ES2202356T3

ES2202356T3 - Formulaciones para el factor ix.

Info

Publication number: ES2202356T3
Application number: ES95915040T
Authority: ES
Inventors: Lawrence Bush; Chandra Webb
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1995-04-06
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2015-04-06
Also published as: DK0758248T3; CA2182200C; AU695084B2; EP0758248A1; ATE244015T1; US6372716B1; PT758248E; EP0758248B1; JP2010077148A; JP2006219500A; JP2007224052A; JPH09512267A; DE69531204T2; JP4789698B2; WO1995028954A1; DE69531204D1; AU2207595A; CA2182200A1

Abstract

SE FACILITAN NUEVOS COMPUESTOS Y METODOS PARA OBTENER PREPARACIONES CONCENTRADAS DE FACTOR IX Y FORMULAS DE FACTOR IX APROPIADAS PARA SU ALMACENAMIENTO Y ADMINISTRACION.

Description

Formulaciones para el factor IX.

La presente invención se refiere generalmente a nuevas formulaciones que comprenden el factor IX.

Antecedentes de la invención

Se ha identificado una variedad de factores implicados en el proceso de coagulación de la sangre, incluyendo el factor IX, una glucoproteína del plasma. Una insuficiencia del factor IX caracteriza un tipo de hemofilia (tipo B). El tratamiento de esta enfermedad ha implicado tradicionalmente la infusión intravenosa de los concentrados de proteína del factor IX procedentes del plasma humano. La infusión de concentrados sanguíneos implica el riesgo de transmisión de varios agentes infecciosos, tales como la hepatitis vírica y el HIV, o factores tromboembólicos. En la patente USPN nº 4.770.999, Kaufman et al., 13 de septiembre de 1988, se ha descrito un procedimiento alternativo de producción del factor IX, por técnicas de ADN recombinante. Se ha aislado el ADNc codificador del factor IX humano, se ha caracterizado, y se ha clonado en vectores de expresión. Véase, por ejemplo, Choo et al., Nature 299:178-180 (1982); Fair et al., Blood 64:194-204 (1984); y Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982). Por consiguiente, mediante los avances en la tecnología del ADN recombinante, ha sido posible producir proteína del factor IX.

Es deseable disponer de formas concentradas de proteína de carga, p. ej.: factor IX, que, a su vez, se pueda almacenar y que sea adecuada para la fabricación adicional de formas galénicas acabadas de proteína. Típicamente, un procedimiento de purificación de una proteína da como resultado la concentración de la proteína. Esta proteína concentrada, conocida también como proteína de carga, puede estar en un tampón de la formulación. La proteína de carga, típicamente en una concentración de aproximadamente 2 hasta por lo menos 20 mg/ml, a continuación se puede transportar congelada en una instalación de llenado/acabado en la que se diluye hasta una concentración de dosificación apropiada en viales de dosificación. Estas muestras diluidas se pueden liofilizar, es decir, secar por congelación. Las muestras liofilizadas se pueden mantener en un almacenamiento a largo plazo y redisolver en un momento posterior añadiendo un diluyente de administración adecuado inmediatamente antes de la utilización por el paciente.

La estabilidad de la proteína puede estar afectada entre otros por factores tales como fuerza iónica, pH, temperatura, ciclos repetidos de congelación/descongelación y exposiciones a fuerzas de cizallamiento. La proteína activa se puede perder como resultado de inestabilidades físicas, incluyendo la desnaturalización y la agregación (formación tanto de agregados solubles como insolubles), así como inestabilidades químicas, incluyendo, por ejemplo, hidrólisis, desamidación y oxidación, por nombrar sólo unas pocas. Para un análisis general de la estabilidad de proteínas farmacéuticos, véase, por ejemplo, Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989).

