BRPI0618133A2

BRPI0618133A2 - solução de cloreto de sódio para reconstituição ou diluição de droga

Info

Publication number: BRPI0618133A2
Application number: BRPI0618133-3A
Authority: BR
Inventors: Chandra A Webb; Julie Zerfas
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2011-08-16
Also published as: UA97234C2; PE20151284A1; ES2627684T3; LUC00035I2; AU2006308921B2; DK1942868T3; EP3225233A1; NZ567685A; US20200138952A1; RU2432157C2; NO20082180A; CN101351190A; US20070135343A1; FR20C1005I1; CR9958A; IL190843A0; HK1245090B; LUC00035I1; MY184364A; DK1942868T5

Abstract

<b>SOLUçãO DE CLORETO DE SóDIO PARA RECONSTITUIçãO OU DILUIçãO DE DROGA<d>. A presente invenção fornece métodos para a preparação de formulações farmacêuticas para injeção de tal modo que durante a injeção a formulação não causa a aglutinação dos eritrócitos, a hemólise, e/ou o encolhimento da célula. Para impedir a aglutinação, uma formulação farmacêutica pronta para injeção necessita ter uma força iónica suficiente. Para impedir a hemólise ou o encolhimento da célula, uma formulação farmacêutica pronta para injeção necessita ser aproximadamente isotónica em relação ao plas- ma. A presente invenção fornece os métodos para preparação das formulações farmacêuticas para injeção possuindo força iónica suficiente para impedir a aglutinação e a tonicidade necessária para impedir a hemólise ou a desidratação significativas ou o encolhimento significativo da célula. Os métodos presentes envolvem o uso de soluções cotendo de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 150 mM de cloreto de sódio para reconstituição dos bolos liofilizados (ou outras formulações farmacêuticas que não sejam líquidas) em solução ou para a diluição de soluções de formulações farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SOLUÇÃODE CLORETO DE SÓDIO PARA RECONSTITUIÇÃO OU DILUIÇÃO DEDROGA".

Esse Pedido reivindica a prioridade do Documento US Série N°60/732.221, arquivado em 1° de novembro de 2005, que é aqui incorporadopela referência em sua totalidade.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações aqui cita-dos são aqui incorporados pela referência em sua totalidade. As divulgaçõese as descobertas dessas publicações em suas totalidades são daqui por di-ante incorporadas pela referência no presente pedido a fim descrever maiscompletamente o estado da arte tal como conhecido por aqueles versadosna mesma desde a data da presente invenção aqui descrita e reivindicada.

Uma parte da divulgação do presente Relatório Descritivo dePatente contém um material que está sujeito à proteção por direitos autorais.O proprietário dos direitos autorais não tem nenhuma objeção à reproduçãopor fac-símile por qualquer pessoa do presente Relatório Descritivo de Pa-tente ou da divulgação da patente, já que o mesmo se encontra nos arquivose registros do Escritório de Marcas e Patentes, porém se reserva todos osdireitos sobre quaisquer direitos autorais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

Quando o sangue total é misturado com uma solução de algumadroga, tal como por via intravenosa (IV) durante a administração de umadroga injetável IV, podem ocorrer coágulos ou pode ocorrer agregação deeritrócitos (também chamada aglutinação da célula vermelha do sangue) sea solução da droga não possuir a força iônica suficiente. A agregação deeritrócitos ocorre, por exemplo, com dextrose a 5% em água (uma soluçãoparenteral comumente de grande volume) e com muitos produtos farmacêu-ticos que possuem baixa força iônica.

Os produtos farmacêuticos são freqüentemente liofilizados, enecessitam conseqüentemente ser reconstituídos com uma solução antes dainjeção parenteral. Entretanto, quando os produtos liofilizados são reconstitu-ídos com soluções com baixa força iônica, a preparação resultante podetambém causar a agregação de eritrócitos. Embora a reconstituição de bolosIiofilizados com solução salina normal (0,9% NaCI) ao contrário da água es-téril para injeção (AEI) forneça uma força iônica adicional, a solução da dro-ga resultante pode ser hipertônica e poderia causar efeitos colaterais indese-jáveis durante a injeção.

Assim, permanece a necessidade de uma solução que possa serusada para reconstituir os bolos Iiofilizados ou diluir soluções farmacêuticaspara fornecer uma preparação resultante para injeção que seja isotônica emrelação ao plasma e tenha força iônica suficiente de tal modo que não causea agregação de eritrócitos.SUMÁRIO DA INVENÇÃO.

A presente invenção fornece a descoberta de que a aglutinaçãode eritrócitos é causada por soluções com baixa força iônica que entram emcontato com o sangue. Assim, quando as formulações farmacêuticas sãopreparadas para injeção intravenosa pela reconstituição ou pela diluição emsoluções com baixa força iônica tais como a dextrose a 5%, o dextrano a3%, ou a AEI, as preparações resultantes podem ter a osmolaridade neces-sária para serem aproximadamente isotônicas em relação ao sangue, masfreqüentemente não possuem uma força iônica suficiente para impedirem aaglutinação. Por outro lado, quando as formulações farmacêuticas são pre-paradas para injeção intravenosa pela reconstituição Ou pela diluição comsoluções com elevada força iônica tais como a solução salina (0,9% NaCI ou154 mM de NaCI), a preparação resultante pode ter uma força iônica sufici-ente para impedir a aglutinação, mas pode possuir uma osmolaridade queseja hipertônica em relação ao sangue, causando desse modo a desidrata-ção das células vermelhas do sangue (CVS), a inflamação venosa, e/oupossivelmente a tromboflebite se repetidas injeções forem freqüentes oucrônicas.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método parapreparação de uma formulação farmacêutica para injeção intravenosa, o mé-todo compreendendo a adição de uma solução contendo de aproximada-mente 25 mM à aproximadamente 150 mM de cloreto de sódio em uma for-mulação farmacêutica tendo desse modo por resultado uma formulação pre-parada para injeção intravenosa, em que a formulação preparada é aproxi-madamente isotônica em relação ao plasma ou é levemente hipotônica oulevemente hipertônica em relação ao plasma, e na qual a formulação prepa-rada possui uma força iônica suficiente para impedir a aglutinação de eritró-citos (ou a agregação de eritrócitos).

A formulação preparada é aproximadamente isotônica em rela-ção ao plasma, por exemplo, quando tem uma osmolaridade que é de apro-ximadamente 270 mOsm/L a aproximadamente 330 mOsm/L. A formulaçãopreparada é levemente hipotônica em relação ao plasma, por exemplo,quando tem uma osmolaridade que é de aproximadamente 220 mOsm/L aaproximadamente 270 mOsm/L. A formulação preparada é levemente hiper-tônica em relação ao plasma, por exemplo, quando tem uma osmolaridadeque é de aproximadamente 330 mOsm/L a aproximadamente 600 mOsm/L

Em um aspecto, a formulação preparada possui uma força iônicaque é suficiente para impedir a aglutinação de eritrócitos quando tem, porexemplo, pelo menos aproximadamente 25 mEq/L de íons de Na+ e de Cl".Em um outro aspecto, a formulação preparada possui uma força iônica que ésuficiente para impedir a aglutinação de eritrócitos quando tem, por exemplo,pelo menos aproximadamente 40 mEq/L de íons de Na+ e de Cl". Em umoutro aspecto, a formulação preparada possui uma força iônica que é sufici-ente para impedir a aglutinação de eritrócitos quando tem, por exemplo, pelomenos aproximadamente 40 mEq/L de íons de Na+ e de Cl" e menor do queaproximadamente 150 mEq/L de íons de Na+ e de Cl". Em um outro aspecto,a formulação preparada possui uma força iônica que é suficiente para impe-dir a aglutinação de eritrócitos quando tem, por exemplo, uma força iônicaquando medida por codutividade que é pelo menos de aproximadamente 2,5mS/cm. Em um outro aspecto, a formulação preparada possui uma forçaiônica que é suficiente para impedir a aglutinação de eritrócitos quando tem,por exemplo, uma força iônica quando medida por codutividade que é depelo menos aproximadamente 4,0 mS/cm.

A formulação farmacêutica a ser preparada para injeção podeser, por exemplo, uma formulação não líquida ou uma formulação em solu-ção. Uma formulação não líquida pode conseqüentemente ser reconstituídaem solução por uma solução de cloreto de sódio que tenha uma concentra-ção de cloreto de sódio de aproximadamente 25 a 150 mM, 25 a 100 mM, 25a 80 mM, 25 a 40 mM, 25 a 35 mM, 25 a 30 mM, ou de aproximadamente 40mM. Uma formulação líquida ou uma formulação em solução pode conse-qüentemente ser diluída por uma solução de cloreto de sódio que tenha umaconcentração de cloreto de sódio de aproximadamente 25 a 150 mM, 25 a100 mM, 25 ã 80 mM, 25 a 40 mM, 25 a 35 mM, 25 a 30 mM, ou de aproxi-madamente 40 mM. Uma formulação não líquida pode ser, por exemplo,uma formulação liofilizada.

Em um aspecto, a solução de cloreto de sódio que é adicionadacompreende de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 150 mM decloreto de sódio. Em um aspecto, a solução de cloreto de sódio que é adi-cionada consiste essencialmente de aproximadamente 40 mM a aproxima-damente 150 mM de cloreto de sódio. Em um aspecto, a solução de cloretode sódio que é adicionada compreende aproximadamente 40 mM de cloretode sódio. Em um aspecto, a solução de cloreto de sódio que é adicionadaconsiste essencialmente em uma solução de cloreto de sódio de 40 mM. Emum aspecto, a solução de cloreto de sódio que é adicionada consiste essen-cialmente em uma solução que tenha uma solução de cloreto de sódio quetenha aproximadamente 40 mM ± 10 mM de cloreto de sódio.

Em um aspecto, em que antes da adição da solução de cloretode sódio, a formulação farmacêutica não contenha uma quantidade apreciá-vel de um sal de ionização. Uma quantidade apreciável de um sal de ioniza-ção pode ser, por exemplo, uma quantidade que seja maior do que aproxi-madamente 5 mM. Em um outro aspecto, uma quantidade apreciável de umsal de ionização pode ser, por exemplo, uma quantidade que seja maior doque aproximadamente 25 mM. Se a formulação farmacêutica for uma formu-lação liofilizada, ela não contem uma quantidade apreciável de um sal deionização se não possuir mais do que, por exemplo, 5 mM ou 25 mM de umsal de ionização quando a formulação liofilizada for reconstituída em água.Em um aspecto, antes da adição da solução de cloreto de sódio,a formulação farmacêutica compreende a histidina, a glicina, a sacarose, e opolissorbato. Em um outro aspecto, antes da adição da solução de cloreto desódio, a formulação farmacêutica compreende a histidina, a glicina, a saca-rose, o polissorbato, e uma proteína terapêutica. Aqui, uma proteína terapêu-tica pode ser, por exemplo, uma proteína usada para tratar os distúrbios dacoagulação ou para a hemostasia, incluindo, mas não limitada ao Fator VII,ao Fator VIII, ao Fator IX, ao Fator XIII, aos anticorpos, aos analogues rela-cionados aos mesmos, e aos derivados os mesmos. Em um outro aspecto,em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulação farma-cêutica compreende a histidina, a glicina, a sacarose, o polissorbato, e o Fa-tor IX (incluindo o Fator IX recombinante (FIXr)). Tal como aqui utilizado, oFator IX pode incluir as versões modificadas do Fator IX, incluindo, por e-xemplo, o Fator IX PEGIado, as fusões de proteína compreendendo o FatorIX tal como a albumina-Fator IX ou a imunoglobulina (total ou os domínios damesma)-Fator IX, e o Fator IX glicado.

