ES2240145T3 - Formulaciones para vacunas contra rotavirus. - Google Patents
Formulaciones para vacunas contra rotavirus.Info
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-
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Abstract
Una formulación para vacuna líquida contra rotavirus que comprende: a) al menos una cepa de rotavirus: de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1000 x 105 ufp/ml; b) azúcar: de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% (p/v); c) fosfato: de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 2 M; d) al menos un carboxilato: de aproximadamente 0, 05 a aproximadamente 2 M; caracterizado porque comprende además al menos un componente seleccionado entre el grupo constituido por e) aproximadamente del 0, 5% a aproximadamente el 1, 25% de albúmina de suero humano recombinante, y f) aproximadamente del 0, 001% a aproximadamente el 2% de un tensioactivo no iónico
Description
Formulaciones para vacunas contra rotavirus.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones líquidas y liofilizadas de rotavirus útiles como
vacunas y procedimientos para su preparación.
Los rotavirus (RV) causan gastroenteritis aguda,
una enfermedad que requiere hospitalización de bebés y niños
pequeños en países desarrollados, y es una causa frecuente de
muerte en niños menores de 5 años en regiones en vías de desarrollo
delmundo. Estudios en Estados Unidos, Australia y Japón han
demostrado que entre el 34 y el 63% de los niños hospitalizados por
enfermedad diarreica aguda se asocian con infección por rotavirus.
La incidencia de hospitalización por gastroenteritis por rotavirus
en una organización para el mantenimiento de la salud en los Estados
Unidos se estimó que era del 222 por 100.000 en niños de 13 a 24
meses de edad, y del 362 por 100.000 en los menores de un año. La
infección con rotavirus se asoció con el 63% de todas las
hospitalizaciones por diarrea aguda en esta población pediátrica.
Una revisión de los datos de mortalidad en los Estados Unidos desde
1973 a 1983 indicó que se producían 500 muertes al año en niños
menores de 4 años debido a enfermedades diarreicas, y que del 20 al
80% del exceso de muertes invernales debidas a diarrea en los
Estados Unidos se asocian con infecciones por rotavirus. Los
rotavirus también son responsables de una proporción importante de
la mortalidad asociada con enfermedades diarreicas en países del
tercer mundo. Por tanto, una vacuna eficaz contra rotavirus podría
tener un impacto importante en la salud de niños tanto en áreas del
mundo desarrolladas como en vías de desarrollo.
Los rotavirus tienen cápside interna y externa
con un genoma de ARN bicatenario formado por once segmentos génicos.
Se han definido múltiples serotipos mediante pruebas de
neutralización de reducción de placa, y los estudios de virus
reagrupamientos han demostrado que dos proteínas de la cápside
externa, VP7 y VP4, son las determinantes del serotipo del virus. La
proteína VP7 está codificada por el segmento génico 7, el segmento
génico 8 o el segmento génico 9 de un rotavirus humano concreto. La
localización del gen que codifica para VP7 se puede determinar para
cada rotavirus específico mediante procedimientos experimentales
convencionales. La proteína VP4 es una proteína estructural
principal de la superficie de 88.000 dalton producto del gen 4 de
un rotavirus. Al igual que VP7, funciona como un antígeno principal
específico de serotipo, operativo en pruebas de neutralización de
suero (NS), capaz de inducir un anticuerpo neutralizante específico
de serotipo, y capaz de inducir protección inmune específica de
serotipo contra enfermedades por rotavirus, en un sistema de ratón.
En algunas referencias anteriores, VP4 se denominó VP3. Después de
1988, un cambio en la nomenclatura, dio como resultado la
denominación más apropiada de esta proteína como VP4.
Puesto que los segmentos génicos que codifican
para las proteínas VP7 y VP4 segregan independientemente, se ha
propuesto que la nomenclatura de serotipaje incluya tanto el tipo G,
determinado por VP7, como el tipo P, determinado por VP4. La
mayoría de las infecciones por rotavirus humanos en los Estados
Unidos están causadas por virus de los tipos G 1, 2, 3 ó 4, y los
tipos P 1, 2 ó 3. Sin embargo, en Asia, Europa y ciertos países del
tercer mundo otros tipos de rotavirus, incluyendo por ejemplo, el
tipo G9, tienen mayor prevalencia.
Una serie de rotavirus animales están atenuados
en humanos y se han evaluado como vacunas potenciales de rotavirus
vivos, incluyendo el rotavirus bovino WC3 de serotipo G6. Se
demostró que la vacuna del virus WC3 era inmunogénica y no
reactogénica en niños, pero no siempre proporcionaba inmunidad
protectora contra las infecciones por rotavirus humanos. Se ha
sugerido que es necesaria inmunidad específica de serotipo para
inducir una protección constante contra diarrea por rotavirus. La
Solicitud Internacional Publicada Nº WO 98/13065 (Merck & Co.,
Inc.) describe formulaciones para vacunas contra rotavirus, en
particular una formulación líquida para vacuna contra rotavirus que
comprende de aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 1000 x
10^{5} ufp/ml o al menos una cepa de rotavirus, de
aproximadamente 1 a aproximadamente 70% (p/v) de azúcar, de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 M de fosfato y de
aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M de al menos un
carboxilato. También se describe una formulación para vacuna contra
rotavirus liofilizada que comprende de aproximadamente 1 a
aproximadamente 1000 x 10^{5} ufp/ml de al menos una cepa de
rotavirus, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20% (p/v) de al
menos un azúcar y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M de
fosfato.
Existe una necesidad en la técnica de vacunas
eficaces que proporcionen inmunidad protectora contra la infección
por rotavirus y los síntomas clínicos graves asociados con ella. La
Solicitud Internacional Publicada Nº WO 99/12568 (Merck & Co.,
Inc.) describe el uso de albúmina sérica humana recombinante en
estabilizadores para vacunas de virus vivos, incluyendo vacunas que
comprenden vacunas contra varicela zoster, sarampión, paperas y
rubéola. La Solicitud de Patente Europea Nº 0028563A1 (Merck &
Co., Inc.) describe una composición estabilizada para vacuna en
forma líquida que contiene un virus vivo, tales como el sarampión,
paperas o rubéola, varicela, poliomielitis o hepatitis y similares.
La Patente de Estados Unidos Nº 4.500.512 (Baume) describe un agente
estabilizante para vacunas que contienen virus atenuados vivos,
constituido por una solución de fosfato tamponado que contiene
iones de calcio y magnesio, lactosa, sorbitol y al menos un
aminoácido. En particular, se describe una vacuna contra la fiebre
amarilla.
Para la distribución mundial de vacunas contra
rotavirus, es necesario formular vacunas que sean estables en
diversas condiciones ambientales. Se conocen los componentes usados
para estabilizar vacunas. Sin embargo, se deben determinar
experimentalmente las formulaciones específicas y componentes útiles
para estabilizar vacunas contra rotavirus. Un objeto de la presente
invención son las presentes formulaciones que estabilizan vacunas
contra rotavirus.
La presente invención proporciona nuevas
formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para
su preparación.
Figura 1. Efecto de combinaciones de tampones
sobre la estabilidad de rotavirus a 37ºC durante 1 semana. Los datos
para el reagrupamiento G1 se muestran en el panel A y los del
reagrupamiento P1 en el panel B. Todos los valores se expresan como
ufp/ml normalizados con respecto a la referencia o muestra del día
0. Las combinaciones de tampones se representan como sigue: citrato
sódico 0,05 M + bicarbonato sódico 0,15 M (\Box), citrato sódico
0,05 M + fosfato sódico 0,15 M (o), ácido láctico 0,05 M +
bicarbonato sódico 0,15 M (\triangle), ácido láctico 0,05 M +
fosfato sódico 0,15 M (\triangledown) y succinato sódico 0,20 M +
fosfato sódico 0,05 M (\lozenge). Todas las formulaciones tienen
valores de pH de 7.
Figura 2. Capacidad neutralizante de ácidos de
los tampones de la formulación comparados con bicarbonato. Se tituló
1 ml de cada tampón con HCl 0,01 M. Símbolos: bicarbonato sódico 0,4
M (\bullet), citrato sódico 0,1 M + fosfato sódico 0,3 M (o),
citrato sódico 0,1 M + bicarbonato sódico 0,3 M (+) y succinato
sódico 0,2 M + fosfato sódico 0,1 M (\lozenge).
