신접종된 유아의 안티-P33 혈청에 의해 동등하게 잘 인식됨을 시사한다. 이러한 관찰은 간접적으로는 이러한 시험관내 검정에서 밝혀진 중화 에피토프가 P33, P38 및 P43 사이에서 변경되지 않았음을 시사한다.
그러나 P89-12C2의 중화 역가의 범위는 P33, P38 및 P43과 현저하게 상이하다. 이러한 관찰은 P33, P38 및 P43의 형태적 및 비-형태적 중화 에피토프가 P33 백신접종된 영아의 안티-P33 혈청에 의해 동등하게 잘 인식되지 않음을 시사한다. 이러한 관찰은 간접적으로는 이러한 시험관내 검정에서 밝혀진 중화 에피토프가 89-12 C2 및 P33, P38 및 P43 사이에 변경되었음을 시사한다.
하기 실시예는 본 발명을 예증한다.
실시예
실시예 1: 제 26 계대(P26)에서 균주 89-12가 변이체의 혼합물임을 증명
상이한 계대 로트로부터 VP4 및 VP7 유전자의 서열분석
계대 P26(일차 AGMK 세포), 계대 P33(확립된(일차와 반대로서) AGMK 세포주), 계대 P41 및 계대 P43으로부터의 VP4 및 VP7 유전자의 서열분석을 수행하였다. 전체 RNA 추출물을 역전사시키고 원 튜브/원 스텝(one tube/one step)으로 PCR을 통해 증폭시켰다.
프라이머 Rota 5bis 및 Rota 29bis는 전체 VP4 유전자를 증폭시켰고 프라이머 Rota 1 및 Rota 2bis는 전체 VP7 유전자를 증폭시켰다. 상기 PCR 물질을 상이한 프라이머를 사용하여 서열분석하였다(표 1 참조).
계대 P26 서열은 VP4에서 3개 염기(개시 코돈으로부터 501, 788 및 802 bp위치) 및 VP7에서 3개 염기(개시 코돈으로부터 108, 605 및 897 bp 위치)에서 계대 P33 서열과 상이하였다.
VP4 및 VP7의 계대 P26 서열 스캔은 백그라운드로서 계대 P33 서열의 돌연변이된 위치가 존재함를 보여주었다. 따라서 계대 P26은 2가지 이상의 변이체의 혼합물임을 알 수 있다.
계대 P33 서열 스캔은 VP4에 대해서 동종이고 VP7에 대해선 이종인 것 같다(표 2 참조).
계대 P38(계대 33으로부터 유래됨)을 Vero 세포상에서 5회 계대시키고 계대 P33(AGMK 세포주)과 동일한 세트의 VP4 및 VP7 서열을 디스플레이시켰다. P33 및 P38 사이의 군집에 있어서 어떠한 주요한 변화도 없었다.
표 1: RT-PCR 및 서열분석에 사용된 올리고누클레오티드
표 2: 하이브리드화에 사용된 올리고누클레오티드
표 2에서 굵은 서체로 나타낸 염기는 VP4 및 VP7의 특정 서열 변이의 부위이다.
표 3: VP4 및 VP7 유전자의 서열 변이
3.1
주의: 생성 로트의 레벨을 위해 개발된 3가지 클론으로부터의 제 2 클론에서, VP7 897 bp 위치 누클레오티드는 P43 선택된 클론에서와 같이 A라기 보다는 G이다. 이것은 아미노산 서열에 있어서 이소류신 대신 메티오닌을 생성시킨다. 선택된 P43 클론 및 VP7의 개시 코돈으로부터 897 bp에 G가 존재하는 클론 둘 모두에 대해 상응하는 변이체는 P33 물질로 백신접종된 영아의 대변으로 배출되었다.
표 3.1에서, 특정 위치에 두개의 대안적인 염기가 존재하는데, 둘 중 첫번째는 다수 군집에서 나타나는 염기를 대표하고 두 번째는 소수 군집에서 나타나는 염기이다. 다수 및 소수 군집은 서열분석에서 시그널의 강도에 의해 판단된다.
3.2
표 3.2는 변이체간의 누클레오티드 차이로부터 일어난 아미노산 변화를 도시한 것이다.
표 4
슬롯 블롯 하이브리드화
AGMK 세포상에서 계대 P26 내지 P33 사이의 군집에 있어서 변화를 슬롯 블롯 하이브리드화에 의해 추가로 확인하였다. RT/PCR에 의해 생성된 VP4 및 VP7 유전자 단편을 각각의 변이체에 대해 특이적인 올리고누클레오티드 프로브와 하이브리드화시켰다(표 3.1 및 3.2 참조). Rota 16, Rota 35 및 Rota 36과 하이브리드화되고 Rota 15와 하이브리드화되지 않는 P26과는 대조적으로, P33 물질의 VP4 PCR 단편은 788 및 802 위치에서 Rota 16과 하이브리드화되고 Rota 15 또는 Rota 35 또는Rota 36과 하이브리드화되지 않았다. 이들 결과는 P26에 3가지 이상의 변이체의 존재를 확립시켰다(표 4 참조).
P33 물질의 VP7 PCR 단편에 있어서, 위치 897은 Rota 41 및 Rota 42와 하이브리드화되었다. 이들 결과는 P33 물질에 2가지 이상의 변이체의 존재를 확립시켰다.
실시예 2: P43 클론의 단리 및 특징화
동종 바이러스 군집으로서 P33 성분을 단리하기 위해, Vero 세포상의 p33/AGMK의 3 종점 희석을 수행하고 생성된 바이러스를 Vero 세포를 감염시키기 위해 사용하였다.