Em um aspecto, em que a formulação farmacêutica é uma for-mulação liofilizada, antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formu-lação, medida como se fosse reconstituída em água (em um volume queseja o mesmo que o volume suficiente, isto é, o volume da formulação antesda liofilização), compreende: (a) de aproximadamente 5 mM a aproximada-mente 30 mM de histidina; (b) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamen-te 0,3M de glicina; (c) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 porcento de sacarose; e (d) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente0,05 por cento (ou de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,05 porcento) de polissorbato. Em um aspecto, a formulação pode também compre-ender, medida como se fosse reconstituída com água, (e) de aproximada-mente 0,1 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL ou mais de uma proteínaterapêutica, ou de aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000,2000 UI/mL (unidade internacional/ml) ou mais, de uma proteína terapêutica.Em um aspecto, a formulação pode também compreender, medida como sefosse reconstituída com água, (e) de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproxi-madamente 100 mg/mL ou mais do Fator IX, ou de aproximadamente 0,4mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL do Fator IX, ou de aproximadamente10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 UI/mL (unidade internacional/ml)ou mais, do Fator IX.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método paraimpedir a aglutinação de eritrócitos causada a partir de uma injeção intrave-nosa, o método compreendendo a reconstituição ou a diluição de uma for-mulação farmacêutica com uma solução de cloreto de sódio de aproxima-damente 25 mM à de aproximadamente 150 mM de tal modo que a formula-ção farmacêutica reconstituída ou diluída possui uma força tônica suficientepara impedir a aglutinação de eritrócitos quando a formulação farmacêuticareconstituída ou diluída é administrada a um indivíduo via injeção intraveno-sa.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método parapreparação de uma formulação farmacêutica Iiofilizada para injeção intrave-nosa, o método compreendendo reconstituir a formulação farmacêutica Iiofi-lizada com com uma solução de cloreto de sódio de aproximadamente 25mM à de aproximadamente 150 mM de tal modo que após a reconstituição,a formulação possui uma força iônica suficiente para impedir a aglutinaçãode eritrócitos e uma osmolaridade que é aproximadamente isotônica (ou le-vemente hipertônica ou levemente hipotônica).

Em um aspecto, a formulação Iiofilizada é reconstituída com asolução de cloreto de sódio, em que o volume da solução de cloreto de sódiousado para a reconstituição é menor do que o volume de pré-liofilização daformulação (isto é, o volume suficiente). Desse modo, a presente invençãofornece um método para a redução do volume da formulação a ser injetada.

Em um aspecto, a formulação Iiofilizada reconstituída com a so-lução de cloreto de sódio, em que o volume da solução de cloreto de sódiousada para a reconstituição é maior do que o volume de pré-liofilização daformulação (isto é, o volume suficiente). Desse modo, a presente invençãofornece um método para manter a isotonicidade da formulação a ser injeta-da.Por exemplo, uma formulação Iiofilizada pode ser reconstituídacom um volume da solução de cloreto de sódio que seja maior do que o vo-lume de pré-liofilização da formulação, tal como a reconstituição com 5 mLde cloreto de sódio onde o volume de pré-liofilização da formulação é de 4mL. Por exemplo, uma formulação Iiofilizada de 4 mL reconstituída em 4 mLde água é uma solução isotônica contendo 10 mM de histidina, 260 mM deglicina, 1% de sacarose, 0,005% de polissorbato, que é aproximadamente300 mOsm/L. Mas se a formulação Iiofilizada for reconstituída com 4 mL deuma solução de NaCI a 40 mM (80 mOsm/L) então a formulação resultanteteria uma solução levemente hipertônica (300 mOsm/L + 80 mOsm/L = 380mOsm/L). Mas se a formulação Iiofilizada for reconstituída com 5 mL de umasolução de NaCI a 40 mM, então a solução resultante é aproximadamente 8mM (8 mOsm/L) de histidina, 208 mM (208 mOsm/L) de glicina, 0,8% de sa-carose (24 mOsm/L), 0,004% de polissorbato (osmolaridade insignificante), e40 mM (80 mOsm/L) de NaCI, que é de aproximadamente 320 mOsm/L. As-sim, pela reconstituição de uma formulação pré-liofilização que é aproxima-damente isotônica, com um volume da solução de cloreto de sódio que émaior do que o volume suficiente, a presente invenção pode fornecer umasolução resultante que ainda é aproximadamente isotônica. Em outras pala-vras, a reconstituição uma formulação pré-liofilização que é aproximadamen-te isotônica com um volume da solução de cloreto de sódio que é menor doque ou aproximadamente o volume suficiente pode resultar em uma soluçãoque é levemente hipertônica. Para evitar isso, a presente invenção forneceum método para manter a isotonicidade pela reconstituição de uma formula-ção Iiofilizada com uma solução de cloreto de sódio em um volume que sejamaior do que o volume de pré-liofilização da formulação.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método paramanter a isotonicidade de uma formulação Iiofilizada após a reconstituição, ométodo compreendendo a reconstituição uma formulação liofilizada em umvolume que é pelo menos 20% maior do que o volume de pré-liofilização daformulação, em que a formulação pré-liofilização é aproximadamente isotô-nica, de tal modo que a formulação reconstituída é aproximadamente isotô-nica e possui uma força iônica suficiente para impedir â aglutinação dos eri-trócitos. A reconstituição de uma formulação Iiofilizada com um volume maiordo que seu volume de pré-liofilização, contribui para que a osmolaridade dobolo Iiofilizado seja diminuída em uma proporção direta ao aumento do vo-lume de reconstituição em comparação à pré-liofilização. Por exemplo, umaformulação pré-liofilização com uma tonicidade de 300 mOsm/L em um vo-lume X, se reconstituída em uma solução com volume Y que é 20% maior doque o volume X, os 300 mOsm/L serão então 240 mOsm/L no volume Y (u-ma diminuição de 20% na osmolaridade devido a um aumento de 20% novolume). Se a solução do volume Y for uma solução de cloreto de sódio, en-tão a contribuição para a tonicidade da solução de cloreto de sódio é duasvezes a concentração de cloreto de sódio na solução. Por exemplo, se a so-lução do volume Y for 40 mM, então a solução reconstituída tem uma tonici-dade de 240 mOsm/L mais 80 mOsm/L, que é aproximadamente isotônica, etem uma força iônica suficiente para impedir a agregação de eritrócitos.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método parapreparação de uma formulação Iiofilizada do Fator IX para injeção intraveno-sa, o método compreendendo a adição de uma solução contendo de apro-ximadamente 25 mM à aproximadamente 150 mM de cloreto de sódio à for-mulação Iiofilizada do Fator IX resultando assim em uma formulação prepa-rada para injeção intravenosa, em que a formulação preparada é aproxima-damente isotônica em relação ao plasma ou é levemente hipotônica ou le-vemente hipertônica em relação ao plasma, e em que a formulação prepara-da possui uma força iônica suficiente para impedir a aglutinação dos eritróci-tos. Em um aspecto, a formulação Iiofilizada do Fator IX, quando medidacomo se fosse reconstituída com água, compreende (a) de aproximadamen-te 5 mM a aproximadamente 30 mM de histidina; (b) de aproximadamente0,1 M a aproximadamente 0,3M de glicina; (c) de aproximadamente 0,5 aaproximadamente 2 por cento de sacarose; (d) de aproximadamente 0,001 aaproximadamente 0,05 por cento de polissorbato; e (e) de aproximadamente0,4 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL do Fator IX, ou de aproximada-mente 0,1 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, ou de alguma outra quan-tidade solúvel do Fator IX, ou de aproximadamente 10 Ul/mL a aproximada-mente 500 UI/mL do Fator IX, ou de aproximadamente 10 Ul/mL a aproxi-madamente 5000 UI/mL do Fator IX. Em um aspecto, uma solução contendoaproximadamente 40 mM de cloreto de sódio é adicionada à formulação liofi-lizada do Fator IX. Em um aspecto, aproximadamente 5 mL da solução decloreto de sódio de aproximadamente 40 mM são adicionados à formulaçãoliofilizada do Fator IX. Em um aspecto, na formulação liofilizada do Fator IXse medida tal como se fosse reconstituída com água, compreende aproxi-madamente 10 mM de histidina, aproximadamente 0,26 M de glicina, apro-ximadamente 1% de sacarose, e no aproximadamente 0,005% de polissor-bato.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit famacêuticocompreendendo: (a) um frasco contendo um bolo liofilizado, em que se obolo liofilizado fosse reconstituído com aproximadamente 5 mL da água asolução compreenderia: (i) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente30 mM de histidina; (ii) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3Mde glicina; (iii) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 por cento desacarose; (iv) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 por centode polissorbato; e (v) de aproximadamente 0,4 mg/mL a aproximadamente20 mg/mL do Fator IX, ou de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximada-mente 100 mg/mL ou de alguma outra quantidade solúvel do Fator IX, ou deaproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 500 UI/mL do Fator IX, oude aproximadamente 10 UI/mL a aproximadamente 5000 UI/mL do Fator IX;(b) uma solução contendo de aproximadamente 25 mM à aproximadamente150 mM de cloreto de sódio; e (c) instruções para reconstituição do bolo liofi-lizado com a solução de cloreto de sódio, de tal modo que depois da recons-tituição a solução resultante é aproximadamente isotônica e possui uma for-ça iônica suficiente para impedir a agregação de eritrócitos durante a injeçãointravenosa.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit famacêuticocompreendendo: (a) um frasco contendo um bolo liofilizado, em que se obolo liofilizado fosse reconstituído com aproximadamente 4 mL da água asolução compreenderia: (i) aproximadamente 10 mM de histidina; (ii) apro-ximadamente 0,26M de glicina; (iii) aproximadamente 1 por cento de sacaro-se; (iv) aproximadamente 0,005 por cento de polissorbato 80; e (v) de apro-ximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 5000 UI/mL do Fator IX; (b) umasolução contendo aproximadamente 40 mM de cloreto de sódio; e (c) instru-ções para reconstituição do bolo Iiofilizado no frasco com aproximadamente5 mL de uma solução contendo aproximadamente 40 mM de cloreto de só-dio, de tal modo que após a reconstituição a solução resultante compreende:(i) de aproximadamente 7 ou 8 a aproximadamente 10 mM de histidina; (ii)de aproximadamente 200 a aproximadamente 210 mM de glicina; (iii) de a-proximadamente 0,7% a aproximadamente 0,9% sacarose; (iv) aproxima-damente 0,004% de polissorbato 80; (v) de aproximadamente 50 UI/mL aaproximadamente 5000 UI/mL do Fator IX; e (vi) aproximadamente 40 mMde NaCl.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS.

A Figura 1 mostra os resultados de sedimentação de eritrócitosdas experiências descritas no Exemplo 3. A sedimentação de eritrócitos foimedida em 60 minutos usando uma adaptação do método modificado deWestergren (veja o Exemplo 2), em que o sangue humano coletado em ED-TA foi misturado em 1:4 com as soluções de teste. Após 60 minutos, a dis-tância em mm entre a marca zero e a interface entre eritrócito:plasma foimedida. As barras horizontais representam os suportes médios e do verticalo desvio padrão de um total de 12 doadores. Os resultados foram combina-dos de 4 experimentos independentes cada uma de que avaliou o sangue de3 doadores.

