CZ302173B6

CZ302173B6 - Oslabená populace lidského rotaviru

Info

Publication number: CZ302173B6
Application number: CZ20020522A
Authority: CZ
Inventors: Desiree Alberte Colau@Brigitte; Denamur@Francoise; Knott@Isabelle; Poliszczak@Annick; Thiry@Georges; Velde@Vincent Vande
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2010-11-24
Also published as: CA2379196A1; CY1106103T1; BR0013357A; UY26297A1; MXPA02001648A; CO5580165A1; MY133158A; CY2006004I2; IL147926A0; DE60028390D1; NO20020763L; JP2007319164A; NL300233I1; JP2003507040A; NO2010011I1; DK1212084T3; EP1212084B1; SI1212084T1; AP1768A; EA200200142A1

Abstract

Rešení poskytuje oslabenou populaci rotaviru, obsahující jedinou variantu nebo v podstate jedinou variantu, která je definována nukleotidovou sekvencí, kódující alespon jednu z hlavních virových bílkovin, oznacovanou jako VP4 a VP7. Rešení zvlášte poskytuje populaci rotaviru, oznacovanou jako P43. Rešení dále poskytuje nový prostredek pro rotavirovou vakcínu, který je ve forme rychle se rozpouštející tablety pro okamžité rozpuštení po vložení do úst.

Description

Oslabená populace lidského rotaviru

Oblast techniky

Vynález se týká nových vakcinačních prostředků, způsobu jejich výroby a jejich použití v léčbě. Zvláště se pak předkládaný vynález týká nových rotavirových vakcinačních prostředků.

Dosavadní stav techniky

Akutní, infekční průjem je přední příčinou onemocnění a smrti v mnoha světových oblastech. V rozvojových zemích je dopad průjmového onemocnění ohromující. Pro Asii, Afriku a Latinskou Ameriku bylo odhadnuto, že zde existují tři až čtyři biliony případů průjmu každý rok a z těchto případů přibližně pět až 10 milionů končí smrtí (J. A. Walsh se spoluautory, N. Engl. J. Med. 301. 967-974, 1979).

Rotavirus byl rozpoznán jako jedna z nej důležitějších příčin těžkého průjmu u kojenců a malých dětí (Μ. K. Estes, Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, 3. vydání, vydáno

2o Fieldsem a spol., Raven Publishers, Philadelphia 1996). Odhaduje se, že rotavirové onemocnění je zodpovědné za více než 1 milion úmrtí ročně. Rotavirem indukovaná nemoc nejběžněji působí na děti mezi 6 a 24 měsíci života a vrcholné rozšíření onemocnění obecně nastává během chladnějších měsíců v umírněném podnebí a během celého roku v tropickém podnebí. Rotaviry se typicky přenášejí z osoby na osobu fekálně orální cestou s inkubační dobou přibližně od 1 do

3 dnů. Oproti infekci u věkové skupiny 6 až 24 měsíců jsou novorozenci obecně bez příznaků nebo mají jen slabší onemocnění. Na rozdíl od těžkého onemocnění s nímž se obvykle střetáváme u malých dětí je většina dospělých chráněna v důsledku předchozí rotavirové infekce, takže většina infekcí u dospělých je mírná nebo bez příznaků (P. A. OfFit se spoluautory, Comp. Ther. 8(8),21-26, 1982).

Rotaviry jsou obecně kulovité ajejich název je odvozen od jejich odlišené vnitřní a vnější, nebo dvouplášťové struktury kapsidu. Dvouplášťová kapsidová struktura rotaviru typicky obklopuje vnitrní bílkovinný obal či jádro, obsahující genom. Genom rotaviru se skládá z 11 segmentů dvouvláknové RNA, která kóduje přinejmenším 11 odlišných virových bílkovin. Dvě z těchto virových bílkovin, označované jako VP4 a VP7 jsou uspořádány vně dvouplášťové kapsidové struktury. Vnitřní kapsid rotaviru představuje jedna bílkovina, jíž je rotavirová bílkovina, označovaná jako VP6. Poměrná důležitost těchto tri konkrétních rotavirových bílkovin ve vyvolání imunitní odpovědi, která následuje po rotavirové infekci, není známa. Přesto však bílkovina VP6 určuje skupinový a podskupinový antigen a bílkoviny VP4 a VP7 jsou determinanty sérotypové specifičnosti.

Bílkovinou VP7 je glykoprotein o molekulové hmotnosti Mw = 38 000 (nebo Mw = 34 000, pokud není glykosilován), který je translačním produktem genomického segmentu 7, 8 či 9, v závislosti na kmeni. Tato bílkovina stimuluje následně po infekci rotavirem vytváření hlavních neutralizujících protilátek. Bílkovinou VP4 je neglykosylovaná bílkovina o Mw = přibližně 88 000, která je translačním produktem genomického segmentu 4. Tato bílkovina také po rotavirové infekci stimuluje neutralizující protilátky.

Vzhledem k tomu, že bílkoviny VP4 a VP7 jsou virovými bílkovinami, proti nimž jsou namířeny neutralizující protilátky, jsou povazovány za prvotní kandidáty pro vývoj rotavirových vakcín, poskytujících ochranu vůči rotavirovým onemocněním.

Je známo, že přirozená rotavirová infekce během ranného dětství vyvolává ochrannou imunitu. Vakcína na bázi živého oslabeného rotaviru je proto velmi žádoucí. S výhodou by se mělo jednat o orálně podávanou vakcínu, neboť tato cesta je přirozenou cestou infekce virem. Časný vývoj

-1 CZ 302173 B6 vakcíny k prevenci rotavirových infekcí započal v sedmdesátých letech po objevu viru. Nejprve byly studovány oslabené kmeny od zvířat Či lidí a získány byly smíšené výsledky či výsledky přinášející zklamání. Později se úsilí zaměřilo na lidské-zvířecí reasortanty (opětně vytříděné typy) a bylo mnohem úspěšnější.

Například v publikaci autorů Midthun et al., J. of Clinical Microbiology, 1986, 24(5): 822-826 se popisovala izolace reasortantů odvozených od koinfekce tkáňových kultur standardními rotaviry rhesus nebo bovinními a lidskými rotaviry několika sérotypů.

io Rotavirový kmen, známý jako 89-12, byl popsán Wardem, viz patent US 5 474 773 a D, L. Bernsteinem se spoluautory, Vaccine 16(4), 381-387, 1998. Kmen 89-12 byl izolován z podkladového druhu, shromážděného od čtrnáctiletého dítěte s přirozeným rotavirovým onemocněním v roce 1988. Podle patentu US 5 474 773 byl lidský rotavirus HRV 89-12 poté pro kultivaci adaptován dvouitým pasážováním v primárních buňkách opičích ledvin (Afričan Green Monkey i? Kidney /AGMK/ cells) a čtyřnásobným pasážováním v buňkách MA-104, jak popsal Ward v J. Clin. Microbiok 19, 748-753, 1984. Poté byl čištěn ptákovou metodou, trojnásobně v buňkách MA-104 (do 9. pasážování) a po dvojím přídavném pasážování byl pěstován v těchto buňkách. Jedno přídavné pasážování bylo uskutečněno (12. pasážování) pro uložení v ATCC (American Type Culture Collection, Americké sbírce typů kultur) pod přírůstkovým číslem ATCC VR 2272.

Uložený kmen je známý jako 89-12C2.

Článek v časopisu Vaccine z roku 1998 Bemsteina a spoluautorů je dále uváděn jako „článek ve Vaccine (1998)“. Tento článek popisuje bezpečnost a imunogenitu orálně podávaného přípravku, aspirujícího na živou vakcínu lidského rotaviru. Tato vakcína byla z kmene 89-12, oslabeného pasážováním bez plakového vyčištění dvacetisestinásobně v primárních AGMK buňkách a poté sed mi násobným pasážováním v ustanovené buněčné Unii AGMK (celkem 33 pasážování).

V tomto popisu vynálezu bude výše zmíněný materiál, který byl pravidelně dvacetisestinásobně pasážován, dále označován jako P26 a materiál, který byl pravidelně třiatricetinásobně pasážo30 ván, bude označován jako P33. Obecně bude rotavirus, získaný n-násobným pasážováním kmene 89-12, označován jako Pn.

V následujících Příkladech byl materiál P33 dále pětinásobně pasážován ve Vero-buňkách. Ten je pak označen jako P38.

Isoláty P26 a P33, popsané v článku ve Vaccine (1989), nebyly uloženy ve sbírce kultur, ani nebyly analyzovány ke stanovení jejich genetické charakterizace.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že populace P26, popsaná v literatuře, zahrnuje směs druhů (variant). To bylo prokázáno genetickou charakterizací, jak je popsáno dále (viz Příklady). P26 tedy není spolehlivě shodnou populací pro další pasážování a zvláště pro výrobu vakcinačních dávek. Podobně P33 zahrnuje směs variant a není spolehlivě shodný pro výrobu vakcinačních dávek.

Bylo zjištěno, že materiál P26 je směsí alespoň tří variant genu VP4. P33 a P38 jsou podobně směsí dvou variant. Tyto varianty se zdají být, pokud se týká neutralizačních epitopů, antigenně odlišné od kmene 89-12C2, uloženého v ATCC, pokud jsou stanoveny titry neutralizujících pro50 tilátek ze séra kojenců, očkovaných pomocí P33 vůči těmto variantám. To je doloženo na Obr. 3 (a-d)

Dále bylo zjištěno, že pokud je materiál P33 podáván kojencům, jsou replikovány a vylučovány dvě identifikované varianty. Ze 100 očkovaných kojenců jen 2 vykázali známky gastroenteritidy, způsobené rotavirovou infekcí, zatímco ze skupiny, dostávající placebo, bylo infikováno 20 %.

-2CZ 302173 B6

Tato zjištění ukazují, že identifikované varianty jsou asociovány (spojeny) s ochranou vůči rotavirovému onemocnění. Předkládaný vynález poskytuje způsob oddělení rotavirových variant a zlepšenou živou oslabenou rotavirovou vakcínu, získanou z klonovaného (homogenního) lidského kmene rotaviru.