포지티브 세포를 두가지 기준을 사용하여 선택하였다: 고전적으로 수행되는 바와 같이, 웰 및 플레이트상의 대부분의 단리된 포지티브 웰에서 검출된 다수의 포커스에 의해 증명된 성장. 96 웰 마이크로역가 플레이트에서 3 종점 희석 계대 후에, 10개의 포지티브 웰을 Vero 세포상에 연속적으로 증폭시키고 이들의 수율을 평가하였다.
수율에 기초하여, 3개의 클론을 발달시켜 생성 로트의 레벨을 계대시켰다. 폴리클로날 항체에 의한 면역인식은 3개의 클론 사이 및 상기 클론과 P33 사이에 모두 유사한 것으로 밝혀졌다. 클론들의 동종성을 슬롯 블롯 하이브리드화에 의해 평가하였다. 단일 클론의 최종 선택은 수율 및 서열에 기초하였다.
선택된 클론을 Vero 세포상에 연속적인 계대에 의해 증폭시켜 마스터 시드(master seed), 워킹 시드(working seed) 및 최종 생성 로트를 생성시켰다.
선택된 클론을 VP4 및 VP7의 서열분석(동일성) 및 PCR 증폭된 물질의 VP4 및 VP7의 특이적인 슬롯 블롯 하이브리드화(동종성)에 이해 상이한 계대 레벨에서 유전학적으로 특징화하였다. P43 물질의 VP4 및 VP7 유전자의 서열을 각각 도 1 및 도 2에 제시하였고 P41과 동일하였다.
선택된 클론의 동종성을 P26/일차 AGMK의 서열분석 동안 확인된 각각의 변이체에 대한 VP4 및/또는 VP7 영역에 있어서의 누클레오티드 변화를 구별하는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하는 선택적 하이브리드화에 의해 평가하였다(표 4 참조).
VP4 단편은 Rota 16과 하이브리드화되었고 Rota 15, Rota 35 또는 Rota 36과는 하이브리드화되지 않았다.
VP7 단편은 Rota 14와 하이브리드화되었고 Rota 42와는 하이브리드화되지 않았다.
이러한 결과는 P43이 동종 군집임을 확정시켰다.
실시예 3: 잠재적인 우발성 바이러스
에테르를 20%의 최종 농도가 되도록 1시간동안 P33(성장한 AGMK)에 첨가하였다. 그런 다음 에테르를 N2를 사용하여 비등시켜 제거하였다. P33의 역가에 대해 어떠한 영향도 관찰되지 않았다.
실시예 4: 살아있는 약독화된 백신의 포뮬레이션
상기 기술한 생성 로트를 유아에게 경구 투여하기 위해 하기 방법에 의해 제형화하였다.
1. 동결건조된 바이러스
표준 기술을 사용하여 바이러스 투여량을 준비하였다. 동결된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고 바람직한 표준 바이러스 농도, 이경우 106.2ffu/ml까지 적절한 매질 조성물, 이 경우에 둘베코의 개질된 이글 매질로 희석시켰다. 그런 다음 희석된 바이러스를 동결건조 안정화제(수크로오스 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%)로 표적 바이러스 역가, 이 경우에 105.6ffu/용량까지 추가로 희석시켰다. 안정화된 바이러스 조성물 0.5 ml 분취액을 3 ml 바이알에 무균적으로 옮겼다. 그런 다음 각각의 바이알을 고무 마개로 부분적으로 닫고, 샘플을 진공하에서 냉동건조시킨 다음, 바이알을 완전히 닫고 알루미늄 캡을 바이알의 주위로 그 자리에 크림핑하여 그 자리에 마개를 유지시켰다.
사용하기 위해, 상기 바이러스를 하기 제산제 재구성물 중 하나를 사용하여 재구성하였다.
(a) 시트레이트 재구성물
소듐 시트레이트를 물에 용해시키고, 여과에 의해 멸균시키고 1.5ml 용량 당 544 mg Na3시트레이트.2H2O의 농도로 1.5 ml 양의 재구성 컨테이너내로 무균적으로 옮겼다. 상기 재구성 컨테이너는 예컨대, 3 ml 바이알, 또는 4 ml 바이알, 또는 2 ml 시린지, 또는 경구 투여용 연질 플라스틱 압착할 수 있는 캡슐일 수 있다. 멸균 조건하에서 멸균 성분을 유지시키기 위한 대안책으로서, 최종 컨테이너를 오토클레이빙할 수 있다.
(b) Al(OH) 3 재구성물
무균적 수산화 알루미늄 현탁물(Mylanta - 상표)을 멸균수중에 무균적으로 희석시키고, 각각 48 mg Al(OH)3를 함유하는 2 ml 양으로 재구성 컨테이너(예컨대, 2 ml 시린지, 또는 연질 플라스틱 압착가능한 캡슐)로 무균적으로 옮겼다. 멸균 조건하에서 멸균 성분을 사용하는 대안책은 수산화 알루미늄 현탁물을 (바람직하게는 희석되는 단계에서) γ 조사시키는 것이다.
표준 성분을 포함시켜 현탁물이 침전되지 않도록 하였다. 이러한 표준 성분에는 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 및 실리콘 중합체가 포함된다. 세균억제제, 예컨대, 부틸파라벤, 프로필파라벤 또는 식품 및 향료에 사용되는 기타 표준 세균억제제가 또한 포함될 수 있다.