A Figura 2 mostra uma avaliação da sedimentação de eritrócitosnas formulações de BeneFIX® reconstituídas com soluções de NaCI. Umasolução de NaCl de 40 mM é suficiente para impedir a aglutinação de eritró-citos quando usada para reconstituir ou os produtos BeneFIX® atualmentecomercializados ou uma nova fromulação de BeneFIX® (BeneFIX®-R ondeantes da liofilização a solução suficiente foi de 4 mL e continha concentra-ções de 10 mM de histidina, 260 mM de glicina, 1% de sacarose, 0,005% depolissorbato 80; de tal modo que depois da liofilização ela foi reconstituídacom 5 mL de cloreto de sódio a 40 mM de tal modo que depois da reconsti-tuição a BeneFIX(S)-R compreende 40 mM de NaCI1 8 mM de histidina, 208mM de glicina, 0,8% de sacarose, e 0,004% de polissorbato).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

A presente invenção fornece métodos para preparação de for-mulações farmacêuticas para injeção (particularmente, as preparações jáprontas para injeção intravenosa) que não causam a aglutinação dos eritróci-tos, a hemólise, e/ou o encolhimento da célula. Para impedir a aglutinação,uma formulação farmacêutica pronta para injeção necessita ter uma forçaiônica suficiente. Para impedir a hemólise ou o encolhimento da célula, umaformulação farmacêutica pronta para injeção necessita ser aproximadamenteisotônica em relação ao plasma. A presente invenção fornece os métodospara preparação das formulações farmacêuticas para injeção possuindo for-ça iônica suficiente para impedir a aglutinação e a tonicidade requisite paraimpedir a hemólise significativa ou a desidratação ou o encolhimento da cé-lula. Os presentes métodos envolvem o uso das soluções de cloreto de só-dio que são de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 150 mM paraa reconstituirão dos bolos Iiofilizados (ou outras formulações farmacêuticasnão líquidas) em solução ou para diluir soluções farmacêuticas da formula-ção. Se as soluções de cloreto de sódio são usadas para a reconstituição oupara diluição, a adição de soluções específicas de cloreto de sódio resultaem uma preparação farmacêutica para injeção que é aproximadamente iso-tônica em relação ao plasma ou ao sangue e possui força iônica suficientepara impedir a agregação de eritrócitos durante a injeção, particularmente,durante a injeção intravenosa.

Os Termos.

Tal com aqui utilizado, a "molalidade" de uma solução é o núme-ro de moles de um soluto por quilograma do solvente.

Tal com aqui utilizado, a "molaridade" de uma solução é o núme-ro de moles de um soluto por litro da solução.

Tal com aqui utilizado, um "osmole" é a quantidade de umasubstância que produza, na solução ideal, o número das partículas (númerode Avogadro) que faria diminuir o ponto se congelando do solvente por 1,86K.

Tal com aqui utilizado, a "osmolaridade" de uma solução é onúmero de osmoles do soluto por quilograma do solvente. A osmolalidade éuma medida do número das partículas presentes na solução e é indepen-dent do tamanho ou do peso das partículas. Pode ser medido somente pelouso de uma propriedade da solução que é dependente somente da concen-tração da partícula. Essas propriedades são a diminuição da pressão do va-por, a diminuição do ponto de congelamento, elevação do ponto de ebulição,e da pressão osmótica, e são referidas coletivamente como sendo proprie-dades coligativas.

Tal com aqui utilizado, o "osmolaridade" de uma solução é onúmero dos osmolalidades do soluto por litro da solução.

Tal com aqui utilizado, "uma formulação farmacêutica" que estápronta ou é preparada para injeção pode ser qualquer droga com a intensãode ser administrada em um indivíduo. Por exemplo, uma formulação farma-cêutica pode ser um bolo liofilizado, uma solução, um pó, ou um sólido. Aformulação, se não estiver na forma líquida, reconstituída em solução comuma solução de NaCI de acordo com a presente invenção. Se a formulaçãoestiver na forma líquida, a formulação está diluído ou misturado com umasolução de NaCI de acordo com a presente invenção.

As forcas iônicas

Força iônica são uma característica de uma solução do eletrólito(um líquido com o positivo e os íons negativamente carregados dissolvidosnele). É expressa tipicamente como as interações eletrostáticas médias en-tre íons de um eletrólito. A força iônica de um eletrólito é metade do total ob-tido multiplicando o molalidade (a quantidade de substância por a massa daunidade do solvente) de cada íon por seu valência esquadrado.A força iônica é relacionada próxima à concentração des eletróli-tos e indica como eficazmente a carga em um íon particular é protegida ouestabilizada por outros íons (a atmosfera iônica chamada) em um eletrólito.A diferença principal entre a força iônica e a concentração de eletrólito é queo anterior é mais elevado se alguns dos íons forem carregados acima. Porexemplo, uma solução (quebrado para baixo) do sulfato inteiramente disso-ciated do magnésio (Mg2+S042") possui uma força iônica 4 vezes mais ele-vada do que üma solução de cloreto de sódio (Na+CI") da mesma concen-tração. Uma outra diferença entre os dois é que a força iônica reflete a con-centração de íons livres, e não apenas de quanto sal foi adicionado a umasolução. Às vezes um sal pode ser dissolvido mas os íons respectivos sãolimitados ainda junto pairwise, assemelhando-se a moléculas descarregada na solução. Neste caso a força iônica é muito mais baixa do que a concen-tração de sal.

Para a presente invenção, as preparações farmacêuticas sãopreparadas para injeção de tal modo que são não somente isotônica, maspossuem também uma força iônica suficiente para impedir a aglutinação das CVS. Uma força iônica suficiente de uma preparação pronta para injeção(isto é, um bolo Iiofilizado que reconstituída com uma solução de NaCI deacordo com a presente invenção, ou uma solução da droga que seja diluídacom uma solução de NaCI de acordo com a presente invenção) pode ter, porexemplo, pelo menos aproximadamente 25 miliequivalents por litro (mEq/L) de íons do Na e dos CF. Em uma modalidade, uma força iônica suficiente épelo menos aproximadamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou pelomenos aproximadamente 40 mEq/L de Na+ e de íons dos CF.

A força iônica pode também ser descrita nos termos do conduti-vidade de uma solução. O condutividade é a capacidade de um material ou de uma solução de conduzir a corrente elétrica. O princípio por que o condu-tividade da medida dos instrumentos é simples - duas placas é colocado naamostra, um potencial é aplicado através das placas (normalmente uma ten-são da onda do seno), e a corrente é medida. O condutividade (g), o inversodo resistividade (R) é determinado da tensão e dos valores presentes de acordo com a lei do ohm. G = l/R = I) (dos ampères/E (volts)

Desde que a carga em íons em facilidades da solução o conduc-tance da corrente elétrica, o condutividade de uma solução é proporcional asua concentração de íon. Em algumas situações, entretanto, o condutividadenão pode correlacionar diretamente à concentração. Entretanto, para solu-ções de cloreto de sódio, o condutividade é diretamente proporcional à con-centração de íon. A unidade básica do condutividade é o Siemens (s), cha-mado anteriormente o mho. Desde que a geometria de uma amostra do tes-te afeta valores do condutividade, as medidas padronizadas são expressa-das nas unidades específicas do condutividade (S/cm) para compensar paravariações em dimensões do elétrodo. O condutividade específico (C) é sim-plesmente o produto do condutividade medido (G) e da constante da célulado elétrodo (o I A), onde L está a um comprimento da coluna de líquido entreo elétrodo e o A é a área dos elétrodos. C = G χ (I A). Se a constante da cé-lula for 1 cm"1, o condutividade específico é o mesmo que o condutividademedido da solução. Embora a forma do elétrodo varie, um elétrodo podesempre ser representado por uma célula teórica equivalente.

Assim, em uma modalidade, uma força iônica suficiente de umapreparação pronta para injeção pode ter, por exemplo, pelo menos sobre umcondutividade de aproximadamente 4 mS/cm ou acima. Em uma outra mo-dalidade, a força iônica suficiente de uma solução pronta para injeção é pelomenos aproximadamente 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3,0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5,3.6, 3.7, 3.8, ou pelo menos aproximadamente 3.9 mS/cm.

Uma definição operacional de se uma solução possui uma forçaiônica suficiente para impedir a aglutinação de eritrócitos pode também serusada explicar o termo "força iônica suficiente". Por exemplo, isto pode serbaseado em um experimento de adicionar uma solução do teste ao sanguetotal e de observar a distância da sedimentação de eritrócitos (veja o exem-plo 2; método adaptado, modificado de Westergren). Em uma modalidade,se uma solução do teste quando misturada com o sangue total em uma rela-ção de 4:1 fornecer um sedimentação de eritrócitos em 60 minutos que sejamenor do que aproximadamente 10 mM (veja o exemplo 2, figura 1 e 2, porexemplo), então a solução do teste possui uma força iônica suficiente paraimpedir a aglutinação dos eritrócitos. Em uma outra modalidade, se uma so-lução do teste quando misturada com o sangue total em uma relação de 4:1fornecer um sedimentação de eritrócitos em 60 minutos que seja menor doque aproximadamente 5 mM, então a solução do teste possui uma força tô-nica suficiente para impedir a aglutinação dos eritrócitos.A osmolaridade da solução.

Os métodos de acordo com a presente invenção fornece prepa-rações farmacêuticas para injeção que são aproximadamente isotônicas emrelação ao sangue. Para determinar se uma preparação farmacêutica é a-proximadamente isotônica em relação ao sangue, calcula-se a osmolaridadepara todos os componentes químicos de uma solução incluindo o diluente. Aconcentração osmolar de preparações farmacêuticas para injeção (soluçõesparenterais) pode exercer efeitos adversos nas células de sangue e nos va-sos do corpo humano. A tonicidade pode ser calculada para os líquidos e osmedicamentos dissolvidos ou diluídos, que são expressos em um valor nu-mérico dos miliosmoles por litro de líquido (mOsm/L). Este valor é conhecidotambém como a osmolaridade. A osmolaridade do sangue varia entre 285 e310 mOsm/L. Quando as soluções hipotônicas ou hipertônicas são injetadasno sangue, o líquido desloca para dentro ou para fora das células, o que po-dem causar diversos efeitos negativos.

A osmolaridade da solução está baseada em parte nos concei-tos da osmose e da pressão osmótica. A osmose é a difusão dos solutos(partículas dissolvidas) ou a transferência de líquido através de membranassemipermeáveis tais como os vasos sangüíneos ou as membranas celula-res. A pressão osmótica, que facilita o transporte das moléculas através dasmembranas, é expressa em concentrações osmolar e denominada comohipo-osmótica (hipotônica), iso-osmótica (isotônica), ou hiper-osmótica (hi-pertônica) quando comparada com os líquidos biológicos tais como o sangueou o plasma. Os termos "tonicidade" e "pressão osmótica" são consideradosfreqüentemente como sendo sinônimos.

A pressão osmótica é a pressão hidrostática (ou hidráulica) re-querida para opôr o movimento da água através de uma membrana semi-permeável em resposta a um "gradiente osmótico" (isto é, dieferentes con-centrações de partícula nos dois lados da membrana). A osmolaridade doserum pode ser medida pelo uso de um osmômetró ou pode ser calculadacomo a soma das concentrações dos solutos presentes na solução. O valormedido no laboratório é referido geralmente como à osmolaridade. O valorcalculado a partir das concentrações do soluto é relatado pelo laboratóriocomo a osmolaridade. A abertura osmolar é a diferença entre estes dois va-lores.