Figura 3. Datos de estabilidad para rotavirus
reagrupamientos en formulaciones líquidas de sacarosa al
5%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M tras su
almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus
G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B.
Los títulos se muestran por mililitro.
Figura 4. Datos de estabilidad para rotavirus
reagrupamiento en formulaciones líquidas de sacarosa al
50%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M tras su
almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus
G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B.
Los títulos se muestran por mililitro.
Figura 5. Datos de estabilidad para formulaciones
líquidas de rotavirus G1 con el tampón superior, sacarosa y
concentraciones de gelatina hidrolizada a diversas temperaturas. El
panel A muestra los datos para el rotavirus G1 en medios E de
Williams ("WE"), sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M y
fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en
medios E de Williams, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M y
fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra
los datos para rotavirus G1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M
y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra los datos del rotavirus
G1 en medios E de Williams, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M,
fosfato sódico 0,1 M y gelatina hidrolizada al 5%. Los títulos se
muestran por mililitro. Los puntos de datos de 4ºC quedan ocultos
por los puntos de datos de -70ºC y 15ºC.
Figura 6. Datos de estabilidad para formulaciones
líquidas de rotavirus P1 con el tampón superior, sacarosa y
concentraciones de gelatina hidrolizada a diversas temperaturas. El
panel A muestra los datos para el rotavirus P1 en medios E de
Williams ("WE"), sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M y
fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en
medios E de Williams, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M y
fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra
los datos para rotavirus P1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M
y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra los datos del rotavirus
P1 en medios E de Williams, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M,
fosfato sódico 0,1 M y gelatina hidrolizada al 5%. Los títulos se
muestran por mililitro.
Figura 7. Datos de estabilidad para formulaciones
líquidas de rotavirus en sacarosa al 50%, succinato sódico 0,1 M y
fosfato sódico 0,05 M tras su almacenamiento a diversas
temperaturas. Los datos para el rotavirus G2 se muestran en el panel
A y para G3 en el panel B. Los títulos se muestran por
mililitro.
Figura 8. Datos de estabilidad para formulaciones
liofilizadas de rotavirus G1 tras su almacenamiento a diversas
temperaturas. El panel A muestra los datos para el rotavirus G1
dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%
y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para vacunas
dializadas antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4%
y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra
los datos para el rotavirus G1 diluido en fosfato antes de la
liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 75
mM. Los títulos se muestran por mililitro.
Figura 9. Datos de estabilidad para formulaciones
liofilizadas de rotavirus P1 tras su almacenamiento a diversas
temperaturas. El panel A muestra los datos del rotavirus P1
dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4%
y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para vacunas
dializadas antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4%
y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra
los datos para el rotavirus P1 diluido antes de la liofilización en
sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 75 mM. Los títulos se
muestran por mililitro.
\newpage
Figura 10. Efecto estabilizante de la albúmina
humana recombinante (AHr) sobre la estabilidad del rotavirus G1 en
formulaciones líquidas a 30ºC. Los valores de cambio de potencia se
expresan como log de ufp comparado con muestras a -70ºC. El
estabilizador es sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/medio
de cultivo tisular/pH 6,2 en presencia o ausencia de AHr.
La presente invención proporciona nuevas
formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para
su preparación. Más especialmente, la invención se refiere a
formulaciones estabilizantes para vacunas líquidas y liofilizadas
contra rotavirus. Además, algunas de estas formulaciones se pueden
administrar por vía oral con o sin preneutralización del ácido
gástrico puesto que algunas de las formulaciones contienen altos
niveles de componentes de tamponamiento.
Debido a la distribución mundial de vacunas y a
la diversidad de temperaturas ambientales, es necesario formular
vacunas que sean estables bajo diversas condiciones ambientales. Se
han usado diversos procedimientos de estabilización. Estos incluyen
los siguientes:
a) Temperaturas bajas (-10ºC a -70ºC). La mayoría
de las vacunas son estables durante su almacenamiento a temperaturas
extremadamente bajas. Sin embargo, las instalaciones de
almacenamiento a bajas temperaturas son costosas y no siempre están
disponibles; esto limita la utilidad y el carácter práctico de este
enfoque.
b) Liofilización. Las vacunas liofilizadas son
razonablemente estables y se pueden almacenar a
2-8ºC durante un periodo de tiempo predeterminado.
La liofilización puede, sin embargo, tener como consecuencia la
pérdida de título vírico durante el desecado reduciendo de ese modo
el rendimiento del proceso de fabricación. Aunque una vacuna
liofilizada es típicamente más estable que una formulación líquida,
durante el almacenamiento a largo plazo, una vacuna liofilizada
puede incluso deteriorarse, hasta el punto que puede o no tener
suficiente título para conferir inmunización. Además, puesto que una
vacuna liofilizada necesita ser reconstituida antes de su uso, la
preparación líquida reconstituida puede perder potencia mientras
permanece a temperatura ambiente antes de su uso. Esta pérdida de
título durante la reconstitución puede también tener como
consecuencia un título insuficiente para conferir
inmunidad.
inmunidad.
c) Estabilizadores. Estos son compuestos químicos
específicos que interaccionan y estabilizan moléculas biológicas y/o
excipientes farmacéuticos generales que se añaden a la vacuna y se
usan conjuntamente con procedimientos de almacenamiento a bajas
temperaturas o procedimientos de liofilización.
Estas formulaciones se pueden preparar mediante
(1) dilución de la vacuna a granel en el estabilizador, (2)
diálisis/diafiltración en el estabilizador o (3) concentración de la
vacuna a granel y diafiltración en el estabilizador, seguido de
liofilización si es necesario.
Las cantidades y concentraciones de los
componentes de las formulaciones descritas en este documento se
entenderán por los expertos en la materia como los porcentajes
peso/volumen cuando se refieran a formulaciones liofilizadas o
líquidas. Por ejemplo, una concentración del 10% en una formulación
líquida es 10 gramos en 100 mililitros de la forma líquida antes de
la liofilización. Otras medidas, tales como la molaridad de un
compuesto, se refieren a una formulación líquida o a una formulación
liofilizada antes de la liofilización.
La composición estabilizadora de la presente
invención contiene los siguientes componentes en aproximadamente las
cantidades indicadas. Por conveniencia, las cantidades se indican en
números redondos. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá
que se espera que cantidades entre el 10 ó 20 por ciento de los
valores indicados también puedan ser apropiados, es decir, cuando se
indica el 20%, está implícito un intervalo del
16-18% al 22-24% y puede ser
apropiado. Para formulaciones líquidas:
Sacarosa: | 1-70% (p/v) |
Fosfato sódico o potásico: | 0,01-2 M |
Succinato sódico o citrato sódico: | 0,05-2 M |
Medio de cultivo tisular, 0-resto
del volumen restante solución salina o agua:
Para formulaciones liofilizadas:
Fosfato sódico | 0,05-2 M |
Sacarosa | 1-20% |
Manitol | 1-20% |
Lactosa | 1-20% |
Además, puede también estar presente los
siguientes:
Gelatina hidrolizada | 2,5% (p/v) |
Cloruro sódico | 150 Mm |
Glutamato sódico | 7 Mm. |
Pueden usarse los siguientes compuestos en lugar
de sacarosa, y a osmolaridad comparable: fucosa, trehalosa, ácido
poliaspártico, hexafosfatode inositol (ácido fítico), ácido siálico
o ácido N-acetilneuramínico-lactosa.
También, puede sustituirse la sacarosa por cualquier azúcar o
alcohol de azúcar adecuado tal como dextrosa, manitol, lactosa o
sorbitol, a concentraciones eficaces par alcanzar la estabilización
deseada.
La concentración de azúcar se refiere a la
viscosidad de la formulación. En casos en los que se desea
viscosidad reducida, es conocido en la técnica que es preferible
usar bajas concentraciones de azúcar, por ejemplo, sacarosa. También
los expertos en la materia apreciarán que el límite superior de la
concentración de azúcar puede venir dictado por la capacidad de una
formulación para experimentar etapas de filtración o procesamiento
requeridas.