2. 액체 포뮬레이션중에 Al(OH) 3 와 함께 동결건조된 바이러스
표준 기술을 사용하여 바이러스 투여량을 준비하였다. 동결된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고 바람직한 표준 바이러스 농도, 이 경우에 106.2ffu/ml 까지 적절한 매질 조성물, 이 경우에 둘베코의 개질된 이글 매질로 희석시켰다. 수산화알루미늄 현탁물을 첨가하여 48 mg/투여량의 최종 양에 이르도록 하고 상기 바이러스 조성물을 표적 바이러스 역가, 이 경우에 105.6ffu/투여량까지 동결건조 안정화제(수크로오스 4%, 덱스트란 8%, 소르비톨 6%, 아미노산 4%)로 희석시켰다. 안정화된 바이러스 조성물 0.5 ml 분취액을 3 ml 바이알로 무균적으로 옮겼다. 그런 다음 파트 1에서 기술한 바와 같이 바이알을 동결건조시키고 닫았다.
3. 블리스터 프리젠테이션을 위해 Al(OH) 3 와 함께 동결건조된 바이러스
표준 기술을 사용하여 바이러스 투여량을 준비하였다. 동결된 정제된 바이러스 벌크를 해동시키고 바람직한 표준 바이러스 농도, 이 경우에 106.2ffu/ml까지 적절한 매질 조성물, 이 경우에 둘베코의 개질된 이글 매질로 희석시켰다. 수산화알루미늄 현탁물을 첨가하여 48 mg/투여량의 최종 양에 이르게 하고 상기 바이러스 조성물을 수크로오스, 덱스트란 또는 아미노산 4%, 또는 젤라틴, 또는 식물성 펩톤, 또는 잔탄일 수 있는 동결건조 안정화제를 사용하여 105.6ffu/투여량의 표적 바이러스 역가까지 희석시켰다. 0.5 ml 또는 바람직하게는 블리스터 캐비티 보다 적은 용량을 이동시키기 위해 무균적 충전 작업을 이용하였다. 상기 조성물을 동결건조시키고, 브리스터 캐비티를 열 봉합에 의해 봉합하였다.
임의로 표준 성분을 포함시켜 수산화알루미늄 현탁물이 침전되지 않도록 하였다. 이러한 표준 성분에는 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 및 실리콘 중합체가 포함된다. 또한 향료가 포함될 수 있다.
실시예 5: 다양한 포뮬레이션을 위한 로타바이러스 역가측정
5.1: 락토오스 및 수크로오스 기재 포뮬레이션간의 비교:
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조전 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
98G06/01 락토오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2% 105.22 104.67
98G06/03 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2% 105.28 104.92
P43 로타바이러스를 상기 표에 제시한 바와 같이 수크로오스 또는 락토오스와 함께 제형화시켰다. 동결건조전 바이러스 역가측정은 완전히 제형화된 액체(수크로오스 덱스트란 소르비톨 아미노산 함유)에서의 바이러스 역가이고 동결건조 단계를 거치지 않았다.
우수한 결과는 동결건조 단계에서 0.5 미만의 log 감소 및 "37℃에서 1주일"(가속화된 안정성 시험) 동안 0.5 미만의 log 감소가 달성되는 결과이다.
상세한 바이러스 역가측정은 약 +0.2 log 또는 -0.2 log이다.
상기 결과는 수크로오스가 락토오스 대신 사용될 수 있음을 시사한다.
5.2: 아르기닌, 및 말티톨에 의한 소르비톨의 치환의 효과
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조 후 t=0에서의 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
98L16/01 락토오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2% 104.8 104.8
98L16/02 락토오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%아르기닌: 3% 104.8 104.9
98L16/04 락토오스: 2%덱스트란: 4%말티톨: 3%아미노산: 2%아르기닌: 3% 104.7 105
상기 결과는 (동결건조 동안 바이러스의 안정성을 향상시키고 위의 산도를보상하기 위한 염기성 매질을 제공하는 것으로 공지된) 아르기닌의 첨가가 바이러스 역가를 유지시킴을 증명한다.
소르비톨은 동결건조된 케이크의 유리의 일시적 온도를 상당한 정도까지 감소시키는 경향이 있다. 이것은 상기 제시된 바와 같이 소르비톨 대신 말티톨을 사용함으로써 극복될 수 있으며 상기 바이러스 역가는 여전히 유지된다.
5.3: 다양한 포뮬레이션 조성
본 실험은 수많은 포뮬레이션이 가능함을 증명한다.
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조전 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
99C11/01 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2% 105.24 105.07
99C11/02 수크로오스: 2%덱스트란: 4%말티톨; 3%아미노산: 2% 105.09 104.92
99C11/04 덱스트란: 4%말티톨: 3%아미노산: 2% 104.89 105.06
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조 후 t=0에서의 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
99C17/01 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2% 105.40 105.41
99C17/02 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 1.5%아미노산: 2% 105.30 104.93
99C17/03 수크로오스: 2%덱스트란: 4%아미노산: 2% 105.31 105.24
99C17/04 수크로오스: 2%덱스트란: 4%말티톨: 3%아미노산: 2% 104.42 104.45
99C17/05 수크로오스: 2%덱스트란: 4%말티톨: 1.5%아미노산: 2% 104.39 104.40
99C17/06 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3% 105.44 104.97
99C17/07 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 1.5% 105.11 104.89
5.4: 로타바이러스와 Al(OH) 3 제산제와의 결합:
로타바이러스 Al(OH)3 H2O 실온에서접촉 시간 원심분리 상층액바이러스 역가(ffu/ml) 펠렛바이러스 역가(ffu/ml)
105.6ffu/ml 0.240ml중에 48mg 0.76ml 30분 8000rpm, 10분 103.66
105.6ffu/ml 0.240ml중에 0.48mg 0.76ml 30분 8000rpm, 10분 104.41
105.6ffu/ml 1ml 30분 8000rpm, 10분 105.68
동결건조된 케이크내의로타바이러스 0.120ml중에 12mg 1.380ml 30분 8000rpm, 10분 검출 한도 미만 104.7
Al(OH)3를 제산제로서 사용하였다. 이것은 Al(OH)3와 함께 원심분리(상층액에서 바이러스 활성의 감소) 이후에 로타바이러스가 불용성 무기염(Al(OH)3)과 결합함을 보여준다.