No presente relatório descritivo, a tonicidade e a pressão osmó-tica devem ser considerados sinônimos, e devem ser amplamente compre-endidas. A tonicidade pode significar a osmolaridade efetiva e é igual à somadas concentrações dos solutos em uma solução possuindo capacidade deexercer uma força osmótica através de uma membrana, incluindo a mem-brana celular. No sentido estrito, a osmolaridade é uma propriedade de umasolução particular e é independent de qualquer membrana. A tonicidade éuma propriedade de uma solução em referência a uma membrana particular.Entretanto, a presente invenção deverá se referir às soluções como sendoisotónicas em relação às soluções biológicas tais como o sangue ou o plas-ma, e essa referência deverá incluir o significado de que a solução em parti-cular é isotônica com sangue ou plasma em relação a uma membrana celu-lar de uma célula no sangue ou no plasma ou em outra solução biológica.

Uma definição operacional da tonicidade pode ser usada paraexplicar o termo. Isto pode ser baseado em um experimento de adicionaruma solução de teste ao sangue total e observar o resultado. Se as CVSs dosangue total sofrerem inchasso e ruptura, a solução de teste é dita hipotôni-ca quando comparada ao plasma normal. Se as CVSs encolherem e se tor-narem aglutinadas, a solução do teste é dita hipertônica em compração aoplasma normal. Se as CVSs permanecerem as mesmas, a solução do testeé dita como sendo isotônica em relação ao plasma. A membrana celular dasCVS é a membrana da referência. Por exemplo, o sangue total colocado emsolução salina normal (isto é, 0,9% cloreto de sódio) não inchará, e assim asolução salina normal é dit ser isotônica.

Características das Soluções Isotónicas.

A presente invenção fornece os métodos para preparação ouaprontamento de formulações farmacêuticas para injeção em um indivíduo,em que as formulações são preparadas em soluções que são (1) aproxima-damente isotônica em relação ao sangue (ou plasma ou outro líquido bioló-gico) ou não são suficientemente hipertônicas ou hipotônicas a ponto decausarem significantes hemólise, trombose, ou irritação dos vasos e (2) pos-suem força iônica suficiente para impedir a agregação de eritrócitos.

Em uma modalidade, as formulações farmacêuticas isotônicas(em relação ao sangue) prontas para injeção possuem uma tonicidade ouuma osmolaridade que é maior do que aproximadamente 270 mOsm/L emenor do que aproximadamente 330 mOsm/L. Em uma modalidade, as for-mulações farmacêuticas isotônicas prontos para injeção possuem uma toni-cidade ou uma osmolaridade que é maior do que aproximadamente 270mOsm/L e menor do que aproximadamente 328 mOsm/L.

Embora as soluções tais como 0,9% cloreto de sódio e dextrosea 5% sejam isotônica, quando são usadas para reconstituir ou diluir muitasformulações farmacêuticas, a solução resultante pode não possuir força iôni-ca suficiente para impedir a aglutinação de eritrócitos (tanto quanto a dextro-se a 5%) ou pode possuir demasiada força iônica de tal modo que a soluçãoresultante seja hipertônica. Assim, os métodos de acordo com a presenteinvenção usam soluções para diluição ou para reconstituição contendo umaconcentração mínima de cloreto de sódio para fornecer (a) uma força iônicasuficiente para diminuir a agregação de eritrócitos, e (b) uma tonicidade sufi-ciente para impedir a hemólise, e uma concentração máxima de cloreto desódio para fornecer (c) uma tonicidade resultante que não seja tão elevadaquanto a das soluções hipertônicas. Além disso, os métodos de acordo coma presente invenção usam soluções para diluição ou para reconstituição quepodem fornecer uma força iônica e uma isotonicidade suficientes em relaçãoao sangue, enquanto também mantém um volume prático de injeção para apreparação farmacêutica.

Características das soluções hipotônicas.

A presente invenção fornece métodos para a preparação deformulações farmacêuticas para injeção em um indivíduo, em que as formu-lações são preparadas para formar soluções que não sejam hipotônicas emrelação ao sangue e nem demasiadamente hipotônicas (isto é, levementehipotônica em relação ao sangue) para causar uma hemólise significativa.Em uma modalidade, as formulações farmacêuticas prontas para injeçãoque são consideradas levemente hipotônicas em relação ao sangue podemter uma tonicidade ou uma osmolaridade que seja menor do que aproxima-damente 270 mOsm/L e maior do que aproximadamente 240 mOsm/L. Emuma modalidade, as formulações farmacêuticas prontas para injeção quesão consideradas levemente hipotônicas em relação ao sangue podem teruma tonicidade ou uma osmolaridade que seja menor do que aproximada-mente 270 mOsm/L e maior do que aproximadamente 220 mOsm/L.

Exemplos de soluções hipotônicas incluem muitas preparaçõesfarmacêuticas que já estão prontas para injeção com água estéril. Quandosoluções hipotônicas são injetadas, ocorre um deslocamento fluido e a águaé movida para dentro das células endoteliais das veias e das células de san-gue. As células que absorvem demasiada água podem estourar, e assim, ainjeção de soluções hipotônicas pode causar a irritação, a flebite, e a hemó-lise das veias.

Características das soluções hipertônicas.

A presente invenção fornece métodos para a estruturação depreparações farmacêuticas para injeção em um indivíduo, em que as prepa-rações são estruturadas para formar soluções que são preparadas para for-mar soluções que não são hipertônicas em relação ao sangue nem são de-masiadamente hipertônicas (isto é, levemente hipertônicas) para causar umatrombose significativa e/ou uma irritação significativa dos vasos. Em umamodalidade, as formulações farmacêuticas prontas para injeção que sãoconsideradas como sendo levemente hipertônicas possuem uma tonicidadeou uma osmolaridade que é maior do que aproximadamente 340 mOsm/L emenor do que aproximadamente 600 mOsm/L. Em uma modalidade, as for-mulações farmacêuticas prontas para injeção que são consideradas comosendo levemente hipertônicas possuem uma tonicidade ou uma osmolarida-de que são maiores do que aproximadamente 340 e menor do que aproxi-madamente 375, 400, 425, 450, 475, 500, ou aproximadamente 575mOsm/L. Em geral as soluções hipertônicas exibem uma tonicidade que émaior do que aproximadamente 340 mOsm/L. As soluções com uma osmo-laridade que é maior do que aproximadamente 600 mOsm/L devem ser usa-das com cuidado nas injeções.

Os exemplos de soluções hipertônicas indesejáveis incluem mui-tas formulações farmacêuticas que estão prontas para injeção tal como adextrose a 10%, ou as preparações farmacêuticas que possuem múltiplosaditivos que afetam a osmolaridade. Quando as soluções hipertônicas sãoinjetadas, ocorre um deslocamento fluido e a água é extraída das célulasendoteliais das veias e das células do sangue. As células que perdem de-masiada água podem encolher, e assim, a injeção de soluções hipertônicaspode causar a irritação, a flebite, e a trombose das veias.fiH

O pH do sangue varia de aproximadamente 7,35 a aproximada-mente 7,45, que é considerado neutro. As preparações farmacêuticas comum valor de pH abaixo de 7 são consideradas drogas ácidas e aquelas comum valor de pH abaixo de 4,1 são consideradas muito ácidas. As drogascom um valor de pH acima de 7,5 são consideradas drogas básicas ou alca-linas, e aquelas com um valor de pH acima de 9,0 são considerados muitobásicos ou muito alcalinas. As soluções de droga muito ácidas ou muito al-calinas podem causar a flebite e a trombose. Assim, em uma modalidade, apresente invenção fornece soluções de cloreto de sódio para reconstituiçãode formulações Iiofilizadas da droga ou para diluição de formulações líquidasda droga para preparar essas formulações para injeção intravenosa, em queas preparações prontas para injeção (1) não possuem um pH que seja me-nor do que 4,1 ou maior do que 9,0, (2) possuem uma força iônica suficientepara impedir a agregação de eritrócitos, e (3) são aproximadamente isotôni-cas (ou levemente hipertônicas ou levemente hipotônicas) em relação aosangue de tal modo que nem a hemólise ou nem a coagulação ocorrem paraas CVSs. Entretanto, o pH de uma solução não é uma consideração em re-lação a se a solução possui uma força iônica suficiente para impedir a agre-gação de eritrócitos. Ou seja se uma formulação Iiofilizada quando reconsti-tuída com água tiver um pH que esteja abaixo de 4,1 ou acima de 9,0, istonão impedirá o uso dessa solução de cloreto de sódio para reconstituição afim impedir a aglutinação dos eritrócitos.

Calculando a Osmolaridade.

A osmolaridade de qualquer preparação farmacêutica pode sercalculada usando a seguinte fórmula:

Osmolaridade = (peso da substância (g) dividido pelo peso mo-lecular da substância (g/l)), multiplicado pelo número de espécies, multipli-cado por 1000 para a miliosmolaridade.

O termo "espécies" se refere ao número dos íons ou de espéciesquímicas fromadas quando a dissolução ocorre.Formulações Farmacêuticas Prontas ou Preapradas para Injeção.

A presente invenção fornece métodos para reconstituição emsolução de produtos de droga Iiofilizados a fim de preparar esses produtosde droga para injeção em um indivíduo. O produto de droga reconstituídaestá pronto para injeção tendo uma força iônica suficiente e uma tonicidadeque é aproximadamente isotônica em relação ao sangue.

Os métodos de acordo com a presente invenção pertencemtambém às soluções para diluição de droga a fim preparar uma solução dadroga para injeção em um indivíduo. A solução diluída da droga está prontapara injeção tendo uma força iônica suficiente e sendo aproximadamenteisotônica em relação ao sangue.

Em uma modalidade, Iiofilizado ou seca a droga pro-duct/formulação, se reconstituída com água, tem uma osmolaridade de a-proximadamente 100 mOsm/L a aproximadamente 360 mOsm/L. Porque apresente invenção fornece métodos para a reconstituição usando aproxima-damente 25mM às soluções de cloreto de sódio de aproximadamente 150mM, o practitioner deve usar uma solução particular de cloreto de sódio ba-seada na osmolaridade combinado preobservada do produto de droga Iiofili-zado reconstituída com solução de cloreto de sódio. Assim, por exemplo, seum produto de droga Iiofilizado se reconstituída em água tiver uma osmolari-dade de aproximadamente 300 mOsm/L, então a solução de NaCI para areconstituição for aproximadamente 25 mM a aproximadamente 30 mM. Emum outro exemplo, se um produto de droga Iiofilizado se reconstituída emágua tiver uma osmolaridade de aproximadamente 100 mOsm/L, então asolução de NaCI para a reconstituição devem ser aproximadamente 25 mMa aproximadamente 130 mM.

Em uma modalidade, um produto de droga (se Iiofilizado ou nasolução) a ser preparado para injeção pelos presentes métodos não contemHES (hidroxietil amido). HES-conter formulações, apesar do reconstituiçãoou da diluição com soluções de NaCI para a força iônica, pode causar a se-dimentação de eritrócitos e a aglutinação dentro em experiências in vitro. Emuma outra modalidade, um produto de droga a ser preparado para injeçãopelos presentes métodos não contem dextranos, porque métodos modifica-dos adaptados de Westergren (veja a mostra do exemplo 2) que a adição deTSTaCI não neutralizaria o efeito da sedimentação melhorado que os dex-tranos podem causar.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos parapreparação de umaa preparação farmacêutica para injeção intravenosa emque a preparação farmacêutica é um bolo Iiofilizado compreendendo um a-gente aumentando preliminar. O agente aumentando preliminar pode ser,por exemplo, em sua maioria não ionizante. Os agentes aumentando nãoionizante incluem, mas não são limitados a, manitol, glicina, sacarose, Iacto-se, outros dissacarídeos, proteínas terapêutica ou o componente ativo deuma formulação próprio, ou outros agentes aumentando conhecidos a umhábil na arte. As concentrações de agentes aumentando não ionizante nãoafetam significativamente se uma solução possui uma força iônica suficientepara impedir a aglutinação. Entretanto, suas concentrações possuem umefeito na osmolaridade, e conseqüentemente, suas concentrações podem terum efeito na tonicidade. A concentração de glicina, por exemplo, é equiva-lente a sucontribui para que a osmolaridade, assim 10 mM de glicina sãoequivalentes a 10 mOsm/L.