También pueden usarse tensioactivos no iónicos
para estabilizar formulaciones líquidas de rotavirus. Un tipo en
particular de tensioactivos no iónicos que puede usarse para
estabilizar realizaciones líquidas de las formulaciones de vacunas
descritas en este documento es polisorbato (ésteres de ácido graso
de polioxietilensorbitán). Las formulaciones líquidas se hacen según
se muestra en este documento con la adición de diversos tipos de
polisorbatos comunes. Los más preferidos son polisorbato 20 y 80
(por ejemplo, Tween® 20 y Tween® 80). Se prefiere que cuando se
añade un tensioactivo no iónico, se use una concentración de
aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,50% de polisorbato 80 o
polisorbato 20 en una formulación líquida. También pueden aplicarse
otros tensioactivos no iónicos para estabilizar formulaciones de
rotavirus. Estos incluyen otros ésteres de polioxietilensorbitán de
ácido graso (polisorbatos) tales como polisorbato 20, 21, 40, 60,
61, 65, 80, 81, 85 y 120, éteres de polioxietilenalquilo tales como
Brij 35®, Brij 58® así como otros incluyendo, pero sin limitarse a,
éteres octilfenólicos de nonaetilenglicol incluyendo Triton
X-100® y NP40®, éteres octilfenólicos de
heptilenglicol incluyen Triton X-114®, triolatos de
sorbitán incluyendo Span 85 y copolímeros de bloque de
polioxietileno y polioxipropileno tales como las series de
tensioactivos no iónicos Pluronic® (por ejemplo, Pluronic 121).
Sólo se necesita titular el tensioactivo y
ensayar la estabilidad de la formulación resultante como se muestra
en este documento para determinar una concentración aceptable de
tensioactivo. El límite superior al cual el nivel de tensioactivo no
es aceptable para una formulación administrada a humanos será cuando
el tensioactivo deje de proporcionar estabilidad añadida a la
formulación o cuando el tensioactivo cause otro efecto negativo. El
nivel inferior será aquel al cual no se observe una mejora en la
estabilidad de la formulación. Se prefiere que el tensioactivo se
use a una concentración de aproximadamente 0,005% a aproximadamente
0,5%. Sin embargo, pueden ser útiles concentraciones de
aproximadamente 0,001%, 0,0025%, 0,005%, 0,0075%, 0,01%, 0,025%,
0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,50%, 1,75%,
2,0%, 2,25%, 2,5% ó 2,75%.
Pueden emplearse aminoácidos en las formulaciones
liofilizadas mostradas en este documento. Se ha encontrado que los
aminoácidos pueden mejorar la estabilidad de una vacuna preparada en
las formulaciones liofilizadas. Los aminoácidos preferidos son
arginina y glutamina. Es apropiada una concentración de
aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 2% del peso seco. Se
prefiere una concentración de aproximadamente el 0,5% a
aproximadamente el 1,25% del peso seco y es más preferida a una
concentración de aproximadamente el 1% del peso seco en
formulaciones liofilizadas. Puede usarse una combinación de
aminoácidos, pero la concentración total de los aminoácidos no deber
ser mayor del 2,0%. Como para el tensioactivo, puede titularse la
concentración de aminoácidos mientras se observa la estabilidad y
cualquier efecto negativo en la formulación. La concentración
concreta de aminoácidos se determina mejor de manera empírica y
puede estar en cualquier punto del intervalo de 0,001% a 2,0%.
Otro excipiente útil tanto en formulaciones para
vacunas líquidas como liofilizadas, como se muestra en este
documento, es albúmina humana recombinante. La albúmina sérica
humana recombinante se produce usando sistemas de expresión génica
y, por tanto, es más seguro que usar albúmina aislada a partir del
suero de seres humanos. La concentración de albúmina típicamente
está en el intervalo de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el
2%, preferiblemente aproximadamente el 1%. Como para el
tensioactivo, la concentración puede titularse mientras se observan
la estabilidad y cualquier efecto negativo en la formulación. La
concentración concreta se determina mejor de forma empírica y puede
estar en cualquier punto del intervalo de 0,001% a 3,0%.
Como diluyente medio de cultivo tisular puede
usarse solución salina o agua. Frecuentemente se usa medio E de
Williams ("WE"), lo que se entiende como medio E de Williams o
medio E de Williams modificado.
También, los agentes tamponadores para
neutralizar el ácido gástrico no se limitan a citrato, fosfato y
succinato y pueden incluir bicarbonato o ácidos carboxílicos comunes
(carboxilatos) tales como, pero no de forma limitante, fumarato,
tartrato, lactato, maleato, etc. La idoneidad de cualquiera de éstos
puede calcularse simplemente ensayando una formulación en la que se
sustituyen o combinan estos agentes con fosfato, citrato o
succinato. Puede usarse hasta aproximadamente 2,0 M de carboxilatos
en las formulaciones líquidas y liofilizadas de esta invención, sin
embargo, se prefiere usar menos de aproximadamente 1,0 M, por
ejemplo aproximadamente 0,05-0,9 M, y puede ser
menos de aproximadamente 0,7 M, por ejemplo, 0,05 a aproximadamente
0,7 M. También se prefiere usar menos de 0,5 M, por ejemplo, de
aproximadamente 0,05 a 0,45 M. Pueden ser apropiadas concentraciones
concretas en estos intervalos. También pueden usarse concentraciones
mayores de componentes tamponadores (por ejemplo, fosfato,
succinato, citrato) si, por ejemplo, se requiere una neutralización
gástrica adicional. En casos en los que en tampones fosfato/citrato
o fosfato/succinato es útil una capacidad tamponadora adicional, es
preferible aumentar adicionalmente las concentraciones de succinato
o citrato en lugar de fosfatos, como agentes tamponadores.
Puede usarse fosfato hasta aproximadamente 2,0 M
en las formulaciones líquidas y liofilizadas de esta invención, sin
embargo, se prefiere usar menos de aproximadamente 1,0 M, por
ejemplo, aproximadamente 0,010-0,8 M, y a menudo
menos de 0,5 M, por ejemplo, aproximadamente 0,010 a 0,45 M. Es más
preferible usar menos de aproximadamente 0,35 M, por ejemplo,
0,010-0,30 M. Pueden ser apropiadas concentraciones
concretas dentro de estos intervalos. En formulaciones líquidas, se
prefiere mantener la concentración de fosfato de aproximadamente o
inferior a 0,30 M, por ejemplo, 0,010-0,35 M para
evitar la precipitación de sales de fosfato, por ejemplo, durante el
almacenamiento a largo plazo o ciclos de congelación/descongelación.
De esta manera, el límite superior para la concentración de fosfato
en cualquier formulación en particular puede venir dictada por la
formación o precipitación de sales de fosfato y si las sales afectan
de forma negativa la realización de la formulación en áreas tales
como estabilidad y administración. Las concentraciones concretas de
cualquier formulación pueden determinarse fácilmente por ensayos
empíricos estándar que incluyen ajustes del pH en el intervalo de pH
6-8.
Como orientación general, se presentan a
continuación en la Tabla 1 ejemplos de las capacidades
neutralizantes de ácidos de algunas formulaciones líquidas.
Fosfato sódico | Citrato sódico | Sacarosa | CNA |
(M) | (M) | (%) | (mEq/ml) |
0,30 | 0,10 | 50 | 0,48 |
0,30 | 0,70 | 50 | 1,55 |
0,75 | 0,25 | 50 | 1,07 |
También se proporcionan para orientación general
algunas formulaciones preferidas. Para formulaciones
liofilizadas:
Fosfato sódico | 20 mM |
Gelatina hidrolizada | 2,5% (p/v) |
Sacarosa | 5% (p/v) |
Cloruro sódico | 150 mM |
Glutamato sódico | 7 mM |
o
Sacarosa o lactosa | 1% (p/v) |
Manitol | 4% (p/v) |
Fosfato sódico o potásico | 0,01-0,1 M |
Una formulación preferida de un estabilizador de
vacuna vírica líquida de la presente invención es como sigue:
Sacarosa | 50% (p/v) |
Fosfato sódico o potásico | 0,1 M |
Succinato sódico | 0,2 M |
Medio de cultivo tisular | usado para todas las diluciones |
o
Sacarosa | 50% (p/v) |
Fosfato sódico o potásico | 0,3 M |
Citrato sódico | 0,1 M |
Medio de cultivo tisular | usado para todas las diluciones |
o
Sacarosa | 30% (p/v) |
Fosfato sódico o potásico | 0,3 M |
Citrato sódico | 0,7 M |
Medio de cultivo tisular | usado para todas las diluciones. |
En estas formulaciones preferidas, puede ser
apropiado usar solución salina o agua en lugar de, o en combinación
con, el medio de cultivo tisular.
