ES2294801T3

ES2294801T3 - Formulaciones de vacunas contra rotavirus.

Info

Publication number: ES2294801T3
Application number: ES97944477T
Authority: ES
Inventors: Carl J. Burke; David B. Volkin
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2017-09-26
Also published as: JP4653262B2; AU4596397A; EP1891968A2; EP0939648B1; DE69738271D1; WO1998013065A1; CA2266486C; AU739916B2; EP1891968A3; PT939648E; ATE377428T1; CA2266486A1; JP2002500622A; EP0939648A1; DK0939648T3; DE69738271T2

Abstract

Una formulación de vacuna líquida para rotavirus que comprende: (Ver tabla)

Description

Formulaciones de vacunas contra rotavirus.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con nuevas formulaciones líquidas de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación.

Antecedentes de la invención

Los rotavirus (RV) provocan gastroenteritis aguda, una enfermedad que requiere hospitalización de niños y jóvenes en países desarrollados, y es una causa frecuente de muerte en niños menores de 5 años de edad en regiones en desarrollo del mundo. Los estudios en Estados Unidos, Australia, y Japón han demostrado que entre el 34 y el 68% de las hospitalizaciones de niños por enfermedad diarreica aguda están asociados con infección por rotavirus. La frecuencia de hospitalización para gastroenteritis por rotavirus en una organización de servicios sanitarios en Estados Unidos se estimó que era de 222 por 100.000 en niños de 13 a 24 meses de edad, y de 362 por 100.000 en aquellos de menos de un año. La infección con rotavirus estaba asociada con el 63% de todas las hospitalizaciones por diarrea aguda en esta población pediátrica. Una revisión de los datos de mortalidad en Estados Unidos desde 1973 a 1983 indicaba que ocurrían 500 muertes por año en niños menores de 4 años debido a enfermedades diarreicas, y que del 20 al 80% del exceso de muertes en invierno debido a diarrea en Estados Unidos están asociadas con infecciones por rotavirus. Los rotavirus también son responsables de una parte sustancial de la mortalidad asociada con enfermedades diarreicas en países del tercer mundo. Una vacuna eficaz para rotavirus, por lo tanto, tendría un impacto fundamental sobre la salud de niños en áreas desarrolladas y en desarrollo del mundo.

Los rotavirus tienen una cápsida interna y externa con un genoma de ARN de doble hebra formado por once segmentos génicos. Se han definido múltiples serotipos mediante ensayos de neutralización por reducción de placas, y estudios sobre virus reordenados han demostrado que dos proteínas de la cápsida externa, VP7 y VP4, son las determinantes del serotipo del virus. La proteína VP7 se codifica mediante el segmento génico 7, el segmento génico 8 o el segmento génico 9 de un rotavirus humano particular. La localización del gen que codifica para VP7 puede determinarse para cada rotavirus específico por procedimientos experimentales convencionales. La proteína VP4 es una proteína estructural superficial principal de 88.000 dalton del producto del gen 4 de un rotavirus. Al igual que VP7, funciona como un antígeno específico para el serotipo principal, siendo operativa en ensayos de neutralización de suero (SN), capaz de inducir un anticuerpo neutralizante específico del serotipo, y capaz de, en un sistema de ratón, inducir protección inmune específica del serotipo contra la enfermedad por rotavirus. En algunas referencias anteriores, la VP4 se denominaba VP3. Desde 1988, un cambio de nomenclatura, dio como resultado la referencia más apropiada a esta proteína como VP4.

Como los segmentos génicos que codifican las proteínas VP7 y VP4 se segregan independientemente, se ha propuesto que la nomenclatura de los serotipos incluya el tipo G, determinado por VP7, y el tipo P, determinado por VP4. La mayoría de las infecciones humanas por rotavirus en Estados Unidos están provocadas por virus de los tipos G 1, 2, 3 ó 4, y tipos P 1, 2 ó 3. Sin embargo, otros tipos de rotavirus humanos, incluyendo por ejemplo, el tipo G9, están más extendidos en Asia, Europa y ciertos países del tercer mundo.

Numerosos rotavirus animales están atenuados en seres humanos, y se han evaluado como vacunas vivas potenciales para rotavirus, incluyendo el serotipo G6 del rotavirus bovino WC3. Se demostró que el virus para la vacuna WC3 era inmunógeno y no reactogénico en niños, aunque era inconsistente para proporcionar inmunidad protectora contra infección por rotavirus humano. Se ha sugerido que es necesario que la inmunidad específica del serotipo incluya protección consistente contra diarrea por rotavirus.

La Publicación de Patente Europea Nº 0 065 905, publicada el 1 de diciembre de 1982, describe un agente estabilizador para vacunas virales constituido por PBS que contiene iones calcio y magnesio, que además contiene lactosa, sorbitol y al menos un aminoácido del grupo que incluye histidina, alanina, valina, treonina, arginina, metionina, hidroxiprolina, lisina, isoleucina, fenilalanina y serina.

La Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/01784, publicada el 6 de febrero de 1992, describe procedimientos de producción de vacunas para rotavirus.

Existe una necesidad en la técnica de vacunas eficaces que proporcionen inmunidad protectora contra la infección por rotavirus y los graves síntomas clínicos asociados con la misma.

