ES2966060T3 - Composiciones estables de adenovirus - Google Patents
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Abstract
Se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen adenovirus, que están libres de glicerol y que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más tipos de adenovirus; un sistema tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina; una mezcla crioprotectora particular; albúmina; y una mezcla particular de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio. También se refiere a un método para preparar dichas composiciones farmacéuticas, así como a sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones estables de adenovirus
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de las formulaciones de adenovirus y a métodos para prepararlas.
Antecedentes de la técnica
Por un lado, es ampliamente conocido que los virus se utilizan como herramientas para el suministro de ácidos nucleicos a las células diana y, por tanto, se emplean como vehículos de suministro de genes para terapias génicas, pero también como herramientas de biología molecular en investigación. Por otro lado, también se emplean algunos virus inactivados y atenuados en formulaciones de vacunas.
En cualquiera de los usos particulares de los virus antes mencionados, las partículas de virus tienen que mantener su estructura, no sólo para poder infectar las células sino también para realizar su actividad biológica, sea cual sea. Sin embargo, las partículas víricas se dañan durante los procesos de formulación, así como por las temperaturas moderadas o altas. Por este motivo, muchos de los virus para terapia génica y herramientas de biología molecular se formulan en tampones que contienen glicerol y luego se almacenan a -80 °C. Esta metodología es costosa debido a la necesidad de bajas temperaturas para el almacenamiento, por lo que es difícil de poner en práctica en zonas remotas y su implementación es baja. Además, esta metodología que utiliza glicerol tiene la desventaja de que el glicerol es tóxico para las células y debe eliminarse de la formulación antes de su uso o, al menos, la formulación con la cantidad deseada de virus debe disolverse para que el glicerol permanezca en niveles no tóxicos.
Otra metodología ampliamente empleada para la formulación de composiciones de virales estables es la liofilización. Con la liofilización se espera una estabilidad del virus mejorada en el almacenamiento a largo plazo, debido a la reducción del contenido de agua en la formulación. Esta metodología se emplea para formulaciones que comprenden adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus del herpes, rotavirus, virus de la viruela y virus de la variolovacuna. Una formulación liofilizada también es útil durante la manipulación de este tipo de material biológico en zonas cálidas o en los casos en los que no es posible la refrigeración durante un tiempo (es decir, durante campañas de vacunación en países cálidos).
En términos generales, las formulaciones estables de adenovirus (y de otros tipos de virus) incluyen las partículas víricas en un agente de carga y uno o más protectores como excipientes farmacéuticos. El agente de carga es principalmente un azúcar o una mezcla de azúcares con el objetivo de servir como sólido principal en una torta liofilizada que comprenda adenovirus. También se emplean composiciones de tampón como excipientes. En el caso particular de las formulaciones liofilizadas los excipientes contienen protectores, tales como crioprotectores y/o lioprotectores (a veces siendo el mismo compuesto). Los ejemplos de este tipo de protectores son los azúcares no reductores, tales como trehalosa o sacarosa. Los lioprotectores particulares son albúmina, aminoácidos, maltodextrinas y tensioactivos, tales como Tween-20. La albúmina también se utiliza como proteína para estabilizar. Se describen ejemplos de formulaciones de virus estables en la solicitud de patente con número de publicación US20080102508 (Introgen Therapeutics Inc.). En este documento se divulga la estabilidad a largo plazo de varias composiciones que contienen adenovirus liofilizadas. Las composiciones liofilizadas comprenden manitol (al menos el 3 % en peso), seroalbúmina humana, glicerol (al 1 % en peso), sacarosa y tampón Tris con MgCh. Al determinar la recuperación de partículas víricas (usando HPLC) y las unidades formadoras de placa (UFP), se concluye que los virus son estables a las dos temperaturas sometidas a ensayo (-20 °C y 4 °C), y también que la humedad residual después del secado es un parámetro importante. afectando a la estabilidad en el almacenamiento. El documento US20080102508 también divulga composiciones líquidas estables que contienen adenovirus. Estas composiciones líquidas comprenden una mezcla de excipientes seleccionados de manitol, sacarosa, glicina, arginina, urea, polietilenglicoles, todas combinaciones divulgadas en tampón tris 10 mM con glicerol al 1 % y MgCh 1 mM. Aunque las formulaciones divulgadas en el documento US20080102508, ya sea liofilizadas o líquidas, son eficaces en términos de conservar la estructura del virus, el glicerol también está presente y, por tanto, se debe diluir hasta niveles no tóxicos antes de su uso.
Además, el documento de patente con número de publicación US7456009 (Merck & Co, Inc) divulga formulaciones líquidas de virus con estabilidad potenciada en un intervalo de temperaturas de 2-8 °C. Las formulaciones comprenden adenovirus, inhibidores de la oxidación de radicales libres y un azúcar. En algunos ejemplos particulares, las formulaciones están tamponadas con Tris-HCl y comprenden histidina o EDTA, NaCl, MgCh o CaCh, sacarosa, polisorbato-80 y manitol. Las composiciones estables ilustradas después de los ciclos de congelación y descongelación son composiciones tamponadas con Tris que comprenden polisorbato-80, sacarosa, NaCl y MgCh. Aunque se ilustran múltiples formulaciones como estables en el intervalo de 2-8 °C a un pH neutro, y son líquidas y están listas usar, por ejemplo, como vacunas intramusculares, pocas son las composiciones ilustradas que pueden liofilizarse.
Para finalizar, otra desventaja en la preparación de formulaciones de adenovirus, en particular las que deben liofilizarse posteriormente, es el valor del pH y el sistema de tampón utilizado para garantizar el mantenimiento del pH durante la manipulación. Por un lado, los sistemas tampón a base de fosfato tienden a precipitar durante la liofilización y esto daña las partículas víricas. Es por esta razón que muchas composiciones de adenovirus están tamponadas con Tris-HCl, que no precipita. Sin embargo, el uso de un tampón protonado (Tris-HCl, por ejemplo) implica el inconveniente de que durante la liofilización, mientras se congela la composición, se forman algunos microentornos. En estos microentornos y debido a la presencia de protones (H+) del sistema de tampón, el pH disminuye y las condiciones ácidas también dañan las partículas del virus.
Por tanto, todavía existe la necesidad de proporcionar formulaciones de virus estables, así como la necesidad de formulaciones que puedan procesarse tanto como formulaciones líquidas como liofilizadas, sin los inconvenientes mencionados anteriormente.
Sumario de la invención
Los inventores proporcionan en el presente documento formulaciones de adenovirus estabilizadas o composiciones farmacéuticas que contienen adenovirus que se pueden utilizar en terapia génica o para vacunación. De manera ventajosa, a pesar de que las formulaciones propuestas no contienen glicerol, son estables en forma liofilizada durante un largo período de tiempo, así como en forma líquida. Las formulaciones líquidas estables permiten el procesamiento a escala industrial, como se representará a continuación, sin comprometer la estructura del adenovirus, principalmente la nucleocápside, garantizando así la cantidad de unidades infecciosas efectivas. Los inventores desarrollaron formulaciones de adenovirus óptimas para la liofilización, en donde los adenovirus liofilizados permanecen estables y tienen una humedad residual del 1 % al 3 %. Esta humedad residual (HR) es la cantidad de agua unida que permanece en un producto liofilizado después de finalizar el ciclo de liofilización. La técnica Karl-Fisher para probar la humedad residual determina el contenido de agua mediante titulación culombimétrica. Esto se mide como el porcentaje en peso de agua restante con respecto al peso total del producto seco. La HR es un indicador de la estabilidad ya que la exposición a la humedad durante el almacenamiento puede desestabilizar un producto.