Aunque la posible aparición de inestabilidades de la proteína se valora generalmente, es imposible predecir los determinados problemas de inestabilidad de una proteína determinada. Cualquiera de estas inestabilidades puede producir la formación de una proteína, subproducto de proteína, o derivado con disminución de actividad, aumento de toxicidad y/o aumento de inmunogenicidad. Naturalmente, la precipitación de la proteína puede conducir a trombosis, no-homogeneidad de la forma y cantidad de dosificación, así como a jeringuillas atascadas. Asimismo, específicas al factor IX, existen varias modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la carboxilación gamma de determinados residuos de ácido glutámico en el N-terminal y la adición de carbohidrato) que pueden ser importantes para mantener la actividad biológica y que pueden ser susceptibles de modificación en el almacenamiento. Por consiguiente, la seguridad y la eficacia de cualquier formulación farmacéutica de una proteína está relacionada directamente con su estabilidad.

Además de las consideraciones de estabilidad, se seleccionan generalmente excipientes que son o que encuentran la aprobación de varias agencias médicas reguladoras mundiales. La solución debería ser isotónica y el pH estar en un intervalo fisiológicamente adecuado. La selección y la cantidad del tampón utilizado es importante para conseguir el intervalo de pH deseado. Además, en el caso del factor IX, se deben evitar agentes tal como la "heparina" debido a su potencial interferencia con el análisis del ensayo del tiempo de coagulación y con la evaluación precisa del potencial trombogénico.

Actualmente, se dispone en el mercado únicamente de dos formulaciones de factor IX procedentes del plasma, exentas de proteína en el excipiente. La Alpha Therapeutic Corporation proporciona AlphaNine® SD liofilizada: que contiene heparina, dextrosa, polisorbato 80 y fosfato de tri(n-butilo). Este preparado está destinado a ser almacenado a temperaturas entre 2º y 8ºC. Como se indicó anteriormente, se ha de evitar la heparina ya que es un anticoagulante y el fosfato de tri(n-butilo) es irritante a las membranas de la mucosa; por lo tanto, esta formulación es inferior a la ideal. Mononine® liofilizada de Armour Pharmaceutical Company: que contiene histidina, cloruro de sodio y manitol está destinada igualmente a ser almacenada de 2º a 8ºC. El prospecto del envase recomienda no almacenar esta formulación más de un mes a temperatura ambiente.

Teóricamente, las formulaciones desarrolladas deberían también ser estables al almacenamiento en grandes cantidades del factor IX en altas concentraciones (\geq 20 mg/ml, por ejemplo) que permite volúmenes relativamente pequeños para llenado/acabado a la dosis apropiada y permite asimismo procedimientos de administración alternativos que pueden necesitar gran concentración de proteína, p. ej.: administración subcutánea. Por consiguiente, continua existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos para mejorar la estabilidad de la proteína del factor IX (y mantener niveles de actividad) durante el procedimiento de concentración y el procedimiento de liofilización, así como para proporcionar formulaciones estables durante el almacenamiento prolongado.

Breve sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención proporciona nuevas composiciones y procedimientos para proveer preparados concentrados del factor IX, útiles como producto de fármaco de carga. Estas composiciones, congeladas, líquidas o liofilizadas, contienen factor IX, un agente de carga, tal como glicina y un crioprotector. Una concentración de factor IX preferida varía desde aproximadamente 0,1 hasta por lo menos 20 mg/ml (equivalente aproximadamente de 20 hasta por lo menos 4000 U/ml). Los agentes de carga preferidos comprenden glicina y/o una sal cloruro de magnesio o de calcio, preferentemente que varía en concentración desde aproximadamente 0,5 a 300 mM. Un crioprotector adecuado es la sacarosa, que varía preferentemente en concentración desde aproximadamente 0,5 hasta el 2%. Opcionalmente, estas composiciones de producto de fármaco de carga pueden contener también un tensioactivo o un detergente, tal como polisorbato (p. ej.: Tween-80®) o polietilenglicol (PEG), que puede servir también como crioprotector durante la etapa de congelación. El tensioactivo varía preferentemente desde aproximadamente 0,005 al 0,05%. Preferentemente, las concentraciones de los excipientes proporcionan una osmolalidad combinada de aproximadamente 250 a 350 miliosmolal (mOsM), con preferencia aproximadamente 300 mOsM \pm 50 mOsM y además, pueden contener un agente de tamponación apropiado para mantener un pH fisiológicamente adecuado, p. ej.: en el intervalo preferentemente de aproximadamente 6,0 a 8,0. Los agentes de tamponación incluyen preferentemente histidina y fosfato de sodio o de potasio, con un pH objetivo de aproximadamente 6,5 a 7,5, todos aproximadamente de 5 a 50 mM.