5.5: 바이러스 역가측정전에 소듐시트레이트에 의한 Al(OH) 3 제산제의 용해
바이러스 샘플 용해 조건 바이러스 역가 ffu/ml
99B10/06 동결건조전 액체 포뮬레이션;105.43 1.5ml Na3시트레이트 실온에서 24시간 105.11
99B10/06: 동결건조105.43 1.5ml Na3시트레이트 실온에서 24시간 104.53
로타바이러스가 Al(OH)3와 결합하는 경우, (Al(OH)3를 포함하여) 모든 것을 동결건조시키는 것이 가능하다. 동결건조후, 소듐시트레이트중에 Al(OH)3를 용해시킴으로써 로타바이러스를 회복시키는 것이 가능하다. 이러한 단계는 로타바이러스를 손상시키지 않으며 이러한 용해 단계 후 이의 활성을 유지시킨다.
5.6: Al(OH) 3 -로타바이러스 결합의 유리후 로타바이러스의 감염성:
(캐리어의 용해에 의한) 바이러스 유리의 메카니즘은 생체내에서 매우 잘 일어날 수 있다. 실제로 pH 6 미만에서, 수산화알루미늄은 완전히 가용성이 됨으로써 로타바이러스는 위에서 유리될 것이다.
Al(OH)3+ 3H+---→ Al+++(수용성) + 3H2O
위에서, Al+++이온은 흡수되지 않는다[참조: J.J. Powell, R.Jugdaohsingh and R.P.H. Thompson,The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153]. 장에서, pH의 증가에 기인하여, 불용성 형태의 알루미늄은 침전되고(Al(OH)3또는 AlPO4) 천연 방식에 의해 제거된다. 새롭게 형성된 Al(OH)3또는 AlPO4침전물이 유리 로타바이러스와 재결합할 수 있을 지는 공지되지 않았다. 이것은 Al(OH)3-로타바이러스 결합 자체의 감염성에 대한 문제를 제기하였다.
또한 기타 메카니즘에 의한 Al(OH)3-로타바이러스 결합으로부터의 로타바이러스 유리가 가능하다. 예를 들어, 리신은 Al(OH)3상의 바이러스 흡착을 방해한다. 보레이트, 설페이트, 카보네이트 및 포스페이트 같은 기타 음이온은 수산화알루미늄상에 특이적으로 흡착함으로써 이론적으로 Al(OH)3-로타바이러스 결합체로부터 로타바이러스를 (흡착 부위에 대한 경쟁에 의해) 떼어낼 수 있어야 함은 공지되어 있다.
따라서, 로타바이러스는 로타바이러스-Al(OH)3결합체로부터 유리될 수 있고이렇게 유리된 로타바이러스는 활성적으로 남아있다. 이러한 유리는 Al(OH)3를 용해시키거나(위에서 HCl에 의해, 또는 시험관내에서 Na3시트레이트에 의해) 염기성 아미노산(리신)에 의헤 로타바이러스를 대체시킴으로써 수행될 수 있다.
5.7: Al(OH) 3 -로타바이러스 결합체의 감염성
단일 용량의 동결건조된 로타바이러스를 물과 재구성시키고 두 부분으로 나누었다. 참조로서 고려되는, 제 1 부분을 추가적인 부피의 물에 수용시켰다. 제 2 부분을 물 0.240ml중에 현탁된 Al(OH)324mg에 수용시켰다(예비임상학적 바이러스 역가측정).
Al(OH)3가 존재하는 경우, 로타바이러스는 활성이고 바이러스 역가측정 값은 참조 샘플에 비해 높았다.
본 실험을 동결건조된 용량을 나누지 않고 12mg Al(OH)3또는 24mg Al(OH)3를 첨가함으로써 반복하였다.
여기서 참조 샘플은 시트레이트-비카보네이트 완충액으로 재구성된 것이었다. 따라서, 바이러스 역가는 Al(OH)3의 존재하에서 더 높았다.
상기 실시예에서와 같이, 로타바이러스는 원심분리에 의해 제거될 수 있기 때문에, Al(OH)3입자와 결합한다. DRVC003A46은 동결건조된 제형화된 로타바이러스이다(수크로오스: 2%, 덱스트란: 4%, 소르비톨: 3%, 아미노산: 2%).
SDSAA=수크로오스 2%, 덱스트란 4%, 소르비톨 3%, 아미노산 2%.