Os componentes da proteína em uma formulação da droga, in-cluindo componentes ativos, não afetam significativamente a força iônica deuma solução ou a osmolaridade de uma solução. Por exemplo, suponha umpeso molecular de 50.000 para uma proteína e suponha magnésio 2,5 daproteína em uma solução de 1-2 mL a ser injetada. Isto é equivalente a 0,05 mM, assim, a proteína não contribui adequadamente à osmolaridade.

As preparações farmacêuticas também contêm freqüentementetensoativos tais como o polissorbato-80. O polissorbato-80 e outros tensoati-vos são moléculas de grande peso molecular, e assim as quantidades queestão normalmente presentes nas preparações, tais como 0,001% a 0,01%, são demasiado pequenas para contribuir consideravelmente para a osmola-ridade ou para a força iônica. Outros tensoativos incluem os Brij® 35, Brij®30, Lubrol-px®, Triton X-10, Pluronic® F127 e dodecil sulfonato de sódio(SDS).

Outras moléculas de grande peso molecular que podem estar presentes em pequenas quantidades nas formulações farmacêuticas e quenão afetam consideravelmente a osmolaridade ou a iônicaidade são políme-ros, com, a qualificação de que não são sais como o sulfato do dextran. Ospolímeros de exemplo incluem dextrano, álcool polivinílico (PVA)1 hidroxipro-pril metilcelulose (HPMC), gelatina, polietileno glicol (PEG) e polivinilpirroli- dona (PVP).

As formulações farmacêuticas também contêm freqüentementesacarose ou outros açúcares ou polióis, freqüentemente em uma quantidadede 0 a 2%, de 0 a 5%, ou de 0 a 10% ou mais elevada. Por exemplo, a saca-rose de 5 a 10% pode ser usada quando a formulação não compreende umagente volumétrico. Geralmente, quando uma formulação é liofilizada, e asquantidades da formulação são identificadas aqui como quantidades percen-tuais ou molaridades, essas são feitas em referência às porcentagens e àmolaridade de uma solução antes da liofilização (isto é, quantidade suficien-te). Assim, quando uma solução tem 1% de sacarose, isto é equivalente a29,2 mM. Como a sacarose não se ioniza ou se dissocia adequadamente emsolução, 29 mM de sacarose são equivalentes a 29 mOsm/L. Os outros açú-cares ou polióis que não se ionizam ou se dissociam adequadamente emsolução incluem o glicerol, o xilitol, o sorbitol, o manitol (também pode serusado como um agente volumétrico), a glicose, o inositol, a rafinose, a mal-totriose, a Iactose, e a trealose.

As formulações farmacêuticas também podem conter agentes detamponamento. Os agentes de tamponamento incluem, por exemplo, o ace-tato, o citrato, a glicina, a histidina, o fosfato (de sódio ou potássio), a dieta-nolamina e o Tris. Os agentes de tamponamento incluem aqueles agentesque mantêm o pH da solução em uma faixa aceitável. Agentes de tampona-mento tais como a glicina, a histidina, e a dietanolamina são em sua maiorparte não ionizantes, e assim suas concentrações são equivalentes à osmo-Iaridade e devem ser mantidas em mente ao se considerar uma formulaçãopronta para injeção seja aproximadamente isotônica. Os agentes de tampo-namento tais como o acetato e o citrato são geralmente sais, e conseqüen-temente se ionizam, e suas concentrações são multiplicadas em relação aocálculo de sua contribuição para a osmolaridade de uma solução.

As formulações farmacêuticas podem incluir essencialmentequalquer componente ativo, incluindo proteínas, ácidos nucleicos, vírus ecompostos químicos. Estas moléculas em sua maioria não afetam adequa-damente a força iônica ou a osmolaridade de uma solução a ser injetada. Seestas moléculas forem sais, como freqüentemente os compostos com molé-culas pequenas são sais farmacêuticos, então podem afetar sensivelmente aforça iônica e/ou a osmolaridade.

Determinados aminoácido também são encontrados em algumasformulações farmacêuticas e são usados como crioprotetores, Iioprotetorese/ou agentes volumétricos. Alguns aminoácidos, tais como a histidina, sãoem sua maioria não ionizantes, e assim a concentração de um aminoácidoem uma formulação deve somente ser mantida na mente ao se calcular aosmolaridade de uma solução de tal modo que uma formulação pronta parainjeção seja aproximadamente isotônica em relação ao sangue.BeneFIX®.

BeneFIX® é produzido por uma Iinhgem geneticamente projeta-da da célula do ovário do hamster chinês (CHO) que é extensivamente ca-racterizada e mostrada como estando livre de agentes infecciosos. Os ban-cos de armazenamento de células são livres de sangue ou dos produtos doplasma. A linhagem celular de CHO secreta o Fator IX (FIXr) recombinanteem um meio de cultura definido da célula que não contenha nenhumas pro-teínas derivadas das fontes animais ou humanas, e o Fator IX recombinanteé purificado por um processo de purificação cromatográfica que não necessi-ta de uma etapa com anticorpo monoclonal e produza um produto ativo dealta pureza. É incluída uma etapa de filtração por membrana que tenha acapacidade de reter moléculas com pesos moleculares aparentes >70.000(tais como proteínas grandes e partículas virais) para uma segurança viraladicional. O BeneFIX® é predominantemente um único componente pelaavaliação da eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A potência (em uni-dades internacionais, U.l. (UI)) é determinada usando-se um teste de coagu-lação in vitro de uma etapa contra o concentrado de Fator IX padrão interna-cional da Organização Mundial de Saúde (OMS). Uma unidade internacionalé a quantidade da atividade do Fator IX presente em 1 mL do plasma huma-no acumulado, normal. A atividade específica do BeneFIX® é maior do queou igual a 180 Ul por miligramaa de proteína. O BeneFIX® não é derivadodo sangue humano e não contem nenhum preservativo ou componente ani-mal ou humano adicionado.

O BeneFIX® é formulado como uma preparação de pó Iiofilizadoestéril, não pirogênico. BeneFIX® é destinado a injeção intravenosa (IV).Está disponível em frascos de uso único contendo a quantidade marcada deatividade do Fator IX, expressada em unidades internacionais (Ul). Cadafrasco contém, por exemplo, nominalmente 250, 500 ou 1000 Ul (ou mais,incluindo 2000 Ul) do Fator IX de coagulação (recombinante). Depois da re-constituição do produto de droga Iiofilizada com água estéril, as concentra-ções dos excipientes com força de dosagem de 500 e 1000 Ul são de 10mM de L-histidina, 1% de sacarose, 260 mM de glicina, 0,005% de polissor-bato 80. As concentrações após a reconstituição com força de dosagem de250 Ul possuem metade da tonicidade de outras duas forças do dosage a-pós constituição. As forças de uma dosagem de 500 e 1000 Ul são isotônicaapós a reconstituição, e a força de um dosagem de 250 Ul tem a metade datonicidade de outras duas forças de dosagem após a reconstituição. Todasas forças de dosagem produzem uma solução clara, incolor em cima do re-constituição.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos pre-parando BeneFIX® para ser injetada em um indivíduo, onde BeneFIX® re-constituída em uma solução de cloreto de sódio, em que a solução de clore-to de sódio é maior do que aproximadamente 25 mM e menor do que apro-ximadamente 150 mM. Em uma modalidade, a solução de cloreto de sódiousada para reconstituir o BeneFIX® é de aproximadamente 40 mM. Em umamodalidade, um frasco de BeneFIX® Iiofilizado é reconstituído em aproxi-madamente 4 mL a 5 ml_ de uma solução de cloreto de sódio de 25 mM a150 mM.

BeneFIX® Reformulado (BeneFIX@-R).

Devido à baixa força iônica de BeneFIX® reconstituída com á-gua, foram feitas várias formulações (BeneFIX® reformulado (BeneFIX®-R)).O objetivo foi adicionar força iônica suficiente à formulação de BeneFIX®para diminuir o potencial de aglutinação das CVS. De modo a aumentar aforça iônica do BeneFIX®, o cloreto de sódio pode ser incorporado ao produ-to reconstituído substituindo a AEI como solução reconstituição. Alternativa-mente, BeneFIX® pode ser reformulado adicionando NaCI à formulação depré-liofilização, de tal modo que a reconstituição pode ainda ser conseguidocom água, mas a liofilização de soluções salinas é mais difícil, sendo maisprático reconstituir os bolos Iiofilizados simplesmente com soluções de NaCI.Isto é também verdadeiro para outras preparações farmacêuticas Iiofilizadasque não possuem uma força iônica suficiente quando reconstituída com AEIpara impedir a aglutinação.

Em uma modalidade, o BeneFIX®-R pode ser Iiofilizado namesma formulação que BeneFIX® (10 mM de L-histidina, 260 mM de glicina,1% de sacarose, 0,005% de polissorbato 80), e somente a concentração deFIXr diferirá. Grande parte do produto da droga BeneFIX®-R pode então serpreenchido, por exemplo, em frascos de 4 mL com 10 mM de L-histídina,260 mM de glicina, 1% de sacarose, 0,005% de polissorbato 80, e depoisliofilizado. Quando o BeneFIX(E)-R é reconstituído a 5 mL por frasco comuma solução de NaCI de 25 mM a 150 mM, tal como com 40 mM de NaCI, aconcentração dos excipientes fica reduzida de 20% quando comparado àformulação de BeneFIX® presente na pré- liofilização. Esta estratégia resul-ta em uma formulação que é (1) isotônica, (2) possui força iônica suficientepara reduzir o potencial para a aglutinação das CVS, e (3) reduz o volumeda injeção para doses mais elevadas de FIXr. O BeneFIX(E)-R pode ser for-necido com, por exemplo, com forças de dosagem do 250, 500, 1000, e2000 Ul de FIXr por frasco. Assim, após a reconstituição com 5 mL de umasolução de NaCI de 25 mM a 150 mM, a solução resultante da formulaçãode BeneFIX®-R pode ter de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9mM de histidina; de aproximadamente 188 mM a aproximadamente 220 mMde glicina; de aproximadamente 0,7% a aproximadamente 0,9% sacarose; eaproximadamente 0,004% de polissorbato 80. Dependendo da quantidadede FIXr em um frasco, por exemplo, 250, 500, 1000, ou 2000 Ul, a reconsti-tuição em 5 mL de uma solução de NaCI resultariam em uma concentraçãode FIXr de aproximadamente 50, 100, 200 ou 400 UI/mL, respectivamente. Aosmolaridade da formulação de BeneFIX(E)-R reconstituída em 5 mL de umasolução de NaCI de 40 mM é de aproximadamente 320 mOsm/L.Exemplos de Formulações a Serem Preparadas para Injeção.