Por tanto, un primer aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene adenovirus, que está exenta de glicerol, que comprende:
- una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un tipo de adenovirus;
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
Sorprendentemente, los inventores han descubierto que con la combinación particular de crioprotectores y utilizando como tampón también la combinación particular de Tris y glicina, se podían obtener formulaciones estables de adenovirus, de tal manera que no se producía ninguna pérdida significativa de unidades infecciosas en las composiciones liofilizadas medidas en diferentes tiempos de almacenamiento. Además, esta propiedad de estabilidad podría lograrse con formulaciones sin glicerol. Por tanto, se puede evitar cualquier etapa adicional de disolución o eliminación del glicerol tóxico antes de su uso. Las cantidades particulares de los compuestos permitieron, además, minimizar la pérdida de unidades infecciosas durante la liofilización. Además, la combinación de compuestos con el sistema de tampón que comprende Tris y glicina dio como resultado una composición con un pH que se mantuvo en líquido y durante la liofilización.
Como se ilustrará en los ejemplos, la protección de las partículas de virus se realizó en líquido, pero también durante la liofilización de la composición, y una vez liofilizada. Esto se debió principalmente a que todos estos componentes en la composición abarcaron partículas de adenovirus en un comportamiento que no dañó las proteínas del virión para la penetración en las células diana. Además, la presencia de albúmina favoreció la adsorción de las partículas víricas en la misma, que a su vez tenía como objetivo proteger las partículas de las proteasas. Para finalizar, como un conocido compuesto lioprotector, la albúmina también ayudó en el proceso de liofilización para obtener una torta estable junto con los sólidos restantes, principalmente trehalosa, manitol y sacarosa.
Particularmente ventajoso es el sistema de tampón que comprende Tris y glicina. Este sistema de tampón aprótico amortiguó de forma eficaz la composición en forma líquida y liofilizada, así como durante el proceso de liofilización, evitando al mismo tiempo la presencia de protones (H+) en la mezcla. Como se indicó anteriormente, los protones favorecen la reducción del pH en los microentornos creados durante la liofilización. Esta bajada del pH es responsable del daño de las partículas víricas, principalmente debido a un proceso de agregación.
Por tanto, también se describe el uso de un sistema de tampón aprótico que comprende Tris y glicina en una composición que comprende adenovirus. Usar un búfer de este tipo es, en particular, ventajoso para formulaciones con adenovirus que van a ser liofilizadas. Como se representará a continuación, el mantenimiento del pH de 7 a 9 con este sistema de tampón aprótico implicó un menor grado de agregación de partículas, cuya agregación se traduce en una pérdida de funcionalidad. Además, este sistema de tampón aprótico también contribuyó, junto con los otros ingredientes de la composición, a estabilizar la composición en términos de unidades infecciosas.
También se divulga una composición farmacéutica que contiene adenovirus que comprende uno o más tipos de adenovirus y un sistema de tampón aprótico que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina.
Un segundo aspecto de la invención es un método para preparar una composición farmacéutica que contiene adenovirus como anteriormente, comprendiendo el método las siguientes etapas:
(a) preparar una solución en agua añadiendo una mezcla crioprotectora que comprende trehalosa, manitol, sacarosa; un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina; y una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio;
(b) filtración de esterilización de la solución obtenida en la etapa (a);
(c) añadir albúmina en condiciones estériles;
(d) mantener la solución de la etapa (c) en refrigeración a una temperatura de 2 °C a 10 °C y en agitación durante el período de tiempo necesario para obtener una solución homogeneizada que comprende el sistema de tampón, las sales inorgánicas y la mezcla crioprotectora;
(e) mezclar la solución homogeneizada de la etapa (d) con una cantidad eficaz de adenovirus para obtener una composición de adenovirus líquida.
Este método se puede realizar en condiciones económicas en términos de tiempo necesario para llevar a cabo el proceso, en términos de reactivos empleados y en términos de dispositivos y herramientas necesarios.
Las composiciones farmacéuticas como se definen anteriormente que comprenden uno o más tipos de adenovirus se pueden utilizar como fuente de unidades infecciosas de adenovirus eficaces y, por tanto, se pueden utilizar en muchos de los usos comunes en los que habitualmente se emplean los adenovirus. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden usar como vacunas para propiciar una respuesta contra el tipo o tipos de adenovirus seleccionados. Por tanto, otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica como se define anteriormente para su uso como vacuna. Otros usos del adenovirus incluyen la terapia genética de determinados cánceres. Por tanto, en otro aspecto más, la invención se refiere a la composición farmacéutica como se define anteriormente para su uso como agente de terapia génica.
La invención también divulga composiciones tamponadas adecuadas para estabilizar adenovirus, en particular cuando estos deben almacenarse en forma liofilizada, estando dichas composiciones exentas de glicerol y comprendiendo: - un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
Esta composición tamponada corresponde, en efecto, a la misma composición divulgada en el primer aspecto pero sin partículas de adenovirus. La composición tamponada supone una composición intermedia preparada para recibir cualquier cantidad deseada de partículas de adenovirus, y que garantiza la conservación de estas partículas en forma líquida y liofilizada. Como anteriormente, no se utiliza glicerol en la conservación del adenovirus y, por tanto, ya no es necesario eliminarlo, abriendo así la opción de mantener el adenovirus en una mezcla que no sea tóxica y que pueda usarse directamente como composición farmacéutica para mamíferos, incluyendo el ser humano.
Otro aspecto de la invención es el uso de una composición tamponada que comprende:
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio; como composición estabilizante de adenovirus.
Descripción detallada de la invención
Todos los términos y las expresiones que se usan en el presente documento en la presente solicitud, a menos que se indique de otro modo, se entenderán en su significado habitual, como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas de determinados términos utilizados en la presente solicitud son tal como se exponen a continuación y están destinados a aplicarse de manera uniforme a lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que una definición expuesta expresamente de otro modo proporcione una definición más amplia.
La expresión "formulación de adenovirus" o "composición que contiene adenovirus" se utilizan en el presente documento como expresiones sinónimas y se refieren a composiciones en las que, además de la cantidad deseada de partículas víricas, también hay excipientes apropiados que acompañan a dichos virus. Estas composiciones están en una forma seleccionada de una forma sólida, en particular como un polvo fino, liofilizada o seca; como comprimidos formados por compresión; como cápsulas que contienen el polvo fino; o en forma líquida.