상층액상에서 수행된 바이러스 역가측정에 따라, 로타바이러스를 흡착시키기위해 필요한 Al(OH)3의 양은 낮은 것 같다(동결건조된 1회 용량 5.7 log에서 시작하여 바이러스 역가측정을 증가시킴):
Al(OH) 3 흡착 시간 상층액중의 역가
12mg 실온에서 1시간 2.7
24mg 실온에서 1시간 3.4
48mg 실온에서 1시간 3.4
72mg 실온에서 1시간 2.0
96mg 실온에서 1시간 검출 한도 미만
12mg 밤새 2.7
24mg 밤새 검출 한도 미만
48mg 밤새 2.5
12mg 즉시 검출 한도 미만
24mg 즉시 2.0
48mg 즉시 검출 한도 미만
Al(OH)3상에 로타바이러스를 흡착시키기 위해 필요한 시간은 짧은 것 같았다:
동결건조된 로타바이러스의 1회 용량을 24mg Al(OH)3의 존재하에 재구성하고, 0분, 15분, 60분 및 24시간 후에 원심분리시켰다. "쿨롯(culot)"을 바이러스 역가측정전에 SDSAA중에 재현탁시켰다:
시간 쿨롯 상층액
0분 5.26 3.17
15분 5.34 <1.44
60분 5.96 <1.44
24시간 6.13 <1.44
5.8: 제산제로서 CaCO 3 사용
백신내에 알루미늄을 사용하지 않기 위해, 제산제 Al(OH)3를 또 다른 불용성 무기염인 CaCO3(탄산 칼슘)으로 대체시켰다.
CaCO3를 사용하여 관찰된 현상은 Al(OH)3에 대해 기술된 것과 유사하였다:
- 무기염과 로타바이러스의 결합;
- 무기염과 결합하는 경우 로타바이러스 활성의 유지;
- 산에 의한 무기 염기의 용해에 의한 결합으로부터 로타바이러스의 유리의 가능성;
- 제산제와 로타바이러스의 공동-동결건조의 가능성.
CaCO 3 와 로타바이러스 결합
제 1 시도에서, 동결건조된 로타바이러스(바이러스 역가 5.7)를 물중의 CaCO3의 현탁물(1.5ml중의 50mg)과 재구성시킨 다음; 원심분리시키고, 상층액의 바이러스 역가를 쿨롯과 비교하였다.
이것은 90% 이상의 로타바이러스가 CaCO3와 결합됨을 시사한다.
또한, 상기 바이러스가 결합되는 경우, 역가측정을 이해하고 본래의 바이러스 양을 회복시키는 것이 가능하였다.
또한, 바이러스 역가는 CaCO3없이 수득된 것 보다 조금 높았다.
CaCO 3 와 로타바이러스 결합의 정량
동결건조된 로타바이러스를 물(1.5ml)중의 CaCO3현탁물과 재구성시켰다:
10mg
50mg
100mg
그런 다음 원심분리시키고, 상층액의 바이러스 역가를 쿨롯과 비교하였다.
CaCO3 익스템포(Extempo) +원심분리 1시간 + 원심분리
쿨롯 상층액 쿨롯 상층액
100mg 4.57 3.01 4.79 3.09
50mg 4.17 4.15 4.22 3.86
10mg 3.17 4.77 3.87 4.87
따라서, 명백하게, 더 많은 CaCO3및 바이러스가 결합할 수록, 상층액에서더 적게 발견되었다. 그러나, 전체 용량은 완전히 회복되지 않았다(예상된 5.3 이상의 전체 또는 이전에 수득된 바와 같은 5.8 조차도 - 상기 참조).
베이비 로셋-라이스(Rossett-Rice) 제산제 역가측정 동안 로타바이러스의 CaCO 3 보호
동결건조된 로타바이러스(DRVC003A46) 10회 용량 및 CaCO350mg을 사용하여, 두 가지 타입의 베이비 로셋-라이스 역가측정을 수행하였다:
고전적인 로셋-라이스 역가측정에서, 제산제를 로타바이러스와 혼합시키고 HCl을 이 매질에 부었다.
"역" 베이비 로셋-라이스에서, 조건은 반대였다: 제산제를 HCl 푸울에 적하하였다(생체내에서 일어나는 것과 같이).
고전적 베이비 로셋-라이스 역가측정
하기 온도에 저장된 동결건조된로타바이러스 완충액 이론적 바이러스역가 측정된 바이러스역가
4℃ 60mg CaCO3 5.3 4.6
-80℃ 60mg CaCO3 5.3 4.69
4℃ 24mg Al(OH)3 5.4 <2.9
-80℃ 24mg Al(OH)3 5.4 <2.9
역 베이비 로셋-라이스 역가측정
하기 온도에 저장된 동결건조된로타바이러스 완충액 이론적 바이러스역가 측정된 바이러스역가
4℃ 60mg CaCO3 5.3 4.6
-80℃ 60mg CaCO3 5.3 4.6
4℃ 24mg Al(OH)3 5.4 <2.9
-80℃ 24mg Al(OH)3 5.4 <2.9
따라서, 이러한 시험관내 실험에서, 탄산 칼슘은 HCl의 존재로부터 약 20%의 로타바이러스를 보호할 수 있는 반면, 수산화알루미늄은 그럴 수 없다.