Para la distribución mundial de las vacunas para rotavirus, es necesario formular vacunas que sean estables en diversas condiciones ambientales. Los componentes usados para estabilizar las vacunas son conocidos. Sin embargo, las formulaciones particulares de componentes útiles para estabilizar vacunas para rotavirus deben determinarse experimentalmente. Un objeto de la presente invención es presentar formulaciones que estabilizan las vacunas para rotavirus.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevas formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Efecto de las combinaciones tampón sobre la estabilidad del rotavirus a 37ºC durante 1 semana. Los datos para el reordenado G1 se muestran en el panel A y para el reordenado P1 en el panel B. Todos los valores se expresan como pfu/ml normalizado a la muestra de referencia, o del día 0. Las combinaciones tampón se representan de la siguiente manera: citrato sódico 0,05 M + bicarbonato sódico 0,15 M (\Box), citrato sódico 0,05 M + fosfato sódico 0,15 M (\medcirc), ácido láctico 0,05 M + bicarbonato sódico 0,15 M (\Delta), ácido láctico 0,05 M + fosfato sódico 0,15 M (\nabla) y succinato sódico 0,20 M + fosfato sódico 0,05 M (\lozenge). Todas las formulaciones tienen valores de pH de 7.

Figura 2. Capacidad de neutralización de ácido de las formulaciones tampón comparadas con bicarbonato. Se valoró un ml de cada tampón con HCl 0,01 N. Símbolos: bicarbonato sódico 0,4 M (\bullet), citrato sódico 0,1 M + fosfato sódico 0,3 M (\medcirc), citrato sódico 0,1 M + bicarbonato sódico 0,3 M (+), y succinato sódico 0,2 M + fosfato sódico 0,1 M (\nabla).

Figura 3. Datos de estabilidad para rotavirus reordenado en formulaciones líquidas de sacarosa al 5%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M después de almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B.

Figura 4. Datos de estabilidad para rotavirus reordenado en formulaciones líquidas de sacarosa al 50%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M después de almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B.

Figura 5. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas del rotavirus G1 con mayores concentraciones de tampón, sacarosa, y gelatina hidrolizadas a diversas temperaturas. El panel A muestra datos para el rotavirus G1 en medio de Williams' E ("WE"), sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, y fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en medio de Williams' E, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M, y fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra datos para el rotavirus G1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M, y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra datos para el rotavirus G1 en medio de Williams' E, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, fosfato sódico 0,1 M, y gelatina hidrolizada al 5%.

Figura 6. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas del rotavirus P1 con mayores concentraciones de tampón, sacarosa, y gelatina hidrolizada a diversas temperaturas. El Panel A muestra datos para el rotavirus P1 en medio de Williams' E, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, y fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en medio de Williams' E, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M, y fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra datos para el rotavirus P1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M, y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra datos para el rotavirus P1 en medio de Williams' E, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, fosfato sódico 0,1 M, y gelatina hidrolizada al 5%.

Figura 7. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas del rotavirus en sacarosa al 50%, succinato sódico 0,1 M, y fosfato sódico 0,05 M después de almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G2 se muestran en el panel A y para G3 en el panel B.

Figura 8. Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas del rotavirus G1 después de almacenamiento a diversas temperaturas. El panel A muestra datos para el rotavirus G1 dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para la vacuna dializada antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra datos para el rotavirus G1 diluido en fosfato antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico
75 mM.

Figura 9. Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas del rotavirus P1 después de almacenamiento a diversas temperaturas. El panel A muestra datos para el rotavirus P1 dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para la vacuna dializada antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra datos para el rotavirus P1 diluido antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%, y fosfato sódico 75 mM.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevas formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación. Más particularmente, la invención se refiere a estabilizar formulaciones para vacunas líquidas para rotavirus. Además, algunas de estas formulaciones pueden suministrarse por vía oral con o sin pre-neutralización de ácido gástrico, ya que algunas de las formulaciones contienen altos niveles de componentes tamponantes.

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Debido a la distribución mundial de vacunas y a la diversidad de temperaturas ambiente, es necesario formular vacunas de manera que sean estables en diversas condiciones ambientales. Se han usado diversos procedimientos de estabilización. Estos incluyen los siguientes:

a) Bajas temperaturas (-10ºC a -70ºC). La mayoría de las vacunas son estables durante el almacenamiento a temperaturas extremadamente bajas. Sin embargo, las instalaciones de almacenamiento a baja temperatura son costosas y no siempre están disponibles; esto limita la utilidad y el sentido práctico de este enfoque.

b) Liofilización. Las vacunas secadas por congelación son razonablemente estables y pueden almacenarse a 2-8ºC durante una cantidad de tiempo predefinida. La liofilización, sin embargo, puede dar como resultado una pérdida de título viral durante el secado, reduciendo de esta manera el rendimiento del procedimiento de fabricación. Además, durante el almacenamiento a largo plazo, una vacuna liofilizada aún puede deteriorarse, hasta el punto de que puede tener o no el suficiente título para conferir inmunización. Adicionalmente, como una vacuna liofilizada requiere reconstitución antes de su uso, una preparación líquida reconstituida puede perder potencia mientras que permanece a temperatura ambiente antes de su uso. Esta pérdida de título durante la reconstitución puede dar como resultado también un título insuficiente para conferir inmunidad.

c) Estabilizadores. Estos son compuestos químicos específicos que interaccionan y estabilizan moléculas biológicas y/o excipientes farmacéuticos generales que se añaden a la vacuna y se usan junto con procedimientos de almacenamiento a menor temperatura o de liofilización.

Estas formulaciones pueden prepararse por (1) dilución del grueso de la vacuna en el estabilizador, (2) diálisis/diafiltración en el estabilizador, o (3) concentración del grueso de la vacuna y diafiltración en el estabilizador, seguido de liofilización si fuera necesario.