Esta invención implica formulaciones de rotavirus
y/o rotavirus reagrupamiento (RRV) adecuados para su uso como
vacunas, que se caracterizan por la seguridad para humanos y la
capacidad para conferir protección inmune contra infección por
rotavirus humanos. Los RRV se producen por reagrupamiento genético
entre un rotavirus bovino atenuado (preferiblemente WC3 o progenie
del mismo) y al menos un rotavirus que representa un serotipo humano
importante desde el punto de vista epidemiológico. En un tipo de
RRV, el rotavirus humano contribuye al reagrupamiento en al menos el
segmento génico que codifica la proteína VP7. En otro tipo de RRV;
el rotavirus parental humano contribuye al reagrupamiento al menos
en el segmento génico que codifica la proteína VP4. Aún en otro tipo
de RRV, la cepa del rotavirus humano parental contribuye al menos en
ambos segmento de los genes VP7 y VP4. En tipos adicionales de RRV,
la cepa del rotavirus humano parental puede contribuir con segmentos
génicos además de aquellos que codifican los antígenos VP7 y/o
VP4.
El gen humano del rotavirus que codifica para el
antígeno de neutralización VP7 y/o VP4 en el RRV, puede
seleccionarse a partir de cualquier serotipo humano de rotavirus
para el cual se desea la inmunización. De forma deseable, en un
reagrupamiento de esta invención el gen de VP7 deriva de un serotipo
humano de rotavirus G1, G2, G3 ó G4 y la proteína VP4 deriva de un
serotipo humano P1 ó P2. Entre las cepas de rotavirus destacadas por
ser clínicamente significativas en infecciones por rotavirus humano
(en lo sucesivo en este documento "cepas de rotavirus
humanos"), incluyendo cepas útiles en la presente invención,
están las cepas proporcionadas a continuación:
- serotipo G1: W179, Wa, D;
- serotipo G2: cepas WISC2 y DS1;
- serotipo G3: cepas W178, P, HCR3A;
- serotipo G4: Bricout (Br) B, ST3;
- serotipo G8: 69M;
- serotipo G9: W161;
- serotipo P1: W179, W178, W161, Wa;
- serotipo P2: DS1; y
- serotipo P3: WISC2, BrB, BrA, M37.
Esta lista de cepas de rotavirus humanos no es
exclusiva. Por ejemplo, varias cepas de rotavirus previamente
identificadas en infecciones animales también se han encontrado en
infecciones humanas. Puede preverse que estas cepas pueden ser
útiles como cepas de rotavirus "humanos" para los fines de esta
invención, por ejemplo, el rotavirus "porcino" OSU, un serotipo
G5, y el rotavirus "bovino" B223, un serotipo G10. Un experto
en la materia puede obtener fácilmente otras cepas humanas
apropiadas a partir de depositarios adecuados o fuentes académicas o
comerciales.
Los genes no humanos presentes en reagrupamientos
se obtienen preferiblemente a partir de la cepa atenuada WC3 de
rotavirus bovino de serotipo G6 o su progenie, descrita en detalle
en la patente de Estados Unidos 4.636.385. Sin embargo, se prefieren
también otros reagrupamientos de rotavirus, particularmente, otros
reagrupamientos bovinos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comprenderá que las cepas mostradas en la
Tabla 2 se han depositado bajo el Tratado de Budapest en referencia
a las Patentes de Estados Unidos Nº 5.626.851 y 5.750.109. Las cepas
se muestran aquí como ejemplo de aquellas que pueden usarse para una
vacuna.
Las vacunas para proporcionar protección
inmunológica contra la diarrea aguda causada por infección por
rotavirus humano pueden contener uno o más rotavirus o
reagrupamientos de rotavirus en una formulación de la presente
invención. Los ejemplos de reagrupamientos de rotavirus y
combinaciones de los mismos y su uso en vacunas se encuentran en las
Patentes de Estados Unidos Nº 5.626.851 y 5.750.109, ambas
incorporadas en su integridad como referencias en este documento. En
la tabla 3 se resumen varios ejemplos de composiciones de
vacunas.
\vskip1.000000\baselineskip
Composiciones de vacunas | Reagrupamientos preferidos |
G1 + G2 + G3 + G4 | W179-3,9 + (W179+WISC2) + |
W178-8 + BrB-9 | |
G1 + G2 + G3 + G4 + P1 | W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + |
W178-8 + BrB-9 + W179-4 | |
G1 + G2 +G3 + P1 | W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + |
W178-8 + W179-4 | |
G1 + P1 | W179-3,9 + W179-4 |
G1 + G2 + G3 | W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + W178-8 |
G1 + G2 + G3 + G4 + | W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + W178-8 |
P1 + P2 | + BrB-9 + W179-4 + DS1-4 |
G1 | W179-3,9 |
\newpage
Las vacunas de rotavirus formuladas de acuerdo
con esta invención pueden contener componentes convencionales. Los
componentes adecuados son conocidos por los expertos en la materia.
Estas composiciones de vacunas pueden prepararse en formas líquidas
o en formas liofilizadas. Pueden añadirse otros componentes
opcionales, por ejemplo, estabilizadores, tampones, conservantes,
aromatizantes, excipientes y similares. La determinación de
formulaciones específicas útiles para estabilizar las composiciones
de vacunas ha requerido amplia experimentación.
Cuando se adapta para administración oral, una
formulación incluye como vehículo medio E de Williams
("WE")/
sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato líquido 50 mM. Otras formulaciones incluyen succinato 0,2 M y fosfato 0,1 M, o citrato 0,1 M y fosfato 0,3 M. Otra formulación incluye citrato 0,7 M y fosfato 0,3 M con medio E de Williams/sacarosa al 30%. Además, los nuevos adyuvantes para estimular o aumentar las respuestas inmunes desarrollados para la administración oral deberían ser compatibles con estas formulaciones. Cuando se adapten para administración parenteral, también pueden emplearse adyuvantes convencionales (por ejemplo, sales de aluminio) o nuevos adyuvantes en la composición de vacuna.
sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato líquido 50 mM. Otras formulaciones incluyen succinato 0,2 M y fosfato 0,1 M, o citrato 0,1 M y fosfato 0,3 M. Otra formulación incluye citrato 0,7 M y fosfato 0,3 M con medio E de Williams/sacarosa al 30%. Además, los nuevos adyuvantes para estimular o aumentar las respuestas inmunes desarrollados para la administración oral deberían ser compatibles con estas formulaciones. Cuando se adapten para administración parenteral, también pueden emplearse adyuvantes convencionales (por ejemplo, sales de aluminio) o nuevos adyuvantes en la composición de vacuna.
De forma opcional, la vacuna puede formularse
preferiblemente para contener otros principios activos y/o antígenos
inmunizantes. Por ejemplo, cuando se adaptan para administración
oral, puede ser deseable una formulación con la vacuna de Sabin
contra la poliomielitis.
La pauta de dosificación implicada en un
procedimiento para vacunación, incluyendo el tiempo, número y
cantidades de vacunas de reinmunización, se determinará considerando
diversos huéspedes y factores medioambientales, por ejemplo, la edad
de los pacientes, el tiempo de administración y la localización
geográfica y entorno.
Por tanto, también se incluye en la invención un
procedimiento de vacunación de humanos contra infecciones por
rotavirus humano con las nuevas composiciones para vacunas de RRV.
Las composiciones para vacunas, incluyendo uno o más de los
reagrupamientos descritos en este documento, se administran
preferiblemente por vía oral, en una dosis adecuada, preferiblemente
líquida.
La dosificación para todas las vías de
administración está generalmente entre 10^{5} y 10^{9} unidades
formadoras de placa (ufp) del reagrupamiento, siendo la dosificación
preferida de 10^{7} ufp. Se pueden administrar también dosis
adicionales de la vacuna. Puede ser preferible inocular a bebés y
niños susceptibles, sobre base anual, antes de la "temporada del
rotavirus". Se ha observado que la infección por rotavirus en
humanos tiene lugar en varias regiones geográficas durante la misma
temporada, por ejemplo, en invierno en los Estados Unidos. Las
inoculaciones repetidas antes de esa temporada pueden estar
indicadas para bebés y niños susceptibles. Por ejemplo, una pauta de
dosificación preferida actualmente para los Estados Unidos incluye
tres dosis con aproximadamente dos meses de diferencia antes del
comienzo de la temporada del rotavirus.