Podle prvního aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje oslabenou rotavirovou populaci (izolovanou), charakterizovanou tím, že obsahuje jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu a tato varianta je definována nukleotidovou sekvencí, kódující alespoň jednu z hlavních virových bílkovin, označovaných jako VP4 a VP7.

Rotavirová populace podle vynálezu je s výhodou klonovanou variantou.

Populací, obsahující jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu, se míní rotavirová populace, která neobsahuje více než 10 %, lépe obsahuje méně než 5 % a nejlépe méně než 1 % odliš15 né varianty nebo odlišných variant. Virová populace může být vyčištěna do homogenity (stejnorodosti) nebo v podstatě do homogenity pasážováním na vhodných typech buněk, nebo provedením řady jednoho nebo více kroků klonování.

Výhodou tohoto vynálezu je to, že populace, obsahující jedinou variantu, je mnohem vhodnější pro formulaci shodné vakcinační dávky. Za zvýšení účinnosti prevence rotavirové infekce mohou být rovněž asociovány (připojeny) konkrétní varianty, definované svými nukleot idovým i sekvencemi, kódujícími hlavní virovou bílkovinu.

V jednom upřednostňovaném aspektu jedinou variantou nebo v podstatě jedinou variantou rota25 virové populace podle vynálezu je ta varianta, u níž gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jedno z následujících uspořádání: adeninovou bázi (A) v poloze 788, adeninovou bázi (A) v poloze 802 a thyminovou bázi (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu.

V dalším aspektu jedinou variantou nebo v podstatě jedinou variantou rotavirové populace podle vynálezu je ta varianta, u níž gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jedno z následujících uspořádání: thymin (T) v poloze 605, adenin (A) v poloze 897 nebo guanin (G) v poloze 897 od počátečního (startovacího) kodonu. Výhodněji je v poloze 897 adenin (A).

V upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu adenin (A) v polohách 788 a 802 a thymin (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP4.

V jiném upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu thymin (T)

4i) v poloze 605 a adenin/guanin (A/G) v poloze 897 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP7. Nejvýhodněji je v genové sekvenci VP7 adenin (A) v poloze 897.

Ve zvláště upřednostňovaném aspektu má jediná varianta populace podle vynálezu adenin (A) v polohách 788 a 802 a thymin (T) v poloze 501 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP4; thymin (T) pak v poloze 605 a adenin/guanin (A/G) v poloze 897 od počátečního (startovacího) kodonu genové sekvence VP7. Nej výhodněji je v genové sekvenci VP7 adenin (A) v poloze 897.

V jiném aspektu zahrnuje jediná varianta nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP4, kde tato nukleotidová sekvence je stejná jako sekvence uvedená na Obr. 1 a/nebo zahrnuje nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP7, kde tato nukleotidová sekvence je stejná jako sekvence, uvedená na Obr. 2.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby rotavirové populace, obsahujícího v podstatě jedinou variantu, přičemž tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se:

-3CZ 302173 B6

- rotavirový preparát pasážuje ve vhodném buněčném typu;

- volitelně vybere homogenní kultura za použití kroků, v nichž se

a) využije limitního zředění; nebo

b) využije izolace jednotlivého plaku; a

- ověří přítomnost v podstatě jediné varianty tak, že sc provede sekvenční stanovení příslušní oblastí genové sekvence VP4 a/nebo VP7.

Sekvenční stanovení se může vhodně provádět postupem kvantitativní nebo semikvantitativní hybridizace, jako je hybrídizace typu „slot blot“ nebo plaková hybridizace.

io

Zvolenou variantou je s výhodou varianta, která se aplikuje a vylučuje po podání výchozího (startovacího) rotavirového preparátu lidskému subjektu, zejména pak dítěti.

Výsledná klonovaná virová populace, vzniklá způsobem podle tohoto vynálezu, může být zmno15 žena dalším pasážováním ve vhodné buněčné linii.

Vhodné buněčné typy pro pasážování rotavirové populace v dříve zmíněném způsobu zahrnují buňky opičích ledvin (AGMK cells, Afričan green monkey kidney cetls), kterými mohou být založené buněčné linie nebo prvotní AGMK buňky. Vhodné AGMK buněčné linie zahrnují zo například linie Věro (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-I (ECACC

85011422) a CV-1 (ATCC CCL-70). Vhodné jsou také MA-104 (makak rhesus) a MRC-5 (lidské - ATCC CCL-I7I) buněčné linie. Pro amplifíkační účely (zesílení populace) se zvláště upřednostňují buňky Věro. Pasážování v buňkách Věro poskytuje vysoký výtěžek viru.

Postupy k ověření, zda ve virové populace, získané popsaným způsobem, existuje jediná varianta a ke stanovení povahy této jediné varianty zahrnují standardní sek ve nač ní nebo hybrid i zač ní postupy, které jsou v oboru známé a jsou zde dále popsány.

V upřednostňovaném aspektu se způsob podle vynálezu provádí za použití vhodného rotaviru, zejména rotaviru, majícího charakteristiky kmene 89-12 nebo jeho pasážovaného derivátu.

Zvláště upřednostňovanou populací o jediné variantě je P43, která byla získána z P33 (izolovaného lidského rotaviru, pasážovaného třiatřicetinásobně v kultuře na vhodných buněčných typech) sérií klonovacích kroků koncového zředění a následně pasážováním klon eho materiálu ve

Věro buňkách kjeho posílení.

Populace P43 byla podle ujednání Budapešťské dohody uložena v Evropské sbírce živočišných buněčných kultur ve Výzkumné a produkční laboratoři vakcín Laboratorní služby veřejného zdraví, v Centru pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum (v ECACC, European Collection of

Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research), v Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, ve Spojeném Království, a to dne 13. srpna 1999 pod ukládacím číslem 99081301.

Ačkoli tato uvedená veřejná dostupnost je nejjednodušším způsobem jak získat lidský rotavirus

P43, není vcelku nemožné nebo nepravděpodobné, že podobné a funkčně v podstatě totožné rotaviry by mohly být vyrobeny těmito nebo jinými způsoby podle poznatků tohoto vynálezu. Takové funkčně v podstatě totožné rotaviry jsou považovány za biologicky rovnocenné lidskému rotaviru P43 podle tohoto vynálezu a spadají tedy do obecného rozsahu předkládaného vynálezu. Rozumí se tím tedy, že vynález zahrnuje rotavirové populace, mající charakteristiky varianty

P43, jakje zde popsána.

Rovněž je tedy zřejmé, že vynález zahrnuje materiál, odvozený od uloženého P43 ECACC 99081301 tak, zeje podroben dalšímu zpracování, jako je jeho rozmnožování dalším pasážováním, klonováním, nebo jinými postupy, využívajícími živý virus, nebo jakoukoli modifikací P43,

-4CZ 302173 B6 včetně postupů genetického inženýrství nebo opětného vytřídění. Takové kroky a postupy jsou v oboru dobře známé.

Materiály, odvozené od P34, které jsou chráněny vynálezem, zahrnují bílkovinný a genetický materiál. Zvláštní pozornost zasluhují reasortní (opětovně vytříděné) rotaviry, které obsahují alespoň jeden antigen nebo alespoň jeden segment P43, například reasortní rotaviry, obsahující virulentní kmen rotaviru, v němž byla jedna část jednoho z 11 genomových segmentů nahrazena genomovým segmentem nebo jeho částí z P43. Vhodné vlastnosti mohou mít zejména reasortní rotaviry, v nichž segmentem nebo částečným segmentem, kódujícím NSP4, je segment nebo částečný segment P43. Reasortní rotaviry a způsoby jejich přípravy jsou dobře známé (viz R. H. Foster a A. J. Wagstaff, Tetravalent Rotavírus Vaccine, souborný článek. AIDS drug evaluation, BioDrugs, Gev 9(2), 155-178, 1998).

Zvláště zajímavými materiály jsou potomstvo P43 a imunologicky aktivní deriváty P43. Imunologicky aktivními deriváty se míní materiály, získané z viru P43, zvláště pak antigeny tohoto viru, které jsou schopné vyvolat imunitní odpověd', působící proti rotaviru po jeho injíkaci do hostitelského zvířete.

Při adaptování rotaviru na vhodnou buněčnou linii, například na buňky Věro, může být nezbytné působit na virus tak, aby se zbavil jakékoli znečišťující substance (kontaminantu), kterou mohou být jakákoli nahodilá činidla, která mohou být přítomna a která mohou působit kontaminaci. V případě nahodilých (přidaných) virů, citlivých vůči etheru, se působení může provádět pomocí etheru, jak bude popsáno dále. Předkládaný vynález se také týká zahrnutí takového ovlivnění etherem jako volitelného kroku v celkovém postupu, který slouží k získání oslabeného živého rotaviru nebo vakcíny, kteráje s ním formulována.

Do rozsahu předkládaného vynálezu patří také směsi P43 s jinými variantami rotaviru, například s jinými klonovanými variantami, nebo s jinými viry, zejména s jinými oslabenými viry. Takové směsi se hodí pro vakcíny podle vynálezu, které jsou popsány dále.

Předkládaný vynález také poskytuje vakcínu živého oslabeného rotaviru, která zahrnuje populaci v podstatě jediné varianty, smíšenou s vhodnou adjuvantní látkou nebo s farmaceutickým nosičem.

Rotavirovou vakcínou podle vynálezu je s výhodou monovalentní rotavirová vakcína, obsahující jediný kmen rotaviru.

Předkládaný vynález je zvláště výhodný v tom, že poskytuje vakcínu živého rotaviru, v níž je živoucím oslabeným rotavirem lidský rotavírus a nevyvolává intususcepci.

Vhodné farmaceutické nosiče pro použití ve vakcíně podle vynálezu zahrnují ty, které jsou v oboru známé jako vhodné pro orální podání, zvláště pak dětem. Takové nosiče zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, cukry, vícesytné alkoholy, aminokyseliny, hydroxid hlinitý, hydroxid hořečnatý, hydroxyapatit, talek, oxid titaničitý, hydroxid železitý, stearát hořečnatý, karboxy methy 1celulózu, hydroxy propyl methylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu, želatinu, rostlinný pepton, xantan, karagen, arabskou gumu (klovatinu) a β-cyklodextrin.