El término "estable" significa que a pesar de los ciclos de congelación y descongelación la composición de adenovirus tiene una infectividad del 60 al 100% con relación con la infectividad inicial y después de haber sido liofilizada y almacenada a una temperatura de 5 °C a -20 °C. La infectividad se determina y mide como unidades infecciosas (UI), que son el número de partículas víricas infecciosas, por tanto, partículas víricas funcionales. Existen muchos protocolos estandarizados para el título de unidades infecciosas en una muestra. Un protocolo estandarizado es aquel en el que la composición con las partículas víricas se utiliza en diferentes diluciones para infectar líneas celulares preparadas para expresar un gen entrans(gen E1) necesario para expresar el hexón adenovírico. La proteína de hexón es necesaria para la replicación adenovírica. Esta proteína de hexón se detecta luego en las células mediante inmunoensayo. Se utiliza un anticuerpo anti-hexón junto con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y se detecta mediante colorimetría cuando la HRP reacciona con diaminobencidina (DAB). Sólo se produce un precipitado oscuro en las células que expresan la proteína de hexón. A continuación, estas células oscuras se cuentan al microscopio de laboratorio convencional para calcular el título viral extrapolando a una curva patrón. La fórmula para obtener las UI/ml es la siguiente:
Número promedio de células positivas/campo x campo/pocillo) / (Volumen de virus diluido utilizado por pocillo (ml) factor de dilución). Un ejemplo de un kit para realizar tal protocolo es el kit de valoración viral AdEasy (Agilent Technologies).
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar hasta cierto punto, uno o más de los síntomas de la enfermedad que se está tratando. La dosis particular del compuesto administrado de acuerdo con la presente invención, se determinará, por supuesto, según las circunstancias particulares del caso, incluido el compuesto administrado, la vía de administración, la afección particular a tratar y las consideraciones similares.
La expresión "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros principios de la composición farmacéutica. Estos también deben ser adecuados para su uso en contacto con el tejido u órgano de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable. Un "crioprotector" es una sustancia utilizada para proteger un tejido biológico, tal como partículas de adenovirus, de los daños por congelación (es decir, debidos a la formación de hielo). Los crioprotectores actúan aumentando la concentración de solutos en las células. Sin embargo, para ser biológicamente viables deben penetrar fácilmente y no deben ser tóxicos para las células. De manera similar a los crioprotectores, algunas moléculas protegen el material liofilizado y se denominan "lioprotectores", estas moléculas son normalmente compuestos polihidroxi tales como azúcares (mono-, di- y polisacáridos), polialcoholes y sus derivados. La trehalosa y la sacarosa son lioprotectores naturales. Algunas moléculas están etiquetadas como crioprotectores y lioprotectores. Otros lioprotectores conocidos incluyen albúmina (es decir, seroalbúmina humana), polietilenglicol, glicina, prolina, lisina, alanina, algunos tensioactivos tales como polisorbato-20 u -80, maltodextrinas y determinados almidones. Cuando en la presente invención, se mencionan la trehalosa, la sacarosa y el manitol, incluyen cualquier forma deshidratada o hidratada de los mismos. De la misma manera, se incluyen cualesquiera sales y ésteres farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de formas hidratadas son, en particular, la trehalosa dihidrato. Siendo los compuestos de la mezcla crioprotectora de la invención azúcares con varios grupos alcohol (-OH), también se pueden utilizar ésteres de ellos con ácidos orgánicos no tóxicos. Los ejemplos de ácidos orgánicos son los ácidos carboxílicos de fórmula CO<2>-alquilo (C<1>-C<19>) o CO<2>-alquenilo (C<1>-C<19>), definiendo así un alcanoílo (C<1>-C<20>) o sustituyentes alquenoílo que esterifican uno o más de los grupos -OH en los azúcares. En particular, los azúcares están esterificados con ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en ácido laurílico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esterárico y ácido oleico. El término "sal" utilizado en el presente documento se refiere a "sales farmacéuticamente aceptables" formadas a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables que incluyen ácidos inorgánicos u orgánicos. No hay limitación con respecto a las sales, a excepción del uso con fines terapéuticos, deben ser farmacéuticamente aceptables. Además, el concepto de "sal" abarca cualquiera de las formas hidratadas o deshidratadas de la misma. En el caso particular del dicloruro de magnesio, éste incluye dicloruro de magnesio hexahidratado.
El término "vacuna" como se usa en el presente documento, se refiere a una composición inmunogénica acompañada de excipientes y/o transportadores adecuados, que cuando se administra a un animal, provoca o puede provocar, directa o indirectamente, una respuesta inmunitaria en el animal. Particularmente, las vacunas de la presente invención suscitan una respuesta inmunológica en el hospedador de tipo celular o mediada por anticuerpos tras la administración al sujeto que es protectora. El término "inmunogénico" o "composición inmunológica" se refiere al material que suscita en el hospedador una respuesta inmunológica de tipo celular o mediada por anticuerpos a la composición tras su administración a un vertebrado, incluidos seres humanos.
Por "agente de terapia génica" se entiende un producto, en particular un virus, para realizar una terapia génica, que se divulga como el suministro terapéutico de un ácido nucleico en las células de un paciente como fármaco para tratar una enfermedad. Hoy en día, el cáncer se enfrenta con la terapia génica utilizando adenovirus como vectores.
Para los fines de la invención, cualquier intervalo proporcionado incluye los extremos tanto inferior como superior del intervalo. Los intervalos proporcionados, tales como las temperaturas, tiempos, tamaños y similares, se deben considerar aproximados, salvo que se indique específicamente lo contrario.
Como se ha indicado, la invención se refiere a nuevas composiciones farmacéuticas que contienen adenovirus, que son altamente estables en términos de conservación de la infectividad del virus, ya sea en forma líquida, así como en liofilizada, midiéndose dicha infectividad como unidades infecciosas por ml (como se indicó anteriormente). Estas composiciones comprenden como excipientes farmacéuticamente aceptables:
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
En una realización particular, la composición farmacéutica comprende excipientes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables adicionales. En particular los otros excipientes y/o transportadores que hacen que la composición sea adecuada para utilizarla en una composición inyectable, tales como disolventes particulares, más en particular, agua. Otros excipientes y/o transportadores adicionales son compuestos adecuados para hacer que las composiciones se administren por vía oral.
De la misma manera, las composiciones farmacéuticas del primer aspecto comprenden, en otra realización particular, cantidades terapéuticamente eficaces adicionales de otros ingredientes, tales como los adyuvantes comúnmente utilizados en vacunación.
Los inventores determinaron que una formulación simplificada sin glicerol podía conservar la integridad de las partículas de adenovirus. Estas formulaciones simplificadas incluían como sistema de tampón sólo Tris y glicina. Por tanto, en una realización particular de la composición farmacéutica de acuerdo con el primer aspecto, el Tris y la glicina son los únicos componentes tampón en la composición.
En una realización particular, la composición farmacéutica consiste en:
(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un tipo de adenovirus;
(b) Tris y glicina;
(c) trehalosa;
(d) manitol;
(e) sacarosa;
(f) albúmina;
(g) cloruro de sodio; y
(h) cloruro de magnesio.
En otra realización particular, la composición farmacéutica consiste en:
(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un tipo de adenovirus;
(b) Tris y glicina;
(c) trehalosa;
(d) manitol;
(e) sacarosa;
(f) albúmina;
(g) cloruro de sodio;
(h) cloruro de magnesio; y
(i) excipientes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables adicionales.
Incluso en una realización más particular, el excipiente y/o transportador farmacéuticamente aceptable adicional es agua. Más en particular agua para inyectables.
Además, en otra realización particular de la composición farmacéutica, opcionalmente en combinación con cualquier realización anterior o posterior, en la mezcla crioprotectora la relación en peso de trehalosa, manitol y sacarosa es de 6,5:1,5:0,5 a 7,5:2,5:1,5. Más en particular es de 7:2:1.