5.9: CaCO 3 제산제의 존재하에서 로타바이러스의 동결건조:
회분 no 조성 동결건조 후 t=0에서의 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
99K08/01 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 50mg 105.28 105.10
99K08/02 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg 105.16 105.15
00C24/01 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.3% 105.07 104.69
00C24/03 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.3% 105.07 104.85
00E09/25 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.25% 105.03 104.91
00E09/30 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.30% 105.01 104.87
00F26/06 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 2% 104.50 104.70
이것은 동일한 바이알내에 로타바이러스의 동결건조 및 제산제(CaCO3)가 함께 존재하는 "올 인 원"이다. 충전 단계 동안 CaCO3의 침강을 방지하기 위해, 점성제가 필요하다. 이러한 점성제의 예에는 잔탄 검 및 전분이 포함된다. 로타바이러스 활성은 잔탄 검 및 전분의 존재하에서도 유지된다.
5.10 입에 위치되었을 때 신속하게 분해되는 동결건조된 정제:
하기 포뮬레이션은 "lyoc" 개념을 증명한다. 즉, 입안에서의 동결건조된 케이크의 신속한 용해.
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조전 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
99B10/06 수크로오스 4%소듐 글루타메이트 3.7%Al(OH)348mg 105.11 104.53
99C11/12 말리톨 3%Al(OH) 48mg하이드록시프로필메틸셀룰로오스: 1% 104.16 103.79
회분 no 포뮬레이션 조성 동결건조 후 t=0에서의 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
00C24/05 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.3% 105.02 104.54
00C24/06 수크로오스: 2%덱스트란: 4%소르비톨: 3%아미노산: 2%CaCO3: 60mg잔탄 0.3% 104.86 104.56
00F26/11 수크로오스: 1%덱스트란: 2%소르비톨: 1.5%아미노산: 1%CaCO3: 60mg잔탄 2% 104.70 104.40
"lyoc 개념"에서 잔탄 및 전분 둘 모두를 사용할 수 있다(동결건조된 케이크의 신속한 용해 특성을 유지시킴).
실시예 6: 로타바이러스 백신 조성물을 위한 제산제로서의 탄산칼슘의 사용
물 중의 CaCO3의 현탁액을 로타바이러스를 위한 제산제로서 사용하는 경우, 탄산칼슘 입자가 물에 들어가면 빠르게 침강한다는 문제가 있는데, 이는 분체 밀도값이 2.6에 근접하고 평균 입자 크기가 30㎛이기 때문이다.
이러한 침강은 다음과 같은 방법에 의해 늦추어질 수 있다:
1. 주위 매질의 밀도를 증가시킨다
2. 주위 매질의 점도를 증가시킨다
3. 입자 크기를 감소시킨다
4. 입자들을 서로 떨어뜨려 놓는다
6.1: 주위 매질의 밀도를 증가시키는 방법:
CaCO3-물 현탁액(주사기에 들어있는 경우)을 동결건조된 케이크(수크로오스 2%, 덱스트란 4%; 소르비톨 3%; 아미노산 2%)상에 정위시키면, 주위 매질의 밀도는 증가하지만 CaCO3의 침강 속도는 CaCO3-물 현탁액과 크게 차이가 없다.
6.2 주위 매질의 점도를 증가시키는 방법:
의가소성(pseudoplastic) 부형제
의가소성 용액은 교반중의 점도에 비해 정치시의 점도가 더 높은 용액으로서 규정된다.
이러한 타입의 통상의 부형제로는 다음과 같은 중합체가 있다:
천연 중합체의 예:
아라비아 검
아드라강트(adragante) 검
아가 - 아가(agar-agar)
알긴산염
펙틴
반합성 중합체의 예:
카복시메틸셀룰로오스 (Tyloses C®)
메틸셀룰로오스 (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH®및 MB®)
하이드록시프로필셀룰로오스 (Klucels®)
하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (Methocels E®및 K®, Viscontrans MPHC®)
일반적으로, 이러한 의가소성 부형제는 틱소트로픽 제제와 함께 사용된다.
흐름 용량이 낮은 의가소성 부형제
이러한 중합체는충분한 농도에서구조적 유체 배열을 일으켜서 정치시의 흐름 용량이 낮은 고점도 용액을 생성시킨다. 흐름 및 전달이 가능해지도록 일정량의 에너지가 시스템에 공급되어야 한다.
구조적 유체 배열을 일시적으로 파괴시켜 유체 용액을 수득하기 위해 외부 에너지(교반)가 필요하다.
이러한 중합체의 예로는 Carbopols® 및 잔탄 검이 있다.
틱소트로픽 부형제
이들 부형제의 경우, 정치시에는 겔 구조가 얻어지며; 교반시에는 유체 용액이 얻어진다.
틱소트로픽 부형제의 예로는 Veegum®(마그네슘-알루미늄 실리케이트) 및 Avicel RC®(미세결정성 셀룰로오스 약 89% 및 카복시메틸셀룰로오스 Na 11%)가 있다.
6.3 입자 크기를 감소시키는 방법
CaCO3입자 크기를 감소시키면 화합물의 제산력이 감소하였다.
6.4 입자들을 서로 떨어뜨려 놓는 방법
이것은 응집을 방지하기 위해 CaCO3입자 보다 작은(약 1㎛) 불용성 입자가 CaCO3입자들 사이에 놓여있는 Veegum®및 Avicel®의 경우이다.
실시예 7: 제품 설계
하기 도해는 가능한 제품 설계를 예시한다.
7.1 주사기 중의 CaCO 3
로타바이러스의 임상 회분(batch)을 동결건조된 바이알의 형태로 이미 얻었으므로, 제산제는 주사기에 함유된 재구성 액체에 넣어질 수 있다.
이러한 제품 제시에 있어서, CaCO3의 침강은 충전 단계 동안 뿐만 아니라 제품의 전체 저장수명(2년 이상) 동안에도 조절되어야 한다.