Vynález rovněž poskytuje způsob výroby rotavirové vakcíny, například lyofilizaci viru v přítomnosti vhodných stabilizátorů nebo smísením viru podle vynálezu s vhodnou adjuvantní látkou nebo s farmaceutickým nosičem.

Výhodné může být také formulování viru podle vynálezu ve vehikulech (nosných prostředcích) na bázi lipidů, jako jsou virosomy nebo liposomy, v emulzích oleje ve vodě nebo s částicemi nosiče. Ve formulacích mohou být alternativně nebo nádavkem zahrnuty imunostimulátory, jako jsou ty, známé v oboru pro orálně podávané vakcíny. Takové imunostimulátory zahrnují bakte- 5 CZ 302173 B6 riální toxiny, zvláště cholerový toxin (CT) ve formě holotoxinu (celé molekuly) nebo pouze řetězce B (CTB) a teplotně labilní enterotoxin z E. coli (LT). Mutované LT, které mají menší sklon k přeměně na svou aktivní formu než přírodní LT, jsou popsány ve WO 96/06627, WO 93/13202 a v IJS 5 182 109.

Dalšími imunostimulátory, které mohou být výhodně použity, jsou saponinové deriváty jakoje QS21 a monofosforyllipid A, zejména pak 3 de O acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Vyčištěné saponiny jako orální adjuvantní látky jsou popsány ve WO 98/56415. Saponiny a monofosforyllipid A mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci (viz například WO 94/00153) a mohou být formulovány v adjuvantních systémech společně s jinými činidly. 3DMPL je dobře známé adjuvans, vyráběné firmou Ribi Immunochem, Montata a jeho výroba je popsána v GB 2 122 204.

Obecná diskuse o vehikulech a adjuvantních látkách pro orální imunizaci lze nalézt v publikaci „Vaccine Design, The subunit and Adjuvant Approach^bt, vyd. Powell a Newman, Plenům Press, New York, 1995.

Vynález také poskytuje způsob vakcinace (očkování) lidských subjektů, zvláště kojenců, podáním účinného množství vakcinačního prostředku podle vynálezu subjektu, který to potřebuje. S výhodou se podává živá oslabená vakcína orální cestou.

V upřednostňovaném aspektu je vakcinační prostředek podle vynálezu formulován spolu s antacidem pro minimalizování inaktivace vakcíny žaludeční kyselinou. Vhodné antacidové složky zahrnují anorganické antacida jako například hydroxid hlinitý Al(OH)i a hydroxid hořečnatý (Mg(0H)₂). Obchodně dostupné antacida, která jsou vhodná pro použití ve vynálezu, zahrnují přípravek Mylanta^{,M(/3ps /,,3čka}\ který obsahuje hydroxid hlinitý a hydroxid hořečnatý. Ty jsou ve vodě nerozpustné a jsou poskytovány v suspenzi.

Hydroxid hlinitý je zvláště upřednostňovanou složkou vakcinačního prostředku podle vynálezu, neboť může poskytovat nejen antacidní působení, ale i adjuvantní účinek.

Vhodné pro použití jako antacidní látky ve vakcíně podle předkládaného vynálezu jsou také organická antacida, jako jsou karboxylátové sole organických kyselin. Upřednostňované antacidum ve vakcinačním prostředku podle vynálezu obsahuje karboxylátovou sůl organické kyseliny, s výhodou sůl kyseliny citrónové jako je citrát sodný nebo citrát draselný.

Zvláště upřednostňované antacidum, které může být použito ve vakcinačním prostředku podle tohoto vynálezu, je nerozpustná anorganická sůl, uhličitan vápenatý (CaCCh). Uhličitan vápenatý je schopný spojení (asociace) s rotavirem a během spojení s uhličitanem vápenatým je udržována rotavirová aktivita.

K prevenci sedimentace uhličitanu vápenatého během kroku plnění jsou v prostředku s výhodou přítomna viskózní činidla.

Možná viskózní činidla, která lze použít, zahrnují pseudoplastické přídavné látky. Pseudoplastický roztok je definován jako roztok, mající při stání vyšší viskozitu, než je jeho viskozita při protřepávání. Přídavnými látkami tohoto typu jsou přirozené polymery jako je arabská guma, adragantová guma, agar, algináty, pektiny nebo polosyntetické polymery, jako například karboxymethylcelulóza (Tyloses C®), methylcelulóza (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® a MB®), hydroxypropylcelulóza (Klucels®) a hydroxypropylmethylcelulóza (Methocels E® a K®, Viscotrans MPHC®). Obecně se tyto pseudoplastické pomocné látky používají společně stixotropními činidly. Jinými viskózními činidly, která je možné použít, jsou pseudoplastické pomocné látky s malou kapacitou toku (tekutosti). Tyto polymery, v dostatečné koncentraci, umožňují vznik uspořádání strukturované tekutiny, výsledkem čehož je roztok o vysoké viskozitě, mající při stání nízkou kapacitu tekutosti. K umožnění toku a převádění je pak potřeba vynaložit určité

-6CZ 302173 B6 množství energie. K dočasnému zrušení uspořádání strukturované tekutiny pro získání tekutého roztoku jsou potřebné vnější energie (protřepávání). Příklady takových polymerů jsou látky Carbopols* a xanthanová guma.

s Tixotropní pomocné látky získají stáním gelovou strukturu, zatímco pri protřepávání vytvářejí tekutý roztok. Příklady tixotropních pomocných látek jsou: Veegum*⁰ (křemičítan hořečnatohlínitý) a Avicel RC^fW (přibližně 89% mikrokrystalické celulózy a 11 % sodné karboxy methy 1celulózy).

io Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahuje viskózní činidlo, zvolené z xanthanové gumy nebo škrobu.

Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu je tedy s výhodou formulován s kombinací uhličitanu vápenatého a xanthanové gumy.

Ostatní složky prostředku, použitého ve vynálezu, vhodně zahrnují cukry, například sacharózu a/nebo laktózu.

Vakcinační prostředek podle vynálezu může obsahovat přídavné složky, zahrnující například příchutě (zejména pro orálně podávanou vakcínu) a bakteriostatická činidla,

U vakcinačního prostředku podle vynálezu se předpokládají různé způsoby presentace (předkládání).

V jednom upřednostňovaném ztělesnění se vakcína podává jako kapalný prostředek. Kapalný prostředek se s výhodou vytváří před podáním alespoň z následujících dvou složek: i) virová složka i i) kapalná složka

V tomto ztělesnění jsou virová složka a kapalná složka normálně přítomné v oddělených zásobnících, které výhodně mohou být oddělenými oddíly jediné nádobky, nebo může jít o oddělené nádobky, které mohou být spojeny takovým způsobem, že konečný vakcinační prostředek je rekonstituován (opětně vytvořen) bez jeho vystavení vzduchu.

Před rekonstituováním může být virus v suché nebo kapalné formě. Virová složka je s výhodou tyofilizována. Lyofilizovaný virus je mnohem stálejší než virus ve vodném roztoku. Lyofilizovaný virus může být vhodně rekonstituován za použití kapalného antacidního prostředku k vytvoření kapalného vakcinačního prostředku. Jinou možností je rekonstituce lyofilizovaného viru vodou nebo vodným roztokem a v takovém případě směs lyofilizovaného viru s výhodou obsahu4o je antacidní složku.

Vakcinační prostředek s výhodou obsahuje virovou složku, formulovanou s uhličitanem vápenatým a xanthanovou gumou v jednom oddílu nebo nádobě a taje rekonstituována vodou nebo vodným roztokem, přítomným v druhém oddílu nebo nádobě.

V jiném upřednostňovaném ztělesnění je vakcinační prostředek prostředkem v pevné formě, s výhodou lyofílizátem, který je vhodný pro okamžité rozpuštění po vložení do úst. Lyofilizované prostředky mohou být výhodně poskytovány ve formě tablet v farmaceutickém balení do blistru.

so V jiném aspektu vynález poskytuje rotavirovou vakcínu ve formě rychle se rozpouštějící tablety pro orální podání.

-7CZ 302173 Β6

V jiném aspektu vynález poskytuje prostředek, obsahující živý oslabený kmen rotaviru, zejména kmen lidského rotaviru, přičemž je tento prostředek lyoťilizovanou pevnou látkou, schopnou okamžitého rozpuštění po vložení do úst.

Rychle se rozpouštějící tableta podle vynálezu se v ústech subjektu s výhodou rozpouští dostatečně rychle, aby se předešlo bobtnání nerozpuštěné tablety. Tento přístup je zvláště výhodný pro pediatrické rotavirové vakcíny.

Virem je s výhodou živý oslabený lidský rotavirus, který je formulován s anorganickým antacidem jako je uhličitan vápenatý a s viskózním činidlem, jako je xanthanová guma.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je poskytnutí lyofilizované formy prostředku, kde virovou složkou je jakýkoli kmen rotaviru, který je formulován s uhličitanem vápenatým a s xanthanovou gumou.

Vakcíny podle vynalezu mohou být formulovány a podávány známými technikami, za použití vhodného množství živého viru k poskytnutí účinné ochrany vůči rotavirové infekci bez významných vedlejších účinků v typických vakcínách. Vhodným množstvím živého viru bude obvykle množství mezi 10⁴ a 10⁷ ffu (focus forming units, jednotek, vytvářejících ložisko) na dávku. Typická dávka vakcíny může zahrnovat 10⁵ a 10⁶ ffu na dávku a může se podávat v několika dílčích dávkách během určitého časového období, například ve dvou dílčích dávkách, podávaných ve dvouměsíčním intervalu. Přínosu lze ovšem dosáhnout i rozdělením na více než dvě dávky, například na 3 anebo 4 dávky, zvláště v rozvojových zemích. Intervaly mezi jednotlivými dávkami by měly být přibližně v délce dvou měsíců. Optimální množství živého viru pro jednu dávku nebo pro vícedávkové uspořádání a optimální načasování dávek může být zjištěno standardními studiemi, které zahrnují sledování titrů protilátek a jiných odpovědí, pozorovaných u subjektů.