La composición estabilizadora de la presente invención contiene los siguientes ingredientes aproximadamente en las cantidades indicadas. Por conveniencia, las cantidades se indican en números redondos. Sin embargo, un especialista en la técnica reconocería que cantidades dentro del 10 o 20 por ciento de los valores indicados pueden esperarse también que sean apropiadas, es decir, donde se indica el 20%, hay implícito un intervalo del 16-18% al 22-24% y puede ser apropiado. Para formulaciones líquidas:

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Los siguientes compuestos pueden usarse en lugar de sacarosa, y a una osmolalidad comparable: fucosa, trehalosa, ácido poliaspártico, hexafosfato de inositol (ácido fítico), ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico-lactosa. También, cualquier azúcar o alcohol de azúcar adecuado tal como dextrosa, manitol, lactosa, o sorbitol, puede sustituir a la sacarosa a concentraciones eficaces para conseguir la estabilización deseada.

La concentración de azúcar se refiere a la viscosidad de la formulación. En los casos en los que se desea viscosidad reducida, se sabe en la técnica que es preferible usar menores concentraciones de azúcar, por ejemplo, sacarosa. Las personas especialistas en la técnica entenderán también que el límite superior para la concentración de azúcar puede estar dictado por la capacidad de una formulación para experimentar las etapas requeridas de filtración o procesado.

Puede usarse medio de cultivo tisular, solución salina o agua como diluyente. Frecuentemente, se usa medio de Williams' E ("WE"), y con ello quiere decirse medio de Williams' E o medio de Williams E modificado.

También, los agentes tamponantes para neutralizar el ácido gástrico no se limitan a citrato, fosfato y succinato y pueden incluir bicarbonato o ácidos carboxílicos comunes (carboxilatos) tales como, aunque sin limitación, fumarato, tartrato, lactato, maleato, etc. Lo apropiado de cualquiera de estos puede evaluarse simplemente ensayando una formulación en la que estos agentes sustituyen a o se combinan con fosfato, citrato o succinato. Pueden usarse carboxilatos hasta aproximadamente 2,0 M en las formulaciones líquidas de esta invención, sin embargo, es preferible usar menos de aproximadamente 1,0 M, por ejemplo, aproximadamente 0,05-0,9 M, y puede ser menor de aproximadamente 0,7 M, por ejemplo, de 0,05 a aproximadamente 0,7 M. También es preferible usar menos de 0,5 M, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 0,45 M. Concentraciones particulares en estos intervalos pueden ser apropiadas. También, pueden usarse concentraciones mayores de componentes tamponantes (por ejemplo, fosfato, succinato, citrato) si, por ejemplo, se requiriera neutralización gástrica adicional. En los casos en los que una capacidad tamponante adicional es útil en tampones fosfato/citrato o fosfato/succinato, es preferible aumentar adicionalmente las concentraciones de succinato o citrato como agente tamponante en lugar de los fosfatos.

Puede usarse fosfato hasta aproximadamente 2,0 M en las formulaciones líquidas de esta invención, sin embargo, es preferible usar menos de aproximadamente 1,0 M, por ejemplo, aproximadamente 0,010 - 0,8 M, y a menudo menos de 0,5 M, por ejemplo, de aproximadamente 0,010 a 0,45 M. Es más preferible usar menos de aproximadamente 0,35 M, por ejemplo, 0,010 - 0,30 M. Concentraciones particulares en estos intervalos pueden ser apropiadas. En las formulaciones líquidas, es preferible mantener la concentración de fosfato a aproximadamente o menor de 0,30 M, por ejemplo, 0,010 - 0,35 M para evitar la precipitación de sales fosfato, por ejemplo, durante el almacenamiento a largo plazo o ciclos de congelación/descongelación. De esta manera, el límite superior para la concentración de fosfato en cualquier formulación particular puede estar dictado por la formación o precipitación de sales fosfato y si las sales afectan negativamente o no al rendimiento de la formulación en áreas tales como estabilidad y administración. Las concentraciones particulares pueden determinarse fácilmente para cualquier formulación particular por ensayo empírico convencional incluyendo ajustes de pH en el intervalo de pH 6-8.

Para una guía general, en la Tabla 1 a continuación se presentan ejemplos de las capacidades de neutralización de ácido de algunas formulaciones líquidas. Se proporcionan también algunas formulaciones preferidas.

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TABLA 1

1

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Una formulación preferida del estabilizador de la vacuna viral líquida de la presente invención es de la siguiente manera:

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En estas formulaciones preferidas, puede ser apropiado usar solución salina o agua en lugar de, o en combinación con, el medio de cultivo tisular.

Esta invención implica formulaciones de rotavirus reordenados (RVR) adecuados para usar como vacunas, que se caracterizan por su seguridad para los seres humanos y la capacidad para conferir protección inmune contra infección por rotavirus humano. Los RVR se producen por reordenación genética entre un rotavirus bovino atenuado (preferiblemente WC3 o una progenie del mismo) y al menos un rotavirus que representa un serotipo humano epidemiológicamente importante. En un tipo de RVR, el rotavirus humano contribuye a la reordenación al menos con el segmento génico que codifica la proteína VP7. En otro tipo de RVR, el rotavirus humano parental contribuye a la reordenación con al menos el segmento génico que codifica la proteína VP4. En otro tipo más de RVR, la cepa del rotavirus humano parental contribuye al menos a ambos segmentos génicos VP7 y VP4. Además de los tipos de RVR, la cepa del rotavirus humano parental puede contribuir a segmentos génicos además de aquellos que codifican los antígenos VP7 y/o VP4.