Otro aspecto de la presente invención proporciona formulaciones de factor IX adecuadas para la administración en una forma galénica final, por ejemplo, por vía intravenosa o por inyección subcutánea. Las formulaciones preferidas comprenden concentraciones de factor IX que varían desde aproximadamente 0,1 hasta por lo menos 20 mg/ml, aproximadamente del 0,5 al 2% de sacarosa, aproximadamente del 0,1 a 0,3 M de glicina y aproximadamente del 0,005 al 0,02% de polisorbato, con histidina como agente de tamponación, variando desde aproximadamente 5 a 50 mM. Una formulación liofilizada preferida comprende aproximadamente 0,1 hasta por lo menos 10 mg/ml de factor IX, aproximadamente 260 mM de glicina, aproximadamente 1% de sacarosa, aproximadamente 0,005% de polisorbato y aproximadamente histidina 10 mM, a pH 7,0.

Descripción detallada de la invención

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos liofilización, liofilizado y secado por congelación comprenden pero no se limitan a los procedimientos que incluyen "congelación" de una solución seguida de "secado", opcionalmente al vacío. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "agente de carga" comprende agentes que proporcionan buenas propiedades de pasta liofilizada, que ayudan a la proteína a superar varías tensiones (cizallamiento/congelación por ejemplo) relacionadas con el proceso de liofilización y que ayudan a mantener los niveles de actividad de la proteína. Ejemplos de agentes de carga comprenden, pero no se limitan a, glicina, MgCl_{2}, CaCl_{2}, NaCl y similares. Estos agentes contribuyen a la tonicidad de las formulaciones. Los crioprotectores también contribuyen a la tonicidad. El término "crioprotectores" comprende generalmente agentes que proporcionan estabilidad a la proteína para las tensiones producidas por congelación; sin embargo, el término comprende asimismo agentes que proporcionan estabilidad, p. ej.: a las formulaciones de fármaco de carga de tensiones producidas sin congelación durante el almacenamiento. El crioprotector es sacarosa. El término "lioprotector" comprende agentes que proporcionan estabilidad a la proteína durante la eliminación del agua del sistema durante el proceso de secado, probablemente manteniendo la conformación característica de la proteína a través del enlace al hidrógeno. El crioprotector puede tener asimismo efectos crioprotectores. Aunque las concentraciones preferidas del crioprotector varían desde aproximadamente 0,5 al 2%, las concentraciones relativamente altas, por ejemplo 5%, son adecuadas con los niveles utilizados, limitados únicamente por los utilizados habitualmente en la práctica clínica.

"Tensioactivos" comprende generalmente los agentes que protegen a la proteína de tensiones producidas por la interfase aire/solución y de tensiones producidas por la solución/superficie (p. ej.: produciendo agregación de proteína) y pueden incluir detergentes tal como polisorbato-80 (Tween), por ejemplo, 0,005 a 0,05% (peso/volumen), o polietilenglicol (PEG), tal como PEG8000, por ejemplo. Opcionalmente, concentraciones relativamente altas, p. ej.: hasta 0,5%, son adecuadas para mantener la estabilidad de la proteína; sin embargo, los niveles utilizados en la práctica real están limitados habitualmente por la práctica clínica.