Los siguientes ejemplos ilustran procedimientos
para preparar las formulaciones para vacunas de RRV de la invención.
Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no limitan el alcance de la
invención.
La administración de una vacuna por vía oral
expone la vacuna al bajo pH del entorno gástrico. La mayoría de las
vacunas tienden a inactivarse por tales condiciones extremas. Para
asegurar el suministro de la vacuna activa se examinaron posibles
tampones por su capacidad para neutralizar ácidos, así como su
capacidad para estabilizar el rotavirus.
Se evaluó el efecto en la estabilidad del
rotavirus de combinaciones de tampones de citrato, lactato y
succinato (5 en total) a 37ºC durante un periodo de 1 semana. Los
tampones, cuyas concentraciones se dan en la leyenda de la figura 1,
se añadieron a un volumen igual de rotavirus en medio WE e incubados
durante 0, 3 ó 7 días.
Para el serotipo G1, las combinaciones de
bicarbonato no tenían efecto en el tiempo en la pérdida de la mitad
del título infeccioso (t_{1/2}) ya que los valores eran similares
a los de sacarosa al 5% (0,5 días). Por el contrario, los tampones
fosfato que contenían citrato, lactato y succinato estabilizaban el
virus, exhibiendo valores de t_{1/2} de 1,2, 1,4 y 1,5 días,
respectivamente (figura 1).
Como se muestra en la figura 1, el fosfato tenía
un efecto similar sobre la estabilidad de P1. El tampón
lactato/fosfato tenía una t_{1/2} de 2,4 días y la combinación
succinato/fosfato tenía una t_{1/2} de 6,8 días comparado con un
valor de aproximadamente de 1,2 días para una solución de sacarosa
al 5%. De forma similar a sus efectos sobre el rotavirus G1, las
combinaciones de tampones que contienen bicarbonato conferían menos
estabilidad al serotipo P1 que los tampones similares que contiene
fosfato.
El efecto estabilizante de succinato/fosfato, así
como de otros tampones, sugiere que la formulación puede contener un
neutralizador de ácidos. Un mililitro de los tampones ensayados
parece neutralizar suficiente ácido para mantener el pH por encima
de 3,5 (figura 2), que se conoce de nuestra experimentación directa
y de la bibliografía científica por ser necesario para la prevención
de la capacidad infectiva del rotavirus. En función de los volúmenes
de ácido gástrico de bebés y las tasas de secreción de ácido, el pH
se puede mantener in vivo durante aproximadamente 0,5 h con
las formulaciones líquidas descritas en este trabajo, sin embargo,
tendrán que realizarse estudios clínicos en humanos para confirmar
estas suposiciones. Como otra prueba de la capacidad de
tamponamiento, se realizó la prueba USP para la capacidad
neutralizante de ácidos. Como se muestra en la tabla 4, los
componentes de tamponamiento de la formulación de RV son más
eficaces que un volumen igual de fórmula para bebés.
\vskip1.000000\baselineskip
mEq/ml | |
(1) sacarosa al 50% + succinato sódico 0,2 M | |
+ fosfato sódico 0,1 M en medio E de Williams ("WE") | 0,41 |
(2) bicarbonato sódico 0,3 M + citrato sódico 0,033 M | 0,40 |
(3) Medio E de Williams | 0,02 |
(4) Isomil® | 0,12 |
(5) Mylanta® | 5,17 |
Para formulaciones liofilizadas se puede lograr
una capacidad de tamponamiento adicional mediante la reconstitución
con un tampón neutralizante de ácidos descrito en este documento o
compuestos neutralizantes de ácidos disponibles comúnmente tal como
una solución de bicarbonato. De esta forma, con una formulación
líquida o liofilizada, es posible una capacidad de tamponamiento
adecuada sin pretratamiento. Por consiguiente, la vacuna para
rotavirus se puede administrar preferiblemente en una administración
única, antes que con una etapa de neutralización gástrica por
separado seguida de la vacuna. Si todavía se desea el pretratamiento
de los pacientes (fórmula de alimentación o dosis de bicarbonato o
un antiácido como Mylanta®) para asegurar una neutralización
adecuada de los ácidos gástricos para vacunación oral rutinaria con
rotavirus, estas formulaciones proporcionarán aún un gran aumento en
la estabilidad de almacenamiento como se describe en la siguiente
sección. Además, los reagrupamientos de rotavirus son compatibles
con fórmulas para bebés (por ejemplo, Isomil® y Similac®), así como
tampones de bicarbonato y muestran estabilidad térmica comparable en
presencia o ausencia de estos estabilizadores.
Los sitios de unión posibles en rotavirus se
pueden considerar como dianas para la estabilización. Se ha sugerido
que en las proteínas de rotavirus están presentes los sitios de
unión a calcio y cinc y la presencia de estos cationes puede
estabilizar la vacuna. Otros cationes divalentes pueden unirse
también a estos u otros sitios y estabilizar el rotavirus y sus
reagrupamientos. La unión de otros compuestos también se investigó
para identificar compuestos que puedan estabilizar la vacuna sin
interferir con su capacidad para conferir inmunogenicidad.
Se sabe que la adición de quelantes de metales
tales como EDTA o EGTA causa una pérdida en la capacidad infectiva
de RV, presumiblemente por perturbar la cubierta externa del RV.
Esto sugiere que los metales pueden ser necesarios para la
integridad estructural. Por consiguiente, se examinaron los iones
metálicos divalentes para valorar su capacidad potencial para
estabilizar el rotavirus (RV).
Se dializó el rotavirus en medio WE a 4ºC durante
aproximadamente 16 horas en tampón tris 20 mM y NaCl 100 mM. La
solución final se suplementó con 10 mM de CaCl_{2}, MnCl_{2},
MgCl_{2}, ZnCl_{2} o CaCl_{2} + ZnCl_{2} para rendir una
concentración final de 10 mM del ión metálico. Las muestras se
pueden filtrar antes de la formulación. Las muestras se incubaron a
37ºC durante 0, 2/3 y 7 días y se almacenaron después a -70ºC hasta
que fueron ensayadas. Cada punto de datos representa un promedio de
2 muestras duplicadas.
Como se muestra en la tabla 5, el calcio y el
magnesio mejoran la estabilidad de los reagrupamientos de rotavirus
G1 y P1 a 37ºC cuando las formulaciones se preparan mediante
diálisis de las masas víricas en formulaciones sin medio de cultivo
tisular El cinc disminuye drásticamente la semivida de inactivación
(t_{1/2}) de G1 y disminuye significativamente la t_{1/2} de P1
en presencia o ausencia de calcio. Es posible que el Zn^{2+} pueda
reemplazar al Ca^{2+}, causando la desestabilización de la cápside
externa de forma análoga a la retirada de Ca^{2+} por EDTA. Una
explicación alternativa puede ser que el Zn^{2+} activa las
metaloproteinasas endógenas o potencia las nucleasas derivadas del
cultivo celular. La adición de metales divalentes no aumenta la
estabilidad térmica de RV cuando se formulan en un estabilizador que
contiene medio de cultivo tisular tal como E de Williams o E
modificado de Williams. Los reagrupamientos G2 y G3 parecen
comportarse de forma similar a los reagrupamientos G1 y P1 cuando se
comparan en medios de cultivo tisular suplementado con catión.
De esta manera, cuando se preparan formulaciones
estabilizadas de rotavirus como se describen en este documento, es
preferible que estén presentes niveles suficientes de iones
metálicos divalentes. Estos iones metálicos son proporcionados con
mayor probabilidad por el medio de cultivo tisular y células usadas
en el cultivo celular para preparar la masa vírica. Si es necesario,
los metales iónicos también pueden suplementarse en la formulación
final mediante adición directa individual o a través del uso de
medio de cultivo tisular
\vskip1.000000\baselineskip
Catión añadido (10 mM) | P1 | G1 |
Ninguno | 2,2 | 2,5 |
Ca^{2+} | 0,5 | 0,2 |
Zn^{2+} | >3,8 | >4,0 |
Zn^{2+} + Ca^{2+} | >3,9 | >3,9 |
Mn^{2+} | 1,5 | 2,2 |
Mg^{2+} | 2,6 | 4,2 |
Los experimentos preliminares descritos
anteriormente muestran que los reagrupamientos de rotavirus se
estabilizan por tampón fosfato. Puesto que hay ejemplos de proteínas
monoméricas que se estabilizan por fosfato, que también se
estabilizan por polianiones relacionados tales como sulfato,
hexafosato de inositol (ácido fítico) y diversos compuestos
sulfatados (heparina y \beta-ciclodextrina
sulfatada), se ensayó la capacidad de estos compuestos para
estabilizar rotavirus. Las formas poliméricas de polianiones son
generalmente estabilizadores más eficaces puesto que puede
mantenerse una densidad de carga mayor a concentraciones más bajas
de ligando, por tanto, se examinó también el ácido poliaspártico
debido a su densidad de carga altamente negativa. Se examinó el
ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) ya que
puede unirse a VP4 y, por tanto, puede proporcionar protección
respecto a la degradación o desplegamiento inducido por temperatura.