7.2 동결건조된 바이알 중의 CaCO 3
7.3 블리스터(blister) 중에서의 동결건조
이 경우, 로타바이러스, CaCO3및 잔탄 검은 직접 블리스터에서 함께 동결건조된다.
실시예 8: 다양한 로타바이러스 균주의 동결건조
회분 번호 로타바이러스 균주 포뮬레이션 조성 동결건조 후 t=0에서의 바이러스 역가 동결건조하고 37℃에서 1주일 지난 후의 바이러스 역가
00F26/01 G1SB purif nO61PRO/0232 수크로오스:2%덱스트란:4%소르비톨:3%아미노산:2% 104.6 104.7
00F26/02 G2 (DS-1) 수크로오스:2%덱스트란:4%소르비톨:3%아미노산:2% 104.4 104.4
00F26/03 G3(P) 수크로오스:2%덱스트란:4%소르비톨:3%아미노산:2% 104.6 104.5
00F26/04 G4(VA-70) 수크로오스:2%덱스트란:4%소르비톨:3%아미노산:2% 104.8 104.8
00F26/05 G9(W161) 수크로오스:2%덱스트란:4%소르비톨:3%아미노산:2% 104.6 104.5
균주 DS-1, P 및 VA70은 문헌["Field" Raven press 1990, second edition]의 1361면에 각각 혈청형 G2, G3 및 G4에 대한 사람 로타바이러스 참고 균주로서 기재되어 있다.
본 실험에서, 다양한 로타바이러스 균주가 동결건조되었다.
그럼에도 불구하고, 바이러스 역가는 동결건조 동안에 유지되었고, 가속 안정성(37℃에서 1주일)이 나타났다.
실시예 9: 로타바이러스 백신의 1회 경구 투여에 의한 성인의 페이스(Phase) I 안전성 실험.
페이스 I 실험을 수행하여 18세 내지 45세의 건강한 성인에 대한 106.0ffu의 P43 백신 1회 경구 용량의 안전성 및 리액토제너시티(reactogenicity)를 평가하였다.
임상 실험은 이중맹검(double blind)이었고 무작위적이었다. 이는 위약 대조실험되며 자체 수용성(self-contained)이었다. 실험을 벨기에의 단일 센터에서 수행하였다.
실험 집단
위약 그룹 11명과 백신 그룹 22명의 전체 33명의 피검자가 등록되었고 이들 모두가 실험을 끝마쳤다. 모든 자원자는 백인이었다. 백신접종시 이들의 평균 연령은 35.3세였으며 18세 내지 44세에 걸쳐 분포하였다. 실험은 1월에 시작하여 1개월에 걸쳐 진행되었다.
재료
백신
P43 백신의 임상 로트(lot)를 우수의약품제조관리기준(Good Manufacturing Practice)에 따라 생성시키고, 정제시키고, 제형화하고, 동결건조시켰다. 로트를 품질 관리 및 품질 보증에 의해 출하(release)하였다. 각각의 백신 바이알은 하기 성분들을 함유하였다:
활성 성분:
P43 균주Min. 105.8ffu
부형제, 안정제:
수크로오스9㎎
덱스트란18㎎
소르비톨13.5㎎
아미노산9㎎
위약
위약 바이알을 제조하고 출하하였다. 각각의 위약 바이알은 하기 성분들을 함유하였다:
부형제, 안정제:
수크로오스9㎎
덱스트란18㎎
소르비톨13.5㎎
아미노산9㎎
희석제
주사용 물을 희석제로서 사용하여 백신과 위약을 재구성하였다.
투여
백신 또는 위약을 투여하기 약 10분 내지 15분 전에, 두 그룹 모두의 피검자에게 Mylanta®10㎖를 경구 투여하였다. Mylanta®는 등록된 제산제이다. 제산제는 위의 pH를 증가시켜, 위 통과 도중의 로타바이러스의 비활성화를 방지해준다.
백신을 제조하기 위해, 바이알 당 105.8ffu를 함유하는 동결건조된 P43의 2개의 바이알을 1.5㎖의 주사용 물을 사용하여 재구성하였다. 이는 용량 당 106.1의 계산된 바이러스 역가를 달성시켰다. 재구성된 백신은 1회 경구 용량으로서 즉시 투여하였다.
위약을 제조하기 위해, 동결건조된 두 개의 바이알을 주사용 물 1.5ml로 재구성하고 단일 용량으로서 경구적으로 투여하였다.
안전성 및 리액토제너시티
하기 안전성 및 리액토제너시티 기준이 적용되었다:
호소된 일반 증상은 발열, 설사, 구토, 복통 및 식욕 상실이었다. 이들 증상은 투여 후 8일 동안 기록되었다. 호소되지 않은 증상은 투여 후 30일 동안 기록되었다. 심각한 역효과가 전체 실험 기간 동안 기록되었다. 설사 샘플은 투여 후 8일 동안 수집할 예정이었다.
결과는 다음과 같았다:
호소된 증상, 호소되지 않은 효과 및 심각한 역효과는 각각의 관찰 기간 동안 보고되지 않았다.
설사 환자는 보고되지 않았다.
결론
SB 바이오로지칼즈 P43 백신은 18세 내지 44세의 건강한 성인 자원자에게 106.1ffu 용량의 1회 용량으로서 이중 맹검 방식으로 경구 투여되는 경우 위약에 비해 안전하였다.