El término "agente tamponante" abarca los agentes que mantienen el pH de la solución en un intervalo aceptable antes de la liofilización y pueden comprender histidina, fosfato (de sodio o potasio), tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietamolamina y similares. Los limites de concentración superiores son generalmente mayores para las formas de proteína "de carga" que para las de proteína "de dosificación" como se aprecia fácilmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, mientras que las concentraciones de tampón pueden variar de varios milimolares hasta el limite superior de su solubilidad, p. ej.: histidina podría ser tan alta como 200 mM, cualquier experto en la materia tendría también en consideración conseguir/mantener una concentración apropiada fisiológicamente adecuada. Los porcentajes son en peso/peso cuando se refieren a sólidos y en peso/volumen cuando se refieren a líquidos. Se entiende que el término "isotónico", 300 \pm 50 mOsM, significa una medida de osmolalidad de la solución de proteína antes de la liofilización; la redisolución típicamente es con agua para inyectables (WFI). Es importante mantener la osmolalidad fisiológica para las formas galénicas. Sin embargo, en las formulaciones de carga, se pueden utilizar eficazmente concentraciones mucho mayores mientras que la solución sea isotónica antes de su utilización. El término "excipientes" comprende los reactivos farmacéuticamente aceptables para proporcionar buenas propiedades de pasta liofilizada (agentes de carga) así como proporcionar lioprotección y crioprotección a la proteína, mantenimiento del pH y conformación característica de la proteína durante el almacenamiento a fin de mantener la retención sustancial de la actividad biológica (estabilidad de la proteína).

Según se utiliza en la presente memoria, la concentración de factor IX se expresa convenientemente en mg/ml o en U/ml, siendo 1 mg aproximadamente igual a 200 U/ml \pm 100 U/ml.

Los ejemplos siguientes ilustran la práctica de la invención. Estos ejemplos son a título ilustrativo únicamente y no se pretenden de ninguna manera limitar el alcance de las reivindicaciones de la invención. El "crioprotector" de la invención es la sacarosa. El Ejemplo 1 describe el factor IX recombinante en varías formulaciones (todas isotónicas) seguido de liofilización y almacenamiento a tres temperaturas diferentes durante un mes. Las composiciones se redisuelven en agua y se calcula la formación de partículas, la recuperación de proteínas, la actividad específica y la formación de agregados en porcentaje. El Ejemplo 2 proporciona formulaciones adicionales y el Ejemplo 3 se refiere a la estabilidad al almacenamiento del factor IX a una concentración de proteína relativamente grande.

Ejemplo 1

Se preparan muestras de las formulaciones indicadas en la Tabla I a continuación, a una concentración de proteína recombinante del factor IX de \sim 0,5 mg/ml (100 U/ml) y una osmolalidad de 300 \pm 50 mOsM. Todas las muestras contienen una forma recombinante del factor IX purificada por columna de conformación de anticuerpo monoclonal específico. La preparación del factor IX recombinante se ha descrito en la patente USPN nº 4.770.999, Kaufman, et al. Un procedimiento de purificación adecuado es el descrito por Hrinda, et al., Preclinical Studies of a Monoclonal Antibody - Purified Factor IX, Mononine™ Seminars in Hematology, 28(3):6 (julio de 1991). Otros procedimientos de preparación comprenden la utilización de anticuerpos monoclonales específicos de conformación descritos por Tharakan, et al., "Physical and biochemical properties of five commercial resins for immunoaffinity purification of factor IX". Journal of Chromatography 595:103- 111 (1992); y por Liebman, et al., "Immunoaffinity purification of factor IX (Christmas factor) by using conformation-specific antibodies directed against the factor IX-metal complex". Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:3879-3883 (1985); así como procedimientos cromatográficos convencionales, por ejemplo, descritos por Hashimoto, et al., "A Method for Systematic Purification from Bovine Plasma of Six Vitamin K-Dependent Coagulation Factors: Prothrombin, Factor X, Factor IX, Protein C, and Protein Z". J. Biochem. 97:1347-1355 (1985) y Bajaj, P. et al. Prep. Biochem, 11:397 (1981).