O Fator IX recombinante também pode ser liofilizado nas formu-lações descritas na Patente Americana Nq US 6.372.716, que é aqui incorpo-rada pela referência para todas as finalidades, incluindo as formulações des-critas na mesma. As formulações descritas na referida patente podem serusados com a presente invenção, onde as formulações não estão limitados apossuírem o FIXr como sendo o componente ativo. Assim, por exemplo, asformulações Iiofilizadas que podem ser reconstituídas com soluções de clo-reto de sódio de 25 mM a 150 mM para prepará-las para injeção, incluem asformulações compreendendo a glicina, o polissorbato, a sacarose, a histidi-na, e um componente ativo. O componente ativo pode ser essencialmente,por exemplo, qualquer proteína, vírus, ácido nucleico ou composto químico.A glicina pode ter uma concentração, por exemplo, de aproximadamente 0,1M a 0,3M. O polissorbato pode ter uma concentração, por exemplo, de apro-ximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05%. A sacarose pode ter umaconcentração, por exemplo, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente2%. A histidina pode ter uma concentração, por exemplo, de aproximada-mente 5 mM a aproximadamente 30 mM.

Em uma modalidade, uma formulação Iiofilizada a ser reconstitu-ída com solução de cloreto de sódio de 25 mM a 150 mM compreendendode aproximadamente 0,1 M a 0,3 M de glicina, aproximadamente 0,5% a 2%de sacarose, aproximadamente 0,001% a 0,05% de polissorbato, de aproxi-madamente 5 mM a aproximadamente 30 mM de histidina, e de aproxima-damente 0,1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de um componente ativo.O componente ativo podendo ser, por exemplo, FIXr. Em uma outra modali-dade, um formulação Iiofilizada de FIXr reconstituída com solução de cloretode sódio de 25 mM a 150 mM compreende de aproximadamente 0,13mg/mL a aproximadamente 3 mg/mL de FIXr ou de aproximadamente 50UI/mL a aproximadamente 600 UI/mL de FIXr, aproximadamente 0,26 M deglicina, aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 1% de sa-carose e aproximadamente 0,005% de polissorbato.

EXEMPLOS DA INVENÇÃO.

Os exemplos descritos abaixo são fornecidos para ilustrar as-pectos de acordo com a presente invenção e não são incluídos com a finali-dade de limitar a presente invenção.

Exemplo 1:

Efeitos dos Anti-coaqulantes e dos Componentes da Formulação Sobre aAglutinação das CVS Associada com a BeneFIX®.

Existem relatórios ocasionais de aglutinação das CVS associadacom BeneFIX® em linhas de cateter com butterfly e em seringas. Estudosrecentes no sangue de cães com hempofilia demonstram que a aglutinaçãoocorre na ausência do Fator IX humano recombinante no tampão de formu-lação. Assim, o presente estudo investigou se os anti-coagulantes padrão,os vários componentes de BeneFIX®, e a força iônica afetam o fenômeno daaglutinação associado com BeneFIX®.

O sangue foi obtido de um acúmulo de voluntários humanos a-nônimos e coletado em tubos Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes,NJ) contendo um anticoagulante padrão, tal como o ácido etileno diaminote-tracético (EDTA), o citrato de sódio, ou a heparina.

Para testar a aglutinação, as amostras de sangue nos tubos Va-cutainer foram primeiras misturados continuamente em um nutator. O san-gue, 12,5 μΙ_, foi diluído em 87,5 μΙ_ de uma solução do teste em uma micro-placa de cultura de células com 48 poços, e deixada em incubação na tem-peratura ambiente por 2 minutos antes da observação sob um microscópiode contraste de fase inversa em uma ampliação de 400x. Cada poço foi gra-vado em videotape para capturar imagens imóveis a fim graduar a aglutina-ção das CVS de acordo com os seguintes critérios listados abaixo na Tabela1.

Tabela 1: Chave de Graduação da Aglutinação das CVS.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Efeito dos Anti-Coaqulantes Padrão na Aglutinação das CVS:

O primeiro estudo incluiu o teste de amostras do sangue de trêsdoadores. O sangue foi coletado em tubos Vacutainer de EDTA, de hepari-na, e de citrato de sódio para cada doador. Os materiais de teste incluíramBeneFIX®, 100 UI/mL, reconstituído em cada uma das seguintes concentra-ções de NaCI: 0 mM (ΑΕΙ), 20 mM, 40 mM, 60 mM, e 77 mM de NaCI. Adi-cionalmente a dextrose a 5% (D5W) foi incluída como um controle positivo.As amostras foram diluídas a uma razão de sangue para BeneFIX® ou desangue para D5W de 1:8. As imagens foram captadas, armazenadas digita-lizadas, mascaradas e graduadas para a aglutinação. Dois minutos após aadição do sangue ao BeneFIX® reconstituído com ΑΕΙ, a aglutinação foi ob-servada nas amostras de todos os três doadores não importando o tipo deanticoagulante usado. Conforme se foram aumentando as concentrações deNaCI usadas, a resposta da aglutinação foi sendo atenuada. Uma aglutina-ção marcante foi observada quando o sangue foi adicionado à D5W.Efeitos do NaCI na Aglutinação das CVS em Doadores Pré-Selecionados:

As amostras doadas foram coletadas em tubos heparinizadosVacutainer. Como a aglutinação espontânea foi observada em algumas a -mostras precedentes, todos os doadores foram selecionados inicialmenteusando o NaCI a 154 mM. Se a aglutinação fosse observada a amostra eradesqualificada de testes adicionais. As amostras restantes de cada doadorforam diluídas 1:8 em uma das duas formulações: (1) 100 UI/mL BeneFIX®reconstituída com ΑΕΙ, e (2) 100 UI/mL BeneFIX® reconstituída com 154 mMde NaCI. As imagens foram captadas, armazenadas digitalmente, mascara-das e graduadas para a aglutinação. A aglutinação foi observada com a Be-neFIX® reconstituída com ΑΕΙ, observou-se que a reconstituição com 154mM de NaCI reduziu ou eliminou a reação da aglutinação (veja a Tabela 2para Gradações).

Tabela 2: Graduação da Aglutinação.

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Efeito dos Componentes da Formulação e da Concentração de BeneFIX®:

Diversas formulações de BeneFIX® foram avaliadas para verifi-car o impacto de diferentes componentes na aglutinação das CVS. Forampreparadas oito misturas diferentes, com e sem 154 mM de NaCI, para umtotal de 16 misturas (Tabela 3). Doze doadores foram avaliados para a agiu-tinação espontânea e dois desqualificados para um estudo posterior. As a-mostras do sangue de cinco dos dez doadores restantes foram usadas paraas primeiras 8 formulações (amostras 1-A até 1-H) e outras cinco amostrasfornecidas foram usadas para as segundas 8 formulações (amostras 2-1 até2-P). As amostras foram diluídas a 1:8 tal como antes e as imagens foramcaptadas e marcadas tal como previamente descrito.

Tabela 3: Matriz do Projeto de Formulação.(+/- indica presence/absence de um componente)

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

As avaliações da aglutinação para a experiência que caíram forana Tabela 3 são mostradas abaixo nas Tabelas 4A e 4B. Nenhum compo-nente em particular, quer fosse componente ativo ou um excipiente, da pre-paração de BeneFIX® foram associados com a aglutinação. Como espera-do, a remoção da glicina causou a Iise das CVS devido à hipotonicidade dasolução. Entretanto, a reconstituição com 154 mM de NaCI reduziu ou elimi-nou na aglutinação in vitro e a lise.

Tabela 4A: Gradacões da Aglutinação - Variando a Concentração de Bene-FIX®.

<table>table see original document page 32</column></row><table>Tabela 4B: Gradações da Aglutinação - Efeitos do Excipiente.

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Efeitos de Concentrações Mais Baixas de NaCI Sobre a Aglutinação dasCVS em Doadores Pré-Selecionados:

As amostras fornecedoras foram coletadas nos tubos heparini-zados Vacutainer. Como a aglutinação foi observada em algumas amostrasprecedentes, todos os doadores foram selecionados inicialmente com 154mM de NaCI. Se a aglutinação for observada, a amostra é desqualificadapara testes adicionais. As amostras restantes de cada doador foram diluídasa 1:8 como antes em uma das três formulações: (1) 100 UI/mL BeneFIX®com ΑΕΙ; (2) 100 UI/mL BeneFIX® com 40 mM de NaCI; ou (3) 100 UI/mLBeneFIX® com 77 mM de NaCI. As imagens foram captadas, coletadas egraduadas como antes. Os resultados são fornecidos na Tabela 5 abaixo. Aaglutinação foi observada em todas as cinco amostras com BeneFIX® re-constituído com água, enquanto que a reconstituição de BeneFIX® com 40mM ou 77 mM de NaCI reduziu ou eliminou a reação da aglutinação.

Tabela 5: Graduação da Aglutinação:

<table>table see original document page 33</column></row><table>Análise:

A aglutinação das CVS ocorreu no sangue anti-coagulado comheparina, EDTA, ou citrato de sódio quando misturado com BeneFIX® emuma amostra de sangue em uma relação reconstituída para o volume deBeneFIX® de 1:8. Nenhum efeito do tipo do anticoagulante foi observado naaglutinação; conseqüentemente a heparina foi usada como anticoagulanteem avaliações subseqüentes. Em algumas amostras, a aglutinação ocorreuna presença de 0,9 % NaCI somente (controle negativo para a aglutinação).Conseqüentemente, as avaliações subseqüentes foram conduzidas somentecom amostras que não exibiram nenhuma aglutinação com o controle de0,9% de NaCI.

Os efeitos de três concentrações de BeneFIX® (100, 300, ou600 UI/mL) e de cada componente individual de BeneFIX®, reconstituídacom AEI ou com a solução de NaCI foram avaliados então para a aglutina-ção das CVS quando misturados com o sangue anti-coagulado com hepari-na em um sangue com uma relação do volume de BeneFIX® de 1:8. A eli-minação de qualquer componente particular, incluindo a proteína humanarecombinante do FATOR IX não teve nenhum efeito sobre a resposta da a-glutinação. Isto indica que uma ampla ecala de formulações farmacêuticasdiferentes pode ser preparada (ou reconstituída, ou diluída) com soluções deNaCI para injeção intravenosa. A remoção da glicina resultou na Iise dasCVS. Entretanto, o uso de 40 mM (0,234% NaCI, injetável), de 77 mM(0,45% NaCI, injetável) ou de 154 mM de NaCI (0,9% NaCI, injetável) para areconstituição reduziu ou eliminou a resposta de aglutinação e a lise.

Assim, estes resultados mostram que nenhum componente par-ticular da formulação de BeneFIX® está relacionado à aglutinação observa-da. Embora a remoção da glicina da formulação do BeneFIX® e da reconsti-tuição com água resulte em uma solução hipotônica que causa a lise, a os-molaridade e a tonicidade são uma consideração diferente da força iônica eda aglutinação. Os resultados mostram que a aglutinação está associadocom a força iônica baixa do Fator IX recombinante (FIXr) reconstituído emΑΕΙ, e a reconstituição com NaCI atenua ou elimina a aglutinação. Assim, areconstituição de outras formulações farmacêuticas com soluções, mesmosoluções de NaCI que possuem uma concentração abaixo de 154 mM, podeimpedir a aglutinação e a Iise durante uma injeção intravenosa.

Exemplo 2:

A Adaptação do Método Modificado de Westergren da Medida da Taxa deSedimentação de Eritrócitos para Avaliar a Agregação de Eritrócitos Induzidapor Agentes Farmacêuticos ou por Formulações.