El gen del rotavirus humano que codifica para el antígeno de neutralización VP7 y/o VP4 en los RVR puede seleccionarse entre cualquier serotipo de rotavirus humano para el que se desea la inmunización. Deseablemente, en una reordenación de esta invención el gen VP7 se deriva de un serotipo G1, G2, G3, o G4 del rotavirus humano y la proteína VP4 se deriva de un serotipo P1 o P2 humano. Entre las cepas de rotavirus que se observó que eran clínicamente significativas en infecciones por rotavirus humano (posteriormente en este documento "cepas de rotavirus humano"), incluyendo cepas útiles en la presente invención, son las cepas proporcionadas a continuación:

serotipo G1: WI79, Wa, D;

serotipo G2: cepas WISC2 y DS1;

serotipo G3: cepas WI78, P, HCR3A;

serotipo G4: Bricout (Br) B, ST3;

serotipo G8: 69M;

serotipo G9: WI61;

serotipo P1: WI79, WI78, WI61, Wa;

serotipo P2: DS1; y

serotipo P3: WISC2, BrB, BrA, M37.

Esta lista de cepas de rotavirus humano es no exclusiva. Por ejemplo, diversas cepas de rotavirus identificadas previamente en infecciones de animales se han encontrado también en infecciones de seres humanos. Puede anticiparse que estas cepas son útiles como cepas de rotavirus "humano" para los propósitos de esta invención, por ejemplo, el rotavirus "porcino" OSU, un serotipo G5, y el rotavirus "bovino" B223, un serotipo G10. Un especialista en la técnica puede obtener fácilmente otras cepas humanas apropiadas a partir de los depósitos adecuados o de fuentes académicas o comerciales.

Los genes no humanos presentes en las reordenaciones de esta invención se obtienen preferiblemente a partir de la cepa WC3 del rotavirus bovino atenuada, serotipo G6, o su progenie, descrita en detalle en la Patente de Estados Unidos 4.636.385. Sin embargo, otras reordenaciones de rotavirus, particularmente otras reordenaciones bovinas, se prefieren también.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

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Los depósitos de WI79-3,9 y WI78-1,6-11 se han convertido para cumplir los requisitos del Tratado de Budapest. Todos los demás depósitos se han preparado originalmente bajo el Tratado de Budapest. Todas las restricciones sobre la disponibilidad para el público del material identificado depositado en la Tabla 2 se retirará irrevocablemente tras la concesión de una patente sobre esta solicitud, el cultivo o cultivos se mantendrán durante un periodo de 30 años desde la fecha de depósito, o al menos cinco años después de la solicitud más reciente de una muestra, lo que es más largo; y el depósito se sustituirá si el depositario no puede ofrecer muestras viables. Durante el trámite de esta solicitud de patente, el acceso a estos depósitos se permitirá a alguien que el Comisionado determine que tiene derecho
a ello.

Composiciones de Vacuna

Las vacunas para proporcionar protección inmunológica contra la diarrea aguda provocada por infección por rotavirus humano pueden contener uno o más rotavirus reordenados en una formulación de la presente invención. Los rotavirus reordenados ejemplares y combinaciones de los mismos y su uso en vacunas se encuentra en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.626.851 y 5.750.109. En la Tabla 3 se resumen varias composiciones ejemplares
de vacuna.

TABLA 3

3

Las vacunas para rotavirus de la invención pueden contener componentes convencionales. Los componentes adecuados los conocen los especialistas en la técnica. Estas composiciones de vacuna pueden prepararse en formas líquidas o en formas liofilizadas. Pueden añadirse otros componentes opcionales, por ejemplo, estabilizadores, tampones, conservantes, aromatizantes, excipientes y similares. La determinación de formulaciones específicas útiles para estabilizar composiciones de vacuna ha requerido experimentación extensiva.

Cuando se adapta para administración oral, una formulación incluye como vehículo medio de Williams' E
("WE")/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato líquido 50 mM. Otras formulaciones incluyen succinato 0,2 M y fosfato 0,1 M, o citrato 0,1 M y fosfato 0,3 M. Otra formulación incluye citrato 0,7 M y fosfato 0,3 M con medio de Williams' E/sacarosa al 30%. Además, los nuevos adyuvantes para estimular o aumentar las respuestas inmunes desarrolladas para administración oral deben ser compatibles con estas formulaciones. Cuando están adaptadas para administración parenteral, pueden emplearse también adyuvantes convencionales (por ejemplo, sales de aluminio) o nuevos adyuvantes en la composición de vacuna.

Opcionalmente, la vacuna puede formularse preferiblemente para contener otros ingredientes activos y/o antígenos inmunizantes. Por ejemplo, cuando se adapta para administración oral, la formulación con la vacuna de la polio Sabin puede ser deseable.

El régimen de dosificación implicado en un procedimiento para vacunación, incluyendo la temporización, el número y cantidades de vacunas de refuerzo, se determinará considerando diversos huéspedes y factores ambientales, por ejemplo, la edad de los pacientes, el momento de administración y la localización y entorno geográfico.

Procedimiento de Vacunación

Por lo tanto, en la descripción se incluye también un procedimiento de vacunación de seres humanos contra infección por rotavirus humano con las nuevas composiciones de vacuna RVR. Las composiciones de vacuna que incluyen uno o más de las reordenaciones descritas en este documento se administran, preferiblemente por vía oral, en una dosis adecuada, preferiblemente líquida.

La dosificación para todas las vías de administración es generalmente entre 10^{5} y 10^{9} unidades formadoras de placa (pfu) de la reordenación, siendo la dosificación preferida de 10^{7} pfu. Pueden administrarse también dosis adicionales de las vacunas. Puede ser preferible inocular a los niños y menores susceptibles una base anual antes de la "temporada del rotavirus". La infección por rotavirus en seres humanos se ha observado que ocurre en diversas regiones geográficas durante la misma temporada, por ejemplo, en invierno en Estados Unidos. Inoculaciones repetidas antes de la temporada para niños y menores susceptibles pueden estar indicadas. Por ejemplo, un régimen de dosificación actualmente preferido para Estados Unidos incluye tres dosis aproximadamente con dos meses de diferencia antes de que comience la temporada del rotavirus.