TABLA I

Número de muestra	pH	Tampón (10 mM)	Sal (Agente de carga)	Protector Crio-Lio
1	7,0	histidina	NaCl 0,066 M	manitol 3%
2	7,0	histidina	glicina 0,13 M	manitol 3%
3	7,0	fosfato de potasio	glicina 0,12 M	manitol 3%
4	7,0	fosfato de potasio	glicina 0,25 M	sacarosa 1%
5	7,0	histidina	glicina 0,26 M	sacarosa 1%
6	7,0	histidina	glicina 0,25 M, Ca^{++} 5 mM	sacarosa 1%
7	7,0	fosfato de sodio	glicina 0,25 M	sacarosa 1%
8	7,5	fosfato de potasio	glicina 0,25 M	sacarosa 1%
9	7,5	fosfato de sodio	glicina 0,25 M	sacarosa 1%
10	7,5	tris	glicina 0,26 M	sacarosa 1%
11	7,5	tris	glicina 0,25 M, Ca^{++} 5 mM	sacarosa 1%
12	7,5	tris	glicina 0,13 M	manitol 3%
13	7,5	dietanolamina	glicina 0,26 M	sacarosa 1%
14	7,5	dietanolamina	glicina 0,13 M	manitol 3%
15	7,5	dietanolamina	glicina 0,25 M, Ca^{++} 5 mM	sacarosa 1%

Se preparó otra serie de 15 muestras, como anteriormente, conteniendo sin embargo, además, un tensioactivo, Tween-80® al 0,005%. La formulación de la muestra 1 es la formulación utilizada para el factor IX procedente del plasma disponible en el comercio (MononineTM).

A. Efectos del ciclo de congelación/descongelación

Antes de la liofilización, las muestras de cada formulación se someten a cinco ciclos de congelación/descongelación para determinar la susceptibilidad a la desnaturalización provocada por congelación. Una serie de ciclos congelación- descongelación (cinco, por ejemplo) a -80ºC/37ºC antes de la liofilización es una "señal" útil de una susceptibilidad de la proteína al aumento de la formación del agregado como se puede observar en un procedimiento de liofilización y/o durante el almacenamiento a largo plazo. Se analiza la cantidad de "especies con peso molecular alto" (HMW) presente en las muestras; HMW comprende agregados covalentes y no covalentes medidos por SEC-HPLC y SDS-PAGE (reducidos y no reducidos). Las muestras con Tween-80® (0,005%) añadido han producido agregación mínima (menos de 0,1% de aumento de HMW). Sin la adición del tensioactivo, las formulaciones 1, 6, 11 y 15 muestran más del 6% de HMW generado y las demás formulaciones tuvieron < 4% de aumento de HMW.

B. Efectos de temperatura y tensioactivo a lo largo del tiempo

Antes de la liofilización, cada muestra, (con y sin tensioactivo (Tween) (0,005%))) se filtra estéril a través de un filtro de 0,2 \mum. La mitad de los volúmenes en ml se llenan en viales de liofilización de 2 ml y se cargan en un liofilizador. Se congelan los viales durante 5,5 horas a -50ºC. La propia temperatura se sube a -30ºC para empezar el sacado primario y se mantiene durante 42 horas. La propia temperatura se sube a +25ºC a lo largo de un periodo de tiempo de 1 hora y se inicia el secado secundario y se mantiene durante 15 horas. Se tapan los viales al final del secado secundario. Todas las formulaciones presentan buenas propiedades de pasta y todas se redisuelven fácilmente en = 30 segundos después de añadir el agua. Inmediatamente después de la liofilización, se evalúa el aumento de HMW en las muestras. La mayoría que no contienen Tween presentaron aumento de \sim/- 2%. Posteriormente, las muestras se almacenan a tres temperaturas diferentes (-80ºC, 4ºC y 30ºC) durante un periodo de tiempo de un mes. El aumento del porcentaje de HMW se expresa como porcentaje de superficie (absorbancia a 280 nm) de SEC- HPLC después de la liofilización. Tabla II. Después de un almacenaje de un mes, muchas formulaciones que no contienen tensioactivo dan un aumento de porcentaje mayor de HMW que varía de 0 al 25%, que es más evidente en la temperatura de almacenamiento a 30ºC. En particular, las muestras 1 a 3, 12 y 14 proporcionan los aumentos de porcentaje más altos.