Vakcína podle vynálezu může také obsahovat jiné vhodné živé víry pro ochranu vůči jiným onemocněním, například poliovirus. Alternativně mohou být jiné vhodné vakcíny s obsahem živého viru pro orální podávání poskytovány v oddělené dávce, ale při stejné příležitosti jako prostředek rotavirové vakcíny podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Popis pro Obr. 3(a-d)

Séra dvanácti dětí ve stáří 4 až 6 měsíců očkovaných materiálem P33, jak je popsán v článku ve Viccine (1998), byla testována vzhledem k neutralizaci P33, P38, P43 a 89-12 C2.

Rozmezí neutralizačních titrů všech testovaných sér je stejné pro P33, P38 a pro P43. Statistická analýza neukázala žádný statisticky významný rozdíl v celkových neutralizačních titrech vzhledem ke všem těmto třem virům. To ukazuje, že konformační a nekonformační neutralizační epitopy P33. P38 a P43 jsou stejně dobře rozpoznávány anti-P33 séry kojenců, očkovaných pomocí P33. Toto pozorování nepřímo ukazuje, že neutralizační epitopy, odkryté v tomto stanovení in vitro, se mezi P33, P38 a P43 nelišily.

Rozmezí neutralizačních titrů P89-12 C2 se ovšem od P33, P38 a P43 významně lišilo. Toto pozorování ukazuje, že konformační a nekonformační neutralizační epitopy P33, P38 a P43 nejsou stejně dobře rozpoznávány anti-P33 séry kojenců, očkovaných pomocí P33. Toto pozorování nepřímo ukazuje, že neutralizační epitopy, odkryté v tomto stanovení in vitro, se lišily mezi 89-12C2aP33, P38 a P43.

Následující Příklady ozřejmují vynález.

-8CZ 302173 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Prokázání toho, že kmen 89-12 je při pasáži 26 (P26) směsí variant

Sekvenování genů VP4 a VP7 z různých pasážování

Provedeno bylo sekvenování genů VP4 a VP7 z pasáže P26 (primární AGMK buňky), pasáže P33 (zavedená /jako opak primární/ AGMK buněčná linie), pasáže P41 a pasáže P43. Celková extrahovaná DNA byla reversně přepsána a amplifikována (zesílena) v PCR (polymerase chain reaction, polymerázové reakci řetězce) v jedné zkumavce/1 krok,

Primery (startéry) Rota 5bis a Rota 29bis amplífíkovaly celý gen VP4 a primery Rota l a Rota 2bis amplífíkovaly celý gen VP7. Materiál z PCR byl sekvencován za použití různých primerů (viz Tabulka 1).

Sekvence pasáže P26 se lišila od sekvence pasáže P33 třemi bázemi (v polohách 501, 788 a 802 párů bází od startovacího kodonu) u VP4 a třemi bázemi (v polohách 108, 605 a 897 párů bází od startovacího kodonu) u VP7.

Zobrazení (skeny) pasáže P26 genů VP4 a VP7 ukazují ve zmutováných polohách přítomnost sekvence pasáže P33 jako základu. Z toho je zřejmé, že pasáž P26 je směsí alespoň dvou variant.

Zobrazení (skeny) pasáže P33 vyhlížejí homogenně pro VP4 a heterogenně pro VP7 (viz Tabulka 2).

Pasáž P38 (odvozená od pasáže 33) byla pětinásobně pasážována na buňkách Věro a vykázala stejný soubor sekvencí VP4 a VP7 jako pasáž P33 (buněčná linie AGMK). Mezi P33 a P38 tedy nebyly žádné větší změny v populacích.

Tabulka 1: Oligonukleotidy, použité pro RT-PCR a sekvenování

	název	sekvence	poloha
VP7	Rota 1	GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG	-49 až -22
	Rota Ibis	GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A	-16 až 10
	Rota 2bis	GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A	1014-988
	Rota 7	GGT CAC ATC GGA CAA TTC TAA TCT AAG	266-287
	Rota 12	CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G	372-394
	Rota 46	TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT	651-682
	Rota 18	AGT GG CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC	682-651

-9 CZ 302173 B6

VP4	Rota 5	TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A	2-23
	Rota 6	ATT TCG GACCAT TTA TAA CC	878-859
	Rota 5bis	TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A	2-23
	Rota 6bis	ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG	878-856
	Rota 25	GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG	268-296
	Rota 26	CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC	296-268
	Rota 27bis	TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G	721-745
	Rota 28	TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG	753-727
	Rota 31	GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G	1048-1070
	Rota 32	CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C	1070-1048
	Rota 45	TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG	1205-1227
	Rota 53	CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA	1227-1205
	Rota 54	GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA	1465-1487
	Rota 55	TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC	1487-1465
	Rota 40	CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G	1703-1727
	Rota 39	CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G	1727-1703
	Rota 33	CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G	2008-2032
	Rota 34	CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G	2032-2008
	Rota 29bis	AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G í	2335-2311 j i

- 10CZ 302173 B6

Tabulka 2: oligonukleotidy, použité v hybridizaci

	název	sekvence	poloha
VP7	Rota 41	AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA TC	882-913
	Rota 42	AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC	882-913
VP4	Rota 15	ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C	807-783
	Rota 16	ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C	807-783
	Rota 35	ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C	807-783
	Rota 36	ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C	807-783

Báze, napsané tučným písmem v Tabulce 2, jsou místy specifických sekvenčních variant ve VP4 aVP7.

Tabulka 3: sekvenační varianty genů VP4 a VP7 io 3.1

VP4	VP7
	501 pb 167 ak	788 pb 263 ak	802 pb 268 ak	108 pb 36 ak	605 pb 202 ak	897 pb 299 ak
P26 (AGMK)	A	G/A	G/A	A	C/T	A
P33 (AGMK)	T	A	A	G/A	T/C	A/G
P38 (VĚRO)	T	A	A	A/G	T	G/A
P43 (VĚRO)	T	A	A	A	T	A

pb = páry bází ak = aminokyseliny

Ve druhém klonu ze tří klonů, které byly rozvinuty na úroveň produkce, je nukleotid v poloze 897 pb na VP7 spíše G než A, jako je zvoleném klonu P43. Výsledkem je v sekvenci aminokyselin přítomnost methioninu na místě isoleucinu. Varianty, odpovídající oběma zvoleným klonům, klonu P43 a klonu, majícímu G v genu VP7 v poloze 897 pb od startovacího kodonu, byly vylučovány stolicí kojenců, kteří byli před tím očkováni materiálem P33.

-11 CZ 302173 B6

V Tabulce 3.1, kde jsou v určité poloze uvedeny dvě alternativní báze, představuje první z nich bázi, která se objevuje v hlavní populaci a druhou je báze, která se objevuje u menší části populace. Varianty hlavní populace a menší populace jsou posuzovány podle síly signálu při sekvenování.

Tabulka 3.2

VP4	VP7
	501 pb 167 ak	788 pb 263 ak	802 pb 268 ak	108 pb 36 ak	605 pb 202 ak	897 pb 299 ak
P26 (AGMK)	Leu	Gly/Glu	Gly/Arg	Arg	Thr/Met	Ile
P33 (AGMK)	Phe	Glu	Arg	Arg/Arg	Met/Thr	Ile/Met
P38 (VĚRO)	Phe	Glu	Arg	Arg/Arg	-1 Met	I- Met/ile I
P43 (VĚRO)	Phe	Glu	Arg	Arg	Met	! ile

Tabulka 3.2 znázorňuje změny v aminokyselinách, vyplývající z odlišnosti nukleotidů mezi variantami.

i5 Tabulka 4

	VP4 (polohy 788 - 802)	VP7 (poloha 897)
	G - G	A - A	A - G	G - A	A	G
sondy	Rota 15	Rota 16	Rota 35	Rota 36	Rota 41	Rota 42
pasáže
P26 i		+	+	+	nedefin.	nedefin.
P33	-	+	-	-	++	+
P38	-	+	-	-	+	++
P43	-	+	-	-	4-	-

Hybridizace typu „slot blot“

Změny v populacích mezi pasážemi P26 až P33 v buňkách AGMK byly dále potvrzeny hybridizací typu „slot blot“. Genové fragmenty VP4 a VP7, vytvořené pomocí RT/PCR, byly hybridizovány oligonukleotidovými sondami, specifickými pro každou variantu (viz Tabulky 3.1 a 3.2). Na rozdíl od pasáže P26, která hybridizovala s Rota 16, Rota 35 a Rota 36 a nikoli s Rota 15, fragment VP4 z PCR materiálu P33 hybridizoval v polohách 788 a 802 pouze s Rota 16 a nikoli buď s Rota 15, nebo s Rota 35 Či s Rota 36. Tyto výsledky prokázaly přítomnost alespoň 3 variant v P26 (viz Tabulka 4).

- 12CZ 302173 B6

U fragmentu VP7 z PCR materiálu P33 byla poloha 897 hybridizována pomocí Rota 41 a Rota

42, Tyto výsledky potvrdily přítomnost alespoň dvou variant v materiálu P33.

Příklad 2: Izolace a charakterizace klonu P43

K izolování složek P33 jako homogenní virové populace byla provedena 3 zředění do koncového bodu (end-point dilution) P33/AGMK v buňkách Věro a výsledný virus byl použit k infikování buněk Věro.

Pozitivní jamky byly vybrány za použití dvou kriterií: růstu prokázaného nejvyšším počtem ložisek, objevených v jamkách a nej izolovanějších Pozitivních jamek na destičkách, jak se provádí klasicky. Po třech pasážích zředěním do koncového bodu v devadesátišesti jamkových mikrotitračních destičkách bylo deset Pozitivních jamek postupně amplifikováno (zesíleno) na buňkách Věro a byl vyhodnocen jejich výtěžek.

Na základě výtěžku byly tri klony rozvinuty na pasážovací úroveň produkčního množství. Imunitní rozpoznání polyklonálními protilátkami bylo prokázáno jako podobné jak mezi těmito třemi klony, tak i mezi klony a P33. Homogennost klonů byla stanovena hybridizací typu „slot blot“ Konečný výběr jediného kmene byl založen na posouzení výtěžku a sekvence.