Así mismo, se ensayaron los derivados de ácido siálico, tales como
ácido N-acetilneuramínico-lactosa y
mucina. Se ha sugerido que la pérdida de capacidad infectiva del RV
con la maduración de hospedador es debida a un intercambio en la
presencia de ácido siálico por fucosa; por consiguiente se examinó
la fucosa. Por último, se examinó la trehalosa por sus reputadas
propiedades como excipiente de secado
favorable.
favorable.
Como puede observarse en la tabla 6, pueden
añadirse diversos compuestos a las formulaciones de rotavirus y
estabilizar el virus durante los ensayos de estabilización
acelerada. El hexafosfato de inositol mostró la mayor capacidad para
estabilizar RV comparado con el resto de ligandos de este estudio.
Para G1 se observó un aumento de 4 veces en la estabilidad térmica a
37ºC. La mucina previene la capacidad infectiva, probablemente no
por desestabilización de la estructura del virión sino porque
secuestra el RV (se observaron agregados antes del ensayo). Los
polímeros sulfatados tuvieron un efecto insignificante, sin embargo,
todos los demás compuestos ensayados estabilizó RV en grado
variable. Por ejemplo, la trehalosa alarga la semivida de la
inactivación de G1 más de 2 veces y de P1 menos del 50%.
El ácido siálico estabilizó tanto RV G1 como P1.
El ácido siálico debería estabilizar los tipos G y no los tipos P si
el sitio de unión se localiza en VP4. En estos experimentos, en
general, P1 parece tener una semivida menor en presencia de
polianiones. La menor t_{1/2} en presencia de heparina y ácido
poliaspártico puede sugerir que RV se une más fuertemente a estos
ligandos antes que ser desestabilizados por ellos. El mecanismo de
supresión de estabilidad no está completamente claro. Un bajo nivel
de capacidad infectiva medido por el ensayo de placa puede estar
causado por la desestabilización de los viriones en sí o por el
secuestro de RV por el ligando. Si la asociación entre RV y el
excipiente es moderada, se esperaría que el ligando se disociara en
condiciones de dilución del ensayo (así como in vivo). Los
complejos fuertemente unidos pueden contener partículas víricas
estables que todavía no son infecciosas ya que son incapaces de
disociarse. Este último caso parece aplicarse a mucina, heparina y
posiblemente a ácido poliaspártico. Tampoco pueden descuidarse los
efectos adversos de los excipientes sobre las células usadas en los
ensayos de placa. A pesar del mecanismo, ciertos polianiones no
proporcionan ventajas. Parece que hexafosfato de inositol es el más
favorable de todos los ligandos examinados, excediendo la
estabilidad inducida por tampones que contienen fosfato. Estos
resultados también apoyan estudios previos descritos en este trabajo
que muestran que el fosfato estabiliza RV de forma dramática. De
esta manera, diversos fosfatos (por ejemplo, monofosfatos y
polifosfatos) y compuestos fosforilados (por ejemplo, azúcares
fosforilados) pueden estabilizar el rotavirus.
\vskip1.000000\baselineskip
añadido a RV en WE | t_{1/2}(días ) para G1 | t_{1/2}(días ) para P1 |
\beta-ciclodextrina sulfatada al 5% | 0,5 | 0,8 |
fucosa al 5% | 1,2 | 1,7 |
ácido poliaspártico al 5% | 1,5 | 0,6 |
hexafosfato de inositol al 1% | 2,0 | 3,2 |
heparina al 1% | 0,7 | <0,1 |
ácido siálico al 1% | 0,8 | 1,4 |
ácido N-acetilneuramínico-lactosa al 1% | 1,2 | 1,5 |
mucina al 1% | <0,1 | <0,1 |
thehalosa al 5% | 1,3 | 2,0 |
sacarosa al 5% | 0,5 | 1,4 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los datos de estabilidad en sonda
de un año para varias formulaciones liofilizadas y líquidas
optimizadas de rotavirus G1 y P1 a diversas temperaturas y comparado
con los datos de estabilidad de una formulación no optimizada, medio
WE/sacarosa al 5%. Las formulaciones líquidas optimizadas que
contienen reagrupamientos de rotavirus en medio WE con sacarosa,
fosfato sódico y succinato sódico o citrato sódico mostraban una
mejora sustancial en la estabilidad. Se observaron mejoras
adicionales en la estabilidad durante el almacenamiento para las
formulaciones liofilizadas. Con la formulación apropiada, la
termoestabilidad del rotavirus excede la de las vacunas líquidas
existentes de virus vivos (es decir, OPV) y liofilizadas (por
ejemplo, sarampión).
El efecto estabilizante de los tampones
succinato/fosfato o citrato/fosfato ofrecen el potencial de combinar
la potenciación de la estabilidad con una neutralización gástrica.
Las formulaciones líquidas, así como las formulaciones liofilizadas
que pueden reconstituirse usando este tampón, pueden permitir que la
formulación se suministre en una administración única.
Cuando se formulan en medio E de William/sacarosa
al 5%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna del
reagrupamiento de rotavirus G1 pierde 0,7 log del título después de
1 año a 4ºC cuando se compara con muestras almacenadas a -70ºC
(figura 3). La vacuna del reagrupamiento P1 pierde 0,2 log en las
mismas condiciones. Después de 6 meses a 22ºC, el reagrupamiento G1
pierde 2,6 log del título de infección mientras que el
reagrupamiento de rotavirus P1 pierden 5,2 log. Este puede
compararse con la formulación líquida no optimizada del
reagrupamiento G1 en medio E de William/sacarosa al 5% que se ha
usado recientemente en ensayos clínicos con una pérdida mayor de 5
log de capacidad infectiva tras la incubación durante 6 meses a 22ºC
y 1-2 log a 4ºC después de un año. Estos datos
demuestran el efecto estabilizante adicional de las combinaciones de
tampón específicas descritas en este
trabajo.
trabajo.
En medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato
0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna de reagrupamiento de rotavirus
G1 pierde 0,8 log de título después de 1 año a 4ºC cuando se compara
con muestras almacenadas a -70ºC (figura 4). La vacuna de
reagrupamiento P1 pierde menos de 0,3 log en las mismas condiciones.
A 22ºC, tanto la vacuna G1 como P1 pierden aproximadamente 2 log de
capacidad infectiva tras 1 año. Estos datos demuestran el efecto
estabilizante adicional de altas concentraciones de azúcar.
Las formulaciones adicionales con altas
concentraciones de tampón (medio E de Williams/sacarosa al
50%/succinato 0,2 M/fosfato 0,1 M, pH 7) estabilizan de forma
adicional la vacuna de rotavirus G1 a 4ºC teniendo como resultado
una pérdida no significativa del título cuando se compara con
muestras similares almacenadas a -70ºC (figura 5). Además, no se
observa pérdida del título de G1 en ninguna de las formulaciones
líquidas optimizadas almacenadas a 4ºC durante un año. La capacidad
infectiva del reagrupamiento P1 es de 0,2 log menos que las muestras
almacenadas a -70ºC para todas las formulaciones (figura 6). Aunque
las estabilidades de los reagrupamientos de rotavirus G1 y P1 a 4ºC
son similares para las formulaciones que usan altas concentraciones
de tampón, la formulación que contiene medio E de Williams/sacarosa
al 50%/citrato 0,1 M/fosfato 0,3 a pH 7 muestra menos perdida a 22ºC
cuando se compara con otras formulaciones. Por ejemplo, el rotavirus
G1 en medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,2 M/fosfato
0,1 M muestra una pérdida de 1,5 log en el título después de un año
a 22ºC, mientras que la formulación de medio E de Williams/sacarosa
al 50%/citrato 0,1 M/fosfato 0,3 M muestra sólo una pérdida de 0,6
log después de este periodo. La mayor concentración de fosfato en la
última formulación puede ser responsable del incremento de la
estabilidad ya que la presencia de fosfato y compuestos fosforilados
aumenta la termoestabilidad de los reagrupamientos de rotavirus,
como se demuestra en experimentos anteriores de análisis. Aunque, el
rotavirus en la formulación tamponada con citrato/fosfato parece ser
más estable a 22ºC, es menos estable a 45ºC para ambos
reagrupamientos y a 37ºC para el rotavirus P1.