Como se representará a continuación en los ejemplos, los inventores han demostrado que diferentes cantidades finales de estos tres componentes crioprotectores pero dentro de esta relación en peso en una composición que contiene adenovirus, permiten mantener unidades infecciosas después de la liofilización y durante varios meses. Además, esta capacidad infecciosa se mantiene cuando las composiciones liofilizadas se almacenan a diferentes temperaturas que oscilan de -20 °C a 25 °C.
En otra realización particular, la composición farmacéutica es una composición acuosa líquida a una temperatura de 14 °C a 35 °C.
Las composiciones líquidas de acuerdo con la invención implican la ventaja de que son estables durante un período de tiempo que puede procesarse a escala industrial como una composición previa que será posteriormente liofilizada. En particular, se ha observado que son estables, lo que significa que no se observa ninguna pérdida significativa de infectividad, lo que significa que las unidades infecciosas/ml se mantienen al menos durante 8-12 horas. Los datos de estabilidad de una composición líquida de acuerdo con la invención se representan a continuación en los ejemplos. Las composiciones estabilizantes de adenovirus típicas comprenden principalmente un sistema de tampón, azúcares como agentes de carga y como crioprotectores, y sales de cationes divalentes. El sistema de tampón es importante no sólo para proporcionar el pH adecuado para las partículas víricas, sino también para garantizar que este pH se mantenga en las múltiples condiciones que encontrarán las partículas. De manera que, se sabe que el sistema de tampón debe funcionar también durante los procesos de congelación sin perder sus efectos y dañar así la estructura vírica. En otra realización particular de esta composición acuosa líquida el pH es de 7,0 a 9,0, la concentración de Tris es de 5 a 30 mM, y la concentración de glicina, es de 0,15 M a 0,25 M. Por tanto, la glicina se usa en la composición farmacéutica de la invención en cantidades particulares que la convierten en un ingrediente del sistema de tampón más que actuar como un agente de volumen.
En una realización más particular la concentración de tris(hidroximetil)aminometano es de 15 a 25 mM, más en particular es de 25 mM. En otra realización particular, la concentración de glicina es de 0,15 M a 0,20 M, más en particular es de 0,19 M. Incluso en una realización más particular, la concentración de Tris es de 25 mM, la concentración de glicina es de 0,192 M y el pH final es de 8,0 a 9,0.
En otra realización particular de las composiciones farmacéuticas acuosas líquidas el porcentaje peso/volumen de trehalosa es del 7 % al 15 %, más en particular es del 7 % al 11 %, y aún más en particular es del 10,5 %;
el porcentaje en peso/volumen de manitol es del 2 % al 3, en particular es del 3 %;
el porcentaje en peso/volumen de sacarosa es del 1 % al 2 %, en particular del 1 % al 1,5 %, más concretamente del 1,5%; y
el porcentaje en peso/volumen de albúmina es del 0,04 % al 0,5 % y aún más en particular es del 0,4 %; estando el porcentaje en peso/volumen de cualquier compuesto definido por la cantidad en gramos del compuesto en 100 ml de la composición acuosa líquida.
Los porcentajes en peso/volumen particulares de cualquiera de los compuestos en combinación con los porcentajes en peso/volumen del resto de los compuestos deben considerarse como se divulga específicamente en la presente descripción.
En otro ejemplo particular, el porcentaje en peso/volumen de trehalosa es del 10,5 %; el porcentaje en peso/volumen de manitol es del 3 %; el porcentaje en peso/volumen de sacarosa es del 1,5 %; y el porcentaje en peso/volumen de albúmina es del 0,4 %.
En otra realización particular alternativa, el porcentaje en peso/volumen de trehalosa es del 7,0 %; el porcentaje en peso/volumen de manitol es del 2,0 %; el porcentaje en peso/volumen de sacarosa es del 1,0 %; y el porcentaje en peso/volumen de albúmina es del 0,4 %.
En otra realización particular alternativa, el porcentaje en peso/volumen de trehalosa es del 7,0 %; el porcentaje en peso/volumen de manitol es del 2,0 %; el porcentaje en peso/volumen de sacarosa es del 1,0 %; y el porcentaje en peso/volumen de albúmina es del 0,04%. Esta composición con cantidades más bajas de crioprotectores aún es capaz de proteger las partículas de virus de la degradación (medida como unidades infecciosas) una vez que la composición se ha liofilizada y probado en cuanto a las unidades infecciosas en varios momentos
Las composiciones con mayores cantidades de crioprotectores que la anterior pero todavía manteniendo la relación en peso particular de 6,5:1,5:0,5 a 7,5:2,5:1,5, más en particular de 7:2:1 de trehalosa:manitol:sacarosa, son especialmente útiles para proteger las partículas de virus de la degradación (medidas como unidades infecciosas). Como se ilustrará a continuación en los ejemplos, otras composiciones más complejas, utilizadas como ejemplos comparativos y con un sistema de tampón diferente, implicaron una mayor pérdida de unidades infecciosas durante el proceso de liofilización.
En otra realización particular la concentración de cloruro de sodio es de 25 mM a 250 mM, más en particular es de 50 mM a 100 mM, aún más en particular de 60 mM a 80 mM, y aún más en particular es de 75 mM a 80 mM. Aún en una realización más particular es de 75 mM.
En otra realización particular la concentración de dicloruro de magnesio es de 0,1 mM a 5,0 mM, más en particular de 0,5 mM a 3,0 mM, aún más en particular de 0,5 a 2,0 mM. Más en particular es de 1,0 mM a 2,0 mM. En particular es de 1,0 mM.
En otra realización particular, la composición que contiene adenovirus está en forma de una composición liofilizada. Como se ilustrará a continuación en los ejemplos, las composiciones liofilizadas son estables al menos durante 6 meses, lo que como se indicó anteriormente significa que las unidades infecciosas no se pierden debido a la desintegración del virus y/o al daño del ácido nucleico (ADN).
Las composiciones liofilizadas tienen una humedad residual de 1,0 % al 3,0 % en peso en relación con el peso total de la torta liofilizada.
Los adenovirus representan los virus sin envoltura (es decir, sin una bicapa lipídica externa) más grandes. Los adenovirus (miembros de la familiaAdenoviridae)son virus de tamaño mediano (90-100 nm) con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN bicatenario. Pueden transportarse a través de endosomas (es decir, no es necesaria la fusión de la envoltura). El virión también tiene una "espícula" o fibra exclusiva asociada con cada base pentona de la cápside (que ayuda a unirse a la célula hospedadora a través del receptor en la superficie de la célula hospedadora). Tienen una amplia gama de hospedadores vertebrados; en los seres humanos, se ha descubierto que más de 50 serotipos adenovíricos distintos provocan una amplia gama de enfermedades, desde infecciones respiratorias leves en niños pequeños (conocidas como resfriado) hasta enfermedades multiorgánicas potencialmente mortales en personas con un sistema inmunitario debilitado. Hay 57 tipos de adenovirus humanos aceptados (HAdV-1 a 57) en siete especies (adenovirus humanos A a G).
La composición farmacéutica de acuerdo con el primer aspecto comprende una o más cantidades terapéuticamente eficaces de cualquiera de los tipos de adenovirus. En particular, los que tienen como objetivo vertebrados, más en particular mamíferos, y aún más en particular los que tienen como objetivo células humanas.