A formulação atualmente introduzido no mercado de BeneFIX®é uma formulação não iônica. Durante a administração da formulação deBeneFIX® reconstituída com AEI, houve umas observações infrequèntes deagregação de eritrócitos (isto é, aglutinação) quando o sangue de um paci-ente é misturado com o BeneFIX® reconstituído, tal como nas vias intrave-nosas. A presente invenção fornece a descoberta de que a agregação deeritrócitos está associada com a formulação, e não com o FIXr, e que é im-pedida usando diluentes contendo pelo menos aproximadamente 40 mM deNaCl. Para ajudar no projeto dos diluentes feitos sob encomenda contendopelo menos aproximadamente 40 mM de NaCl, um teste quantificável foiprojetado para ser usado para medir a sedimentação dos eritrócitos, e é ummétodo estabelecido para avaliar a agregação de eritrócitos in vitro. O méto-do modificado de Westergren1 em que o sangue é diluído a 4:5 com soluçãosalina normal, foi adaptado para avaliar a agregação no sangue que foi diluí-do a 1:4 ou a 1:8 com as soluções salina ou de teste (isto é, diluentes feitossob encomenda).

O sangue humano foi obtido de voluntários saudáveis adultos ecoletado em tubos contendo EDTA. Para demonstrar a adequabilidade deamostras de sangue para experiências de sedimentação, a taxa de sedimen-tação de eritrócito clinicamente definida de ESReo foi medida pelo métodomodificado de Westergren. Rapidamente, a amostra de sangue bem homo-genizada foi diluída a 4:5 com 154 mM de NaCI1 homogenizando delicada-mente e suficientemente, e colocada então imediatamente em um tubo dezeragem automática de Westergren que foi depois colocado sobre uma es-tante de suporte projetada para 10 tubos. A distância em mm da marca zerono alto do tubo até a interface plasma.eritrócitos após 60 minutos foi medidae gravada. Os resultados da ESR6O foram comparados com os valores dereferência normais já publicados (Morris, M. W. et al, Basic Examination ofBlood, in Henry, J.B., ed., Clinicai Diagnosis and Management by LaboratoryMethõds, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2001: 479-519).

Duas experiências foram conduzidas para mostrar a adaptabili-dade do método modificado de Westergren para avaliar a agregação de eri-trócitos associada com as formulações farmacêuticas. As amostras humanasde sangue eram adequadas para uso nesses testes porque todas tiveram osvalores de ESR6O que estavam dentro dos limites normais. Estas amostrasforam diluídas a 1:4 na primeira experiência e diluídas a 1:8 na segunda.

Na primeira experiência, a sedimentação de eritrócitos foi melho-rada pelo dextrano 70 a 5% ou pelo BeneFIX® reconstituído com AEI ou 10mM de NaCI. Dentro de 5 minutos, os agregados foram visíveis nos tubosque tinham sido carregados com o sangue diluído com o dextrano 70 a 3%ou com o BeneFIX® reconstituída com ΑΕΙ. Em 60 minutos, a sedimentaçãode eritrócitos nestes tubos foi marcantemente melhorada quando comparadocom o controle salino (Tabela 6). Em 90 minutos, o sangue de um doadorque foi diluído com BeneFIX® reconstituído em 10 mM de NaCI mostrou umteste padrão bifásico da sedimentação com uma relação clara de eritróci-to.plasma localizada a 8 mm da zero-marca e uma outra relação entre eritró-citos densamente empacotados e menos densamente empacotados locali-zada a 149 mm da marca zero.Tabela 6: Sedimentacao de eritrocitos do sangue humane diluido a 1:4 em BeneFIX® ou em 3% dextrano.(distancia de sedimentacao em mm medida desde o zero).

<table>table see original document page 37</column></row><table>As concentraçãos de NaCI são aquelas utilizadas para reconsti-tui o BeneFIX®.

Na segunda experiência, a sedimentação de eritrócitos foi me-lhorada pela dextrose a 5%, "MFR-927" (o tampão da formulação para Be-neFIX® ém que não há o FIXr), e o BeneFIX® reconstituído com 10 mM deNaCI (Tabela 7). Ao contrário da primeira experiência, a sedimentação nes-tes tubos foi rápida com a sedimentação máxima ou quase máxima alcança-das em 15 e 30 minutos.Tabela 7: A Sedimentacao de Eritrocitos do Sangue Humano Diluido a 1:8 em MRF-927, BeneFIX® ou em 5% de Dextrose.

<table>table see original document page 39</column></row><table>As concentrações de NaCI são aquelas usadas para reconstituiros BeneFIX®; MFR-927 é o tampão da formulação para BeneFIX® em quenão há FIXr.

Os resultados destas experiências demonstram que o métodomodificado de Westergren usado para medir a sedimentação de eritrócitospode ser adaptado para avaliar a agregação de eritrócitos induzida por pre-parações ou por formulações farmacêuticas. Por exemplo, a medida da se-dimentação de eritrócitos nos tubos de Westergren em 60 minutos depoisque carregando o sangue diluído a 1:4 com as soluções do teste é suficientede distinguir entre os agentes que melhoram a agregação (isto é, dextrose a5%, o dextrano 70 a 3%, o MFR-927, e o BeneFIX® reconstituído com ΑΕΙ)daqueles que não melhoram (isto é, solução salina e BeneFIX® reconstituí-do nos diluentes contendo aproximadamente 25 mM ou mais NaCI).Exemplo 3:

A Adequação de NaCI 40 Mm no Diluente para o Benefix® Reformulado pa-ra Melhorar a Agregação de Eritrócitos Associada com a Formulação.

A formulação não iônica de BeneFIX® atualmente comercializa-da foi associada com na agregação de eritrócitos in vitro, que pode ocorrerdurante a administração quando o sangue paciente é misturado com o Be-neFIX® dentro do Iumem intravenoso. A presente invenção fornece a des-coberta de que a agregação de eritrócitos está associada com a formulação,e não com o Fator IX recombinante, e a agregação pode ser impedida pelareconstituição do BeneFIX® com diluentes contendo pelo menos 40 mM deNaCI.

Um objetivo deste Exemplo é testar a robustez de um diluente a40 mM para a reconstituição de preparações reformuladas de BeneFIX®(BeneFIX®-R). Especificamente, as experiências foram projetadas para de-terminar se as concentrações de NaCI que se desviam dos 40 mM em ummáximo de 10% são suficientes impedir a formulação de agregação associ-ada ao eritrócito, que foi avaliado pelo método adaptado, modificado deWestergren para medir a taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR). Alémdisso, a robustez da concentração de NaCI sobre a sedimentação de eritróci-tos foi avaliada tanto em tascos de BeneFIX®-R de altas dosagens (isto é,2000 Ul) como em baixas dosagens (isto é, 250 Ul).

O efeito de formulações de BeneFIX(S)-R, de MFR-927, e de dex-trano 70 a 3% na sedimentação de eritrócitos foi medida na temperaturaambiente usando uma adaptação do método modificado de Westergren, co-mo descrita no exemplo 2. O projeto do estudo é esboçado na Tabela 8.

Tabela 8: Projeto de Estudo para a Exemplo 3.

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No dia do experimento, tanto os frascos de dosagem elevada(frascos de BeneFIX(E)-R Iiofilizado contendo -2000 Ul de FIXr) quanto os debaixa dosagem de BeneFIX®-R (frascos de BeneFIX®-R Iiofilizado contendo-250 Ul de FIXr) foram reconstituídos imediatamente antes do uso com 5mL de NaCI a 36 mM, a 40 mM, e a 44 mM. A solução de controle positivode dextrano 70 a 3% (p/v) foi preparada em solução estéril de Dulbecco mo-dificada em solução tampão salina de fosfato livre de cálcio e de magnésio(PBS-CMF; pH 7,4). O sangue humano foi obtido de doadores e coletado emtubos Vacutainer contendo EDTA. As amostras de sangue foram usadaspara experiências de sedimentação de eritrócitos dentro de 3 horas após acoleta.

O sangue total foi diluído a 1:4 nas soluções do teste (ou seja,400 μL de sangue total foram adicionados a 1,2 mL da solução de teste),homogenizadõ, è carregado então nos tubos de vidro descartáveis auto ze-rados de Westergren que foram presos precisamente na vertical em umaestante de suporte especificamente projetada. A sedimentação de eritrócitosapós 60 minutos, que foi a distância em mm da marca zero no alto do tuboaté a interface plasma:eritrócito, foi medida e registrada.

Os resultados de todos os 12 doadores foram similares. A formu-lação da solução tampão atualmente comercializada BeneFIX® na qual nãohá FIXr (MFR-927) e o dextrano 70 a 3%, uma solução padrão de controlepositivo, mostrou uma sedimentação de eritrócitos melhorada em compara-ção ao sangue que foi misturado com as soluções do teste em NaCI (verFigura 1). Independente da concentração de NaCI no tampão (36 mM, 40mM, ou 44 mM) ou a concentração do FIXr no produto, o BeneFIX®-R nãomelhorou a sedimentação de eritrócitos por tanto tempo quanto a que foireconstituída com um diluente de NaCI.

Os resultados deste estudo demonstram que concentrações deNaCI 10% acima ou abaixao de 40 mM nos diluentes de BeneFIX(E)-R sãosuficientes para impedir a sedimentação de eritrócitos ou a agregação me-lhorada (aglutinação). Os resultados mostram também que o efeito melhora-do do NaCI na agregação de eritrócitos associada com a formulação não foiafetada pela concentração do componente ativo (isto é, FIXr).

Exemplo 4:

O Papel da Força lônica na Solução Tampão para a Reconstituição do Be-neFIX® em Promover a Aglutinação das CVS.

O sangue humano foi coletado por venipuntura de quatro doado-res diferentes em tubos padrão de coleta heparinizados. A formação de CVSaglutinadas foi testada pela extração de até 2,6 mL do tampão ou da proteí-na do BeneFIX® reconstituída em seringas seguidas por 0,6 mL do sangueheparinizado. O comportamento da mistura/sedimentação dos aglutinadosfoi observado nessas seringas com o passar do tempo e gravado fotografi-camente usando uma câmera digital.

A composição da atual formulação de pré-liofilização BeneFIX®é FIXr, com aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 260mM de glicina, aproximadamente 1% de sãcarose e aproximadamente0,005% de polissorbato-80, em pH 6,8. A formulação de BeneFIX® é Iiofili-zada, e antes da injeção, reconstituída com ΑΕΙ. Originalmente, a sacarosefoi suspeitada como sendo a causa da aglutinação. Assim, os tampões doteste foram formulados com 1%, 0,5%, ou 0% de sacarose. Cada tampão doteste com sacarose foi drenado em seringas, seguido por um pouco de san-gue heparinizado. A aglutinação das CVSs e a rápida sedimentação subse-qüente foram avaliadas como sendo idênticas para as três soluções tampão,sugerindo que o teor de sacarose da formulação de BeneFIX® não foi leva-da em conta em relação à aglutinação observada. O BeneFIX® reconstituídoem solução salina normal, em vez de em água estéril, não causou nenhumaaglutinação. Estes dados indicam que a força iônica da formulação de Be-neFIX® não é suficiente para impedir a aglutinação quando BeneFIX® é re-constituído com água.

A fim determinar a força iônica mínima necessária para eliminara aglutinação, o BeneFIX® reconstituído (ou a formulação de pré-liofilizaçãodo BeneFIX® pode ser variada para incluir o cloreto de sódio, embora osmétodos para liofilização de formulações com cloreto de sódio sejam maisdifíceis em comparação com as formulações de liofilização que não possu-am o cloreto de sódio) com as soluções que possuem concentrações varia-das de NaCl (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, e 137 mM). O Bene-FIX® também foi reconstituído em solução salina normal contendo 154 mMde NaCI. O comportamento da aglutinação e da sedimentação das CVS foiexaminado em todas essas soluções. A Tabela 9 mostra a osmolaridade eas forças iônicas (expressas como condutividade) de algumas destas solu-ções junto com outras soluções intravenosas comuns. Durante a adição decloreto de sódio à formulação de BeneFIX®, seja por adição direta antes daliofilização ou pela reconstituição de um Iiofilizado com uma solução de cio-reto de sódio, se espera que o NaCI esteja inteiramente dissociado em umaconcentração equivalente de íons Na+ e de íons Cl. Assim, a força iônica(expressada em mEq/L (miliequivalentes/L) de Na+ e de Cl") de formulaçãode um tampão mais o NaCI seria prevista como sendo equivalente à concen- tração de NaCI se o tampão da formulação não contivesse outros íons.