Vybraný klon byl amplifikován (zesílen) následnými pasážemi v buňkách Věro k vytvoření matečného či kmenového zaočkování (Master seed), pracovního zaočkování (Working seed) a konečně produkčních množství (dávek).

Zvolený klon byl geneticky charakterizován na různých úrovních pasážování sekvenováním VP4 a VP7 (identita) a specifickou hybridizací typu „slot blot“ VP4 a VP7 materiálů, amplifikovaných PCR (homogennost). Sekvence genů VP4 a VP7 materiálu P43 jsou uvedeny na obr. 1 a Obr. 2 a jsou identické s P41.

Homogennost vybraného kmene byla určena selektivní hybridizací za použití oligonukleotidových sond, rozlišujících nukleotidů změny v oblastech VP4 a/nebo VP7 pro každou variantu, identifikovanou během sekvenování P26/primámích AGMK (viz Tabulka 4).

Fragment VP4 byl hybridizován účinkem Rota 16 a nebyl hybridizován účinkem Rota 15, Rota 35 či Rota 36.

Fragment VP4 byl hybridizován účinkem Rota 41 a nebyl hybridizován účinkem Rota 42. Tyto výsledky potvrzují, že P43 je homogenní populace.

Příklad 3: Odstranění případného vedlejšího nahodilého viru

K P33 (zralé AGMK) byl přidáván ether do konečné 20% koncentrace po dobu 1 hodiny. Poté byl pomocí N₂ vybubláván ven po dobu 35 minut. Na titr P33 nebyl pozorován žádný dopad,

Příklad 4: Formulování živé oslabené vakcíny

Produkční množství, popsaná výše, jsou formulovány pro orální podávání kojencům následující metodou.

- 13CZ 302173 B6

1. Lyoťilizovaný virus

Pro přípravu virových dávek se používají standardní techniky. Zamražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí se vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem

Eagle, na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě 10^Λ ffu/ml. Naředěný virus sc poté dále zředí lyofilizačním stabilizátorem (4% sacharóza, 8% dextran, 6% sorbitol a 4% aminokyselina) až na cílový titr viru, v tomto případě na 10^5,6 ffu/dávku. Alikvotní množství stabilizovaného virového prostředku o objemu 0,5 ml se asepticky přenesou do lahviček o objemu 3 ml. Každá lahvička se částečně uzavře gumovou zátkou, vzorek se lyofilizuje ve vakuu a io poté se lahvička zcela uzavře a kolem její vrchní části se upevní hliníková čepička, držící zátku na svém místě.

Pro použití se virus rekonstituuje za použití následných antacidních rekonstituentů:

(a) c itrátový rekonstituent

Citrát sodný se rozpustí ve vodě, sterilizuje se filtrací a asepticky se převede do zásobníků v množství 1,5 ml a koncentraci 544 mg dihydrátu citrátu trojsodného na dávku 1,5 ml. Zásobníky na rekonstituent mohou být například lahvičky o objemu 3 ml, nebo 4 ml, nebo injekční stří20 kačky o objemu 2 ml, nebo měkké plastové vymáčknutelné tobolky pro orální podávání. Jinou možností, jak udržet sterilní složky ve sterilních podmínkách, je konečné autoklávování zásobníku.

(b) rekonstituent A1(OH)₃

Aseptická suspenze hydroxidu hlinitého (My lan ta, zaps. značka) se asepticky naředí sterilní vodou, asepticky se v množství po 2 ml přenese do zásobníků rekonstituentu (například do injekčních stříkaček o objemu 2 ml, nebo do měkkých plastových vymáčknuté Iných tobolek), z nichž každý obsahuje 48 mg Al(OH)s. Jinou možností, jak udržet sterilní složky ve sterilních

3o podmínkách, je ozářit suspenzi hydroxidu hlinitého γ-zářením (s výhodou v naředéném stavu).

K prevenci usazování suspenze se začleňují standardní přísady. Takové standardní přísady zahrnují například stearát hořečnatý, karboxymethylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu a silikonové polymery. Začleněna mohou být i bakteriostatická činidla, například butylparaben, propylparaben nebo jiná standardní bakteriostatická činidla, používaná v potravinách a příchutě.

2. Lyofilizovaný virus s A1(OH)₃ v kapalném prostředku

Pro přípravu dávek viru se používají standardní techniky. Zmražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem Eagle, na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě IO^6,2 ffu/ml. Přidá se suspenze hydroxidu hlinitého k dosažení konečného množství 48 mg/dávku a virový prostředek se naředí lyofilizačním stabilizátorem (4% sacharóza, 8% dextran, 6% sorbitol a 4% aminokyselina) až na cílový titr viru, v tomto případě na 10^5,6 ffu/dávku. Alikvotní množství stabilizovaného virového prostředku o objemu 0,5 ml se asepticky přenesou do lahviček o objemu 3 ml. Lyofilizace a uzavření lahviček se pak provádí stejným způsobem, jaký je popsán v části 1.

3. Lyofilizovaný virus s Al(OH)s pro balení do bii stru

Pro přípravu dávek viru se používají standardní techniky. Zmražená vyčištěná šarže viru se rozmrazí a naředí vhodným médiem, v tomto případě podle Dulbecca modifikovaným médiem Eagle, na požadovanou standardní koncentraci viru, v tomto případě 10⁶’² ffu/ml. Přidá se suspenze hydroxidu hlinitého k dosažení konečného množství 48 mg/dávku a virový prostředek se naředí lyofilizačním stabilizátorem, kterým může být sacharóza, dextran nebo aminokyselina

- 14CZ 302173 B6 v množství 4 %, nebo želatina či rostlinný pepton, anebo xanthan až na cílový titr viru, v tomto případě na 10^5,6 ffu/dávku. K převodu dávek o objemu 0,5 ml nebo s výhodou menším do prohlubní v blistru se používá aseptického plnění. Prostředek se lyofilizuje a prohlubně blistru se uzavřou tepelným zapečetěním.

K prevenci usazování suspenze hydroxidu hlinitého se volitelně začleňují standardní přísady. Takové standardní přísady zahrnují například stearát hořečnatý, karboxymethylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, mikrokrystalickou celulózu a silikonové polymery. Začleněny mohou být i příchutě.

Příklad 5: Virová titrace rotaviru pro různé prostředky

5.1: Srovnání prostředků na základě laktózy a na základě sacharózy

číslo šarže	složení prostředku	virový titr před lyofilizací	virový titr po lyofilizaí a 1 týdnu při 37°C
98G06/01	laktóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	1 o⁵·²²	10⁴·⁶⁷
98G06/03	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny; 2 %	10⁵'²®	10⁴’⁹²

Rotavirus P43 byl formulován buď se sacharózou, nebo s laktózou, jak je znázorněno ve výše uvedené tabulce. Titrace viru před lyofilizací je virový titr v kompletní formulované tekutině (obsahující sacharózu, dextran, sorbitol a aminokyseliny), nepodrobené kroku lyofilizace.

Dobré výsledky jsou takové, v nichž je dosaženo < 0,5 log snížení v kroku lyofilizace a < 0,5 log snížení během „1 týdne při 37 °C“ (urychlený test stability).

Přesnost virové titrace je kolem ± 0,2 log.

Výsledky ukazují, že lze použít sacharózu namísto laktózy.

-15CZ 302173 B6

5.2. Účinek argininu a náhrada sorbitolu manitolem:

čisto šarže	složeni prostředku	virový titr v t=0 po tyofilizaci	virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37.^σΟ
98L16/01	laktóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	10⁴·⁸	10⁴·⁸
98L16/02	laktóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % arginin: 3 %	10⁴'⁸	10⁴’⁹
98L16/04	laktóza: 2 % dextran: 4 % manitol: 3 % aminokyseliny: 2 % arginin: 3 %	10⁴·⁷	10⁵

Výsledky ukazují, že přídavek argininu (o němž je známo, že zlepšuje stálost viru během lyofilizace a rovněž poskytuje zásadité prostředí ke kompenzaci kyselosti žaludku) udržuje vírový titr.

Sorbitol má sklon příliš značně snižovat teplotu sklovatění lyofilizovaného koláče. To lze překoio nat použitím manitolu namísto sorbitolu, jak je ukázáno výše a vírový titr je zachováván.

- 16CZ 302173 Bó

5.3. Různá složení prostředku

Tento pokus prokazuje, že lze vytvořit vetší množství prostředků.

číslo šarže	složení prostředku	virový titr před lyofilizaci	virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37?C
99C11/01	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	10^S'²⁴	1O⁵·⁰⁷
99C11/02	sacharóza: 2 % dextran: 4 % manitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	1 o⁵·⁰⁹	1Q4.92
99C11/04	dextran: 4 % manitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	10⁴'⁸⁹	1O⁵·⁰⁶ --—

číslo šarže	složení prostředku	virový titr v t=0 po lyofilizaci	virový titr po lyofilizac a 1 týdnu při 37 °C
98C17/01	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 %	1O⁵·⁴⁰	10⁵·⁴¹
98C17/02	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol; 1,5 % aminokyseliny: 2 % arginin: 3 %	1O⁵’³⁰	1θ4.93
98C17/03	sacharóza; 2 % dextran: 4 % aminokyseliny: 2 %	10⁵’³¹	10⁵'²⁴

- 17CZ 302173 B6

98C17/04	sacharóza: 2 % dextran: 4 % manitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	10^4,42	10⁴'⁴⁵
98C17/05	sacharóza: 2 % dextran: 4 % manitol: 1,5% aminokyseliny: 2 %	10⁴·³⁹	1O^4,40
98C17/06	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 3 %	10⁶'⁴⁴	10⁴·⁹⁷
98C17/07	sacharóza: 2 % dextran: 4 % sorbitol: 1,5 %	10⁵·¹¹	10⁴'⁸⁹

5.4. Spojení mezi rotavirem a antacidem A1(OH)₃

rotavirus	AI(OH)₃	H₂O	doba styku při tepl. místnosti ;	odstředění	titr vir. supematantu (ffu/ml)	vir. ti peletu (ffu/ml
10⁵·⁶ ffu/ml	48 mg v 0,24 ml	0,76 ml	30 minut	8000 rpm* : 10 minut	10³’⁶⁶
10⁵·⁶ ffu/ml	48 mg v 0,24 ml	0,76 ml	30 minut	8000 rpm 10 minut	10^4,41
10⁵'⁶ ffu/ml		1 ml	30 minut	8000 rpm 10 minut	-JO⁵’⁶⁸
v lyofiliz. koláči	12 mg v 0,12 ml '	1,38 ml I !	30 minut	8000 rpm 10 minut	pod hranicí detekce	10⁴’⁴⁷

*rpm = otáčky za minutu

A1(OH)₃ se používá jako an tací dum. Výsledky ukazují, že rotavirus je asociován (spojen) io s nerozpustnou anorganickou solí /AI(OH)₃/ od doby, kdy je společně s Al(OH)₃ odstřeďován (snížení virové aktivity v supematantu).