En realizaciones particulares de la composición farmacéutica de la invención, los uno o más tipos de adenovirus se seleccionan del grupo que consiste en uno o más adenovirus humanos de serotipo C, uno o más adenovirus humanos de serotipo D, y combinaciones de los mismos.
En otra realización más particular, los uno o más tipos de adenovirus es un adenovirus humano de serotipo C seleccionado del grupo que consiste en Ad1, Ad2, Ad5, Ad6 y combinaciones de los mismos. Aún más en particular es el Ad5.
La cantidad terapéuticamente eficaz del adenovirus en la composición farmacéutica puede estar en forma de un adenovirus purificado o como un extracto o lisado de células infectadas con el adenovirus. Los adenovirus purificados se obtienen principalmente mediante lisis celular y separación adicional de las partículas víricas en centrifugación en gradiente de cloruro de cesio.
Más en particular, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un solo tipo de adenovirus.
En otra realización particular, la cantidad de adenovirus en la composición farmacéutica de la invención es de 1 * 1010 pv/ml a 1 * 1013 pv/ml. Más en particular de 1*1011 pv/ml a 1 * 1012 pv/ml. "pv/ml" es la abreviatura de partículas de virus por mililitro de la composición farmacéutica y se calcula como se divulga. En síntesis, la concentración de partículas de adenovirus se determina espectrofotométricamente utilizando la propiedad de las proteínas de absorber a 277 nm, y la del ADN bicatenario con un máximo de absorbancia a 260 nm. La densidad óptica detectada a 260 nm (DO260) en presencia de un detergente iónico, tal como SDS, es por tanto proporcional a la concentración de partículas de adenovirus. La concentración de partículas de adenovirus de cada muestra se calcula a partir de un análisis por triplicado y considerando el factor de dilución y la equivalencia de un valor de DO260 de 1,00 siendo una concentración de 1,1 * 1012 partículas/ml (pv/ml).
Otro aspecto de la invención es un método para preparar una composición farmacéutica que contiene adenovirus como se divulga anteriormente. El método comprende (a) preparar una solución en agua con la mezcla crioprotectora desprovista de albúmina, el sistema de tampón y la mezcla de sales inorgánicas;
(b) filtración de esterilización de la solución obtenida en la etapa (a);
(c) añadir albúmina en condiciones estériles;
(d) mantener la solución de la etapa (c) en refrigeración a una temperatura de 2 °C a 10 °C y en agitación durante el período de tiempo necesario para obtener una solución homogeneizada que comprende el sistema de tampón, las sales inorgánicas y la mezcla crioprotectora; y
(e) mezclar la solución homogeneizada de la etapa (d) con una cantidad eficaz de adenovirus para obtener una formulación de adenovirus líquida.
La composición farmacéutica que contiene adenovirus, que está exenta de glicerol y que comprende:
- una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un tipo de adenovirus;
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende trehalosa, manitol y sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio;
también puede definirse, por su proceso de preparación, como la composición como se define anteriormente, obtenible mediante un método que comprende las siguientes etapas:
(a) preparar una solución en agua añadiendo una mezcla crioprotectora que comprende trehalosa, manitol, sacarosa; un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina; y una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio;
(b) filtrar en condiciones estériles la solución de la etapa (a) a través de una malla con un diámetro de poro igual o inferior a 0,22 pm:
(c) añadir albúmina en condiciones estériles;
(d) mantener la solución de la etapa (c) en refrigeración a una temperatura de 2 °C a 10 °C y en agitación durante el período de tiempo necesario para obtener una solución homogeneizada que comprende el sistema de tampón, las sales inorgánicas y la mezcla crioprotectora;
(e) mezclar la solución homogeneizada de la etapa (d) con una cantidad eficaz de adenovirus para obtener una composición farmacéutica líquida que contiene adenovirus.
En una realización particular del método, la etapa b) de filtración de esterilización se realiza mediante filtración en condiciones estériles la solución de la etapa (a) a través de una malla con un diámetro de poro igual o inferior a 0,22 pm.
El periodo de tiempo necesario para obtener una solución homogeneizada en la etapa (d) lo determinará el experto dependiendo del volumen del lote fabricado.
En otra realización particular del método, comprende además una etapa de liofilización para obtener una composición farmacéutica que contiene adenovirus liofilizada, que es muy estable en términos de unidades infecciosas y que tiene una consistencia de torta adecuada.
Se pueden utilizar muchos patrones de liofilización, pero, en una realización particular de la invención, la liofilización se lleva a cabo mediante:
- reducción de la composición farmacéutica que contiene adenovirus líquida a una temperatura de -60 °C a -50 °C, en particular durante un período de tiempo de 4 min a 10 horas;
- una primera etapa de secado a una temperatura de -45 °C a -30 °C a una presión de 5,0 Pa a 8,0 Pa, en particular durante un período de tiempo de 30 a 60 horas; y
- una segunda etapa de secado en la que se eleva la temperatura a una temperatura de 10 °C a 40 °C, temperatura que se mantiene durante un período de tiempo necesario para obtener una torta liofilizada con una humedad residual (también conocida como humedecimiento residual) del 1,0 % al 3,0 % en peso en la composición liofilizada final.
La humedad residual es la cantidad de agua unida que queda en el producto liofilizado. Se mide mediante un culombímetro de tipo Karl-Fisher (Mettler DL37, culombímetro KF, Titrator 852). El Modo de CKF fue el siguiente: Punto final 50 mV; I(pol) 10 pA; Corrección automática de desviación; Desviación relativa de parada de 10 pg/min y generador sin diafragma 400 mA. El método se diseñó siguiendo las instrucciones del fabricante con el disolvente Hydranal Coulomat AG (Honeywell): formamida (Fluka) (70:30 v/v). El cálculo del porcentaje de agua en la muestra liofilizada (vial) en relación con el peso total del comprimido (% p/p) liofilizado se realizó según lo recomendado por el fabricante. Se realizaron triplicados para cada muestra probada.
La composición farmacéutica de la invención es para su uso como vacuna. Por tanto, la presente invención también se refiere a vacunas que comprenden la composición farmacéutica de la invención. Estas vacunas comprenden, en una realización particular, uno o más adyuvantes, que en combinación con la porción antigénica de la vacuna definida por uno o más tipos de adenovirus, dan como resultado la composición inmunogénica debidamente acompañada de los excipientes, a saber, el sistema de amortiguación, las sales inorgánicas, la mezcla crioprotectora, albúmina y opcionalmente excipientes y/o transportadores adicionales.
Si la composición farmacéutica de la invención está en forma liofilizada, las vacunas que la comprenden pueden administrarse por vía oral en forma de comprimidos, resuspenderse en un disolvente apropiado (es decir, agua) para administración oral o para inyección si esta es la vía de administración preferida.
Siendo los adenovirus buenos vectores recombinantes, también se han utilizado extensamente en terapia génica. Por tanto, la composición farmacéutica que contiene adenovirus también se utiliza como agente de terapia génica. Esta se puede reformular como una composición farmacéutica como se define anteriormente para su uso en la terapia génica de enfermedades y/o trastornos en los que tiene lugar el silenciamiento o la activación o la represión de determinados genes. Los ejemplos de estos trastornos son principalmente varios tipos de cáncer. Por tanto, la invención también se refiere al uso de la composición farmacéutica que contiene adenovirus para la preparación de un medicamento para terapia génica, en particular para la terapia genética del cáncer. Esto significa que en el presente documento se divulga la composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad y/o trastorno, en el que tiene lugar el silenciamiento, o la activación o la represión de determinados genes, mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.