Aunque las formulaciones a las que se ha añadido tensioactivo, generalmente tienen un aumento de porcentaje inferior en HMW, es decir, minimización de la agregación producida por la congelación a partir del propio proceso de liofilización, la lioprotección a largo plazo depende además de la presencia de otros excipientes. Por ejemplo, las formulaciones con sacarosa en lugar de con manitol presentan un aumento de porcentaje inferior en HMW. Por lo tanto, las formulaciones con manitol 1, 2, 3, 12 y 14, con o sin tensioactivo, proporcionan un aumento hasta del 36% en porcentaje de HMW.

TABLA II Cambio en el porcentaje de HMW por SEC-HPLC

Un mes a tres temperaturas sin Tween® (-T) y con Tween® (+T)

Temp.		-80ºC	4ºC	30ºC
Muestra nº	Tiempo cero^{1}	Un mes^{2}	Un mes^{2}	Un mes^{2}
	-T	+T	-T	+T	-T	+T	-T	+T
1	1,1	0,0	8,4	-1,0	10,0	-1,0	14,0	18,0
2	1,9	0,1	2,0	0,8	2,0	0,4	8,0	7,5
3	1,4	0,0	2,2	0,1	3,0	-1,5	8,0	3,5
4	0,5	0,1	0,6	-1,5	1,0	-1,9	1,5	-1,0
5	0,9	0,0	3,0	-0,6	4,1	-0,5	4,0	-1,0
6	0,7	0,2	4,4	0,2	4,0	0,1	5,0	0,0
7	0,7	0,2	2,2	-0,1	3,1	-0,1	3,0	-0,2
8	1,6	0,2	0,4	-0,2	2,6	-0,1	0,8	-0,1

TABLA II (continuación)

Temp.		-80ºC	4ºC	30ºC
Muestra nº	Tiempo cero^{1}	Un mes^{2}	Un mes^{2}	Un mes^{2}
	-T	+T	-T	+T	-T	+T	-T	+T
9	1,2	0,3	2,0	-0,2	3,5	-0,8	2,0	-0,1
10	1,1	0,1	1,0	-0,4	1,6	-0,8	2,1	-0,2
11	0,3	0,2	0,4	0,0	0,8	-0,1	0,8	0,0
12	0,6	0,1	0,6	-1,5	3,4	-1,0	8,0	6,0
13	0,0	0,0	0,1	0,0	0,8	-0,5	0,8	0,1
14	1,5	0,0	3,0	0,1	5,4	13,0	25,0	36,0
15	0,0	0,0	-1,0	-1,0	-1,2	2,0	1,0	1,0
^{1} = Cambio en porcentaje en Tiempo cero (%) de HMW desde "antes de la liofilización" hasta
"después de la liofilización"
^{2} = Aumento de superficie de HMW en % con respecto al valor en Tiempo cero

Se determinan los valores de actividad de coagulación y de actividad específica para las muestras de un mes, a
-80ºC, 4ºC y 30ºC. La actividad del factor IX se determina según el procedimiento de Pittman, D., et al., Blood 79:389-397 (1992) utilizando la sangre con insuficiencia en factor IX.

Se observan pequeñas diferencias en la recuperación de la actividad o de la actividad específica a -80ºC o a 4ºC después de un mes (con o sin añadir tensioactivo); sin embargo, a 30ºC, la recuperación de la actividad y de la actividad específica se correlaciona generalmente con los resultados de la agregación; en otras palabras, se observa generalmente una pérdida de actividad con aumento de la agregación, más notablemente en las formulaciones 1, 2, 3, 12 y 14, en las que la adición del tensioactivo no evita que tenga lugar la agregación a lo largo del tiempo.

Ejemplo 2

Adicionalmente, se evalúan dos formulaciones que comprenden histidina, glicina (con y sin tensioactivo) y sacarosa al 2%, isotónica, y se observa que mantienen la actividad del factor IX.

Se prepara otra serie de 10 formulaciones como se relaciona en la Tabla III (con una osmolalidad de 300 \pm 50 mOsM), se liofiliza como se describió anteriormente y se colocan a -80ºC, 4ºC y 30ºC para almacenamiento y análisis de estabilidad en uno, tres y cuatro meses. Se ha añadido tensioactivo a todas las muestras, es decir, Tween-80 al 0,005%.