-18CZ 302173 B6

5.5. Rozředění antacida (A1(OH)₃ citrátem sodným před titrací viru

I vzorky viru	naředění	podmínky	virové titry (ffu/ml)
99B10/06 kapalný prostředek před lyofilizací; 10^5,43	1,5 ml citrátu trojsodného	24 hodin při teplotě místnosti	10⁵·¹¹
99B10/06 lyofilizovaný 1_θ5.«	1,5 ml citrátu trojsodného	24 hodin při teplotě místnosti	10⁴·⁵³

Pokud je rotavirus asociován s A1(OH)₃, je možné lyofilizovat vše (včetně AI(OH)₃. Po lyofilizaci je možné zpětně získat rotavirus naředěním AI(OH)₃ citrátem sodným. Tento krok rotavirus nepoškozuje a udržuje jeho aktivitu po tomto kroku naředění.

5.6. Infekčnost rotaviru po uvolnění spojení mezi A1(OH)₃ a rotavirem

Mechanismus uvolnění viru (naředěním nosiče) může velmi dobře nastat i v podmínkách /« vivo. Ve skutečnosti se při pH o hodnotě nižší než 6 stává A1(OH)₃ zcela rozpustným a rotavirus tak může být uvolněn do žaludku.

Al(OH)₃ + 3H⁺-> Al~ (vodou rozpustný) + 3 H₂O

V žaludku se ionty trojmocného hliníku neabsorbují (J. J. Powell, R. Jugdaohsingh a R. P. H. Thompson, The Regulation of minerál adsorption in the gastrointestinal tract, Proceedings of the Nutrition Society 58, 147-153, 1999).

V tenkém střevě se, vzhledem ke vzrůstu pH, nerozpustné formy hliníku vysrážejí /A1(OH)₃ nebo AlPOV a eliminují se přirozeným způsobem.

Není známo, jestli bude nově vzniklá sraženina A1(OH)₃ (nebo AIPO₄) schopna reasociace (opětovného spojení) s rotavirem. To vyvolává otázku účinnosti samotného spojení Al(OH)₃ - rotavirus.

Možné je rovněž uvolnění rotaviru se spojení AI(OH)₃ - rotavirus jinými mechanismy. Například lysin zasahuje do adsorpce viru na A1(OH)₃. Specifická adsorpce na hydroxid hlinitý je známa i u jiných aniontů, jako je boritanový, síranový, uhličitanový a fosforečný aniont a tedy teoreticky by mělo být možné uvolnit (kompetici a adsorpční místo) rotavirus ze spojení A1(OH)₃ - rotavirus.

- 19CZ 302173 B6

DRVC003A46 +

mg AI(OH)₃v 0,120 ml +

mg lysinu

1,280 ml H₂O + minut při tepl. místnosti + odstředění

000 ot/min, 10 minut

kulot supematant +

naředění citrátem pod hranicí detekce 3,8

Rotavirus tedy může být ze spojení AI(OH)₃ - rotavirus uvolněn a uvolněný rotavirus zůstává aktivní.

Toto uvolnění může být provedeno buď naředěním A1(OH)₃ (HCI v žaludku nebo in vitro pomocí troj sodného citrátu), nebo nahražením rotaviru zásaditou aminokyselinou (lysinem).

5.7. lnfekěnost spojení Al(OH)₃ - rotavirus

Jedna dávka lyofilizovaného rotaviru byla rekonstituována vodou a rozdělena do dvou částí. K první části, považované za srovnávací, byl přidán ještě jeden objem vody. Ke druhé části bylo přidáno 24 mg Al(OH)₃, suspendovaného v 0,240 ml vody (preklinická titrace viru).

DRVC003A46

1,5ml H₂O

0,750 ml	0,750 ml
+	+
0,240 ml H₂O	24 mg Al(OH)₃v 0,240 ml
1 hodina	1 hodina
5,55	6,22

-20 CZ 302173 B6

Pokud je A1(OH)₃ přítomen, rotavirus je aktivní a hodnota virové titrace je ve srovnání se srovnávacím vzorkem vyšší.

Tento pokus byl opakován bez rozdělení lyofilizované dávky, přidáním 12 mg AI(OH)₃ nebo 24 mg A1(OH)₃.

Zde byl srovnávacím vzorkem jeden ze vzorků, rekonstituovaný citrátovo-hydrogenuhličitanovým pufrem. Virový titr je tedy opět vyšší v přítomnosti A1(OH)₃.

DRVC003A46

1,5 ml WL pufru mg AI(OH)₃v 0,120 ml mg Al(OH)₃v 0,240 ml

1,380 ml H₂O

1,260 ml H₂O

5,34

5,32

6,24

5,95

6,05

6,26

Stejně jako ve výše uvedeném příkladu se rotavirus spojuje (asociuje) s částicemi A1(OH)₃, neboť virus lze oddělit odstředěním. DRVC003A46 je lyofilizovaný formulovaný rotavirus (sacharóI5 za 2 %, dextran 4 %, sorbitol 3 %, aminokyseliny 2 %).

-21 CZ 302173 B6

DRVC003A46

DRVC003A46 mg AI(OH)₃v 0,120 ml mg AI(OH)₃v 0,240 mt

1,380 ml H₂O +

1,260 ml H₂O +

odstředění 8 000 ot./min 10 minut odstředění 8 000 ot./min 10 minut

kulot supematant +

1,5 ml

SDSAA kulot supematant

1,5 ml SDSAA

5,78 <1,44

5,96 <1,44

5,92 <1,44

6,11 <1,44

SDSAA = 2 % sacharóza, 4 % dextran, 3 % sorbitol, 2 % aminokyseliny s Podle vírové titrace prováděné v supematantu se zdá, že množství AI(OH)₃, potřebné k adsorbo vání rotaviru, je malé (počínaje jednou lyofilizovanou dávkou 5,7 log) za zvyšování virové titra ce:

-22CZ 302173 B6

AI(OH),.	adsorpční doba	titr v supematantu

12 mg	1 hodina při tepl. místnosti	2,7
24 mg	1 hodina při tepl. místnosti	3,4
48 mg	1 hodina při tepl. místnosti I	3,4
72 mg	1 hodina při tepl. místnosti	2,0
96 mg	1 hodina při tepl. místnosti	pod hranicí detekce

12 mg	přes noc	2,7
24 mg	přes noc	pod hranicí detekce
48 mg	přes noc	2,5

12 mg	okamžitě	pod hranicí detekce
24 mg	okamžitě	2,0
48 mg	okamžitě	pod hranicí detekce

Doba, potřebná k adsorpci rotaviru na A1(OH)₃ se zdá být krátká.

Jedna dávka lyofilizovaného rotaviru byla rekonstituována v přítomnosti 24 mg A1(OH)₃ a odstředěna po 0, 15, 60 minutách a po 24 hodinách. Kulot byl resuspendován v SDSAA před titrací viru:

doba	kulot	supematant
0 min	5,26	3,17
15 min	5,34	< 1,44
60 min	5,96	< 1,44
24 h	6,13	< 1,44

5.8 Použití CaCO₃ jako antacidu

K vyloučení přítomnosti hliníku z vakcíny byl antacid A1(OH)₃ nahrazen jinou nerozpustnou anorganickou solí: uhličitanem vápenatým CaCO₃.

Jevy, pozorované za přítomností CaCO₃ jsou obdobné jevům, popsaným za použití AI(OH)₃:

-23CZ 302173 B6

- asociace (spojení) rotaviru s anorganickou solí;

- udržení aktivity rotaviru při jeho asociaci s anorganickou solí;

- možnost uvolnění rotaviru z asociace rozpuštěním anorganické zásady kyselinou;

- možnost společné lyoťilizace antacidu a rotaviru.

Asociace CaCOi a rotaviru

V prvním zkušebním vzorku byl lyofílízovaný rotavirus (virový titr 5,7) rekonstituován suspenzí CaCO- ve vodě (50 mg v 1,5 ml); poté byl odstředěn a virový titr supematantu byl srovnán in s kulotem.

DRVC003A46

DRVC003A46 mg CaCO₃v 1,5 ml H₂O odstředění 8 000 ot./min 10 minut

S X kulot supematant +

1,5 ml

SDSAA

5,83 4,46 mg CaCO₃v 1,5 ml H₂O odstředění 8 000 ot./min 10 minut

XX kulot supematant +

1,5 ml citrátu sodného

5,88 4,33

Tyto výsledky ukazují, že více než 90 % rotaviru je asociováno s CaCO₃.

Rovněž po asociaci viru bylo možné uskutečnit titraci a znovu získat původní množství viru. Také virové titry byly poněkud vyšší než titry, získané bez přítomnosti CaCO₃.

-24CZ 302173 B6

DRVC003A46 +

1,5 ml H₂O

DRVC003A46 +

1,5 ml pufru W.L odstředění 8000 ot./min 10 minut / X kulot supernatant

4,99 5,03

5,35

Množství CaCO₃ a asociace rotaviru

Lyofílizovaný rotavirus byl rekonstituován suspenzí CaCO₃ ve vodě (1,5 ml): 10 mg 50 mg 100 mg a poté odstředěn; virový titr supematantu byl srovnán s kulotem.

io

CsC O β	přípr. dle popisu a odstředění	1 hodina + odstředění
	kuloty	supernatant	kuloty	supernatant
100 mg	4,57	3,01	4,79	3,09
50 mg	4,17	4,15	4,22	3,86
10 mg	3,17	4,77	3,87	4,87

Je zřejmé, že s rostoucím množstvím CaCO₃ se asociuje více viru a méně se nalézá v supematantu. Ovšem plná dávka není zcela získána (očekávané množství přinejmenším 5,3 nebo dokonce 5,8 jak bylo získáno dříve - viz výše).