Los siguientes ejemplos ilustran procedimientos para preparar las formulaciones de vacuna RVR de la invención.

Ejemplo 1

La administración de una vacuna por la vía oral expone la vacuna al entorno gástrico de bajo pH. La mayor parte de las vacunas tienden a inactivarse por dichas condiciones extremas. Para asegurar el suministro de una vacuna activa, se examinaron los tampones potenciales para su capacidad de neutralización de ácido así como su capacidad para estabilizar el rotavirus.

Estabilidad del Rotavirus en presencia de Tampones de Neutralización de Ácido

Se evaluaron combinaciones tampón de citrato, lactato, y succinato (5 en total) para su efecto sobre la estabilidad del rotavirus a 37ºC durante un periodo de 1 semana. Los tampones, cuyas concentraciones se dan en la leyenda de la Figura 1, se añadieron a un volumen igual de rotavirus en medio WE y se incubaron durante 0, 3, o 7 días.

Para el serotipo G1, las combinaciones de bicarbonato no tenían efecto sobre el tiempo para perder la mitad del título infeccioso (t_{1/2}) ya que los valores eran similares a aquellos en sacarosa al 5% (0,5 días). En contraste, los tampones fosfato que contenían citrato, lactato, y succinato estabilizaron el virus presentando valores t_{1/2} de 1,2, 1,4, y 1,5 días, respectivamente (Figura 1).

Como se muestra en la Figura 1, el fosfato tenía un efecto similar sobre la estabilidad de P1. El tampón lactato/fosfato tenía un t_{1/2} de 2,4 días, y la combinación succinato/fosfato tenía un t_{1/2} de 6,8 días comparado con un valor de aproximadamente 1,2 días para una solución de sacarosa al 5%. De forma similar a su efecto sobre el rotavirus G1, las combinaciones tampón que contienen bicarbonato conferían menos estabilidad sobre el serotipo P1 que los tampones similares que contienen fosfato.

Combinación de Rotavirus con Tampón de Neutralización de Ácido - Administración Sencilla Potencial

El efecto estabilizador del succinato/fosfato así como otros tampones sugiere que la formulación puede contener un neutralizador de ácido. Un ml de los tampones ensayados parece neutralizar suficiente ácido para mantener el pH por encima de 3,5 (Figura 2) lo que se sabe a partir de nuestra experimentación directa y de la bibliografía científica que es necesario para conservar la infectividad del rotavirus. Basado en volúmenes de ácido gástrico de niños y velocidades de secreción de ácido, el pH puede mantenerse in vivo durante aproximadamente 0,5 h con las formulaciones líquidas que se describirán en esta obra, sin embargo, habrá que realizar estudios clínicos humanos para confirmar estas suposiciones. Como otro ensayo de la capacidad tamponante, se realizó el ensayo USP para la capacidad de neutralización de ácido. Como se muestra en la Tabla 4, los componentes tamponantes de la formulación RV son más eficaces que un volumen igual de la fórmula infantil.

TABLA 4 Capacidad de neutralización de ácido medida por un ensayo USP para una nueva formulación de rotavirus líquida (1); formulación usada en ensayos clínicos previos por otros (2); medios de cultivo tisular (3); fórmula infantil (4), y un antácido (5)

4

Para formulaciones liofilizadas, puede obtenerse capacidad tamponante adicional por reconstitución con un tampón de neutralización de ácido descrito en esta obra o compuestos de neutralización de ácido disponibles habitualmente tales como una solución de bicarbonato. De esta manera, con una formulación líquida o liofilizada, es posible una capacidad tamponante adecuada sin pretratamiento. Por consiguiente, la vacuna para rotavirus debe poder administrarse, preferiblemente, en una única administración en lugar de con una etapa separada de neutralización gástrica seguido de la vacuna. Sin embargo, la administración simultánea de tampón y vacuna tendrá que evaluarse adicionalmente en pacientes que tienen confianza en la eficacia de la vacuna usada en este enfoque. Si el pretratamiento de los pacientes (suministro de la fórmula o dosis de bicarbonato o un antácido tal como Mylanta®) es aún necesario para asegurar una neutralización adecuada del ácido gástrico para una vacunación oral rutinaria con rotavirus, estas formulaciones aún proporcionarán una gran potenciación en la estabilidad durante el almacenamiento como se describe en la siguiente sección. Adicionalmente, los rotavirus reordenados son compatibles con las fórmulas infantiles (por ejemplo, Isomil® y Similac®) así como los tampones bicarbonato y muestran estabilidad térmica comparable en presencia o ausencia de estos neutralizadores.

Ejemplo 2

Los sitios de unión supuestos en el rotavirus pueden considerarse como dianas para la estabilización. Se ha sugerido que los sitios de unión de calcio y cinc están presentes en proteínas de rotavirus y la presencia de estos cationes puede estabilizar la vacuna. Otros cationes divalentes pueden unirse también a estos y otros sitios y estabilizar el rotavirus y sus reordenados. La unión mediante otros compuestos se investigó también para identificar compuestos que pueden estabilizar la vacuna sin interferir con su capacidad para conferir inmunogenicidad.

a. Efecto de los Iones Metálicos Divalentes

Se sabe que la adición de quelantes metálicos tales como EDTA o EGTA provoca una pérdida en la infectividad del RV, presumiblemente alterando la carcasa externa del RV. Esto sugiere que los metales pueden ser necesarios para la integridad estructural. Por consiguiente, los iones metálicos divalentes se examinaron para evaluar su capacidad potencial para estabilizar el rotavirus (RV).