Tabela 9: A Caracterização das Várias Soluções.

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Quando do contato do sangue com as soluções na Tabela 9dentro de seringas, a aglutinação das CVS foi observada individualmente eas seringas foram então delicadamente homogenizadas e invertidas para observar a decantação do sangue. A formação da aglutinação não foi obser-vada em todos as formulações de BeneFIX® reconstituída com pelo menosaproximadamente 40 mM de NaCI (notar no Exemplo anterior que aproxima-damente 36 mM de NaCI também foram suficientes para impedir a aglutina-ção). O comportamento de células sangüíneas nestas soluções contendo pelo menos 40 mM de NaCI foi indistinguível daquele em solução salinanormal.

A sedimentação do sangue foi testada em uma série de seringascontendo a formulação de BeneFIX® diluída (no caso de pré-liofilização)/reconstituída (se liofilizado) em concentrações decrescentes deNaCI (começando em 40 mM) 15 minutos após a inversão. Houve uma res-posta consistente dependente da concentração em termos de formação decoágulos e a subseqüente velocidade de sedimentação / aglutinação cres-cente e de uma sedimentação mais rápida com a concentração descrescen-te de NaCI no tampão. A aglutinação óbvia foi visível com uma amostra desangue em tampão contendo NaCI < 25 mM e com outra amostra de sangueem tampão contendo NaCI < 30 mM. Em todas as preparações de tampãocom NaCI > 40 mM, o comportamento das células do sangue foi indistinguí-vel tanto em solução salina normal como em BeneFIX® reconstituído com 40mM de NaCI correspondente a uma condutividade calculada de 4 mS/cm.

A solução da injeção de dextrose a 5%, cada ml_ da qual contém50 mg de dextrose hidratada USP em água para injeção, tem uma osmolari-dade calculada de 250 mOsm/L e uma força iônica calculada de 0 mS/cm.Esta solução, que é administrada geralmente intravenosamente, causoutambém a aglutinação das CVS e uma sedimentação muito rápida do san-gue similar a aquelas observadas com a formulação de BeneFIX® reconsti-tuída com água.

Assim, estes resultados indicam que a aglutinação das CVScausada por BeneFIX® reconstituída em água é devido à baixa força iônicada formulação de BeneFIX® (força iônica calculada de 0 mEq/L, < 0,2mS/cm de condutividade medida). Esse peroblema pode ser corrigido pelareconstituição com uma solução de NaCI contendo > 40 mM de NaCI de talmodo que a solução para injeção reconstituída possua uma força iônica cal-culada de aproximadamente 40 mEq/L (a força iônica suficiente para impedira aglutinação pode também ser calculada como um condutividade de apro-ximadamente 4 mS/cm, ou mais elevada) ou mais.

Claims

1. Método para preparar uma formulação farmacêutica para inje-ção intravenosa, o método compreendendo a adição de uma solução con-tendo de aproximadamente 25 mM à aproximadamente 150 mM de cloretode sódio à formulação farmacêutica, resultando assim em uma formulaçãopreparada para injeção intravenosa, em que a formulação preparada é apro-ximadamente isotônica em relação ao plasma ou é levemente hipotônica oulevemente hipertônica em relação ao plasma, e em que a formulação prepa-rada possui uma força iônica suficiente para impedir a aglutinação dos eri-trócitos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a formula-ção preparada é aproximadamente isotônica em relação ao plasma e temuma osmolaridade que é de aproximadamente 270 mOsm/L a aproximada-mente 330 mOsm/L.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a formula-ção preparada é levemente hipotônica em relação ao plasma e tem umaosmolaridade que é de aproximadamente 220 mOsm/L a aproximadamente-270 mOsm/L.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a formula-ção preparada é levemente hipertônica em relação ao plasma e tem umaosmolaridade que é de aproximadamente 330 mOsm/L a aproximadamente-600 mOsm/L.

5. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, em que a formulação preparada possui uma força iônica que é pelo me-nos aproximadamente 25 mEq/L de íons Na+ e Cl-.

6. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, em que a formulação preparada possui uma força iônica que é pelo me-nos aproximadamente 30 mEq/L de íons Na+ e Cl-.

7. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, em que a formulação preparada possui uma força iônica que é pelo me-nos aproximadamente 36 mEq/L de íons Na+ e Cl-.

8. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, em que a formulação preparada possui uma força iônica que é pelo me-nos aproximadamente 40 mEq/L de íons Na+ e Cl-.

9. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, em que a formulação preparada possui uma força iônica de que é pelomenos aproximadamente 40 mEq/L de íons Na+ e Cl- e menor do que apro-ximadamente 150 mEq/L de íons Na+ e Cl-.

10. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que a formulação preparada possui uma força iônica quando medidapor codutividade que é de pelo menos 2,5 mS/cm.

11. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que a formulação preparada possui uma força iônica quando medidapor codutividade que é de pelo menos 4,0 mS/cm.

12. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 11, em que a formulação farmacêutica a ser preparada para injeção é umaformulação liofilizada.

13. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 11, em que a formulação farmacêutica a ser preparado para injeção é umasolução.

14. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 13, em que a solução contém de aproximadamente 40 mM à aproximada-mente 150 mM de cloreto de sódio.

15. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 13, em que a solução contém de aproximadamente 36 mM à aproximada-mente 44 mM de cloreto de sódio.

16. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 13, em que a solução de cloreto de sódio é de aproximadamente 40 mM.

17. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 16, em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulaçãofarmacêutica não contém uma quantidade apreciável de um sal de ioniza-ção.

18. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a formu-lação liofilizada, se reconstituída com água, não contem mais do que 5 mMde um sal de ionização.

19. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a formu-lação liofilizada, se reconstituída com água, não contem mais do que 25 mMde um sal de ionização.

20. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 19, em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulaçãofarmacêutica compreende a histidina, a glicina, a sacarose, e o polissorbato.

21. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 19, em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulaçãofarmacêutica compreende a histidina, a glicina, a sacarose, o polissorbato, euma proteína terapêutica.

22. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 21, em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulaçãofarmacêutica compreende a histidina, a glicina, a sacarose, o polissorbato, eo Fator IX.

23. Método de cordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 21, em que antes da adição da solução de cloreto de sódio, a formulaçãofarmacêutica se reconstituída em água compreende:(a) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM de histidina;(b) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3M de gli-cina;(c) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 por cento desacarose; e(d) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 porcento de polissorbato.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que antes daadição da solução de cloreto de sódio, a formulação farmacêutica se recons-tituída em água compreende também:(e) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX.

25. Método para preparação de uma formulação liofilizada doFator IX para injeção intravenosa, o método compreendendo a adição deuma solução contendo de aproximadamente 25 mM à aproximadamente 150mM de cloreto de sódio à formulação Iiofilizada do Fator IX resultando assimem uma formulação preparada para injeção intravenosa, em que a formula-ção preparada é aproximadamente isotônica em relação ao plasma ou é le-vemente hipotônica ou levemente hipertônica em relação ao plasma, e emque a formulação preparada possui uma força iônica suficiente para impedira aglutinação dos eritrócitos.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a formu-lação Iiofilizada do Fator IX se reconstituída em água compreende:(a) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM dehistidina;(b) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3M de gli-cina;(c) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 por cento desacarose; e(d) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 porcento de polissorbato.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que uma so-lução com aproximadamente 40 mM de cloreto de sódio é adicionada à for-mulação Iiofilizada do Fator IX.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que aproxi-madamente 5 mL da solução com aproximadamente 40 mM de cloreto desódio são adicionados à formulação Iiofilizada do Fator IX.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a formu-lação do Fator IX tem um volume de pré-liofilização de aproximadamente 4mL.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a formu-lação Iiofilizada do Fator IX, se reconstituída em água, compreende aproxi-madamente 10 mM de histidina, 0,26 M de glicina, 1% de sacarose, 0,005%de polissorbato, e o Fator IX.

31. Kit farmacêutico compreendendo:(a) um frasco contendo um bolo liofilizado, em que se o bolo Iiofi-lizado for reconstituído com 5 mL da água a solução compreenderia:(i) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM dehistidina;(ii) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M de gli-cina;(iii) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 por cento desacarose;(iv) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 porcento de polissorbato; e(v) de aproximadamente 50 Ul/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX;(b) uma solução contendo de aproximadamente 25 mM à apro-ximadamente 150 mM de cloreto de sódio; e(c) instruções para reconstituição do bolo liofilizado com a solu-ção de cloreto de sódio, de tal modo que depois da reconstituição a soluçãoresultante é aproximadamente isotônica e possui uma força iônica suficientepara impedir a agregação de eritrócitos durante a injeção intravenosa.

32. Kit farmacêutico compreendendo:(a) um frasco contendo um bolo liofilizado, em que se o bolo liofi-lizado for reconstituído com 4 mL da água a solução compreenderia:(i) aproximadamente 10 mM de histidina;(ii) aproximadamente 0,26 M de glicina;(iii) aproximadamente 1 por cento de sacarose;(iv) aproximadamente 0,005 por cento de polissorbato 80; e(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX;(b) uma solução contendo aproximadamente 40 mM de cloretode sódio; e(c) instruções para reconstituição do bolo liofilizado no frascocom aproximadamente 5 mL de solução de cloreto de sódio, de tal modo queapós a reconstituição a solução resultante compreende:(i) de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9 mM de his-tidina;(ii) de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 210 mMde glicina;(iii) de aproximadamente 0,7% a aproximadamente 0,9% saca-rose;(iv) aproximadamente 0,004% de polissorbato 80;(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX; e(vi) aproximadamente 40 mM de NaCI.

33. Bolo liofilizado, em que se o bolo Iiofilizado for reconstituídocom 5 mL da água a solução compreenderia:(i) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM dehistidina;(ii) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3M de glici-na;(iii) de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2% de saca-rose;(iv) de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05% depolissorbato; e(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX.

34. Bolo liofilizado, em que se o bolo liofilizado for reconstituídocom 4 mL da água a solução compreenderia:(i) aproximadamente 10 mM de histidina;(ii) aproximadamente 0,26 M de glicina;(iii) aproximadamente 1% de sacarose;(iv) aproximadamente 0,005% de polissorbato 80; e(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX.

35. Frasco contendo um bolo liofilizado, em que se o bolo liofili-zado for reconstituído com 5 mL da água a solução resultante compreende-ria:(i) de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM dehistidina;(ii) de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3M de glicina;(iii) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 por cento desacarose;(iv) de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 porcento de polissorbato; e(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX.

36. Frasco contendo um bolo liofilizado, em que se o bolo Iiofili-zado for reconstituído com 4 mL da água a solução resultante compreenderia:(i) aproximadamente 10 mM de histidina;(ii) aproximadamente 0,26 M de glicina;(iii) aproximadamente 1 por cento de sacarose;(iv) aproximadamente 0,005 por cento de polissorbato 80; e(v) de aproximadamente 50 UI/mL a aproximadamente 2000UI/mL do Fator IX.