Ochrana rotaviru pomocí CaCO₃ během titrace antacidu typu „mini Rossett-Rice“

Za použití deseti dávek lyofilizovaného rotaviru (DRVC003A46) a 50 mg CaCO₃ byly provedeno ny dva typy titrace „mini Rossett-Rice“:

V klasické titraci „Rossett-Rice“ se antacid smísí s rotavirem a do tohoto média se vlije HCI.

V „inversní“ mini titraci Rossett-Rice je situace opačná: antacid se přikapává do zásobní HCI 25 (jak k tomu dochází in vivo).

-25CZ 302173 B6

klasická mini titrace Rossett-Rice
lyofiliz. Rota, skladování při:	pufr	teoretický virový titr	naměřený virový titr
4 °c	60 mg CaCO₃	5,3	4,6
-80 °C	60 mg CaCO₃	5,3	4,6
4 °C	24 mg AI(OH)₃	5,4	< 2,9
-80 °C	24 mg AI(OH)₃	5,4	< 2,9

inversní mini titrace Rossett-Rice
lyofiliz. Rota, skladování při:	pufr	teoretický virový titr	naměřený virový titr
4 °C	60 mg Ca CO ₃	5,3	4,6
-80 °C	60 mg CaCO₃	5,3	4,6
4 °C	24 mg AI(OH)₃	5,4	< 2,9
-80 ^ŮC	24 mg AI(OH)₃	5,4	< 2,9

V tomto pokusu v uspořádání in vivo je tedy uhličitan vápenatý schopný chránit přibližně 20% 5 rotaviru před přítomností HCl, zatímco hydroxid hlinitý toho schopen není.

-26CZ 302173 B6

5.9: Lyofil izace rotaviru v přítomnosti antacidu CaCO₃:

číslo šarže	složení prostředku	virový titr v t=0 po lyofilizaci	virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37°C
99K08/01	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % CaCO₃; 50 mg	10⁵·²⁸	10⁵'¹⁰
99K08/02	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny; 2 % CaCO₃: 60 mg	10⁵'¹⁶	10=.15 i
] 00C24/01	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃. 60 mg xanthan: 0,3 %	1₀5,07	i 10*69
00C24/03	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg xanthan: 0,3%	1O⁵'⁰⁷	10⁴'⁸⁵
00E09/25	sacharóza; 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg xanthan: 0,25 %	1O⁵’⁰³	10*.91

-27 CZ 302173 B6

00E09/30	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg _; 1 xanthan: 0,3%	1O⁵·⁰¹ 1 i	10⁴·⁸⁷ I i
00F26/06	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg škrob: 2 %	1O⁴'⁵⁰	1O⁴⁷⁰

Zde se jedná o uspořádání „vše v jednom“ - lyofilizace rotaviru a antacidu CaCCC společně v jedné lahvičce. K prevenci usazování CaCO? během kroku plnění jsou potřeba viskózní činidla.

Příklady takových viskózních činidel zahrnují xanthanovou gumu a škrob. Aktivita rotaviru je uchovávána i v přítomnosti xanthanové gumy a škrobu.

5.10. Lyofilizované tablety pro rychlý rozpad po vložení do úst:

o Následující prostředky dokládají koncept „lyoc“, což je rychlé rozpuštění lyofilizovaného koláče v ústech.

č. šarže	složení prostředku	virový titr před lyofilizací	virový titr po lyofilizací a 1 týdnu při 37 °C
99B10/06	sacharóza: 4% glutamát Na: 3,7 % AI(OH)₃ : 48 mg	₁₀5.’1	_W4.53
99C11/12	maltitol: 3% Al{OH)₃ : 48 mg hydroxypropylmethyl celulóza: 1 %	1Q4.18	10³'⁷⁹

-28 CZ 302173 B6

číslo šarže	složení prostředku	virový titr v t=0 po lyofilizaci	virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37 °C
0OC24/O5	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg xanthan: 0,3 %	10⁵’⁰²	104.M
OOC24/06	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 % CaCO₃: 60 mg xanthan: 0,3 %	₁₀4,86	10⁴’⁵⁶
00F26/11	sacharóza: 1% dextran: 2 % sorbitol: 1,5 % aminokyseliny: 1 % CaCO₃: 60 mg škrob: 2 %	1O⁴·⁷⁰	1O⁴·⁴⁰

V „konceptu lyoc“ je možné použít jak škrob, tak i xanthanovou gumu (za udržení rychlého rozpouštění lyofílizovaného koláče).

Příklad 6: Použití uhličitanu vápenatého jako antacida pro rotavirový vakcinační prostředek

Pokud se jako antacidum pro rotavirus použije suspenze CaCO₃ ve vodě, objevuje se problém, že io částice uhličitanu vápenatého se ve vodě rychleji usazují, neboť hodnota hustoty prášku se blíží

2,6 a průměrná velikost částic činí 30 pm.

Toto usazování lze zpomalit:

1. Zvýšením hustoty okolního média.

2. Zvýšením viskozity okolního média.

3. Snížením velikosti částic.

4. udržováním částic oddělené od sebe navzájem.

-29CZ 302173 B6

6.1. Zvýšení hustoty okolního média

Pokud se na lyofilizovaný koláč (obsahující 2% sacharózu, 4% dextran, 3% sorbitol a 2% aminokyseliny) nanese suspenze CaCO₃ ve vodě (umístěná v injekční stříkačce), zvýší se hustota okolního média, ovšem rychlost usazování CaCO₃ se příliš neliší od suspenze CaCCl· ve vodě.

6.2. Zvýšení viskozity okolního média

Pseudoplastické pomocné látky

Pseudoplastický roztok je definován jako roztok, mající vyšší viskozitu při stání než viskozitu při protřepávání.

Obvyklými pomocnými látkami tohoto typu jsou:

- přírodní polymery, například:

arabská guma adragantová guma agar algináty pektiny

- poIosyntetické polymery, například:

karboxymethylcelulóza (Tyloses C^) methylcelulóza (Methocels Viscotrans MC*\ Ty lose MH* a MB^W) hydroxypropylcelulóza (Klucels^) hydroxypropylmethylcelulóza (Methocels E^ll° a ΚΛ, Viscotrans MPH^K)

Obecně sc tyto pseudoplastické pomocné látky používají společně s tixotropními činidly. Pseudoplastické pomocné látky s nízkou kapacitou tekutosti

Takové polymery, v dostatečné koncentraci, umožňují vznik uspořádání strukturované tekutiny, výsledkem čehož je roztok o vysoké viskozitě, mající při stání nízkou kapacitu tekutosti. K umožnění toku a převádění je pak potřeba vynaložit určité množství energie.

K dočasnému zrušení uspořádání strukturované tekutiny pro získání tekutého roztoku jsou potřebné vnější energie (protřepávání).

Příklady takových polymerů jsou látky Carbopols“¹ a xanthanová guma.

Tixotropní pomocné látky

S těmito pomocnými látkami se stáním získá gelová struktura, zatímco při protřepávání se získá tekutý roztok.

Příklady tixotropních pomocných látek jsou: Veegum“ (křemičitan hořečnato-hlinitý) a Avicel RC^X (přibližně 89 % mikrokrystalické celulózy a 11 % sodné karboxymethylcelulózy).

6.3. Snížení velikosti částic

Výsledkem snížení velikosti částic CaCO₃ je snížení antacidní kapacity sloučeniny.

-30CZ 302173 B6

6.4. Udržování částic odděleně od sebe navzájem

To je případ látek Veegum® a Avicel®, u nichž jsou nerozpustné částice (přibližně o rozměru 1 mm), menší než částice CaCO₃, umístěny mezi částice CaCO₃ k prevenci agregace (vytváření sraženin).

Příklad 7: Vzhled výrobku io Následující schémata dokládají příklady možných vzhledů výrobku

7.1. CaCO₃ v injekční stříkačce

Poté, co byly klinické šarže rotaviru umístěny do lyofilizovaných lahviček, lze antacid umístit do is kapalného rekonstituentu, obsaženého v injekčních stříkačkách.

inj. stříkačka s 1,3 ml

CaCO₃ (60 mg x ml'¹) jehla

lyofilizovaný rotavirus

U tohoto předkládání produktu musí být usazování CaCO₃ pod kontrolou nejen během kroků 20 plnění, ale i během celé doby skladování produktu (alespoň 2 roky).

7.2. CaCO₃ v lyofilizované lahvičce inj.stříkačka s 1,3 ml vody

jehla lyofilizovaná lahvička rotavirus +

CaCO₃ (60 mg) xanthan

-31 CZ 302173 B6

7.3. Lyofilizace v blistru

V tomto případě se rotavirus, CaCOi a xanthanová guma lyofilizují společné přímo v blistru.

Příklad 8:

Lyofilizace různých kmenů rotaviru

č.šarže	kmen rotaviru	složení prostředku	virový titr v t=0 po lyofilizaci	virový titr po lyofilizaci a 1 týdnu při 37 °c
00F26/01	G1 SB vyčišť.č. 61 PRO/0232	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3% aminokyseliny: 2 %	10⁴·⁶	10⁴·⁷
OOF26/02	G2 (DS-1)	sacharóza: 2% dextran: 4 % sorbitol: 3 % aminokyseliny: 2 %	io⁴·⁴	10⁴'⁴

Kmeny DS-1, Pa VA70jsou popsány jako srovnávací kmeny lidského rotaviru pro sérotyp G2, G3 a G4 na straně 1361 ve „Fíelds“, Raven Press 1990, druhé vydání.

V tomto pokusu byly lyofilizovány různé kmeny rotaviru.