El rotavirus en medio WE se dializó a 4ºC durante aproximadamente 16 horas en tampón Tris 20 mM y NaCl 100 mM. La solución final se complementó con 10 mM de CaCl_{2}, MnCl_{2}, MgCl_{2}, ZnCl_{2}, o CaCl_{2} + ZnCl_{2} para producir una concentración final de 10 mM de ión metálico. Las muestras pueden filtrarse antes de la formulación. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 0, 2/3, y 7 días y después se almacenaron a -70ºC hasta que se ensayaron. Cada dato puntual representa una media de 2 muestras replicadas.

Como se muestra en la Tabla 5, el calcio y el manganeso mejoran la estabilidad de ambos rotavirus reordenados G1 y P1 a 37ºC cuando las formulaciones se preparan mediante diálisis de los rotavirus a granel en formulaciones sin medio de cultivo tisular. El cinc disminuyó drásticamente la semi-vida de inactivación (t_{1/2}) de G1 y disminuyó significativamente el t_{1/2} de P1 en presencia o ausencia de calcio. Es posible que Zn^{2+} pueda sustituir al Ca^{2+}, provocando la desestabilización de la cápsida externa de manera análoga a la retirada de Ca^{2+} por EDTA. Una explicación alternativa puede ser que el Zn^{2+} active las metaloproteinasas endógenas o potencie las nucleasas derivadas del cultivo celular. La adición de metales divalentes no aumenta la estabilidad térmica de RV cuando se formula en un estabilizador que contiene medio de cultivo tisular tal como Williams' E o Williams E modificado. Los reordenados G2 y G3 parecieron comportarse de forma similar a los reordenados G1 y P1 cuando se comparan medios de cultivo tisular complementados con catión.

De esta manera, preparando las formulaciones estabilizadas de rotavirus como se ha descrito en este documento, es preferible que estén presentes niveles suficientes de iones metálicos divalentes. Estos iones metálicos los proporciona más probablemente el medio de cultivo tisular y las células usadas en el cultivo celular para preparar el virus a granel. Los iones metálicos pueden suplementarse también, si fuera necesario, en la formulación final por adición directa individualmente o usando el medio de cultivo tisular.

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TABLA 5 Efecto de los metales divalentes sobre la cinética de inactivación de rotavirus reordenados. Los valores representan la pérdida logarítmica de título viral después de 3 días a 37ºC

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b. Efecto de Azúcares y Polianiones Biológicamente Pertinentes

Los experimentos preliminares descritos anteriormente mostraron que los rotavirus reordenados se estabilizan mediante tampón fosfato. Como hay ejemplos de proteínas monoméricas que se estabilizan mediante fosfato que se estabilizan también mediante polianiones relacionados tales como sulfato, hexafosfato de inositol (ácido fítico) y diversos compuestos sulfatados (heparina y p-ciclodextrina sulfatada), estos compuestos se ensayaron para su capacidad para estabilizar los rotavirus. Las formas poliméricas de los polianiones son generalmente estabilizadores más eficaces ya que puede mantenerse una mayor densidad de carga a menores concentraciones de ligando, por lo tanto, el ácido poliaspártico se examinó también debido a su alta densidad de carga negativa. Se examinó el ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) ya que puede unirse a VP4 y, por lo tanto, puede proporcionar protección de la degradación inducida térmicamente o desplegado. Análogamente, se ensayaron los derivados de ácido siálico tales como ácido N-acetilneuramínico-lactosa y mucina: la pérdida de infectividad del RV con maduración del huésped se ha sugerido debido a un cambio en la presencia de ácido siálico a fucosa; por consiguiente, se examinó la fucosa. Por ultimo, se examinó la trehalosa por sus supuestas propiedades como un excipiente de secado favorable.

Como puede observarse en la Tabla 6, pueden añadirse diversos compuestos a las formulaciones de rotavirus y estabilizar el virus durante un ensayo de estabilidad acelerada. El hexafosfato de inositol mostró la mayor capacidad para estabilizar el RV comparado con los otros ligandos en este estudio. Para G1, se observó un aumento de 4 veces en la estabilidad térmica a 37ºC. La mucina evita la infectividad, probablemente no desestabilizando la estructura del virión sino también secuestrando el RV (se observaron agregados antes del ensayo). Los polímeros sulfatados tenía un efecto insignificante, sin embargo, todos los demás compuestos ensayados estabilizaban el RV en grados variables. Por ejemplo, la trehalosa prolongaba la semi-vida de inactivación para G1 en más de 2 veces y P1 en menos del 50%.

El ácido siálico estabilizaba ambos G1 y P1 RV. El ácido siálico debería estabilizar los tipos G y no los tipos P si el sitio de unión está localizado en VP4. En estos experimentos, P1 parecía tener una menor semi-vida en presencia de polianiones en general. Cuanto menor sea t_{1/2} en presencia de heparina y ácido poliaspártico puede sugerir que RV se une más fuertemente a estos ligandos en lugar de verse desestabilizado por ellos. El mecanismo de supresión de estabilidad no está totalmente claro. Un bajo nivel de infectividad como el medido por el ensayo de placa puede provocarse por desestabilización del propio virión o el secuestro del RV por el ligando. Si la asociación entre el RV y el excipiente es moderada, sería de esperar que el ligando se disociara en las condiciones diluidas del ensayo (así como in vivo). Los complejos fuertemente unidos pueden contener partículas virales estables, no tan infecciosas puesto que son incapaces de disociarse. Este ultimo caso parece aplicarse a mucina, heparina, y posiblemente al ácido poliaspártico. También, los efectos negativos de los excipientes sobre las células usadas en el ensayo de placa no pueden pasar indiferentes. Independientemente del mecanismo, ciertos polianiones no proporcionan ninguna ventaja. El hexafosfato de inositol parece ser el más favorable de todos los ligandos examinados, superando la estabilidad inducida por los tampones que contienen fosfato. Estos resultados sostienen también los estudios previos descritos en esta obra que muestran cómo el fosfato estabiliza drásticamente el RV. De esta manera, diversos fosfatos (por ejemplo, monofosfatos y polifosfatos) y compuestos fosforilados (por ejemplo, azúcares fosforilados) pueden estabilizar el rotavirus.