Debido a sus propiedades estabilizantes, las formulaciones se pueden utilizar como fuente de adenovirus estables que se empleen habitualmente como vectores para la investigación en biología molecular, por ejemplo en procesos de transformación de células, incluyendo células de mamíferos, y en particular células humanas.
Como se indicó anteriormente, la invención también divulga como producto intermedio una composición tamponada exenta de glicerol y que comprende:
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
Esta composición tamponada es, en una realización particular, una composición líquida. En otra realización particular está en forma de una composición liofilizada (por ejemplo, en forma de polvo fino o como comprimidos formados por compresión). Las composiciones líquidas tamponadas están listas para mezclarse con el título deseado de partículas víricas, mientras que las formas liofilizadas primero deben resuspenderse en un volumen predeterminado de un disolvente, en particular agua, para añadir además el título deseado de partículas de virus.
También se divulga, aunque no forma parte de la invención, una composición farmacéutica que contiene adenovirus líquida, que está exenta de glicerol, que comprende:
- una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un tipo de adenovirus;
- un sistema de tampón que comprende Tris-HCl en una concentración de 20 mM a 25 mM, en particular de 25 mM; - una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, ya sea una sal o un éster de la misma con un porcentaje en peso/volumen del 8,0 % al 12 %, en particular del 10,5 %; (b) manitol, ya sea una sal o un éster del mismo, con un porcentaje en peso/volumen del 2,0 % al 3,0 %, en particular del 3 %; (c) sacarosa, ya sea una sal o un éster de la misma, con un porcentaje en peso/volumen del 1,0 % al 2,0 %, en particular del 1,5 %;
- albúmina con un porcentaje en peso/volumen del 0,3 % al 0,5 %, en particular del 0,4 %; estando el porcentaje en peso/volumen de cualquier compuesto de la mezcla crioprotectora y de albúmina definido por la cantidad en gramos del compuesto en 100 ml de la composición acuosa líquida total; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio, en donde la concentración de cloruro de sodio es de 25 mM a 250 mM, más en particular de 50 mM a 100 mM, más en particular de 60 mM a 75 mM, y más en particular de 75 mM; y la concentración de cloruro de magnesio es de 0,1 mM a 5,0 mM, más en particular de 0,5 mM a 3,0 mM, más en particular de 0,5 mM a 1,5 mM, y aún más en particular es de 1 mM. También se divulga, pero no forma parte de la invención, una composición farmacéutica liofilizada que se puede obtener liofilizando la composición farmacéutica líquida definida en el párrafo anterior y que comprende como sistema de tampón Tris-HCl en una concentración de 20 mM a 25 mM, en particular de 25 mM. Este tipo de composiciones liofilizadas también son estables en términos de unidades infecciosas cuando se almacenan a -20 °C y 5 °C (véase la Tabla 2, lote LP0243_86). Esta composición liofilizada con un sistema de tampón que comprende Tris-HCl tiene una humedad residual del 1,0 % al 3,0 % en peso en la composición liofilizada final.
Como se ha indicado, se describe el uso de un sistema de tampón aprótico que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina como sistema de tampón en una composición que contiene adenovirus. Este aspecto es el resultado de la observación de los inventores, según la cual un sistema de tampón compuesto por una mezcla de Tris y glicina permitía mantener el pH y también la integridad de las partículas víricas durante la liofilización. Las partículas también mantuvieron su funcionalidad (en términos de Ul/ml). Todo esto permitió que se pudiera utilizar una alta concentración inicial de partículas víricas en el proceso de fabricación de composiciones líquidas que comprenden adenovirus. Esta concentración de la composición líquida no se vio alterada debido al proceso de liofilización.
En una realización particular del uso de un sistema de tampón aprótico que comprende Tris y glicina como sistema de tampón en una composición que contiene adenovirus, dicho sistema de tampón consiste en la mezcla de Tris y glicina. En otra realización particular, opcionalmente en combinación con cualquier realización anterior o posterior, la concentración de Tris es de 5 a 30 mM, y la concentración de glicina, es de 0,15 M a 0,25 M. Incluso en una realización más particular, la concentración de Tris es de 15 a 25 mM, más en particular es de 25 mM. En otra realización particular, la concentración de glicina es de 0,15 M a 0,20 M, más en particular es de 0,19 M. Incluso en una realización más particular, la concentración de Tris es de 25 mM, la concentración de glicina es 0,192 M y el pH final en la composición que contiene adenovirus proporcionado por el uso del sistema de tampón aprótico es de 8,0 a 9,0. Así, se divulgan, composiciones farmacéuticas que contienen adenovirus que comprenden uno o más tipos de adenovirus y un sistema de tampón aprótico que comprende Tris y glicina, en donde el Tris y la glicina son los únicos componentes tampón en la composición que contiene adenovirus.
A lo largo de toda la descripción y en las reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la misma, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Adicionalmente, la palabra "comprender" abarca el caso de "consistir en". Objetos adicionales, ventajas y características de la invención serán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
Ejemplo
Composiciones farmacéuticas estables que contienen adenovirus
Por el presente documento se divulgan diferentes composiciones farmacéuticas que contienen adenovirus. La estabilidad del adenovirus se evaluó determinando las unidades infecciosas perdidas debido la etapa de liofilización. También se analizaron unidades infecciosas en varios momentos después de la liofilización y a varias temperaturas de almacenamiento.
Materiales y métodos
Los ingredientes empleados para la preparación de las diferentes composiciones fueron trehalosa dihidrato (Pfanstiehl), manitol (Pfanstiehl), sacarosa (Merck), Tris (Sigma Aldrich), MgCh hexahidrato (Merck), NaCl (Merck), HCl (Sigma Aldrich), glicina (Sigma Aldrich), histidina (Merck), EDTA (Merck), Polisorbato-80 (PS-80 de Croda) y seroalbúmina humana (HSA de Grifols).
Todos los componentes se mezclaron en agua en las cantidades indicadas a continuación en la Tabla 1. La mezcla de todos los excipientes se filtró usando un Millex-GV de polivinilpirrolidona (PVP) de 0,22 pm bajo flujo laminar. A continuación, se transfirió la solución a tubos Falcon (50 ml) estériles que tenían baja retención de proteínas. En caso de que la mezcla crioprotectora comprendiera albúmina (HSA), esta se añadió después de la filtración y bajo flujo laminar. Los tubos se mantuvieron en agitación orbital durante 15 minutos y se refrigeraron (4-5 °C) para garantizar la completa homogeneización de todos los ingredientes.