TABLA III

Número de muestra	pH	Tampón (10 mM)	Glicina	Sacarosa, %
1	7,0	histidina	0,26 M	1
2	7,0	histidina	0,29 M	0
3	7,0	fosfato de sodio	0,25 M	1
4	7,0	fosfato de potasio	0,25 M	1
5	7,5	tris	0,26 M	1
6	7,5	fosfato de potasio	0,25 M	1
7	7,5	fosfato de sodio	0,25 M	1

TABLA III (continuación)

Número de muestra	pH	Tampón (10 mM)	Glicina	Sacarosa, %
8	7,0	fosfato de sodio	0,29 M	0
9	7,5	fosfato de sodio	0,29 M	0
10	7,5	tris	0,29 M	0

Todas las formulaciones forman buenas pastas liofilizadas y se redisuelven en 20 a 30 segundos.

La Tabla IV resume la recuperación de la actividad y de la actividad específica después de varios meses y a las tres temperaturas de almacenamiento. Los datos para las muestras a 4ºC después de tres meses son similares para la mayoría de las formulaciones excepto para las formulaciones 8 y 10 que pierden actividad. Después de tres meses, a 30ºC, las formulaciones 2, 8, 9 y 10 pierden actividad. La mayor recuperación de actividad y de actividad específica se observa en las formulaciones 1, 3, 5, 6 y 7.

La Tabla V resume el aumento de la agregación a lo largo del tiempo. A 4ºC, después de tres meses, las formulaciones 1 a 7, tienen un aumento de HMW < 4% y a 30ºC, las formulaciones 8, 9 y 10 presentan la formación mayor de agregado. A 30ºC, la formulación 1 no presenta aumento de HMW, aún después de cuatro meses, mostrando las demás formulaciones > 3% de HMW. Las formulaciones 2, 8, 9 y 10 (que no contienen sacarosa) presentan formación elevada de agregado.

(Tabla pasa a página siguiente)

1

\newpage

TABLA V HMW (%) frente al tiempo

Liofilizado

	4ºC	30ºC
Muestra nº	Tiempo cero	1 mes	3 meses	4 meses	1 mes	3 meses	4 meses
1	0,6	0,1	0,0	0,1	0,1	0,2	0,3
2	0,6	0,1	0,5	ND	2,8	6,3	ND
3	0,5	0,2	1,4	1,8	1,0	3,5	4,0
4	0,6	0,6	1,9	ND	1,2	3,9	ND
5	0,5	0,0	0,3	1,2	0,4	3,0	5,1
6	0,6	0,7	2,6	ND	1,4	4,7	ND
7	0,9	0,9	3,3	ND	1,9	4,2	ND
8	1,6	9,4	12,1	ND	16,0	18,6	ND
9	1,8	5,9	8,3	ND	20,0	34,5	ND
10	0,8	3,3	21,5	ND	76,0	72,0	ND
ND = no determinado

Ejemplo 3

Para minimizar los requisitos de volumen de los recipientes de transporte, es preferible concentrar la proteína de la carga tanto como sea posible (p. ej.: hasta por lo menos 20 mg/ml) antes del transporte en un dispositivo de llenado/acabado. Además, es deseable tener el producto de fármaco de carga y el producto acabado en formulaciones similares.

Para evaluar preparados concentrados del factor IX útiles como producto de fármaco de carga, se prepararon doce formulaciones como se indica en la Tabla VI a continuación, excepto a altas concentraciones (\geq 10 mg/ml) de factor IX. La concentración de tensioactivo es superior al 0,005 ó 0,02% de Tween-80® (útil como estudio de optimización de Tween). Todas las muestras tienen factor IX en una concentración de \geq 10 mg/ml y de sacarosa al 1%. La osmolalidad de todas las muestras fue de 300 \pm 50 mOsM.