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TABLA 6 Efecto de polianiones y azúcares sobre la cinética de inactivación. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 semana

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Ejemplo 3

Se obtuvieron datos de estabilidad investigados durante un año para diversas formulaciones liofilizadas y líquidas optimizadas de rotavirus G1 y P1 a diversas temperaturas y se compararon con los datos de estabilidad de una formulación no optimizada, medio WE/sacarosa al 5%. Las formulaciones líquidas optimizadas que contienen rotavirus reordenados en medio WE que contiene sacarosa, fosfato sódico, y succinato sódico o citrato sódico mostraron una mejora sustancial en estabilidad. Otras mejoras en estabilidad durante el almacenamiento se observaron para las formulaciones liofilizadas. Con la formulación apropiada, la termoestabilidad de los rotavirus superó la de vacunas líquidas de virus vivo (es decir, OPV) y liofilizadas (por ejemplo, sarampión) existentes.

El efecto estabilizador de cualquier tampón succinato/fosfato o citrato/fosfato ofrece el potencial de combinar la potenciación de estabilidad con una neutralización gástrica. Las formulaciones líquidas así como las formulaciones liofilizadas que pueden reconstituirse usando este tampón pueden permitir suministrar la formulación en una única administración.

a. Datos de Estabilidad de la Formulación Líquida

Cuando se formula en medio de Williams'E/sacarosa al 5%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna del rotavirus reordenado G1 pierde 0,7 unidades logarítmicas de su título después de 1 año a 4ºC cuando se compara con las muestras almacenadas a -70ºC (Figura 3). La vacuna de P1 reordenado pierde 0,2 unidades logarítmicas en las mismas condiciones. Después de 6 meses a 22ºC, el G1 reordenado pierde 2,6 unidades logarítmicas del título infeccioso mientras que el rotavirus reordenado P1 pierde 5,2 unidades logarítmicas. Esto puede compararse con la formulación líquida no optimizada del reordenado G1 en medio de Williams' E/sacarosa al 5% que se usó recientemente en ensayos clínicos que perdían más de 5 unidades logarítmicas de infectividad después de la incubación durante 6 meses a 22ºC y 1-2 unidades logarítmicas a 4ºC después de un año. Estos datos demuestran el efecto estabilizador adicional de las combinaciones tampón específicas descritas en esta obra.

En medio de Williams' E/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna del rotavirus reordenado G1 pierde 0,8 unidades logarítmicas del título después de 1 año a 4ºC cuando se compara con muestras almacenadas a -70ºC (Figura 4). La vacuna de P1 reordenado pierde menos de 0,3 unidades logarítmicas en las mismas condiciones. A 22ºC, ambas vacunas G1 y P1 pierden aproximadamente 2 unidades logarítmicas de infectividad después de 1 año. Estos datos demuestran el efecto estabilizador adicional de altas concentraciones de azúcar.

Otras formulaciones con mayores concentraciones de tampón (medio de Williams' E/sacarosa al 50%/succinato 0,2 M/ fosfato 0,1 M, pH 7) estabilizan también la vacuna G1 para rotavirus a 4ºC dando como resultado que no haya una pérdida significativa de título cuando se compara con muestras similares almacenadas a -70ºC (Figura 5). Además, no se observa pérdida en el título de G1 para ninguna de las formulaciones líquidas optimizadas almacenadas a 4ºC durante un año. La infectividad del P1 reordenado es de 0,2 unidades logarítmicas menos que las muestras a -70ºC para todas las formulaciones (Figura 6). Aunque las estabilidades de ambos rotavirus reordenados G1 y P1 a 4ºC son similares para formulaciones usando concentraciones de tampón más altas, la formulación que contiene medio de Williams' E/sacarosa al 50%/citrato 0,1 M /fosfato 0,3 M a pH 7 muestra menos pérdida a 22ºC cuando se compara con otras formulaciones. Por ejemplo, el rotavirus G1 en medio de Williams' E/sacarosa al 50%/succinato 0,2 M/fosfato 0,1 M muestra 1,5 unidades logarítmicas menos en el título después de un año a 22ºC, mientras que la formulación de medio de Williams' E/sacarosa al 50%/citrato 0,1 M/fosfato 0,3 M muestra sólo 0,6 unidades logarítmicas menos después de este periodo. Cuanto mayor sea la concentración de fosfato en la última formulación puede ser responsable de un aumento de la estabilidad ya que la presencia de fosfato y compuestos fosforilados aumenta la termoestabilidad de los rotavirus reordenados como han demostrado nuestros experimentos de detección anteriores. Aunque el rotavirus en la formulación tamponada con citrato/fosfato parece más estable a 22ºC, es menos estable a 45ºC para ambos reordenados y a 37ºC para el rotavirus P1.

Después 12 meses a 4ºC en medio de Williams' E/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, el rotavirus reordenado G2 perdió 0,2 unidades logarítmicas de infectividad y el reordenado G3 disminuyó su título en 0,3 unidades logarítmicas cuando se comparaba con muestras similares almacenadas a -70ºC (Figura 7). Comparado con los reordenados G1 y P1 en formulaciones similares (Figura 3), G2 y G3 tienen estabilidades comparables a la del rotavirus reordenado P1 y mejores que las observadas con el reordenado G1 a 4ºC. Sin embargo, las vacunas G2 y G3 parecen ser menos estables que la vacuna G1 a 22ºC.