Después de 12 meses de 4ºC en medio E de
Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, el
reagrupamiento de rotavirus G2 perdía 0,1 log de capacidad infectiva
y el reagrupamiento G3 disminuía 0,3 log en el título cuando se
comparaba con muestras similares almacenadas a -70ºC (figura 7).
Comparado con los reagrupamientos G1 y P1 en formulaciones similares
(figura 3), G2 y G3 tienen estabilidades comparables a las del
reagrupamiento de rotavirus P1 y mejores que las obtenidas con el
reagrupamiento G1 a 4ºC. Sin embargo, las vacunas de G2 y G3 parecen
ser menos estables que la vacuna G1 a 22ºC.
Se estudió la estabilidad de los reagrupamientos
G1 en presencia y ausencia de medio de cultivo tisular en
formulaciones que incluyen sacarosa, fosfato y citrato (tabla 7). La
formulación A que sólo contiene sacarosa al 5% en WE, sirvió como
estándar en este estudio. La formulación de ensayo B contiene
fosfato sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M con sacarosa al 50% en
WE. La formulación de ensayo C contiene sacarosa al 50%, fosfato
sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M sin WE. La masa vírica se diluye
10 veces en las formulaciones B o C. De esta manera, el 100% del
medio líquido en B es medio de cultivo tisular, mientras que el 10%
del medio líquido en C es medio de cultivo tisular. En C, la masa
vírica es la única fuente de medio de cultivo tisular. Como se
muestra en la tabla 7, las formulaciones B y C mostraron mayor
estabilidad que la formulación A. La presencia o ausencia de medio
de cultivo tisular tiene un pequeño, aunque mesurable, efecto sobre
la estabilidad del rotavirus a 30ºC (compárese B y C, tabla 7). Este
efecto fue mayor a 37ºC, pero aún pequeño comparado con el estándar
(formulación A). Estos datos indican que un amplio intervalo de
concentración (10-100%) de medio de cultivo tisular
es aceptable par lograr una estabilidad
mejorada.
mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
A | B | C | |
Pérdida tras 1 semana a 30ºC | 3,2 | 0,7 | 0,6 |
Pérdida tras 1 semana a 37ºC | >6,5 | 0,6 | 1,0 |
Para examinar el efecto del medio de cultivo
tisular a proporciones de volumen de menos del 10%, se empleó la
diálisis para eliminar completamente el medio de cultivo tisular de
la masa vírica. Cuando se preparó una formulación líquida de
rotavirus a partir de la masa vírica dializada, conteniendo, de esta
manera, un 0% de medio de cultivo tisular en la formulación final,
estas preparaciones se inactivaban más rápido que las preparaciones
en las que la masa de rotavirus se diluyó simplemente en un
estabilizador sin medio de cultivo tisular (dando como resultado una
presencia de medio de cultivo tisular en la formulación final para
vacuna del 10%). Esto sugiere que la diálisis puede haber retirado
los componentes estabilizantes esenciales que están presentes en el
medio de cultivo tisular WE. En ausencia de una cantidad eficaz de
medio de cultivo tisular, pueden añadirse cationes divalentes tal
como calcio a la formulación para vacuna dializada para mejorar la
estabilidad (véase tabla 5). La diálisis a varias escalas de
procesamiento se puede realizar también usando procedimientos de
diafiltración o ultrafiltración.
La estabilidad de los reagrupamientos G1 se
estudió sobre un intervalo de pH. El reagrupamiento de rotavirus G1
se formuló en el estabilizador fosfato sódico 0,3 M/citrato sódico
0,1 M/sacarosa al 50% a diferentes valores de pH. El título vírico
indica que bajo condiciones de estabilidad acelerada, la estabilidad
del reagrupamiento G1 es mayor en el intervalo desde aproximadamente
pH 4,0 a aproximadamente pH 8,0, especialmente entre aproximadamente
pH 5,0 y aproximadamente pH 7,0. Por "pH aproximado" se
entiende dentro de aproximadamente 0,3 unidades del valor de pH
indicado.
\newpage
1 mes a 30ºC | 1 mes a 37ºC | |
pH 3 | 4,6 | >6 |
pH 4 | 1,3 | >6 |
pH 5 | 1,3 | 1,5 |
pH 6 | 1,3 | 1,4 |
pH 7 | 1,4 | 2,2 |
pH 8 | 1,6 | >6 |
Las vacunas de G1 mostraron una pérdida de 0,3
log después de un año a 22ºC en una formulación liofilizada de
sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a pH 7 (figura 8).
Las formulaciones que contienen sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato
sódico 75 mM a pH 7 no mostraron pérdidas significativas después de
un año a temperaturas de 22ºC o inferiores. Las vacunas de P1
mostraron menor estabilidad que las formulaciones correspondientes
de G1. En sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a 4ºC
durante un año, el reagrupamiento P1 muestra una pérdida en el
título de 0,4 log cuando se comparaba con la vacuna almacenada a
menos 70ºC (figura 9). Una formulación similar con más fosfato
muestra una pérdida de la capacidad infectiva de menos de 0,2 log.
La vacuna de P1 en un estabilizador de fosfato, sacarosa y gelatina
hidrolizada no muestra una pérdida significativa después de un año a
4ºC. Estas formulaciones liofilizadas se prepararon diluyendo 10
veces la masa del rotavirus en el estabilizador (concentración final
de medio de cultivo tisular del 10%) o mediante diálisis de la masa
del rotavirus en el estabilizador (retirada completa del medio de
cultivo tisular).
Se han identificado varias formulaciones
optimizadas para una vacuna líquida contra rotavirus. Una
formulación estabilizante final consiste en sacarosa al 50%, fosfato
0,1 M, citrato 0,2 M y WMEM a pH 6,2. La formulación estabilizante
tiene una capacidad neutralizante de ácidos (CNA) de 0,8 mEq/2 ml de
dosis. La adición a este estabilizador de polisorbato 80 o
polisorbato 20 mejoró de forma adicional la estabilidad del
reagrupamiento de rotavirus G1. Como se muestra en la tabla 9, en la
formulación optimizada que contiene 0,01-0,1% de
polisorbato, el rotavirus G1 tiene estabilidad mejorada de 4ºC a
30ºC, comparado con la formulación optimizada sin polisorbato.
Los tensioactivos no iónicos que tienen
propiedades similares a los polisorbatos 20 y 80 pueden ser útiles
para estabilizar formulaciones líquidas de rotavirus. Estos incluyen
otros ésteres de polioxietilensorbitán de ácido graso
(polisorbatos), como polisorbato 21, 40, 60, 61, 65, 81, 85 y 120,
ésteres de polioxietilenalquilo como Brij 35®, Brij 58®, así como
otros que incluyen, aunque sin limitación, éteres octilfenólicos de
nonaetilenglicol incluyendo Triton X-100® y NP40®,
éteres octilfenólicos de heptilenglicol incluyendo Tritón
X-114®, triolatos de sorbitán, incluyendo Span 85 y
copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno tales
como las series Pluronic® de tensioactivos no iónicos (por ejemplo,
Pluronic 121).