Bylo ukázáno, že u všech šarží byly jak virový titr, tak i stálost za urychlených podmínek (1 týden při 37 °C) během lyofilizace udržovány.

Příklad 9: Fáze I bezpečnostní studie orálního podání jedné dávky rotavirové vakcíny u dospělých

Fáze I této studie byla prováděna ke stanovení bezpečnosti a reaktivnosti jedné orálně podávané 25 dávky IO^Ó'° ffu vakcíny P43 zdravým dospělým lidem ve věku 18 až 45 let.

Klinický test byl dvojitě slepý a randomizovaný (na základě náhodnosti). Byl kontrolován placebem a samostatný. Studie byla prováděna v jediném centru v Belgii.

Studovaná populace

Přihlášeno bylo celkem 33 subjektů, 11 ve skupině dostávající placebo a 22 ve skupině, dostávající vakcínu a všichni studii dokončili. Veškeří dobrovolníci byli běloši. Jejich průměrný věk v době vakcinace byl 35,3 roky, v rozmezí od 18 do 44 let. Test započal v lednu a probíhal po dobu právějednoho měsíce.

-32CZ 302173 Bó

Materiál

Vakcína

Vyrobena byla klinická množství vakcíny P43, která byla vyčištěna, formulována a lyofilizována podle zásad Správné výrobní praxe (Good Manufacturin Practices). Množství byla podrobena Kvalitativní kontrole a získala Záruku kvality. Každá lahvička vakcíny obsahovala následující složky:

io aktivní přísada:

kmen P43 minimálně 10⁵’⁸ ffu pomocné látky, stabilizátory:

sacharóza 9 mg dextran 18 mg sorbitol 13,5 mg aminokyseliny 9 mg placebo

Vyrobeny a poskytnuty byly lahvičky sobsahem placeba, přičemž každá žních obsahovala následující složky:

pomocně látky, stabilizátory:

sacharóza 9 mg dextran 18 mg sorbitol 13,5 mg aminokyseliny 9 mg

3o Ředidlo

Jako ředidlo k rekonstituování vakcíny a placeba byla použita voda pro injekce.

Podávání

Přibližně 10 až 15 minut před podáním vakcíny nebo placeba dostaly subjekty v obou skupinách orálně 10 ml přípravku Mylanta®. Mylanta® je zapsaný (registrovaný) antacid. Antacid zvyšuje pH v žaludku a předchozí inaktivaci rotaviru během jeho průchodu žaludkem.

K přípravě vakcíny byly dvě lahvičky lyofilizovaného P43, obsahující 10⁵⁸ ffu na lahvičku, rekonstituovány 1,5 ml ředicí vody pro injekce. Tím bylo dosaženo vypočítaného virového titru IO^6,1 ffu na dávku. Rekonstituovaná vakcína byla ihned podávána v jedné orální dávce.

K přípravě placeba byly dvě lahvičky lyofilizovaného placeba rekonstituovány 1,5 ml vodou pro injekce a podávány orálně jako jedna dávka.

Bezpečnost a reaktivita

Použita byla následující kritéria bezpečnosti a reaktivnosti:

- Obecnými navozenými příznaky byly horečka, průjem, zvracení, nevolnost, bolesti břicha a ztráta chuti k jídlu. Byly zaznamenávány během osmi dnů po podání.

- Nenavozené příznaky byly zaznamenávány během 30 dnů po podání.

-33 CZ 302173 B6

- Vážné vedlejší účinky byly zaznamenávány během celého období průběhu studie.

- Vzorky průjmu bylo třeba shromažďovat osmi dnů po podání.

Výsledky byly následující:

Během jednotlivých sledovaných období nebyly zaznamenány žádné navozené příznaky, žádné nenavozené příznaky ani žádné vážné vedlejší účinky.

Nebyly zaznamenány žádné případy průjmu, io

Závěry:

Vakcína SB Biologicals P43 byla bezpečná ve srovnání s placebem při podání orální cestou ve dvojitě slepém uspořádání v podobě jedné dávky a v dávce 10^6J ffu zdravým dospělým dobro15 volníkům ve věku 18 až 44 let.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Oslabená populace lidského rotaviru, vyznačující se tím, že zahrnuje jedinou variantu nebo v podstatě jedinou variantu, přičemž uvedená varianta je definována nukleotidovou

25 sekvencí, kódující alespoň jednu z hlavních virových bílkovin, označovanou jako VP4 a VP7.
2. Populace rotaviru podle nároku 1, vyznačující se tím, že je klonovaným kmenem.

30
3. Populace rotaviru podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je odvozena od infekce lidského rotaviru.
4. Populace rotaviru podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se replikuje u lidí a je jimi vylučována.
5. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků laž 4, vyznačující se tím, že v podstatě jedinou variantou je varianta, v níž gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jednu z následujících bází: adeninovou bázi A v poloze 788, adeninovou bázi A v poloze 802 a thyminovou bázi T v poloze 501 od startovacího kodonu.
6. Populace rotaviru podle nároku 5, vyznačující se tím, že gen VP4 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující adeninovou bázi A v polohách 788 a 802 a thyminovou bázi T v poloze 501 od startovacího kodonu.

45
7. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků lažó, vyznačující se tím, že v podstatě jedinou variantou je varianta, ve které gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující alespoň jednu z následujících bází: tbymin T v poloze 605, adenin A v poloze 897 a guanin G v poloze 897 od startovacího kodonu.

50
8. Populace rotaviru podle nároku 7, vyznačující se tím, že gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující thymin T v poloze 605 a adenin A nebo guanin G v poloze

897 od startovacího kodonu.
9. Populace rotaviru podle nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že gen VP4 zahrnuje

55 nukleotidovou sekvenci, obsahující adenin A v polohách 788 a 802 a thymin T v poloze 501 od

-34CZ 302173 B6 startovacího kodonu; a gen VP7 zahrnuje nukleotidovou sekvenci, obsahující thymin T v poloze

605 a adenin A v poloze 897 od startovacího kodonu.
10. Rotavirus, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, kóduj ící

5 bílkovinu VP4, kde nukleotidové sekvence odpovídá obr. 1 a/nebo nukleotidovou sekvenci, kódující bílkovinu VP7, kde nukleotidové sekvence odpovídá obr. 2.
11. Populace rotaviru podle kteréhokoliv z nároků 1 az 10, vyznačující se tím, že je označována jako P43 aje uložena pod přírůstkovým číslem ECACC 99081301.

io
12. Varianta rotaviru označovaná P43 a uložená v Evropské sbírce živočišných buněčných kultur pod přírůstkovým číslem 99081301, potomstvo rotaviru a imunologicky aktivní deriváty rotaviru a materiály z něho získané.

15
13. Rotavirový reasortant, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen, nebo alespoň jeden segment rotavirové varianty P43 podle nároku 11 nebo nároku 12.
14. Způsob výroby vyčištěné lidské rotavirové populace, zahrnující v podstatě jedinou variantu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky v nichž se:

20 pasážuje rotavirový preparát na vhodné buněčné linii;

volitelně zvolí homogenní kultura za použití kroků bud’; limitního zředění; nebo izolace jednotlivého plaku; a ověří přítomnost v podstatě jediné varianty sekvenováním vhodné oblasti genové sekvence VP4

25 a/nebo VP7.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se rotavirový preparát pasážuje na primárních buňkách opičích ledvin AGMK.

so
16. Způsob podle nároku 14 nebo 15, v y z n a č u j í c í se tím, že rotavirový preparát má charakteristiky kmene 89-12, nebojeho derivátu.
17. Způsob podle kteréhokoli z nároků 14 až 16, vyznačující se tím, že zahrnuje přídavný krok působení etherem k odstranění nahodilých kontaminujících činidel, citlivých vůči

35 etheru.
18. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje živý oslabený virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, smíšeným s vhodným farmaceutickým nosičem nebo s adjuvans.
19. Vakcinační prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že je upravený pro orální podávání.
20. Vakcinační prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že živý oslabený

45 virus je formulován s antacidním prostředkem.
21. Vakcinační prostředek podle nároku20, vyznačující se tím, žeantacidní prostředek zahrnuje organický antacid.

50
22. Vakcinační prostředek podle nároku 21, vyznačující se tím, že antacidem je citrát sodný.
23. Vakcinační prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že antacidní prostředek zahrnuje anorganický antacid.

-35CZ 302173 B6
24. Vakcinační prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že antacidem je hydroxid hlinitý.
25. Vakcinační prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že antacidem je uhličitan vápenatý.
26. Vakcinační prostředek podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále obsahuje viskózní činidlo.
27. Vakcinační prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že viskózním činidlem je xanthanová guma.
28. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že živý oslabený virus je formulován s uhličitanem vápenatým a xanthanovou gumou a rekonstituován vodným roztokem.
29. Vakcinační prostředek podle kteréhokoliv z nároků 20 až 28, vyznačující se tím, že živý oslabený virus je formulován s antacidním prostředkem a lyofilizován v blistrovém balení.
30. Vakcinační prostředek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 29, vyznačující se tím, že virus je v lyoťilizované formě.
31. Vakcinační prostředek podle nároku 30, vyznačující se tím, že živý oslabený virus a antacidní prostředek jsou přítomné před podáváním v oddělených zásobnících pro přípravky, jako je kapalný vakcinační prostředek.
32. Vakcinační prostředek podle nároku 30, vyznačující se tím, že živý oslabený virus a antacidní prostředek jsou před podáváním přítomné ve stejném zásobníku pro přípravek jako lyofilizovaný vakcinační prostředek, který má být rekonstituován vodným roztokem.
33. Způsob výroby rotavirové vakcíny podle kteréhokoli z nároků 18až32, vyznačující se t í m , že zahrnuje kroky, v nichž se smísí oslabený lidský rotavirus s vhodným farmaceutickým nosičem nebo adjuvans.
34. Použití oslabeného lidského rotaviru při přípravě vakcíny podle kteréhokoli z nároků 18 až 32 pro prevenci rotavirové infekce u lidského subjektu.
35. Vakcinační formulace podle kteréhokoli z nároků 18 až 32 pro použití v lékařství.