Todos los lotes se formularon con partículas adenovíricas de Ad5 equivalentes a 1*1012 pv/ml. Esta cantidad de Ad5 proporcionó una concentración de adenovirus deseada en el producto final y al mismo tiempo, cantidades iniciales altas ayudan a estabilizar las partículas debido a una mayor concentración de proteínas [véase Altaraset al.,"Production and Formulation of Adenovirus Vectors", Adv. Biochem. Engin/Biotechnol-2005, vol. n.° 99, pág.: 193-260]. En primer lugar se descongelaron las reservas víricas a temperatura ambiente (14-26 °C). Si se utilizaban crioviales, se descongelaron y centrifugaron con pulso para recuperar todo el contenido en un tubo Falcon (de 15 ml). Los tubos se mantuvieron en agitación orbital durante 10 minutos y se refrigeraron (4-5 °C). Si la solución madre de virus ya estaba en un tubo Falcon, se mantuvo directamente en agitación orbital durante 10 minutos y se refrigeró (4-5 °C). Una vez que se homogeneizó la solución madre de virus, se transfirió la cantidad deseada a un Falcon de 50 ml y se le añadió un volumen de la mezcla de excipientes (sistema de tampón, crioprotectores y sales inorgánicas) para tener una concentración final de Ad5 de 1*1012 pv/ml. A continuación, la composición que contenía adenovirus se agitó en refrigeración (4-5 °C) durante 10 min. La concentración de partículas de adenovirus (pv/ml) utilizada estuvo en el intervalo de lo terapéuticamente eficaz. Por lo tanto, las composiciones de la invención se sometieron a ensayo con el título vírico adecuado para su uso en el tratamiento.
Todos los lotes se dosificaron y liofilizaron de la siguiente manera: se dosificaron 0,5 ml en viales de borosilicato tipo I plus. El equipo de liofilización empleado fue Lyobeta-20 de Telstar. Los viales se depositaron inicialmente en placas previamente refrigeradas (5-10 °C) y la temperatura se redujo a -5 °C durante 15 minutos para garantizar una congelación simultánea y homogénea de todos los viales. El patrón de liofilización incluyó un ciclo de congelación a -55 °C durante 6 horas; un secado primario a -40 °C durante 50 horas a una presión de 6 Pa (0,06 mbar); y un secado secundario con gradiente de temperatura creciente para finalmente alcanzar los 30 °C en 10 horas, 30 °C que se mantuvieron durante 4 horas. Después de la liofilización, los viales se taparon con tapones al vacío. A los viales se les añadieron tapas de papel de aluminio y se distribuyeron según las diferentes condiciones de almacenamiento sometidas en ensayo.
Resultados
1. Efecto de la liofilización y datos de estabilidad en diferentes condiciones
A continuación la Tabla 1 muestra la composición de varios lotes fabricados de la composición farmacéutica de la invención, que inicialmente contenían una concentración de Ad5 de 1*1012 pv/ml. Aunque no se indica en la Tabla 1, todos los lotes incluían NaCl 75 mM y MgCh hexahidrato 1 mM. La trehalosa estaba en forma dihidrato.
La Tabla 1 incluye también algunos ejemplos comparativos (lote L0243_86 y L0243_41).
Para cada uno de los lotes se indican las unidades infecciosas por mililitro (Ul/ml) cuando se añadió Ad5 a la mezcla de excipientes, después de la liofilización y la pérdida durante la liofilización. Las Ul/ml se determinaron aplicando el protocolo divulgado en el kit AdEasy Viral Titer Kit (Agilent Technologies). En síntesis, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-hexón primario y un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante secundario y un sustrato apropiado.
Tabla 1. Proceso de liofilización
La Tabla 2 muestra los datos de estabilidad después del almacenamiento en diferentes condiciones y para diferentes tiempos después de la liofilización (1 mes, 3 meses y 6 meses).
Tabla 2. Datos de estabilidad durante el almacenamiento
Como se puede deducir de las Tablas 1 y 2, las composiciones farmacéuticas que comprenden un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina, mostraron una alta estabilidad en el sentido de que después de la liofilización la pérdida de unidades infecciosas a las tres temperaturas de almacenamiento probadas fue insignificante o muy baja en comparación con el ejemplo comparativo con Tris-HCl como sistema de tampón. Curiosamente, este comportamiento también se observó a 25 °C, lo que hace que las composiciones farmacéuticas de la invención sean almacenables en condiciones no refrigeradas. Las condiciones no refrigeradas son las que suelen producirse durante las campañas de vacunación en los países en desarrollo o en casos de emergencia epidemiológica, cuando algunas composiciones farmacéuticas tienen que transportarse en malas condiciones en zonas remotas. Por lo tanto, con cantidades terapéuticamente eficaces de partículas de adenovirus, las composiciones eran estables durante un largo período de tiempo.
Además, las composiciones farmacéuticas de la invención en las que se observó una mayor pérdida de unidades infecciosas debido al proceso de liofilización (lotes LP0234_26 y LP0243_27) fueron, en cualquier caso, estables tras su almacenamiento a la temperatura sometida a ensayo (-20 °C) como se puede deducir de los valores de pérdida de 0,72 y 1,21, respectivamente.
Por otra parte, el ejemplo comparativo LP0243_41 (Tabla 1) presentó una alta pérdida de unidades infecciosas durante el proceso de liofilización y fue una formulación más compleja. El ejemplo comparativo LP0243_86 mostró una ligera pérdida de unidades infecciosas durante la liofilización, pero una buena estabilidad cuando se almacenó a -20 °C y 5 °C. Sin embargo, esta formulación de Tris-HCl no era estable a 25 °C en términos de que la pérdida de unidades infecciosas era bastante mayor que la pérdida de las composiciones de la invención a la misma temperatura de almacenamiento. Para finalizar, a continuación se representan las unidades infecciosas por ml del lote LP0243_102 en forma líquida y a lo largo de 8 horas. Estos datos tienen como objetivo divulgar la estabilidad de las composiciones de adenovirus de la invención en forma líquida.
Los datos se muestran en la Tabla 3, en donde las Ul/ml se determinaron en varios tiempos (t = 0, 2, 4 y 8 horas). La prueba se llevó a cabo con muestras congeladas tomadas en los tiempos de muestreo indicados anteriormente y analizadas al día siguiente. En la Tabla 3 se muestra el valor de una dilución de 2,5 de un título físico inicial de 2,5*1012 pv/ml, y un valor inicial de título funcional de 6,34*1010 Ul/ml. Nuevamente se utilizó el kit AdEasy Viral Titer (Agilent Technologies). También se indican las partículas víricas por ml (pv/ml) medidas de acuerdo con el protocolo divulgado anteriormente (siendo la equivalencia de un valor de DO260 de 1,00 una concentración de 1,1 x 1012 partículas/ml (pv/ml)).
Tabla . P r i rí l vir r n l r mi n n líquido
Los datos de la Tabla 3 demuestran que no hubo ninguna pérdida significativa de unidades infecciosas durante el procesamiento líquido de la formulación. Por lo tanto, usar como tampón la mezcla de Tris y glicina no sólo permite evitar el glicerol tóxico en la composición sino que también proporciona un entorno adecuado para las composiciones contienen adenovirus líquidas y liofilizadas.
2. Análisis del efecto del pH sobre la estabilidad de las partículas de adenovirus: Agregación y funcionalidad de las partículas de adenovirus.