TABLA VI Formulaciones con Factor IX - alta concentración de carga

Número de muestra	pH	Tampón (10 mM)	Sales	Tween-80%
1A	7,0	histidina	Glicina 0,26 M	0,005
1B	7,0	histidina	Glicina 0,26 M	0,02
2A	7,0	fosfato de sodio	Glicina 0,25 M	0,005
2B	7,0	fosfato de sodio	Glicina 0,25 M	0,02
3A	7,0	fosfato de potasio	Glicina 0,25 M	0,005
3B	7,0	fosfato de potasio	Glicina 0,25 M	0,02
4A	7,5	tris	Glicina 0,26 M	0,005

TABLA VI (continuación)

Número de muestra	pH	Tampón (10 mM)	Sales	Tween-80%
4B	7,5	tris	Glicina 0,26 M	0,02
5A	7,5	fosfato de potasio	Glicina 0,25 M	0,005
5B	7,5	fosfato de potasio	Glicina 0,25 M	0,02
6A	7,5	fosfato de sodio	Glicina 0,25 M	0,005
6B	7,5	fosfato de sodio	Glicina 0,25 M	0,02

Se someten las muestras a cinco ciclos de congelación-descongelación, congelación repetida a -80ºC, descongelación posterior a 37ºC durante cinco ciclos y se analiza la recuperación de la concentración total del factor IX, de la actividad y de la actividad específica. La concentración del factor IX (mg/ml) varía de 10,40 a 15,20 mg/ml. El porcentaje inicial de HMW es < 0,5%. No existe pérdida de proteína o de actividad y ningún aumento significativo en la formación del agregado a partir de los ciclos congelación- descongelación para las 12 formulaciones. Se analiza la estabilidad del producto de carga formulado con alta concentración para varias formulaciones de la Tabla V después del almacenamiento a -80ºC durante un mes. No se observa ningún aumento en % de HMW y se mantiene la actividad específica.

Es de esperar que a los expertos en la materia les ocurran numerosas modificaciones y variaciones de la invención como las descritas en los ejemplos ilustrativos anteriores y, por consiguiente, solamente tales limitaciones como aparecen en las reivindicaciones adjuntas se deberían situar en las mismas. Por consiguiente, se pretende en las reivindicaciones anexas cubrir todas las variaciones equivalentes que están comprendidas en el alcance de la invención tal como se reivindica.

Claims

1. Composición estable a la liofilización, que comprende el factor IX, glicina, sacarosa y un tensioactivo, con la condición de que la composición sea isotónica.

2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además cloruro de calcio.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicho tensioactivo es polisorbato.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un agente tamponante.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho agente tamponante es un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por histidina, fosfato, tris y dietanolamina.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, histidina, sacarosa y polisorbato.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, fosfato de sodio, sacarosa y polisorbato.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, fosfato de potasio, sacarosa y polisorbato.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, tris, sacarosa y polisorbato.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, cloruro de calcio, polisorbato y sacarosa.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, tris, cloruro de calcio, polisorbato y sacarosa.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende factor IX, glicina, dietanolamina, polisorbato y sacarosa.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha concentración de factor IX está comprendida entre aproximadamente 0,4 y 20 mg/ml.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que dicha concentración de factor IX está comprendida aproximadamente entre 0,1 y 10 mg/ml.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha concentración de factor IX está comprendida entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/ml.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha concentración de glicina está comprendida entre aproximadamente 0,1 y 0,3 M.

17. Composición según la reivindicación 16, en la que dicha concentración de glicina está comprendida entre aproximadamente 0,2 y 0,3 M.

18. Composición según la reivindicación 17, en la que dicha concentración de glicina es de aproximadamente 0,26 M.

19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18, en la que dicho agente tamponante es histidina comprendida entre aproximadamente 5 y 30 mM.

20. Composición según la reivindicación 19, en la que dicha concentración de histidina es de aproximadamente 10 mM.

21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la concentración de sacarosa está comprendida entre aproximadamente 0,5 y 2%.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que dicha concentración de sacarosa es de aproximadamente 1%.

23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que dicho tensioactivo es polisorbato comprendido entre aproximadamente 0,005 y 0,05%.

24. Composición según la reivindicación 23, en la que dicha concentración de polisorbato es de aproximadamente 0,005%.

25. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende 0,75 mg/ml de factor IX, 0,26 M de glicina, 10 mM de histidina, 1% de sacarosa y 0,005% de polisorbato.