Claims (39)

  1. VP4 및 VP7으로서 표기되는 주요 바이러스 단백질중 하나 이상을 엔코딩하는 누클레오티드 서열로 정의되는 단일 변이체 또는 실질적인 단일 변일체를 포함함을 특징으로 하는 약독화된 로타바이러스 군집.
  2. 제 1항에 있어서, 클로닝된 균주임을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 사람 로타바이러스 감염으로부터 유래됨을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 사람내에서 복제되고 사람에 의해 분비됨을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 단일 변이체가 개시 코돈으로부터 788 위치에 아데닌 염기(A), 802 위치에 아데닌 염기(A) 및 501 위치에 티민 염기(T) 중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열이 VP4 유전자에 포함된 변이체임을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  6. 제 5항에 있어서, VP4 유전자가 개시 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌 염기(A) 및 501 위치에 티민 염기(T)를 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 단일 변이체가 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T), 897 위치에 아데닌(A) 및 897 위치에 구아닌(G) 중 하나 이상을 포함하는 누클레오티드 서열이 VP7 유전자에 포함된 변이체임을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  8. 제 7항에 있어서, VP7 유전자가 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌(A) 또는 구아닌(G)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  9. 제 5항 내지 제 8항에 있어서, VP4 유전자가 개시 코돈으로부터 788 및 802 위치에 아데닌(A) 및 501 위치에 티민(T)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하고; VP7 유전자가 개시 코돈으로부터 605 위치에 티민(T) 및 897 위치에 아데닌(A)을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  10. 누클레오티드 서열이 도 1에 도시된 바와 같은 VP4 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열, 및/또는 누클레오티드 서열이 도 2에 도시된 바와 같은 VP7 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 로타바이러스.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, P43으로서 표기되고 수탁 번호 ECACC 99081301호로 기탁되어 있음을 특징으로 하는 로타바이러스 군집.
  12. P43으로 표기되고 ECACC에 수탁 번호 제 99081301호로 기탁된 로타바이러스 변이체, 이의 로타바이러스 자손 및 면역학적 활성 유도체 및 이로부터 수득된 물질.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 따른 로타바이러스 변이체 P43의 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 절편을 포함하는 로타바이러스 재집합체.
  14. 적합한 세포주상에 로타바이러스 프레퍼레이션(preparation)을 계대시키고; 제한 희석 또는 플라크의 개별적 단리 중 어느 한 단계를 사용하여 균질 배양물을 임의로 선택하고; VP4 및/또는 VP7 유전자 서열의 적절한 영역을 서열분석함으로써 실질적인 단일 변이체의 존재를 검사하는 것을 포함하여, 실질적인 단일 변이체를 포함하는 정제된 로타바이러스 군집을 생성시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 로타바이러스 프레퍼레이션이 AGMK 세포상에 계대됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 로타바이러스 프레퍼레이션이 89-12 균주 또는 이의 유도체의 특징을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 우발성 에테르-민감성 오염 제(agent)를 제거하기 위해 에테르 처리하는 추가적인 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 적합한 약제학적 캐리어 또는 애쥬번트와 혼합된 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 살아있는 약독화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 경구 투여용으로 적합함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 살아있는 약독화된 바이러스가 제산성 조성물과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 제산성 조성물이 유기 제산제을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 제산제가 소듐 시트레이트임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  23. 제 20항에 있어서, 제산성 조성물이 무기 제산제를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 제산제가 수산화 알루미늄임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  25. 제 23항에 있어서, 제산제가 탄산칼슘임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 점성제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 점성제가 잔탄 검(xanthane gum)임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 살아있는 약독화된 바이러스가 탄산칼슘 및 잔탄 검과 함께 제형화되고 수용액으로 재구성됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  29. 제 20항 내지 제 28항에 있어서, 살아있는 약독화된 바이러스가 제산성 조성물과 함께 제형화되고 블리스터 팩내에서 동결건조됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  30. 제 18항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 동결건조된 형태로 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  31. 제 30항에 있어서, 살아있는 약독화된 바이러스 및 제산성 조성물이 투여전에 액체 백신 조성물로서 제형화하기 위해 별도의 컨테이너에 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  32. 제 30항에 있어서, 살아있는 약독화된 바이러스 및 제산성 조성물이 투여전에 수용액으로 재구성되는 동결건조된 백신 조성물로서 제형화하기 위해 동일한 컨테이너에 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  33. 동결건조된 형태로 존재하는 살아있는 약독화된 사람 로타바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 조성물이 혀위에 놓여졌을 때 즉시 용해되는 신속하게 용해되는 정제의 형태로 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 탄산칼슘과 같은 무기 제산제 및 잔탄 검과같은 점성제와 혼합된 동결건조된 살아있는 약독화된 로타바이러스를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 약독화된 바이러스 및 제산성 조성물이 투여전에 액체 백신 조성물로서 제형화하기 위해 별도의 컨테이너에 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  37. 제 35항에 있어서, 약독화된 바이러스 및 제산성 조성물이 투여전에 수용액으로 재구성되는 동결건조된 백신 조성물로서 동일한 컨테이너에서 제형화됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  38. 동결건조된 살아있는 약독화된 사람 로타바이러스를 제산제 및 점성제와 혼합하는 것을 포함하여 로타바이러스 백신을 제조하는 방법.
  39. 유효량의 제 18항 내지 제 27항 중 어느 한항에 따른 백신을 이를 필요로 하는 사람 피검자에게 투여함으로써 사람의 로타바이러스 감염을 예방하는 방법.
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