El siguiente ensayo representa el efecto del sistema de tampón elegido sobre las composiciones que contienen adenovirus. Para determinar el efecto del uso de un sistema de tampón con ácido protónico (HCl) en comparación con un tampón aprótico, se probaron varias composiciones. Se utilizó una concentración de 1x1012 partículas de Ad5/ml (pv/ml) en cada solución madre líquida probada, asemejándose así a un procesamiento líquido antes de la liofilización. El promedio de Z, medido por dispersión dinámica de luz (DDL) y el índice de polidispersidad correspondiente (IPD) se indican a continuación. Estos parámetros se relacionan con el tamaño de los agregados de partículas (promedio de Z en nm) y con la distribución del tamaño de las partículas (IPD). Para una muestra perfectamente uniforme, el IPD sería 0,0. El IPD de 0,0 a 0,1 refleja una muestra de tipo de distribución estrecha y no uniforme. De 0,1 a 0,4 el IPD indica una muestra de tipo distribución no uniforme moderada. Se suele entender un IPD superior a 0,4 como una muestra de tipo de distribución amplia.
Los datos se tomaron utilizando el Malvern Zetasizer Nano ZS (ZEN3600) con un ángulo de detección de 173° y un láser rojo de 632 nm a 25 °C. Para todos los análisis se utilizó un patrón de poliestireno (100 nm) (Thermo Scientific). Se hicieron cinco determinaciones (medidas) de 200 pl de muestra en cubos de poliestireno (Starstedt). El promedio de Z y el IPD es el valor medio de estas cinco determinaciones.
Tabla 4. A re ación
Como se puede deducir de la tabla 4, las soluciones madre D y E tienen un tamaño de partícula adecuado en el t(0), ya que un tamaño de 145-154 nm es equivalente a un diámetro hidrodinámico de Ad5 (aproximadamente 117 nm) y teniendo en cuenta los múltiples excipientes que interactúan con las partículas. En este t(0) los IPD son bajos, lo que significa que las composiciones garantizan la estabilidad de las partículas. La solución madre E mantiene el tamaño y la polidispersidad a lo largo del tiempo, mientras que en la solución madre D sólo se observa un ligero aumento de la agregación cuando las composiciones están en solución. En contraste, la composición que contiene adenovirus con un tampón que incluye el ácido HCl (un tampón con un ácido protónico) supuso agregados más grandes que los de las composiciones que comprenden el sistema de tampón aprótico (Tris y glicina).
Como se representa en la tabla 2, una composición como la de la solución madre E (o muestra LP0243_81) implicaba buenos valores de funcionalidad (UI/ml) incluso después de haberla almacenado en forma liofilizada durante 3 y 6 meses a -20 °C.
Por lo tanto, con el tampón propuesto que consiste en una mezcla de Tris y glicina podrían emplearse altas cantidades iniciales de partículas víricas (1*1012 pv/ml) sin el inconveniente de la pérdida por agregación durante el procesamiento en forma líquida y durante la liofilización. Por tanto, se conservó la funcionalidad de las partículas víricas. Además, las composiciones conteniendo adenovirus, incluso estando exentas de glicerol, garantizan la estabilidad de las partículas víricas durante un largo tiempo.
También se analizó en un ensayo paralelo, el efecto del pH en composiciones conteniendo adenovirus con un sistema de tampón que comprende Tris-HCl. Esto se hizo en un intento de simular las condiciones que tienen lugar durante la liofilización mientras la muestra se congela y en presencia de protones. Los datos de la siguiente Tabla 5 demuestran que la reducción del pH (debido a la presencia de protones proporcionados por el tampón) de 7,4 a 7,2 en el sistema de tampón que comprende Tris-HCl implica un aumento de la agregación de las partículas víricas. Por otra parte, la basificación (a pH = 8,9) tiende a reducir el tamaño de las partículas.
Tabl . Ef l r n r r i n r l i m m n r nicos
Por tanto, el sistema de tampón que comprende glicina y Tris, como los únicos componentes del tampón, en una composición que contenga adenovirus, es una opción buena y ventajosa para conservar partículas de adenovirus.
Listado de citas
Bibliografía de patentes
- documento US20080102508
- documento US7456009
Bibliografía no de patentes
- Altaraset al.,"Production and Formulation of Adenovirus Vectors", Adv. Biochem. Engin/Biotechnol-2005, vol.
n.° 99, pág.: 193-260
Claims (15)
1. Una composición farmacéutica que contiene adenovirus, que está exenta de glicerol, que comprende:
- una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más tipos de adenovirus;
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además excipientes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables adicionales.
3. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el tris(hidroximetil)aminometano y la glicina son los únicos componentes tampón en la composición.
4. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es una composición acuosa líquida a una temperatura de 14 °C a 35 °C.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene un pH de 7 a 9, y en donde la concentración de tris(hidroximetil)aminometano es de 5 a 30 mM y la concentración de glicina es de 0,15 M a 0,25 M.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde el porcentaje en peso/volumen de trehalosa es del 7% al 15%; el porcentaje en peso/volumen de manitol es del 2% al 3%; el porcentaje en peso/volumen de sacarosa es del 1 % al 2 %; y el porcentaje en peso/volumen de albúmina es del 0,04 % al 0,5 %; estando el porcentaje en peso/volumen de cualquier compuesto definido por la cantidad en gramos del compuesto en 100 ml de la composición acuosa líquida.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es una composición liofilizada.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde los uno o más tipos de adenovirus se seleccionan del grupo que consiste en uno o más adenovirus humanos de serotipo C, uno o más adenovirus humanos de serotipo D, y combinaciones de los mismos.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los uno o más tipos de adenovirus es un adenovirus humano de serotipo C seleccionado del grupo que consiste en Ad1, Ad2, Ad5, Ad6 y combinaciones de los mismos.
10. Un método para preparar una composición farmacéutica que contiene adenovirus como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, comprendiendo el método las siguientes etapas:
(a) preparar una solución en agua añadiendo una mezcla crioprotectora que comprende trehalosa, manitol, sacarosa; un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano y glicina; y una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio;
(b) filtración de esterilización de la solución obtenida en la etapa (a);
(c) añadir albúmina en condiciones estériles;
(d) mantener la solución de la etapa (c) en refrigeración a una temperatura de 2 °C a 10 °C y en agitación durante el período de tiempo necesario para obtener una solución homogeneizada que comprende el sistema de tampón, las sales inorgánicas y la mezcla crioprotectora; y
(e) mezclar la solución homogeneizada de la etapa (d) con una cantidad eficaz de adenovirus para obtener una composición farmacéutica líquida que contiene adenovirus.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además una etapa de liofilización.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la liofilización se lleva a cabo mediante:
- reducción de la composición farmacéutica que contiene adenovirus líquida a una temperatura de -60 °C a -50 °C; - una primera etapa de secado a una temperatura de -45 °C a -30 °C a una presión de 5,0 Pa a 8,0 Pa; y - una segunda etapa de secado en la que se eleva la temperatura a una temperatura de 10 °C a 40 °C, temperatura que se mantiene durante un período de tiempo necesario para obtener una torta liofilizada con una humedad residual del 1,0 % al 3,0 % en peso en la composición liofilizada final.
13. Una composición farmacéutica que contiene adenovirus como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso como vacuna.
14. Una composición tamponada adecuada para estabilizar adenovirus que deben almacenarse en forma liofilizada, estando dicha composición exenta de glicerol y comprendiendo:
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio.
15. Uso de una composición tamponada que comprende:
- un sistema de tampón que comprende tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y glicina;
- una mezcla crioprotectora que comprende (a) trehalosa, (b) manitol y (c) sacarosa;
- albúmina; y
- una mezcla de sales inorgánicas que comprende cloruro de sodio y cloruro de magnesio; como composición estabilizante de adenovirus.
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