La estabilidad de los reordenados G1 se estudió en presencia y ausencia de medio de cultivo tisular en formulaciones que incluyen sacarosa, fosfato y citrato (Tabla 7). La formulación A, que contiene únicamente sacarosa al 5% en WE, sirvió como patrón en este estudio. La formulación de ensayo B contiene fosfato sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M con sacarosa al 50% en WE. La formulación de ensayo C contiene sacarosa al 50%, fosfato sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M sin WE. La masa viral se diluye 10 veces en las formulaciones B o C. De esta manera, el 100% del medio líquido en B es medio de cultivo tisular mientras que el 10% del medio líquido en C es medio de cultivo tisular. En C, la masa viral es la única fuente de medio de cultivo tisular. Como se muestra en la Tabla 7, las formulaciones B y C mostraron mayor estabilidad que la formulación A. La presencia o ausencia de medio de cultivo tisular en las formulaciones tenía un pequeño efecto, aunque medible, sobre la estabilidad del rotavirus a 30ºC (compárese B y C, Tabla 7). Este efecto era mayor a 37ºC aunque era aún pequeño comparado con el patrón (Formulación A). Estos datos indican que un amplio intervalo de concentración (10-100%) de medio de cultivo tisular es aceptable para obtener una estabilidad mejorada.

TABLA 7

7

Para examinar el efecto del medio de cultivo tisular a proporciones de volumen menores del 10%, se empleó diálisis para retirar completamente el medio de cultivo tisular de la masa viral. Cuando una formulación líquida de rotavirus se preparó a partir de la masa viral dializada y, de esta manera, contenía el 0% de medios de cultivo tisular en la formulación final, estas preparaciones se inactivaron más rápido que las preparaciones en las que la masa de rotavirus simplemente se diluía en un estabilizador sin medios de cultivo tisular (dando como resultado un 10% de medio de cultivo tisular que está presente en la formulación final de vacuna). Esto sugiere que la diálisis puede haber retirado los componentes estabilizadores esenciales que están presentes en el medio de cultivo tisular WE. En ausencia de una cantidad eficaz de medio de cultivo tisular, pueden añadirse cationes divalentes tales como calcio a la formulación dializada de vacuna para mejorar la estabilidad (véase la Tabla 5). La diálisis a diversas escalas de procesado puede realizarse también usando procedimientos de diafiltración o ultrafiltración.

La estabilidad de los reordenados G1 se estudió en un intervalo de pH. El rotavirus reordenado G1 se formuló en estabilizador de fosfato sódico 0,3 M/citrato sódico 0,1 M/sacarosa al 50% a diferentes valores de pH. El título viral indica que en condiciones de estabilidad acelerada, la estabilidad del reordenado G1 es mayor en el intervalo de pH aproximadamente 4,0 a pH aproximadamente 8,0, particularmente entre pH aproximadamente 5,0 a pH aproximadamente 7,0. Por "pH aproximadamente" quiere decirse dentro de aproximadamente 0,3 unidades del valor de pH indicado.

TABLA 8

8

b. Datos de Estabilidad de la Formulación Liofilizada

La vacuna G1 mostró una pérdida de 0,3 unidades logarítmicas después de un año a 22ºC en una formulación liofilizada de sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a pH 7 (Figura 8). Las formulaciones que contienen sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 75 mM a pH 7 no mostraron pérdidas significativas después de un año a temperaturas de 22ºC o menores. Las vacunas P1 mostraron menor estabilidad que las formulaciones G1 correspondientes. En sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a 4ºC durante un año, el reordenado P1 muestra una pérdida de 0,4 unidades logarítmicas en el título cuando se compara con la vacuna almacenada a menos 70ºC (Figura 9). Una formulación similar con más fosfato muestra una pérdida de infectividad de menos de 0,2 unidades logarítmicas. La vacuna P1 en un estabilizador de fosfato, sacarosa y gelatina hidrolizada no muestra pérdida significativa después de un año a 4ºC. Estas formulaciones liofilizadas se prepararon mediante dilución de 10 veces del masa del rotavirus en el estabilizador (concentración final del 10% de medio de cultivo tisular) por diálisis del masa del rotavirus en el estabilizador (retirada completa del medio de cultivo tisular).

Claims

1. Una formulación de vacuna líquida para rotavirus que comprende:

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102

2. La formulación de la reivindicación 1 en la que dicho al menos un carboxilato se selecciona entre el grupo constituido por succinato, citrato, fumarato, tartrato, maleato y lactato.

3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho azúcar se selecciona entre el grupo constituido por sacarosa, manitol, lactosa, sorbitol, dextrosa, fucosa, trehalosa, ácido poliaspártico, hexafosfato de inositol (ácido fítico), ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico-lactosa.

4. La formulación de vacuna líquida de la reivindicación 1 que comprende:

103

5. La formulación de la reivindicación 1 en la que la concentración de azúcar es entre el 5 y el 70%; la concentración de fosfato es entre 0,05 y 0,3 M; y dicho al menos un carboxilato es citrato o succinato a una concentración entre 0,05 y 0,7 M.

6. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el pH es entre pH 5,0 y pH 8,0.

7. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicho fosfato se selecciona entre el grupo constituido por monofosfatos, polifosfatos y compuestos fosforilados.

8. La formulación de acuerdo con la reivindicación 7 en la que dichos compuestos fosforilados son azúcares fosforilados.

9. Un procedimiento de preparación de una formulación estabilizada de vacuna para rotavirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende cultivar un rotavirus y mezclar el rotavirus con un solución solubilizadora concentrada para formar un virus en masa.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende adicionalmente dializar la masa de virus para formar una solución estabilizada de vacuna para rotavirus.

11. El uso de una formulación de vacuna para rotavirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento en forma de vacuna para el tratamiento de un individuo contra infección por rotavirus.