\newpage
De forma similar, una vacuna pentavalente contra
rotavirus que contiene los reagrupamientos de rotavirus G1, G2, G3,
G4, P1 se estabiliza también por la presencia de polisorbato 80 en
una formulación que contenga un 15% de masas víricas en medio de
cultivo tisular y un 85% de estabilizador (con o sin medio de
cultivo tisular). La concentración final fijada es sacarosa al
50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/pH 6,2 con 15% ó \sim100% de medio
de cultivo tisular. Después de un mes a 25ºC, la vacuna pentavalente
muestra una estabilidad mejorada en formulaciones que contienen
polisorbato 80 comparado con las vacunas formuladas sin polisorbato
80, como se muestra en la tabla 10.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de almacenamiento a largo plazo a
4ºC tanto de vacunas monovalentes como pentavalentes contra
rotavirus en una formulación líquida que contiene polisorbato 80 se
ha demostrado por un periodo de 8 meses medido mediante ensayos de
formación de placas víricas. La formulación para vacuna contiene 15%
de masa vírica en medio de cultivo tisular y 85% de estabilizador
con una concentración final fijada de sacarosa al 50%/fosfato 0,1
M/citrato 0,2 M/pH 6,2/polisorbato 80 al 0,01%. Las pérdidas
estimadas a 4ºC se dan en la tabla 11 comparado con controles a
-70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Reagrupado | Cambio de potencia media |
(log UFP) | |
G1 | -0,05 |
G2 | -0,15 |
G3 | 0,13 |
G4 | 0,01 |
P1 | -0,01 |
Pentavalente | 0,12 |
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de formulaciones líquidas de
vacunas contra rotavirus puede mejorarse también por la adición de
albúmina humana recombinante (AHr). Como se muestra en la figura 10,
el rotavirus G1 formulado con uno de los estabilizadores líquidos
optimizados sin AHr pierde aproximadamente un log de la potencia
después de cuatro semanas a 30ºC en este experimento (sacarosa al
50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/medio de cultivo tisular/pH 6,2). La
estabilidad vírica a esta temperatura se mejora significativamente
por la adición de AHr al 0,1% (p/v) ó al 1,0% al mismo
estabilizador. Las albúminas de otras fuentes, como albúmina sérica
bovina (BSA) o albúmina sérica humana purificada de suero (HSA)
pueden tener efectos estabilizantes similares a los de AHr en
formulaciones para rotavirus. Sin embargo, se prefiere la albúmina
recombinante debido a su procedimiento de preparación.
Se han identificado varias formulaciones
estabilizantes para una vacuna liofilizada contra rotavirus. Estas
formulaciones incluyen sacarosa al 1%, manitol al 4%, medio de
cultivo tisular al 50% y fosfato sódico 10 mM a pH 6,5. La
estabilidad del rotavirus liofilizado se mejora además por la
adición de hasta 0,1% (p/v; 10 mg/ml) de arginina al estabilizador.
Las estabilidades de los rotavirus reagrupados G1 y G2 se mejoran
además a temperaturas en el intervalo de 4-37ºC por
la adición de arginina (tabla 12). La inclusión de arginina mejora
generalmente la estabilidad del rotavirus como se puede observar en
la tabla 13. Como se muestra en la tabla 14, otros aminoácidos
incluidos en el estabilizador sacarosa/manitol también mejora la
estabilidad del rotavirus a 37ºC.
Se ha diseñado un tampón de reconstitución para
formulaciones liofilizadas. Proporciona una capacidad neutralizante
de ácidos adicional necesaria para tamponar el ácido gástrico. Este
tampón consiste en sacarosa al 50% y citrato sódico 0,7 M a pH 7 y
tiene una CNA de 1,5 mEq/ml. No se observó pérdida de potencia del
rotavirus G1 después de su reconstitución e incubación durante 30
min a 37ºC ó 2 horas a 30ºC.
Concentraciones más bajas de sacarosa (intervalo
= 0-50%) y citrato (intervalo
0,2-0,7 M) también tendrán el efecto deseado. Se
pueden usar estas concentraciones más bajas de sacarosa y citrato en
el tampón de reconstitución si se incrementa el volumen de
reconstitución.
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\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Una formulación para vacuna líquida contra
rotavirus que comprende:
a) al menos una cepa de rotavirus: de
aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 1000 x 10^{5}
ufp/ml;
b) azúcar: de aproximadamente 1 a aproximadamente
70% (p/v);
c) fosfato: de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 2 M;
d) al menos un carboxilato: de aproximadamente
0,05 a aproximadamente 2 M;
caracterizado porque comprende además
al menos un componente seleccionado entre el
grupo constituido por
e) aproximadamente del 0,5% a aproximadamente el
1,25% de albúmina de suero humano recombinante, y
f) aproximadamente del 0,001% a aproximadamente
el 2% de un tensioactivo no iónico
2. La formulación de la reivindicación 1 en la
que dicho al menos un carboxilato se selecciona entre el grupo
constituido por succinato, citrato, fumarato, tartrato, maleato y
lactato.
3. La formulación según la reivindicación 1 en la
que dicho azúcar se selecciona entre el grupo constituido por
sacarosa, manitol, lactosa, sorbitol, dextrosa, fucosa, trehalosa,
ácido poliaspártico, hexafosfato de inositol (ácido fítico), ácido
siálico o ácido
N-acetilneuramínico-lactosa.
4. La formulación líquida para vacuna de la
reivindicación 1 que comprende además:
g) al menos un diluyente seleccionado entre el
grupo constituido por medio de cultivo tisular, solución salina y
agua hasta completar el volumen.
5. La formulación de la reivindicación 1 en la
que la concentración de azúcar está entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 70%; la concentración de fosfato está entre
aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3 M; y dicho al menos un
ácido carboxílico es citrato o succinato a una concentración entre
aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,7 M.
6. La formulación según la reivindicación 1 en la
que el pH está entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH
8,0.
7. La formulación según la reivindicación 1 en la
que dicho fosfato se selecciona entre el grupo constituido por
monofosfatos, polifosfatos y compuestos fosforilados.
8. La formulación según la reivindicación 7 en la
que dichos compuestos fosforilados son azúcares fosforilados.
9. La formulación según la reivindicación 1 en la
que el tensioactivo no iónico se selecciona entre el grupo
constituido por polisorbatos, ésteres de polioxietilenalquilo,
éteres octilfenólicos de nonaetilenglicol, éteres octilfenólicos de
heptilenglicol, triolatos de sorbitán y copolímeros de
polioxietileno-polioxipropileno.
10. La formulación según la reivindicación 1 en
la que la concentración de tensioactivo está entre aproximadamente
el 0,005% y aproximadamente el 0,5%.
11. Una formulación liofilizada para vacuna
contra rotavirus que comprende:
a) al menos una cepa de rotavirus: de
aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 1000 x 10^{5}
ufp/ml;
b) al menos un azúcar: aproximadamente del 1% a
aproximadamente el 20% (p/v);
c) fosfato: de aproximadamente 0,05 a
aproximadamente 2 M;
caracterizado porque comprende además
al menos un componente seleccionado entre el
grupo constituido por
d) aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el
1,25% de albúmina sérica humana recombinante y
\newpage
e) aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el
1,25% de al menos un aminoácido seleccionado entre el grupo de
aminoácidos constituido por glutamato, glutamina y arginina.
12. La formulación según la reivindicación 11 en
la que dicho al menos un azúcar se selecciona entre el grupo
constituido por sacarosa, manitol y lactosa.
13. La formulación de la reivindicación 11 que
comprende
a) al menos un azúcar seleccionado entre el grupo
constituido por sacarosa y lactosa: aproximadamente al 1% (p/v);
b) manitol: aproximadamente al 4% (p/v) y
c) fosfato: de aproximadamente 0,010 a
aproximadamente 0,075 M.
14. La formulación según la reivindicación 11 en
la que después de la reconstitución, el pH está entre
aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 7,0.
15. Un procedimiento para preparar formulaciones
para vacunas contra rotavirus que comprende:
a) cultivar un rotavirus y mezclar el rotavirus
con una solución estabilizante concentrada para formar una mezcla
concentrada; y, opcionalmente,
b) dializar la masa vírica o la mezcla
concentrada para formar una solución de vacuna contra rotavirus;
en el que la solución de vacuna incluye al menos
un componente seleccionado entre el grupo constituido por (i) del
0,5% a aproximadamente el 1,25% de albúmina sérica humana
recombinante aproximadamente y (ii) del 0,001% a aproximadamente el
2% de un tensioactivo no iónico aproximadamente y (iii) del 0,1% a
aproximadamente el 1,25% de al menos un aminoácido aproximadamente
seleccionado entre grupo de aminoácidos constituido por glutamato,
glutamina y arginina.
16. El procedimiento de la reivindicación 15 que
comprende además la liofilización de la solución de vacuna.
17. La formulación para vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para uso en terapia.
18. Uso de una formulación para vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la fabricación de un
medicamento para la prevención de una enfermedad causada por la
infección con rotavirus.
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